EA043487B1 - Штамм bifidobacterium bifidum 8, используемый в качестве пробиотика - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, фармацевтической и пищевой промышленности и представляет собой штамм бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, который может быть использован в лекарственных средствах, функциональных и специализированных пищевых продуктах, в том числе, биологически активных добавках к пище.

Уровень техники.

Бифидобактерий являются основными представителями индигенной микрофлоры человека. Описаны следующие основные функции бифидобактерий в организме человека: бифидобактерий образуют основу микрофлоры, в результате высокой адгезивности к слизистой оболочке кишечника и определяют основные ниши сосуществования для других микроорганизмов, стабилизируют биопленку кишечника; укрепляют эпителиальный барьер кишечника, необходимы для созревания эпителиоцитов; белок клеток бифидобактерий содержит все незаменимые аминокислоты, включая триптофан (Терешкова Е.А. и др., 2020; Иванова Е.В., 2018).

Вид Bifidobacterium bifidum согласно современным исследованиям преобладает в кишечном микробиоценозе и необходим для нормального функционирования организма человека (Иванова Е.В., 2018; Turroni F. et al., 2019). Вид Bifidobacterium bifidum является доминирующим видом у лиц с нормальным составом микрофлоры и с начальными степенями дисбиоза 1-2 степени. При глубоких нарушениях в микросимбиоценозе (3 степень дисбиоза) выявляемость вида Bifidobacterium bifidum снижается (Иванова Е.В., 2018).

В литературе имеется много данных, свидетельствующих о том, что Bifidobacterium bifidum может взаимодействовать с человеком и с микроорганизмами микрофлоры кишечника с помощью различных механизмов, в частности, активировать иммунитет человека, адгезировать на слизистую оболочку кишечника и метаболизировать гликаны, такие как муцин (Turroni F. et al., 2019). Примечательно, что вид Bifidobacterium bifidum является единственным представителем среди всех признанных видов бифидобактерий, способным к росту посредством метаболизма муцина (Ruas-Madiedo P. et al., 2008, Turroni F. et al., 2011). Причем метаболизм муцина, осуществляемый Bifidobacterium bifidum, может активировать выработку муцина, тем самым увеличивая глубину слоя слизи, обволакивающей слизистую оболочку, и, таким образом, усиливая функцию эпителиального барьера (Rokhsefat S. et al., 2016). Данные свойства позволяют отнести представителей данного вида бифидобактерий к пробиотическим микроорганизмам.

Штамм Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium bifidum 791 в составе отечественных препаратовпробиотиков применяется в широком масштабе во всех возрастных группах с 1972 года по настоящее время (Терешкова Е.А. и др., 2020).

В современной концепции функционального питания существенным весом обладают пребиотики и синбиотики. Согласно общепринятому в научной литературе определению, пребиотики - это пищевые ингредиенты, сочетающие следующие признаки: 1) устойчивые к желудочному соку, гидролизу пищеварительными ферментами человека, и не всасывающиеся в тонком кишечнике, 2) ферментируемые кишечной микрофлорой 3) избирательно стимулируют рост и/или активность одной или ограниченного числа групп бактерий микробиоты кишечника, которые положительно влияют на здоровье хозяина. Смесь синергетически взаимодействующих пробиотиков и пребиотиков, в которой они взаимно усиливают эффективность друг друга, называют синбиотиками (Gibson G.R., Roberfroid M.B., 1995). Также пребиотики часто связывают с так называемым бифидогенным эффектом (Roberfroid M. et al., 2010).

Известен штамм Bifidobacterium bifidum 792 (патент RU 2215028), который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, активно размножающийся в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования с высокой концентрацией бифидобактерий. Обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры. Это позволяет получить кисломолочные, ферментированные и неферментированные пищевые продукты, закваски, гигиенические и косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, обеспечивающие нормализацию микробиоценозов организма человека. Известны штаммы Bifidobacterium bifidum 79-32 (патент RU 2314340) и Bifidobacterium bifidum B-UH ВКПМ Ac-1875 (патент RU 2453592), выделенные из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста, которые, кроме указанных выше свойств, заквашивают, либо сквашивают молоко.

Однако, для указанных штаммов не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам, что осложняет возможность их применения в качестве активного компонента лекарственных препаратов в комплексной терапии ряда заболеваний. Также, для всех указанных штаммов видовая принадлежность не подтверждена современными молекулярно-генетическими методами, что для выделенных из природных источников микроорганизмов в настоящее время является обязательным (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5).

