BRPI0007481B1 - formulação contendo cepa de bifidobacterium e uso da mesma - Google Patents

Abstract

"cepa de bifidobacterium, agente antimicrobiano e formulação obtidos da cepa de bifidobacterium". uma cepa de bifidobacterium isolada do trato gastrintestinal humano ressecado e lavado é significativamente imunomoduladora seguindo consumo em humanos. a cepa é útil na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável, especialmente atividade inflamatória gastrintestinal tal como doença inflamatória do intestino ou síndrome do intestino irritável. a atividade inflamatória também pode ser causada por câncer.

Description

FORMULAÇÃO CONTENDO CEPA DE BIFIDOBACTERIUM E USO

DA MESMA

IntrodugÃo Essa invenção se relaciona a cepas probióticas de Bifidobacteríum que têm várias aplicações em produtos alimentícios e em medicina. Mais partícularmente, a invenção se relaciona a cepas probióticas de bifidobactéria capazes de modificar beneficamente e consequentemente aliviar os sintomas observáveis em doença inflamatória.

Os consumidores estão se tornando crescentemente conscientes de questões que possam ser necessárias para a manutenção de seu meio ambiente, saúde e nutrição. Em resposta, a pesquisa científica focalizou nos papéis que a dieta, o estresse, e as práticas médicas modernas {por exemplo antibióticos e radioterapia) podem desempenhar em termos de ameaça para a saúde humana. Em particular, a mudança dinâmica da população em direção a sociedades mais idosas está aumentando a. incidência de doenças que podem ser causadas por microflora deficiente ou comprometida tais como infecções do trato gastrintestinal (GIT), constipação, sindrome do intestino irritável {IBS), doença inflamatória. do intestino {IBD) - doença de Crohn e colite ulcerativa, alergias alimentares, diarréia induzida por antibióticos, doença cardiovascular e certos cânceres (por exemplo, câncer colorretal).

Probióticos foram definidos como suplementos alimentares microbianos vivos que afetam beneficamente o hospedeiro ao melhorar o equilíbrio microbiano intestinal, ou mais amplamente, como microorganismos vivos, que sob ingestão em certo número, exercem efeitos na saúde além da nutrição básica inerente. Coquetéis de vários organismos, particularmente espécies de Lactobacillus e Streptococcus, têm sido tradicionalmente usados em produtos laticínios fermentados para promover a saúde.

Em anos recentes, a fabricação comercial e a propaganda de alimentos funcionais (alimentos que afetam funções do corpo de um modo direcionado de forma a ocasionar efeitos positivos na fisiologia e nutrição), particularmente iogurtes probióticos (Acidophilus-Bifidus), se espalharam do nicho de mercado japonês bem estabelecido para o mercado lucrativo e em expansão da União Européia. Apesar de inúmeras bactérias probióticas de origem humana estarem sendo comercíalmente exploradas agora (por exemplo, L. acidophílus LA-1), muitos consumidores, organizações de consumidores, e membros da comunidade científica são cépticos de tais produtos e de suas reivindicações probióticas anunciadas. A indústria de alimento diário está, dessa forma, sob considerável pressão para validar cientificamente esses novos produtos alimentícios probióticos.

Os critérios sugeridos para a seleção de microrganismos probióticos potencialmente efetivos podem ser resumidos como a seguir: origem humana, comportamento não-patogênico, resistência a processos tecnológicos (ou seja, viabilidade e atividade em veículos de liberação), resistência à acidez gástrica e à toxicidade da bile, adesão ao tecido epitelial do intestino, habilidade para colonizar o GIT, produção de substâncias antimicrobianas, habilidade para modular respostas imunes, e a habilidade para influenciar atividades metabólicas (por exemplo, assimilação de colesterol, atividade de lactase, produção de vitamina) (Huis in't Veld J, Shortt C. "Selection criteria for probiotic micro-organisms". Em: Leeds. A.R., Rowland, I.R. eds. Gut Flora and Health - Past, Present and Future. Londres: The Royal Society of Medicine Press Ltd., 1996:19-26) .

Bifidobactérias são uma de várias bactérias predominantes cultiváveis presentes na microflora colônica.

As funções de bifidobactérias endógenas no cólon não foram completamente elucidadas. No entanto, é reconhecido que bebês alimentados exclusivamente com leite materno têm um risco reduzido de diarréia comparados com bebês alimentados com fórmulas. 0 fato de que esses bebês têm maior número de bifidobactárias colônicas pode explicar em parte essa vantagem para a saúde observada, já que a ocupação de nichos disponíveis no GIT por grande número de bifidobactéria não-patogênicas pode ajudar a evitar infecção bacteriana. Acredita-se que a patogênese da doença de Crohn esteja relacionada com a microflora bacteriana colônica (Targan, S. e Shanahan, F. Inflammatory bowel disease: From bench to bedside. Williams e Wilkins 1994). Verificou-se recentemente que pacientes que sofrem de doença de Crohn ativa têm significativamente menos bifidobactérias recuperáveis em suas fezes comparados com indivíduos saudáveis. Essa redução nos números de bifidobactérias foi observada que está diretamente relacionada com níveis diminuídos de produção e atividade de galactosidase β-D (Favier, C. e cols. Dig. Dis. Sei. 1997; 42:817-822). Galactosidase β-D é uma enzima produzida por bifidobactérias. Esses resultados suportam sugestões propostas em outros estudos de que cepas de bifidobactérias podem desempenhar papéis importantes na manutenção de uma microflora intestinal saudável equilibrada.

Bifidobactérias são consideradas como sendo probióticas já que são organismos vivos que exercem efeitos saudáveis além da nutrição básica quando ingeridas em números suficientes. Numerosas bifidobactérias ingeridas devem alcançar o local de ação no intestino a fim de exercer um efeito probiótico. Foi sugerido um nível mínimo de aproximadamente 106-107 bifidobactérias viáveis por grama de conteúdo intestinal (Bouhnik, Y., Lait 1993: 73:241-247). Há relatos na literatura que mostram que estudos in vivo completados em adultos e em bebês indicam que algumas cepas de bifidobactérias são capazes de sobreviver à passagem através do trato gastrintestinal. Diferenças significativas foram observadas entre habilidades de diferentes cepas de bifidobactérias para tolerar ácido e sais biliares, indicando que a sobrevivência é um critério importante para a seleção de cepas probióticas potenciais. A ingestão de bifidobactérias pode incrementar o trânsito gastrintestinal.

Além disso, evidência indireta em humanos demonstra que o consumo de leite fermentado por bifidobactérias pode levar a níveis reduzidos de certas enzimas fecais tal como a galactosidase β-D implicadas na conversão de pró-carcinógenos em carcinógenos (Bouhnik, Y, e cols-, Eur. J. Clin. Nutr, 1996; 50:269-273). Além disso, metabólitos de putrefação oriundos das fezes tais como p-cresol, indol e amônia também foram reduzidos quando os indivíduos consumiram leite fermentado por Bifidobacterium longum e S. thermophilus (Takiguchi, R. e cols. Bifidus - Flores, Fructus et Semina 1996; 9:135-140). A atividade antimicrobiana foi relatada estar associada com bifidobactérias. Além disso, bifidobactérias mostraram que modulam vários parâmetros do sistema imune. A inflamação da mucosa em camundongos deficientes em IL-10 foi relatada estar reduzida pela alimentação dos animais com uma preparação de bactérias ácidas (Madsen, K. e cols. Gastroenterol. 1997; 112:A1030). Estudos posteriores completados em ratos demonstraram que a ingestão de bifidobactérias pode suprimir a formação de focos de criptas aberrantes (lesões pré-neoplásicas iniciais) no cólon (Kulkarni, N. e Reddy, B. Proc. Soc. Experim. Biol. Med. 1994; 207:278-283) além de diminuir significativamente a incidência de tumor de cólon e o número de tumores presentes (Singh, J. e cols. Carcinogenesis 1997; 18:833-841). Há uma pesquisa em andamento por cepas probióticas com efeitos benéficos particulares na nutrição e terapia e na saúde de forma geral.

Fundamentos da Invenção A invenção fornece uma cepa de Bifidobacterium isolada do trato gastrintestinal humano ressecado e lavado, que é significativamente imunomoduladora após consumo oral em humanos. A cepa de Bifidobacterium preferentemente efetua mudanças em um marcador imunológico introduzido em um sistema que compreende células que interagem com o sistema imune e com células do sistema imune. Preferentemente, as células que interagem com o sistema imune são células epiteliais. Preferentemente, o marcador é uma citocina, especialmente TNFa.