Известен штамм Bifidobacterium bifidum 791/БАГ (патент RU 2165454), полученный селекцией штамма Bifidobacterium bifidum 791. Штамм более устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта человека, обеспечивает утилизацию более широкого спектра аминокислот, т. е. обладает более высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение препаратов и продуктов на его основе с более длительными

- 1 043487 сроками хранения и более высокими лечебно-профилактическими свойствами. Однако, для указанного штамма также не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам, что осложняет возможность его применения как активного компонента лекарственных препаратов в комплексной терапии ряда заболеваний.

Известен штамм Bifidobacterium bifidum OV-19 (патент RU 2375444), выделенный из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, который, кроме указанных выше свойств, устойчив к широкому спектру антибиотиков, а также сквашивает молоко с образованием ровного сгустка.

Недостатком всех указанных выше штаммов является то, что ни на уровне генотипа, ни на уровне фенотипа не определено отношение к муцину и желчным солям, что, как указывалось выше, является важными особенностями, влияющими на эффективность штамма, как пробиотика.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм Bifidobacterium IATA-ES2 WO2010007198A1, выделенный из фекалий здорового ребенка на грудном вскармливании и идентифицированный секвенированием 16S рРНК как представитель вида Bifidobacterium bifidum. Штамм предложено применять с целью улучшения защитных функций и снижения риска заболеваний. Показаны следующие механизмы его действия: 1) регуляция гликозилирования кишечника, благоприятствующую таковому у здоровых людей, 2) модуляция взаимодействия между эпителиальными клетками и микробиотой кишечника, способствующую адгезии полезных бифидобактерий, и 3) регуляцию иммунологического ответа. Однако, для указанного штамма не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам.

Для всех указанных выше штаммов не приведена оценка способности ферментировать селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, что ограничивает возможность их применения в синбиотических функциональных и специализированных продуктах питания. Данная особенность, как указывалось выше, является основным критерием для разработки на основании штамма синбиотических продуктов. Изучение эффективности in vivo либо не проводилось, либо проводилось на животных моделях, т.е. полученные результаты не могут в полной мере быть перенесены на человека.

Раскрытие сущности изобретения.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов, с подтвержденной молекулярно-генетическими методами исследования принадлежностью к виду Bifidobacterium bifidum, охарактеризованного по показателям необходимым для включения в состав пробиотических лекарственных средств, функциональных и специализированных пищевых продуктов, в том числе, биологически активных добавок к пище.

При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм является антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, сбраживает молоко с образованием сгустка, отличается активным ростом и образованием органических кислот в средах, содержащих селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, что обусловливает усиление антагонизма против условно-патогенных микроорганизмов. Штамм устойчив к антимикробным веществам канамицину, гентамицину, амикацину. В результате полногеномного исследования показано, что штамм характеризуется наличием генов, кодирующих пептиды, которые отвечают за адгезию к муцину и слизистой кишечника, а также генов, кодирующих ферменты, осуществляющие гидролиз муцина. В результате полногеномного исследования показано, что штамм характеризуется наличием генов, отвечающих за гидролиз желчных солей, что указывает на устойчивость к желчи и участие в регулировании трансформации указанной группы веществ в цикле печень-кишечник-печень, способствуя пищеварению. Применение ферментированных продуктов и бактерийных препаратов на основе заявляемого штамма приводит к исчезновению клинических проявлений дисбактериоза (дисбиоза) кишечника, боли в желудке, улучшению функции иммунной системы, улучшению общего состояния, повышению работоспособности.

Осуществление изобретения

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Bifidobacterium bifidum 8, который выделен из содержимого кишечника здорового человека, идентифицирован по 16S рРНК, и депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ Курчатовский институт - ГосНИИгенетика, коллекционный номер AC-2136.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Полноразмерная последовательность гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК, SEQ ID NO 1 на 100% гомологична типовому штамму вида Bifidobacterium bifidum DSM 20456 (ATCC 29521).

Культурально-морфологические свойства

Облигатный анаэроб, оптимальная температура роста 36-38°C.

Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие прямые или слегка изогнутые палочки с утолщением или бифуркацией на одном или обоих концах. Располагаются по одной, чаще по 2 или скоплениями. Характерной особенностью является расположение парных клеток под углом 90° друг к другу на поздних фазах роста.

При культивировании в среде Блаурокка в модификации Г. И. Гончаровой при температуре 37-38°C

- 2 043487 в течение 36-48 ч образует колонии белого цвета в виде слаборасширяющихся конусов длиной до 10 мм.

При культивировании на поверхности агаризованной (плотной) среды Bifidobacterium Broth фирмы Himedia в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer, температура 37-38°C, продолжительность 72 ч) образует плоские сероватые колонии R-формы, диаметром до 5 мм.

Физиолого-биохимические свойства штамма

Штамм желатин не разжижает, каталазу не продуцирует, молоко сквашивает с образованием сгустка. Утилизирует глюкозу без образования газа, с образованием молочной и уксусной кислот, снижая pH среды до 3,8 - 4,2. Утилизирует сахарозу, лактозу, маннозу, целлобиозу. Не утилизирует: арабинозу, ксилозу, инулин (высокой степени очистки), салицин, сорбит.

Штамм устойчив к канамицину, гентамицину, амикацину. Штамм чувствителен к азитромицину, амоксицилину, кларитромицину, доксициклину, тетрациклину, цефтриаксону, ванкомицину, цефепиму, линкомицину, имипенему. В отношении, левофлоксацина, метронидазола, триметоприма, ципрофлоксацина, офлоксацина является промежуточным с учетом концентрации, минимально подавляющей рост (см. примеры).

Штамм является активным антагонистом патогенных микроорганизмов. В присутствии пребиотиков фрутоолигосахаридов (ФОС), либо лактулозы в качестве единственного углевода в питательной среде отличается наибольшей степенью подавления микробных контаминантов пищи и возбудителей инфекционных заболеваний на примере тестовых штаммов Bacillus cereus и Staphylococcus aureus.

Установлена безвредность штамма на белых беспородных мышах массой 14-16 г. Суспензию лиофилизированного штамма вводили из расчета примерно 1х10⁹ КОЕ. В течение 5 суток все мыши остались живы и не потеряли в весе.

Штамм хранится в лиофлизированном виде в сахарозо-желатиновой среде высушивания не менее 5 лет в герметично укупоренных флаконах без потери указанных свойств.

Пример 1.

Для подтверждения антагонистической активности штамма суспензию лиофилизата, восстановленного в физиологическом растворе, высевали на чашки Петри со средой MPC-5 штрихом по диаметру. Инкубировали культуру в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer) при 37°C в течение 48 часов. После этого перпендикулярно зоне роста штамма, но не касаясь ее, высевали тестовые штаммы, используя для каждого отдельную чашку. Через 20 часов определяли зону отсутствия роста (табл. 1). Штамм Bifidobacterium bifidum 8 показал высокую антагонистическую активность в отношении тест-штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Таблица 1

Антагонистическая активность штамма Bifidobacterium bifidum 8

Тест-штамм	Зона отсутствия роста, мм
Staphylococcus aureus 209	20±2
Escherichia coli 157	27±1
Shigella flexneri 170	21±1
Shigella sonnei 5063	31±1
Proteus vulgaris 177	28±2
Proteus mirabilis H-237	30±3

Пример 2.

Лиофилизированную культуру штамма Bifidobacterium bifidum 8 ресуспендировали в физиологическом растворе и инокулировали предварительно подвергнутую пастеризации 10% суспензию обрата молока из расчета примерно 2х10⁶ КОЕ/мл. Инкубацию проводили при 37°C в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 2. Штамм Bifidobacterium bifidum 8 сквашивает молоко с образованием сгустка.

Таблица 2

Показатели сквашивания молока штаммом Bifidobacterium bifidum 8

Время инкубации	КОЕ/мл	pH	Титруемая кислотность, °Т	Сгусток
12 ч	lx 107	5,8	46	Отсутствует
24 ч	8х107	4,2	92	Со сгустком

Пример 3.