Em uma modalidade preferida, as células que interagem com o sistema imune e com as células do sistema imune têm origem semelhante.

As células que interagem com o sistema imune são de origem gastrintestinal, respiratória ou geniturinária.

As células do sistema imune são preferentemente de origem gastrintestinal, respiratória ou geniturinária. A invenção também fornece uma cepa de Bífidobacterium longum infantis isolada do trato gastrintestinal humano ressecado e lavado que é significativamente imunomoduladora após consumo oral em humanos. A cepa de Bífidobacterium que tem efeito antiinflamatório significativo após consumo oral em humanos. A cepa de Bífidobacterium é isolada preferentemente do trato gastrintestinal humano ressecado e lavado que é capaz de combater os efeitos de doença inflamatória do intestino, a referida capacidade sendo mantida na presença de concentrações fisiológicas de bile humana e suco gástrico humano. A capacidade de combater os efeitos da doença inflamatória do intestino é avaliada medindo-se a reversão de uma doença debilitante induzida em camundongos receptores de imunodeficiência combinada severa (SCID) aos quais foram administradas células T CD4 + , CD45RDhl9h purificadas. A capacidade da cepa de Bífidobacterium longum infantis para combater os efeitos da doença inflamatória do intestino também pode ser avaliada medindo-se a redução na inflamação colônica em camundongos deficientes em IL-10 (cepa IL-10+ 129 Svex) seguindo a administração de uma ou mais cepas de Bifídobacterium longum infantis de acordo com a invenção de forma isolada ou em combinação com uma cepa de Lactobacillus salivarius como definida a seguir.

Interleucina 10 (IL-10) é uma citocina reguladora importante que suprime as funções efetoras de macrófagos/monócitos, células T auxiliares 1 (Thl), e células exterminadoras naturais. Adicionalmente, IL-10 aumenta a proliferação e diferenciação de células B. Modelos murídeos desprovidos do gene de IL-10 desenvolvem espontaneamente doença inflamatória do intestino e tumores gastrintestinais. A flora gastrintestinal tem sido implicada na patogênese desses estados de doença, uma vez que animais livres de germe não desenvolvem doença. A cepa de Bifídobacterium preferentemente tem atividade inibidora contra uma ampla variedade de bactérias gram-positivas e gram-negativas.

Preferentemente a cepa de Bifídobacterium exibe um amplo espectro de atividade contra bactérias incluindo espécies de Staphylococcus, Pseudomonas, Coliform e Bacillus.

Em um aspecto particular a invenção fornece cepa de Bifídobacterium longum infantis UCC35624 ou mutante ou variante desta.

Um depósito de Bifídobacterium longum infantis cepa UCC 35624 foi feito no National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (NCIMB) em 13 de janeiro de 1999 e concedido o número de acesso NCIMB 41003.

Em uma modalidade o mutante é um mutante geneticamente modificado.

Em uma modalidade a variante é uma variante que ocorre naturalmente de Bifidobacterium longum infantis UCC 35624. A cepa de Bifidobacterium pode estar na forma de células viáveis. Alternativamente, a cepa de Bifidobacterium está na forma de células não-viáveis. A invenção também fornece um agente antimicrobiano obtido de uma cepa de Bifidobacterium da invenção que é antagonista ao crescimento e outros organismos.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma formulação que compreende uma cepa de Bifidobacterium da invenção. A formulação pode compreender duas ou mais cepas de Bifidobacterium. A formulação pode incluir outro material probiótico. Alternativamente ou adicionalmente a formulação inclui um material prebiótico. A formulação pode incluir uma cepa de Lactobacillus salivaríus. A cepa de Lactobacillus salivaríus pode estar na forma de células viáveis ou na forma de células não-viáveis. 0 Lactobacillus salivaríus é preferentemente isolado de trato gastrintestinal humano ressecado e lavado, o Lactobacillus salivaríus sendo significativamente imunomodulador seguindo consumo oral em humanos. Preferentemente, a cepa de Lactobacillus salivaríus é isolada de trato gastrintestinal humano ressecado e lavado que inibe uma ampla variedade de microorganismos gram-positivos e gram-negativos.

Em uma modalidade preferida, a cepa de Lactobacillus salivarius secreta um produto que tem atividade antimicrobiana em um sobrenadante livre de células, a referida atividade sendo produzida somente pelo crescimento de células e sendo destruída por proteinase K e pronase E, as propriedades inibidoras da referida cepa e seus produtos secretórios sendo mantidos na presença de concentração fisiológica de bile humana e de suco gástrico humano.

Tais cepas de Lactobacillus salivarius são reveladas em WO 98/35014.

De modo ideal, a cepa de Lactobacillus salivarius é a cepa de Lactobacillus salivarius UCC 118 ou uma mutação ou variante da mesma. A mutação é modificada geneticamente. A variante pode ser uma ocorrência natural de Lactobacillus salivarius.

Foi feito um depósito da cepa UCC 118 de Lactobacillus salivarius na NCIMB em 27 de novembro de 1996, sob o número de adição NCIMB 40829.

Preferivelmente, a formulação inclui um transportador que possa ser ingerido. Esse pode ser um transportador farmaceuticamente aceitável como, por exemplo, uma cápsula, tablete ou pó.

Esse transportador pode ser um produto alimentício tal como leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, leite em pó, concentrado de leite, pastas de queijo, molhos ou bebidas. A formulação pode conter uma proteína e/ou peptídeo, em proteínas particulares e/ou peptídeos ricos em glutamina/glutamato, um lipídeo, um carboidrato, uma vitamina, mineral e/ou elemento vestigial.

Em uma modalidade, a Bifidobacterium está presente em mais de 106 cfu por grama de sistema de fornecimento.

Em outra modalidade, a formulação inclui um adjuvante. A formulação pode incluir um componente bacteriano. A formulação pode alternativamente ou adicionalmente incluir uma entidade de droga. A formulação pode também incluir um composto biológico. A formulação pode estar em uma forma para imunização oral. A invenção fornece adicionalmente uma cepa de Bifidobacterium ou uma formulação desta para uso em produtos alimentícios.

Em outro aspecto a invenção fornece uma cepa de Bifidobacterium ou uma formulação desta para uso como um medicamento. A cepa ou formulação pode ser para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamacória indesejável. A cepa ou formulação pode ser para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória gastrintestinal indesejável tal como doença inflamatória do intestino, por exemplo, doença de Crohns ou colite ulcerativa, síndrome de intestino irritável, pouchitis, ou colite pós-infecção. A atividade antiinflamatória pode ser devida ao câncer.

Em adição a cepa ou formulação pode ser para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer (es) gastrintestinal. A cepa ou formulação pode ser usada para a profilaxia de câncer. Além disso, a cepa ou formulação pode ser para uso para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença sistêmica tal como artrite reumatóide. A cepa ou formulação pode ser para uso na profilaxia e/ou tratamento de distúrbios auto-imunes devidos à atividade inflamatória indesejável. A cepa ou formulação pode ser para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer devido à atividade inflamatória indesejável. A cepa ou formulação pode ser para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença diarréica devida à atividade inflamatória indesejável, tais como diarréia associada ao Clostrídíum díffícile, diarréia associada ao Rotavírus ou diarréia pós-infecciosa.

Breve descrição dos desenhos Nos desenhos que acompanham: Fig. 1 é um gráfico de cfu/ml versus tempo para Bifidobacterium longum infantis cepa 35612 como descrito no Exemplo 2;

Fig. 2 é um gráfico de cfu/ml versus tempo para Bifidobacterium longum infantis cepa 35624 como descrito no Exemplo 2;

Fig. 3 é um gráfico de mudança percentual de peso versus tempo (dias) para cinco camundongos SCID (1-5) aos quais foi administrada a cepa UCC 35624 como descrito no Exemplo 5;

Fig. 4 é um gráfico de mudança média do percentual de peso versus tempo (dias) para cinco camundongos SCID (1-5) aos quais foi administrada a cepa UCC 35624 como descrito no Exemplo 5;

Fig. 5 é um gráfico de mudança percentual de peso versus tempo (dias) para cinco camundongos (1-6) aos quais foi administrada uma combinação de cepas de Lactobacíllus salivarius UCC 118 e UCC 35624 como descrito no Exemplo 5;

Fig. 6 é um gráfico de mudança média do percentual de peso versus tempo (dias) para cinco camundongos (1-6) aos quais foi administrada uma combinação de cepas UCC 118 e UCC 35624 como descrito no Exemplo 5;

Fig. 7 é um gráfico de mudança percentual de peso versus tempo (dias) para cinco camundongos (11-15) aos quais foi administrada uma combinação de cepas UCC 118 e UCC 35624 como descrito no Exemplo 5;

Fig. 8 é um gráfico de mudança média do percentual de peso versus tempo (dias) para cinco camundongos (11-15) aos quais foi administrada uma combinação de cepas UCC 118 e UCC 35624 como descrito no Exemplo 5;

Fig. 9 é um diagrama de barras de níveis de TNFa em amostras de pacientes e de controle na presença de PBMCs e Bifidobacterium longum infantis como descrito no exemplo 7;

Fig. 10 é um diagrama de barras mostrando níveis de TNFa e IL-8 em co-culturas de células epiteliais, PBMCs e Bifidobacterium longum infantis como descrito no exemplo 7. Controles representam co-culturas somente de células epiteliais e PBMCs;

Fig. 11 são diagramas de barras de níveis de citocina no sangue periférico após o consumo de Bifidobacterium longum infantis por voluntários humanos saudáveis (n=18) por três semanas como descrito no exemplo 8;

Fig. 12 são diagramas de barras de níveis séricos de TNFa e IL-IRA após o consumo de Bifidobacterium longum infantis por voluntários humanos saudáveis (n=18) como descrito no exemplo 8;

Fig. 13 é um diagrama de níveis de TNFa em sobrenadante de cultura gasta livre de células de Bifidobacterium longum infantis e um controle MRS como descrito no Exemplo 9;

Fig. 14 é uma representação diagramática do intestino inferior de um camundongo SCID após tratamento com Bifidobacterium longum infantis; e Fig. 15 é uma representação diagramática do intestino inferior de um camundongo SCID não tratado.

Descrição Detalhada Isolamos cepas de bactéria probióticas que são capazes de modificar beneficamente e conseqüentemente aliviar os sintomas observáveis em distúrbios inflamatórios. Essas cepas e as formulações preparadas podem ser usadas em uma variedade de produtos alimentícios e medicamentos para combater o efeito de distúrbios inflamatórios.

Estudos in vivo e in vitro foram conduzidos usando-se as cepas de bactérias probióticas. Verificou-se que humanos alimentados com iogurte contendo Bifidobacterium longum infantis UCC35624 mostram diminuições em seus níveis sistêmicos de IL-8. Essa cepa pode dessa forma ter aplicação potencial no tratamento de uma gama de distúrbios inflamatórios, particularmente se usada em combinação com terapias antiinflamatórias atuais, tais como drogas antiinflamatórias não esteróides (NSAIDs) ou Infliximab. 0 consumo de Bifidobacterium longum infantis por camundongos SCID também foi examinado. Embora esse experimento atenuou significativamente a atividade inflamatória, camundongos consumindo Bifidobacterium longum infantis retiveram fezes sólidas enquanto que camundongos de controle sofreram de diarréia. Esse efeito antidiarréico podería estar relacionado à atividade antiinflamatória dessa invenção, possivelmente mediado por meio de modulação de cAMP. É incerto se são necessárias bactérias intactas para exercer um efeito antiinflamatório ou se componentes ativos individuais da invenção podem ser usados isoladamente. Foram identificados componentes pró-inflamatórios de certas cepas de bactérias. Os efeitos pró-inflamatórios de bactérias gram-negativas são mediados por lipopolissacarídeos (LPS). LPS isoladamente induz uma trama pró-inflamatória, parcialmente devido ao LPS que se liga ao receptor de CD14 em monócitos. Presume-se que componentes de bactérias probióticas possuam atividade antiinflamatória, devido aos efeitos de toda a célula. Sob isolamento desses componentes, é antecipado um grau de manipulação farmacêutica. 0 uso geral de Bifídobacterium longum infantis UCC35624 é na forma de células viáveis. No entanto, ele também pode ser estendido a células não-viáveis tais como culturas mortas ou composições contendo fatores benéficos expressos por Bifídobacterium longum infantis UCC35624. Isso podería incluir microrganismos mortos termicamente ou microrganismos mortos por exposição a pH alterado ou submetidos â pressão. Com células não-viáveis, a preparação do produto é mais simples, as células podem ser incorporadas facilmente nos farmacêuticos e as necessidades de estoque são muito menos limitadas do que as de células viáveis. Lactobacillus casei YIT 9018 oferece um exemplo do uso efetivo de células mortas por calor como um método para o tratamento e/ou prevenção de crescimento de tumor, como descrito na Patente U.S. N° US4347240. A invenção será mais claramente entendida a partir dos seguintes exemplos.

Exemplo 1 Isolamento de bactérias probióticas Apêndices e secções dos intestinos grosso e delgado do G.I.T. humanos, obtidos durante cirurgia reconstrutora, foram rastreados para cepas bacterianas probióticas como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1 Amostras de tecido do trato gastrintestinal rastreadas para a presença de bactérias probióticas Amostra Locação A íleo B Cólon C Região ileo-cecal D Apêndice E Apêndice F íleo G Região ileo-cecal Todas as amostras foram estocadas imediatamente após a cirurgia a -80°C em recipientes estéreis. Os tecidos congelados foram descongelados, pesados e colocados em solução de Ringer com cisteína (0,05%) a um quarto da potência. Cada amostra foi gentilmente agitada para remover microrganismos aderidos de forma frouxa (chamada - lavada 'W'). Após a transferência para um segundo volume de solução de Ringer, a amostra foi girada por 7 minutos para remover bactérias aderidas de forma apertada (chamada - Amostra 'S'). A fim de isolar bactérias embebidas em tecido, as amostras A, B e C também foram homogeneizadas em um misturador de Braun (chamadas - homogeneizadas Ή')· As soluções foram diluídas serialmente (diluição IO'1 de uma amostra lavada foi rotulada Wl, diluição 10'2 foi rotulada W2 e o mesmo sistema de rotulagem foi usado para as amostras 'S' e Ή') e espalhadas em placas (100 μΐ) sobre o seguinte meio ágar: RCM (meio clostrídico reforçado) e RCM ajustado para pH 5,5 usando ácido acético; TPY (tripticase, peptona e extrato de levedura), Chevalier, P. e cols. (1990) J. Appl. Bacteríol 68, 619-624). MRS (deMann, Rogosa e Sharpe); ROG (meio de acetato (SL) de Rogosa); LLA (Lactose de fígado de Lapiere); BHI (ágar de infusão de cérebro coração); LBS (ágar seletivo de Lactobcilo) e TSAYE (ágar de triptona de soja suplementado com extrato de levedura a 0,6%). Todos os meios de ágar foram fornecidos por Oxoid Chemicals com a exceção de ágar TPY. As placas foram incubadas em jarros anaeróbicos (BBL, Oxoid) usando kits de geração de C02 (Anaerocult A, Merck) por 2-5 dias a 37°C.

Isolados de bactérias gram-positivas, catalase-negativas, em forma de bastão ou bifurcadas/pleomórficas, foram espalhadas para pureza sobre um meio não-seletivo complexo (TPY). Os isolados foram cultivados rotineiramente em meio TPY, a menos que estabelecido de outra forma, a 37°C sob condições anaeróbicas. Espécies presumidas de Bifidobacteriums foram esticadas em glicerol a 40% e armazenadas a -20°C e -80°C.

Análise de fermentação do produto final O metabolismo da glicose do carboidrato e os subseqüentes produtos finais de ácido orgânico foram examinados usando-se uma coluna de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) LBK Bromma, Aminex HPX-87H. A coluna foi mantida a 60°C com uma taxa de fluxo de 0,6 •ml/min (pressão constante). 0 tampão de HPLC usado foi 0,01 N H2S04. Antes da análise, a coluna foi calibrada usando 10 mM de citrato, 10 mM de glicose, 20 mM de lactato e 10 mM de acetato como padrões. As culturas foram propagadas em caldo MRS modificado por 1-2 dias a 37°C de forma anaeróbica. Após centrifugação por 10 minutos a 14.000 g, o sobrenadante foi diluído 1:5 com tampão de HPLC e 200 μΐ foram analisados na HPLC. Todos os sobrenadantes foram analisados em duplicata.

Caracterização Bioquímica e Fisiológica Os traços bioquímicos e fisiológicos dos isolados de bactérias foram determinados para auxiliar na identificação. Redução de nitrato, formação de indol e atividade de expressão de β-galactosidase foram avaliadas. Foram determinados o crescimento em caldo a 15°C e 45°C e a atividade de protease sobre gelatina. As características de crescimento das cepas em leite de tornassol também foram avaliadas.

Perfis de sensibilidade antibiótica Foram determinados os perfis de sensibilidade antibiótica dos isolados usando-se · o ensaio 'susceptibilidade de disco'. As culturas foram cresceram no meio de caldo apropriado por 24-48 horas, espalhadas em placas (100 μΐ) sobre o meio de ágar e os discos contendo concentrações conhecidas dos antibióticos foram colocados sobre o ágar. As cepas foram examinadas quanto a sensibilidade antibiótica após incubação de 1-2 dias a 37°C sob condições anaeróbicas. As cepas seriam consideradas sensíveis se fossem vistas zonas de inibição de 1 mm ou mais.

Isolamento de sp. Bifidobacterium.

Sete secções de tecido do G.I.T humano foram rastreadas para a presença de cepas que pertencem ao gênero Bífidobacterium. Havia alguma variação entre amostras de tecido como segue. Amostras A (íleo) e E (apêndice) tinham as contagens mais baixas com aproximadamente 102 células isoladas por grama de tecido. Em comparação, mais do que 103 cfu/g de tecido foram recuperadas das outras amostras. Números similares de bactérias foram isolados durante as etapas de 'lavagem' e 'amostra' com contagens ligeiramente maiores nas soluções de 'amostra' de F (íleo) e G (ileo-cecal). Daquelas rastreadas para bactérias aderidas de forma apertada (homogeneizadas), C (ileo-cecal) foi a única secção de tecido que deu contagens significativas.

Durante o rastreamento de algumas secções de tecido, por exemplo, C e B, não havia uma correlação direta entre contagens obtidas durante uma série de diluição. Isso indicaria que alguns fatores de crescimento, derivados tanto do sangue como do tecido, estavam sendo fornecidos para o crescimento da bactéria exigente na suspensão inicial, os quais foram subseqüentemente diluídos. Caracterização e seleção de cepa Aproximadamente mil e quinhentos isolados bacterianos catalase-negativos de diferentes amostras foram escolhidos e caracterizados em termos de sua reação de Gram, tamanho de célula e morfologia, crescimento a 15°C e 45°C e produtos finais de fermentação de glicose. Mais do que sessenta por cento dos isolados testados foram gram-positivos, cocos homofermentativos arranjados seja em tetraedros, cadeias ou cachos. Dezoito por cento dos isolados foram bastões gram-negativos e cocobacilos heterofermentativos.

Os isolados restantes (vinte e dois por cento) foram predominantemente cocobacilos homofermentativos. Trinta e oito cepas foram caracterizadas em mais detalhe: 13 isolados de G; 4 de F; 8 de D; 9 de C; 3 de B e 1 de E. Todos os trinta e oito isolados testaram negativos tanto para redução de nitrato como para produção de indol de triptofano.

Perfis de sensibilidade antibiótica Antibióticos de importância clínica humana foram usados para avaliar os perfis de sensibilidade de bifidobactérias selecionadas. As bifidobactérias testadas foram sensíveis a ampicilina, amoxicilina, ceftaxime, ceftriaxona, ciprofloxacina, cefradina, rifampicina, amicacina, gentamicina e cloranfenicol. Elas também eram resistentes a netilmicina, trimetoprim, ácido nalidíxico, cefuroxima, vancomicina e tetraciclina.

Exemplo 2 Resistência Ácida A primeira linha de defesa do hospedeiro que um microorganismo alcança após o consumo humano é o ácido gástrico do estômago. Um fator chave que influencia as bactérias é a sobrevivência no suco gástrico. Foram examinados a sobrevivência e crescimento de Bifidobacterium longum infantis cepas 35612 e 35624 em um ambiente de pH baixo. As cepas foram rotineiramente cultivadas em meio de extrato de tripticase-peptina-levedura (TPY) a 37°C sob condições anaeróbicas estritas (jarros BBL Gas usando o sistema Merck Anaerocult A gas pak) por 12-24 horas. 0 suco gástrico humano foi obtido de indivíduos saudáveis por aspiração por aspiração através de sonda nasogástrica (Mercy Hospital, Cork, Irlanda). Ele foi imediatamente centrifugado a 13.000 g por 30 minutos para remover todas as partículas sólidas, esterilizado através de filtros de 0,45 μπι e filtros de 0,2 μτη e armazenado a 4°C. O pH e a atividade de pepsina foram medidos antes do uso experimental. A atividade de pepsina foi medida usando o ensaio de hemoglobina quantitativo (Guantam, S. e R.S. de la Motte. 1989. Proteolytic enzymes, a practical approach. Capítulo 3. R.J. Beynon e J.S. Bond (eds.), IRL Press, Oxford University Press; Dawson, R.M. 1969. pH and buffers. Em Data for Biochemical Research pág. 138. R.M. Dawson, D.C. Elliot e K.M. Jones (eds.), Clarendon Press, Oxford). A sobrevivência das cepas em pH baixo in vitro foi investigada usando os seguintes ensaios: (a) as células foram colhidas de culturas frescas de um dia para o outro, lavadas duas vezes em tampão de fosfato (pH 6,5) e ressuspensas em caldo MRS ajustado para pH 3,5, 3,0, 2,5 e 2,0 (com 1 N HC1) até uma concentração final de aproximadamente 106 cfu/ml. As células foram incubadas a 37°C e a sobrevivência medida em intervalos de 5, 30, 60 e 120 minutos, usando o método de contagem de placa.

As cepas sobreviveram sem nenhuma perda de viabilidade em pH 3,5. Em pH 2,5 houve uma redução de 3 log após um período de incubação de 60 minutos como descrito nas Figs. 1 e 2.

Sobrevivência de cepas de Bifidobacterium em suco gástrico humano Culturas frescas de um dia para o outro foram colhidas, lavadas duas vezes em tampão (pH 6,5) e ressuspensas em suco gástrico humano até uma concentração final de 106 cfu/ml. A sobrevivência foi monitorada por um período de incubação de 30-60 minutos a 37°C. O experimento foi realizado usando suco gástrico humano em pH 1,2 (não ajustado) e pH 2,0 e 2,5 (ajustado usando IN NaOH). A sobrevivência das cepas foi aumentada em suco gástrico em pH 2,0, quando comparada com suco gástrico em pH 1,2. Após 30 minutos de incubação não foram recuperadas células viáveis em qualquer pH como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2 Sobrevivência de Bifidobacterium sp. Em suco gástrico humano* TEMPO (Min) CEPA pH 0 5 30 60 35612 1,2 7,56 0,00 0,00 0,00 2.0 6,27 6,31 2,88 0,00 35624 1,2 5,96 4,18 0,00 0,00 2.0 6,33 6,32 0,00 0,00 35652 1,2 6,16 3,78 0,00 0,00 2.0 8,45 8,40 3,45 0,00 35648 1,2 6,00 0,00 0,00 0,00 2.0 7,89 6,45 0,00 0,00 35687 1,2 6,68 0,00 0,00 0,00 2.0 8,75 8,77 3,34 0,00 BO 2,0 8,41 8,56 8,42 8,43 10 2,0 8,39 8,56 4,64 0,00 6,3 2,0 8,75 8,75 8,29 8,42 Β. 6 2,0 8,15 8,02 0,00 0,00 longum * sobrevivência expressa como logi0 cfu/ml Exemplo 3 Resistência a bile Na avaliação da efetividade do uso de bactérias de ácido lático como membros benéficos do trato gastrintestinal, considera-se que a resistência aos ácidos biliares é uma característica biológica de cepa importante requerida para a sobrevivência nesse ambiente hostil e adicionalmente ela não deve violar a saúde do hospedeiro pela produção de compostos tóxicos tais como ácido desoxicólico (DCA) e ácido litocólico (LCA) que têm sido implicados em inúmeros fenômenos citotóxicos.

Inúmeras cepas de Bífidobacterium longum infantis foram espalhadas sobre placas de ágar TPY suplementadas com bile suína (B-8631, Sigma Chemical Co. Ltd., Poole) em concentrações de 0,3, 0,5, 1,0, 1,5, 5,0 e 7,5 (p/v) (Legrand-Defretin, R. e cols., Lipids 1991; 26 (8), 578-583) . A bile suína é a mais próxima em composição à bile humana no que diz respeito âs proporções de sal biliar/colesterol e fosfolipídeo/colesterol. As placas foram incubadas a 37 °C sob condições anaeróbicas e o crescimento foi anotado após 24-48 horas. Verificou-se que a cepa 35624 era fortemente resistente à bile e cresceu para confluência em até 55 de bile suína como mostrado na Tabela 3.

Tabela 3 Crescimento de isolados de Bifidobacterium sp. Na presença de bile suína % (p/v) de BILE SUÍNA

CEPA 0,0 0,3 0,5 1,0 1,5 5,0 7,5 34612 + - - 35624 + + + + + + 35652 + - 35658 + + + + 35687 + - - -, nenhum crescimento; +, crescimento confluente A bile humana foi obtida de várias vesículas biliares e esterilizada a 80°C por 10 minutos. A composição de ácido biliar da bile humana foi determinada usando-se Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) de fase reversa em combinação com um detector amperométrico de pulso de acordo com o método de Dekker, R.R. e cols., Chromatographia, 1991, 31 (11/12), 255-256. A bile humana foi adicionada em uma concentração de 0,3% (v/v). Culturas recentemente espalhadas foram examinadas quanto ao crescimento após 24 e 48 horas. A cepa 35624 foi capaz de crescimento na presença de bile humana fisiologicamente relevante (0,3% (v/v)). 0 crescimento das cepas foi examinado na presença de ácidos biliares individuais conjugados e não conjugados. Sob condições fisiológicas os ácidos biliares são encontrados frequentemente como sais de sódio. As cepas foram rastreadas quanto ao crescimento em ágar de TPY contendo os sais de sódio conjugados e não conjugados de cada um dos seguintes ácidos biliares. (a) forma conjugada: ácido glicocólico (GCA); ácido glicodesoxicólico (GDCA); e ácido glicochenodesoxicólico (GCDCA); (b) forma não conjugada: ácido litocólico (LCA), ácido chenodesoxicólico (CDCA), ácido desoxicólico (DCA) e ácido cólico (CA). Para cada ácido biliar, foram usadas concentrações de 1, 3 e 4 mM. 0 crescimento foi anotado após 24 e 48 horas de incubação anaeróbica.

As cinco cepas estudadas cresceram em meio de ágar suplementado com 5 mM de GCA e GCDCA e em meio de ágar suplementado com 1 mM de GDCA, como mostrado na Tabela 4. A cepa 35624 foi resistente até concentrações de 5 mM de LCA (dados não mostrados) e as cepas 35612 e 35624 foram capazes de crescer em concentrações de 5 mM de CA, como mostrado na Tabela 5. Nenhum crescimento foi observado na presença de 1 mM de CDCA (dados não mostrados).

Tabela 4 Crescimento de isolados de Bifidobacterium sp. na presença de ácidos biliares conjugados a glicina -, nenhum crescimento; +, crescimento confluente GCDCA, ácido glicochenodesoxicólico; GDCA, ácido glicodesoxicólico; CGA, ácido glicocólico.

Tabela 5 Crescimento de isolados de Bifidobacterium sp. na presença de ácido cólico (CA) não conjugado ÁCIDO CÓLICO (mM) CEPA 0 13 5 35612 + + + + 35624 + + + + 35652 + + 35658 + + - - 35687_______+_______ + _______ - nenhum crescimento; +, crescimento confluente Exemplo 4 Atividade Antimicrobiana As espécies Bifidobacterium exercem efeitos inibitórios em outras bactérias pela exclusão de colonização em longo prazo por patógenos invasivos. Sua atividade antagonista é devida à produção de ácido acético e lático através de fermentação (Scardovi, V. (1986) Bifidobacterium em Bergey's Manualof systemic bacteriology, Vol. 2. Eds. Sheath, P.H., Main, N.S., Sharpe, M. e Holdt, J.G., Williams e Wilkins Publishers, Baltimore, M.D., pl418). Há muito poucos relatos sobre a produção de outros compostos antimicrobianos que não ácidos (Anand, S.K. e cols. Cult. Dairy Prods. 1985; J. 2, 21-23). Bacteriocinas e outros compostos podem influenciar a sobrevivência de uma bactéria em um nicho ecológico e permiti-las dominar efetivamente ecossistemas de fermentação. Tal característica é um traço positivo para uma cepa probiótica. 0 espectro inibidor de varias cepas de bifidobactérias foi determinado pelo método de Tagg e cols. (Tagg, J.R. e cols. Bacteriol. Rev. 1976; 40, 722-856). Um sobrenadante livre de células foi testado quanto à atividade inibidora contra uma ampla variedade de microrganismos gram-positivos e gram-negativos. Os revestimentos de cada indicador foram preparados sobre placas de ágar e foi permitido que secassem. Pontos (5 ml) de sobrenadante livre de células foram colocados sobre as placas semeadas, permitiu-se a secagem, e as placas foram incubadas de um dia para o outro.

Foi observado que as cepas eram inibidoras para uma ampla variedade de espécies de Staphylococcus, Pseudomonas, Coliform e Bacillus quando testadas no meio de TPY. Zonas de inibição de até 4,4 mm foram anotadas contra Pseudomonas e Staphylococcus e de até 7,00 mm circundando Bacillus sp., como mostrado nas Tabelas 6 e 7. No entanto, quando os referidos testes foram realizados em meio de TPY tamponado, não foram observadas zonas de inibição contra qualquer cepa indicadora. Dessa forma, a inibição parece ser somente causada pela presença de ácido produzido pelas bifidobactérias.

Tabela 6 Inibição de cepas de Staphylococcus por Bifidobacteríum sp. em meio não-tamponado* o Η H £ S 5 3 D 3 bi tn tn q q q OOO CNi^oocoincoo MMM HCNLDLnr^I^CÜ VO VO VO VO VO VO VO · · rninLniriLnLnLnLn pqcqcqvomronmnmm S. aureus MHS 1,5 2 1,5 3,5 1,5 1 2 2 1 2,5 1,5 S. aureus HC 1,5 1,5 2 2,5 2 1,5 2,5 2 1,5 1,5 2 S. aureus 771 1,5 3 1,5 3 2 2 2,5 2 3 2 3,5 S. aureus 949 2 3,5 2,5 2 3 3,5 3 2,5 3,5 3,5 2,5 S. aureus 1018 1 3,5 1,5 1,5 2 3,5 1 3 3,5 2,5 2 S. aureus 1502 1,5 3,5 1 2 2,5 2,5 1,5 3 4 2,5 1,5 S. aureus 1505 3 4 3 2,5 2,5 3 2,5 4,5 5,5 5 5,5 S. aureus 1511 1 3,5 2 1,5 2 2,5 3 3,5 4 2,5 3 S. aureus 1522 1,5 3 2,5 1 2,5 1,5 2,5 2,5 3,5 3,5 3 S. aureus 1499 1,5 3,5 1,5 1,5 2 2 3 2 3,5 3,5 1,5 S. aureus 1963 2 3 2 2,5 3,5 3,5 3,5 3,5 2,5 3 2,5 S. aureus PRMM 1 3,5 1 1,5 1 3,5 2 2 3 2 2,5 S. albus 1 2 1,5 1 2 2,5 2 1,5 2 1,5 1 S. carnosus 1 1,5 2 2,5 2,5 2,5 2 2,5 2 1,5 1 *, valores dados são raios de zonas de inibição em mm (distância da borda da colônia produtora até a borda da zona de inibição).

Tabela 7 Inibição de cepas de Pseudomonas e Bacillus por Bifídobacterium sp. em meio não-tamponado* o rH 0\ rH

5 § E 3 3 3 bi tn bi R q q OOO cN^cNroincot'' MMM Η M LD LTI l> Γ" C0 ω vo U) md v> φ ω • · ΓΟίηίηιηι/ιιχιιηιη fflfflfflvomronmmmro P. fluorescens HC. 1 2,5 1,5 1 1,5 2 3 2 1,5 2 2,5 P. fluorescens MHP 1,5 4,5 3,5 2 2,5 3,5 2,5 2,5 3,5 2 4 P. fluorescens DW 1,5 4 4 3,5 2,5 3,5 2,5 4,5 5,5 3,5 5 B. cereus 3 3 5 3 4 4 3,5 5 6 4,5 5,5 B. subtilis 2 2,5 523636736 B. circulans 1 2 4 1,5 2,5 1,5 2 3,5 4,5 2 4,5 B. thuringensis 2,5 3,5 5 3 3,5 4,5 4 5,5 6,5 4,5 5,5 *, valores dados são raios de zonas de inibição em mm (distância da borda da colônia produtora até a borda da zona de inibição).

Exemplo 5 Teste de alimentação murídea oara investigar a habilidade de Lactobacillus salivarius subespécie Salivarius UCC 118 e Bifidobac teríum loncrum infantis 35624 para aliviar os sintomas de Doença Inflamatória do Intestino (IBP) Fundamentos Inúmeros modelos de camundongos foram gerados recentemente tanto por meios genéticos como por meios imunológicos para estudar os mecanismos de IBD. Um desses modelos envolve a transferência de linfócitos CD4+T derivados de baço ou linfonodos de camundongos normais em camundongos receptores com imunodeficiência combinada severa (SCID). Foi demonstrado que camundongos que receberam células T CD4 + , CD45RBlugh purificadas desenvolveram uma doença debilitante caracterizada por inflamação intestinal crônica que é mais severa no cólon. Nesse estudo, um grupo controle de camundongos SCID foi injetado com CD4+ CD45RBhl9h e os camundongos desenvolveram uma doença debilitante progressiva incluindo uma aparência arqueada, pilo-ereção da pelagem, diarréia, perda de peso e dano macro e microscópico do cólon. Um plano de alimentação foi estabelecido administrando UCC 118 e cepa 35624 (aqui também referida como UCC 35624) para determinar se os sintomas de IBD poderíam ser modificados nesse modelo.

Cepas Bacterianas Lactobacillus salivarius subespécie Salivarius UCC 118 e Bífidobacterium longum infantis UCC 35624 foram isolados da região ileocecal de um adulto humano como descrito no Exemplo 1. Nesse exemplo, foram gerados derivados espontâneos resistentes a rifampicina e estreptomicina das cepas pela colocação em placas de células, previamente crescidas de um dia para o outro e subseqüentemente lavadas em solução de Ringer a um quarto da potência em ágar MRS e TPY contendo 50 μς/ιηΐ de rifampicina (Sigma) respectivamente e MRS contendo 400 μg/ml de estreptomicina (Sigma). As placas foram incubadas por dois dias a 37°C de forma anaeróbica. Os derivados resistentes a antibiótico resultantes foram determinados como sendo de outro modo similares à cepa genitora. Essa característica selecionada permite que a cepa de ser enumeradamente lida seguindo o transito do intestino.

Animais e manutenção Os camundongos doadores (C57BL/6 x BALB/c) F1 foram adquiridos de Simonsen Laboratories (Gilroy,CA) e mantidos no vivário da University of Califórnia - Los Angeles, em prateleiras de gaiolas ventiladas (Thoren caging systems, Hazelton, PA) sob condições específicas livres de patógenos (SPF). Os camundongos SCID CB-17 foram gerados em prateleiras de gaiolas ventiladas originalmente obtidas das instalações centrais de SCID da University of Califórnia -Los Angeles. Os camundongos eram camundongos com flora reduzida (RF) em vez de livres de germes e que atuam como os camundongos receptores (Aranda R. e cols. J. of Immunol. 1997; 158 (7), 3464-3473) .

Camundongos fêmeas CB-17 (SCID), com oito semanas de idade, foram abrigados em pares em gaiolas com o filtro superior em prateleiras ventiladas. Os camundongos foram divididos em quatro grupos; Grupo A: consumiu leite desnatado a 10%, controle; Grupo B: consumiu Lactobacillus salivarius UCC 118; Grupo C: consumiu Lactobacillus salivarius UCC 118 e Bifidobacterium longum UCC 35624 9 (proporção 1:1); Grupo D: consumiu Bifídobacteríum longum UCC 35624. UCC 118 e UCC 35624 que cresceram de um dia para o outro em caldo MRS suplementado com cisteína a 0,05% (Sigma), respectivamente, foram lavados em PBS, ressuspensos em leite desnatado (10% (vol/vol)) e administrados na água de beber de outro modo esterilizada (PBS). Os camundongos em cada grupo respectivo receberam 2,55 x xlO8 cfu/ml de UCC 118 e 2,35 x 108 cfu/ml de UCC 35624 diariamente pela duração do período de alimentação. Os camundongos de controle receberam leite esterilizado diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e foram mantidos sob condições idênticas às do grupo de teste.

Projeto Experimental A todos os camundongos CB-17 foi administrada sua respectiva alimentação de acordo com seu agrupamento por 2 dias antes da injeção com as células CD4+ CD45RBhigh. Os linfócitos doadores classificados (3-4 x 105) foram representados em 200 μΐ ml de PBS estéril e injetado i.p. nos camundongos CB-17 SCID receptores. Todos os camundongos foram inicialmente pesados e, desde então, duas vezes semanalmente. Eles foram observados quanto aos sinais clínicos de doença: aparência arqueada, pilo-ereção da pelagem e diarréia.

Avaliação dos efeitos dos probióticos administrados nos números de bactérias nativas cultiváveis das fezes de camundonqo Foi investigada a influência exercida na microflora do intestino murídeo CB-17 SCID pela administração de UCC 118 e UCC 35624, quando administradas seja de forma isolada ou em combinação entre ambas. Foram coletadas amostras fecais de cada camundongo semanalmente, pesadas e ressuspensas em 10 ml de PBS. As amostras foram então diluídas de forma serial em PBS, e tanto derramadas como espalhadas em placas, em diluições apropriadas, no meio apropriado, em duplicata. Os seguintes grupos bacterianos foram enumerados: lactobacilos; bifidobactérias; enterococos; bacteróides e coliformes. Os meios seletivos usados foram: ágar de Mann Rogosa & Sharpe (MRS) ; ágar MRS suplementado com cloreto de lítio 0,2% (BDH), propionato de soido 0,3% (Fluke chemie), hidrocloreto de cisteína 0,5% (Sigma) e sangue de carneiro 5%; ágar de Slanetz e Bartley; ágar de Wilkins e Chalgren suplementado com suplemento anaeróbico SR 108 e sangue de cavalo 5%; e Ágar de Bile Vermelho Violeta. (Todos Oxõides, a menos que estabelecido de outra forma). Placas de VRBA e Slanetz e Bartley foram incubadas de forma anaeróbica por 24 horas e 45 horas respectivamente. Todas as outras placas foram incubadas de forma anaeróbica por 48 horas a 37ÜC.

Enumeração de flora nativa cultiváveis de segmentos específicos do G.I.T murídeo SCID CB.17 Após o período de alimentação, todos os camundongos foram sacrificados e dissecados. Segmentos da região ileo-cecal, intestino delgado, e intestino grosso foram removidos. Um linfonodo periférico (PLN), um linfonodo mesentérico (MLN) e um pedaço do baço também foram retirados. Todos os tecidos foram pesados antes de serem ressuspensos em 10 ml de PBS. As amostras foram homogeneizadas e diluídas de forma serial em PBS e tanto espalhadas em placas como derramadas em placas, em diluições apropriadas, nos meios apropriados, em duplicata. Os grupos bacterianos foram enumerados da mesma forma que aqueles enumerados na análise fecal, e as amostras foram incubadas como descrito previamente.

Preparação de linfócitos intra-epiteliais e de lâmina própria 0 isolamento dos linfócitos da mucosa foi conduzido de acordo com o método de Aranda, R. e cols. ((1997) supra) . Análise citomêtrica de fluxo de populações de linfócitos. A análise foi conduzida como descrito por Aranda, R. e cols. ((1997) supra).

Preparação de tecido para análise histooatolóaica Foram retiradas amostras de tecido do intestino delgado, intestino grosso, e região ileo-cecal, e fixadas em formalina 10%. O procedimento foi como descrito em Aranda, R. e cols. ((1997) supra).

Foi observado a partir do experimento conduzido que, consistente com resultados prévios, os camundongos SCID reconstituídos com linfócitos T CD4+ CD45RBhlsh e que consumiram somente leite desnatado (controle) desenvolveram uma doença debilitante progressiva, identificada por sua perda de peso significativa. A doença tornou-se aparente em cerca de 2 e meia a três semanas e os camundongos doentes caracteristicamente manifestaram uma aparência arqueada, pilo-ereção da pelagem, e fezes soltas. Um dos camundongos no grupo de controle (camundongo 4) morreu após 25 dias e os camundongos 1, 2, 3 e 5 mostraram uma mudança percentual de peso de -20%, 25%, 21% e -35%, respectivamente, como revelado nas Figs. 3 e 4.

Camundongos CB-17 SCID que consumiram somente UCC 118 deram um resultado similar ao dos controles com a perda de peso característica. O camundongo 3 morreu após 14 dias, e os camundongos 4, 5 e 6 mostraram uma mudança percentual de peso de -15%, -25%, e -28%, respectivamente (dados não mostrados). Verificou-se que os camundongos que consumiram uma combinação de UCC 118 e UCC 35624 tiveram uma melhora marcante em relação aos camundongos de controle. Esses camundongos não perderam tanto peso quanto os camundongos de controle ao longo do período de alimentação. Mesmo após 35 dias, três dos camundongos nesse grupo mostravam pequena perda percentual de peso. (Figs. 5 e 6) . Dois camundongos nesse grupo mostraram perda de peso somente após cerca de 30 dias, enquanto que os camundongos de controle mostraram perda de peso em 14 dias (Figs. 3 e 4).

Os camundongos que consumiram somente UCC 35624 apareceram com boa saúde e novamente a perda de peso quando comparada aos controles foi consideravelmente menor (Figs. 7 e 8). Pode-se concluir, dessa forma, que o consumo de UCC 35624, tanto de forma isolada quanto em combinação com UCC 118, alivia os sintomas de doença inflamatória do intestino. A Tabela 8 é um resumo dos dados experimentais para o estudo sobre o tratamento de colite CD45RB induzida em camundongos CB17 e SCID com um coquetel de UCC 118 e UCC 35624 .

Constatou-se nos estudos que os camundongos foram reconstituídos com sucesso com línfócítos e línfócitos que tinham sido derivados do modelo doador (dados não mostrados).

Tabela 8 Tratamento de colite CD45RB induzida em camundongos CB 17 SCID com um coquetel de Lactobacillus salivarius UCC 118 e Bifidobacteria A: Grau de infiltrado inflamatório; B: Depleção de mucina; C: Hiperplasia do epitélio; D: N° de TEL nas criptas; E: N° de focos inflamatórios por campos de alta potência.

Exemplo 7 Estudos in vitro para examinar a percepção imune de Bifídobacterium loncrum infantis Culturas lavadas crescidas de um dia para o outro de Bifidobactérias foram incubadas com células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) tanto de voluntários saudáveis (n=9) como de pacientes que sofrem de doença inflamatória do intestino (n=5). A produção da citocina pró-inflamatória de fator α de necrose de tumor (TNFa) foi medida por ELISA em sobrenadantes de cultura de setenta e duas horas. A co-incubação de Bifídobacterium longum infantis com PBMCs humanas não resultou na estimulação da produção de TNFa (Figura 9) . Dessa forma, a exposição do sistema imune a essa bactéria não induz reposta inflamatória. A fim de avaliar a percepção imune de Bifídobacterium longum infantis nas superfícies mucosas, foi realizada a co-cultura de células epiteliais e PBMCs em câmaras trans-cavidades. Resumidamente, uma monocamada de célula epitelial cresceu na câmara superior e as PBMCs foram incubadas no compartimento inferior. Essas foram separadas entre si por uma membrana porosa que permitia a passagem de mediadores solúveis entre os dois compartimentos, mas não permitia o contato célula-a-célula. Usando esse modelo, a produção de TNFa e Interleucina-8 (IL-8) foi medida na presença e na ausência de Bifídobacterium longum infantis no compartimento de PBMCs. A co-cultura de células epiteliais, PBMCs e Bifídobacterium longum infantis resultou em supressão significativa da produção de TNFa e IL-8 (Figura 10) . Assim, uma trama tri-celular envolvendo células epiteliais, PBMCs e Bifidobacterium longum infantis resulta na supressão da produção de citocina pró-inflamatória.

Exemplo 8 Atividade antiinflamatória in vivo de Bifidobacterium longum infantis Bifidobacterium longum infantis (lxlO9 células por dia) foi consumida por 18 humanos saudáveis em um produto de leite fermentado (iogurte) por três semanas. 0 soro foi coletado para análise de citocina antes e após o consumo dessa cepa probiótica. Foram obtidas amostras fecais para análise microbiológica.

Foram observadas modificações consideráveis nos níveis sangüíneos de citocinas nesse estudo de alimentação. Os níveis séricos de Interleucina-6 (sIL-6R, p=0,007), Interferon-γ (IFNy, p=0,041) e IL-8 (p=0,004) foram significativamente reduzidos seguindo o consumo dessa cepa probiótica (Figura 11). Não foi observada nenhuma alteração nos níveis séricos de TNFa e de antagonista de receptor de Interleucina-l (IL-1RA) (Figura 12). Bifidobacterium longum infantis foi detectada em aproximadamente lxlO5 unidades formadoras de colônia por grama de material fecal ao longo do curso desse estudo de alimentação.

Os critérios-alvo de seleção in vitro que refletem as interações complexas do ambiente GI permitem a identificação de cepas probióticas capazes de funcionar efetivamente quando reintroduzidas naquele ambiente. Usando-se os critérios de seleção acima delineados, a bactéria probiótica Bifídobacterium longum infantis tem propriedades imunomoduladoras in vitro demonstráveis. Seguindo o consumo por camundongos SCID e voluntários humanos, foi observada uma modificação significativa dos parâmetros sistêmicos imunes. Dessa forma, é garantido o uso de Bifídobacterium longum infantis como um agente bioterapêutico no tratamento de doenças de mediação imune.

Exemplo 9 Medida de TNFa em sobrenadante livre de células de Bifídobacterium longum infantis UCC 35624 Culturas de um dia para o outro de Bifídobacterium longum infantis foram centrifugadas e o sobrenadante livre de células foi examinado quanto a. presença de inibidores de citocina. Os sobrenadantes livres de células foram incubados com TNFa humano por 20 minutos a 37°C. Depois disso os níveis de TNFa foram quantificados por ELISA. Seguindo a exposição ao sobrenadante de Bifidobactéria, os níveis de TNFa foram reduzidos significativamente (Figura 13). Dessa forma, Bifídobacterium longum infantis UCC35624 secreta um fator que antagoniza a atividade de TNFa. A produção desse fator por Bifídobacterium longum infantis na superfície do trato gastrintestinal, in vivo iria restringir significativamente a resposta inflamatória dc hospedeiro.

Isso indica que o antagonismo de TNFa também ocorre a nível molecular devido ao fator solúvel liberado por UCC35624.

Inflamação Inflamação é o termo usado para descrever o acúmulo local de fluido, proteínas plasmáticas e células sangüíneas brancas no local que tem dano físico sustentado, infecção ou onde há uma resposta imune em andamento. 0 controle da resposta inflamatória é exercido em diversos níveis (para revisão veja Henderson B. e Wilson M., 1998. Em "Bacteria-Cytokine interactions in health and disease". Portland Press, 79-130). Os fatores de controle incluem citocinas, hormônios (por exemplo, hidrocortisona), prostaglandinas, intermediários reativos e leucotrienos. Citocinas são proteínas biologicamente ativas de baixo peso molecular que estão envolvidas na geração e controle de respostas imunológicas e inflamatórias, embora também regulem o desenvolvimento, reparação de tecido e hematopoiese. Elas fornecem meios de comunicação entre os próprios leucotrienos e também com outros tipos de células. A maioria das citocinas são pleiotrópicas e expressam múltiplas atividades biologicamente sobrepostas. Cascatas e redes de citocinas controlam a resposta inflamatória em vez da ação de uma citocina em particular em um tipo de célula em particular (Arai Kl, e cols., Annu Rev Biochem 1990;59:783-836). A diminuição da resposta inflamatória resulta em concentrações menores dos sinais ativadores apropriados e de outros mediadores inflamatórios levando à cessação da resposta inflamatória. TNFa é uma citocina pró-inflamatória essencial uma vez que ela inicia uma cascata de citocinas e de efeitos biológicos que resultam no estado inflamatório. Dessa forma, agentes que inibem TNFa estão sendo atualmente usados para o tratamento de doenças inflamatórias, por exemplo, infliximab.

Acredita-se que citocinas pró-inflamatórias desempenhem um papel importante na patogênese de muitas doenças inflamatórias, incluindo doença inflamatória do intestino (IBD). Terapias atuais para o tratamento de IBD são dirigidas à redução dos níveis dessas citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-8 e TNFa. Foi sugerido que tais terapias também podem desempenhar um papel significativo no tratamento de doenças inflamatórias sistêmicas, tal como artrite reumatóide. Humanos alimentados com iogurte contendo Bifidobacterium longum infantis UCC35624 mostraram diminuição marcante em seus níveis sistêmicos de IL-8. Essa cepa pode, desse modo, ter aplicação potencial no tratamento de uma variedade de doenças inflamatórias, particularmente se usadas em combinação com terapias antiinflamatórias atuais, tais como drogas antiinflamatórias não-esteróides (NSAIDs) ou Infliximab. Doença Diarréica A função de barreira do epitélio intestinal pode ser diminuída durante secreção por mediação nervosa (acetilcolina) e imune (histamina). Certas toxinas bacterianas também podem induzir a secreção dependente de Ca2+ e PKC e dessa forma podem perturbar a barreira epitelial (Ganguly NK e Kaur T. Indian J Med Res 1996,-104:28-37, Groot JA. Vet Q 1998,-20 (S3) :45-9) . Vários estudos examinaram a prevenção e tratamento de diarréia usando-se bactérias probióticas. Estudos prospectivos demonstraram a eficácia da administração de bactérias de ácido láctico para uso tanto profilático como terapêutico contra diarréia em bebês prematuros, recém nascidos, crianças (Isolauri E, e cols., Dig Dis Sei 1994 Dez;39(12):2595-600) e no tratamento de diarréia relacionada a antibiótico (Siitonen S, e cols., Ann Med 1990 Fev,-22(1) :57-9) e diarréia do viajante (Oksanen PJ, e cols., Ann Med 1990 Fev;22(1):53-6).

Examinamos o consumo de Bifidobacterium longum infantis UCC35624 por camundongos SCID. Verificou-se que a atividade inflamatória foi significativamente atenuada e os camundongos que consumiram Bifidobacterium longum infantis UCC35624 retiveram fezes sólidas, enquanto que os camundongos de controle sofreram de diarréia. As Figs. 14 e 15 ilustram o intestino inferior de camundongos SCID tratados e não tratados. O intestino inferior mostrado inclui o ceco 2, intestino 3 e ânus 5. Na Fig. 14 os camundongos foram tratados com Bifidobacterium longum infantis UCC35624 e é aparente que as fezes sólidas 4 foram retidas no intestinos. Em comparação a Fig. 15 mostra o intestino 3 do camundongo não tratado, caracteristicamente inflamado. Não ocorreu qualquer absorção de água de modo que não foram retidas fezes sólidas resultando em diarréia. O efeito antidiarréico observado pode estar relacionado à atividade antiinflamatória mediada via modulação de cAMP. A' secreção de Cl dependente de AMP cíclico é o caminho secretor principal no intestino humano (Brzuszczak IM, e cols., J. Gastoenterol. Hepatol. 1996,-11 (9):804-10). Pode-se deduzir que o efeito antidiarréico de Bifidobacterium longum infantis UCC35624 não se restringe à diarréia resultante de inflamação gastrintestinal, mas pode ser aplicado ao tratamento geral da doença diarréica.

Doença auto-imune O sistema imune tem um grande repertório de especificidades expressas por células B e T. Algumas dessas especificidades serão direcionadas a autocomponentes. 0 auto-reconhecimento normalmente é controlado por deleção e inativação clonal de linfócitos auto-reativos. No entanto, há um pano de fundo constante de auto-imunidade com anticorpos para muitas proteínas sendo formados no soro. Uma quebra no sistema de reconhecimento próprio/não-próprio resulta em auto-imunidade. Quando a doença auto-ímune ocorre, a resposta imune danifica o tecido que sustenta o antígeno ofensivo. 0 depósito de complexo imune, e as reações de hipersensibilidade do tipo II e mediadas por célula são os mecanismos mais importantes pelos quais ocorre o dano imunopatológico. Exemplos de doenças auto-imunes incluem, mas não se limitam a, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, diabetes melito insulino-dependente, miastenia gravis e anemia perniciosa. Bífidobacterium longum infantis e Lactobacillus salivaríus subsp. salívarius são bactérias imunomoduladoras. Dessa forma, o consumo tanto como componentes únicos como em combinação dessas bactérias por pacientes que sofrem de doença auto-imune pode restringir o dano do órgão e auxiliar a restaurar a homeostase normal do corpo. Inflamação e Câncer A produção de citocinas multifuncionais através de um amplo espectro de tipos de tumor sugere que respostas inflamatórias significativas estão em andamento em pacientes com câncer. É incerto atualmente que efeito protetor tem essa resposta contra o crescimento e desenvolvimento de células tumorais in vivo. No entanto, essas respostas inflamatórias poderíam afetar de forma adversa o hospedeiro que abriga o tumor. Interações complexas de citocinas estão envolvidas na regulação da produção de citocina e na proliferação celular dentro do tumor e de tecidos normais (McGee DW, e cols., Immunology 1995 Set;86 (1):6-11, Wu S, e cols., Gynecol Oncol 1994 Abr;53(1):59-63. Há muito foi reconhecido que a perda de peso (caquexia) á a causa única mais comum de morte em pacientes com câncer (Inagaki, J, e cols., Câncer 1974 Fev;33(2):568-73) e a desnutrição inicial indica um prognóstico pobre (Van Eys J. Nutr Rev 1982 Dez;40(12):353-9). Para que um tumor cresça e se espalhe, ele deve induzir a formação de novos vasos sangüíneos e degradar a matriz extracelular. A resposta inflamatória pode ter papéis significativos para desempenhar nos mecanismos acima, contribuindo dessa forma para o declínio do hospedeiro e para a progressão do tumor. Devido à natureza antiinflamatória dessas cepas bacterianas, elas podem reduzir a taxa de transformação celular maligna. Além disso, bactérias intestinais podem produzir, a partir de compostos dietéticos, substâncias com atividade genotóxica, carcinogênica e promotora de tumor e as bactérias do intestino podem ativar pró-carcinógenos para agentes reativos ao DNA (Rowland I.R. (1995). Toxicology of the colon: role of the intestinal microflora. Em: Gibson G.R. (ed). Human colonic bactéria: role in nutrition, physiology and pathology, pp 155-174. Boca Raton CRC Press). Em geral, espécies de Bifidobacteria e Lactobacillus têm baixa atividade de enzimas metabolizadoras xenobióticas comparadas â outras populações dentro do intestino, tais como bacteróides, eubactérias e clostridia (Saito, Y., e cols., Microb. Ecol. Health Dis., 1992;5, 105-110). Dessa forma, o número crescente de bactérias de ácido láctico no intestino podería modificar beneficamente os níveis dessas enzimas.

Prebióticos A introdução de organismos probióticos é obtida pela ingestão do microrganismo em um transportador adequado. Seria vantajoso fornecer um meio que promovesse o crescimento dessas cepas probióticas no intestino grosso. A adição de um ou mais oligossacarídeos, polissacarídeos, ou outros prebióticos potencializa o crescimento de bactérias de ácido láctico no trato gastrintestinal (Gibson, GR. Br. J. Nutr. 1998,-80 (4) :S209-12} . Prebióticos refere-se a qualquer componente alimentar não-viável que seja fermentado especificamente no cólon por bactérias nativas que têm supostamente valor positivo, por exemplo, bifidobactérias, lactobacilos. Tipos de prebióticos podem incluir aqueles que contêm frutose, xilose, soja, galactose, glicose e manose. A administração combinada de uma cepa probiótica com um ou mais compostos prebióticos pode intensificar o crescimento in vivo do probiótico administrado resultando em um benefício à saúde mais pronunciado, e é chamado simbiótico.

Outros ingredientes ativos Será observado que a Bifidobacterium pode ser administrada profilaticamente ou como um método de tratamento tanto isoladamente como com outros materiais probióticos e/ou prebióticos como descrito acima. Adicionalmente, as bactérias podem ser usadas como parte de um regime profilático ou de tratamento usando-se outros materiais ativos tais como aqueles usados para o tratamento de inflamação ou outros distúrbios, especialmente aqueles do trato gastrintestinal. Tais combinações podem ser administradas em uma formulação única ou como formulações separadas, administradas ao mesmo tempo ou em tempos diferentes, usando-se a mesma via ou vias diferentes de administração. A invenção não se limita às modalidades aqui descritas, as quais podem variar em detalhe.

Claims (3)

1. Formulação caracterizada pelo fato de compreender: uma cepa de Bifidobacterímn longum infantis ÜCC35624 {PCIMB 41003); um transportador passível de ingestão selecionado a partir do grupo compreendendo um transportador farmaceutícamente aceitável, tal como uma cápsula, comprimido, ou pó, ou um transportador passível de ingestão de produto alimentar, tal como leite acidifícado, iogurte, iogurte congelado, pô de leite, concentrado de leite, pastas de queijo, molhos ou bebidas.

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da cepa estar presente em mais do que 10* cfu por grama do sistema de liberação.

3. Uso da formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada por ser em gêneros alimentícios.