Подтверждение активного роста штамма Bifidobacterium bifidum 8 и образованием органических кислот в средах, содержащих селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты пребиотики, а также их синергетического эффекта против условно-патогенных микроорганизмов проводили по описанному ранее методу (Karetkin B.A. et al., 2019). Представители вида B. cereus являются контаминатами пищевых продуктов и возбудителями кишечных инфекций. В качестве тестового исполь- 3 043487 зовали штамм B. cereus ATCC 9634. Ферментацию смешанной культуры бифидобактерий и тест-штамма проводили при температуре 37°C в анаэробных условиях (2% углекислого газа, 98% азота) при постоянном перемешивании в жидкой среде, содержащей в качестве единственного углевода 1% одного из известных коммерческих пребиотиков: фруктоолигосахариды (ФОС, Orafti ® P95, BENEO ORAFTI, Бельгия), изомальтулоза (Palatinose™, BENEO Palatinit GmbH, Германия), лактулоза сухая Лактусан (ООО Фелицата Холдинг, РФ) и D-раффиноза (ООО ДиаМ, РФ). В начальный момент эксперимента и после 9 ч роста оценивали численность обоих микроорганизмов высевом на селективные среды. Определение кислот проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Agilent 1220 с рефрактометрическим детектором и колонкой Hi-Plex H (4.6x250 мм). Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum 8 характеризуется активным ростом и наибольшим подавлением тест-штамм в синбиотической композиции с ФОС и лактулозой (табл. 3).

Таблица 3

Влияние коммерческих пребиотиков на активность штамма Bifidobacterium bifidum 8 против B. cereus ATCC 9634

Субстрат	Кон. численность В. bifidum 8, log(KOE/мл)	Кон. pH	Продукция кислот, мМ	В. cereus ATCC 9634
Мол.	Укс.	Кон. числ., logfKOE/мл)	Изменение числен. Х9-Х0, КОЕ/мл
ФОС	9,5	5,30	7,8	15,2	5,9	Минус 1,6x106
Раффиноза	9,4	5,90	5,0	5,8	6,7	4,1х106
Изомальтулоза	9,1	6,01	6,6	4,0	7,0	8,7x106
Лактулоза	9,5	4,63	11,4	31,2	4,8	Минус 3,2x106

Staphylococcus aureus считается одной из основных причин энтероколита и диареи у пациентов, прошедших курс лечения антибиотиками в госпитальных условиях (Lo T.S., Borchardt S.M., 2009). Исследования проводили по аналогичной методике. Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum 8 характеризуется активным ростом и наибольшим подавлением тест-штамм S. aureus ATCC 43300 в синбиотической композиции с ФОС и лактулозой (табл. 4).

Таблица 4

Влияние коммерческих пребиотиков на активность штамма Bifidobacterium bifidum 8 против S. aureus ATCC 43300

Субстрат	Кон. численность В. bifidum 8, log (КОЕ/мл)	Продукция кислот, мМ	S. aureus ATCC 43300
Молочная	Уксусная	Кон. численность, 1од(КОЕ/мл)	Изменение численности Хю-Хо, КОЕ/мл
ФОС	9,7	6,7	13,7	7,7	3,5х107
Раффиноза	9,1	6,7	5,8	8,1	1,3χ108
Изомальтулоза	9,4	6,9	17,5	8,1	Ι,ΙχΙΟ8
Лактулоза	9,8	18,7	45,8	7,6	2,9χ107

Пример 4.

Определяли чувствительность заявляемого штамма к антимикробным веществам дискодиффузионным методом и методом серийных разведений в жидкой питательной среде по МУК 4.2.1890-04.

Суточную культуру штамма, полученную инкубированием в среде Блаурокка при температуре 37°C, стандартизовали стерильным забуференным физиологическим раствором до OD₅₆₀=2,1 и высевали по 0,1 мл полученной суспензии на чашки со средой Bifidobacterium Broth фирмы Himedia. На поверхность среды помещали диски с антибиотиками (см. табл. 5). Инкубацию проводили в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer) при температуре 37°C в течение 3 суток, после чего определяли диаметр зоны угнетения роста (табл. 5).

- 4 043487

Таблица 5

Исследования чувствительности штамма Bifidobacterium bifidum 8 к антимикробным веществам диско-диффузионным методом

Антимикробное вещество, доза на диске	Диаметр зоны задержки роста, мм	Чувствительность
Амоксициллин 20 мкг	36	Ч
Цефтриаксон 30	24	Ч
Цефепим 30 мкг	28	ч
Имипенем 10 мкг	28	ч
Доксициклин 30 мкг	26	ч
Кларитромицин 30 мкг	34	ч
Линкомицин 15 мкг	30	ч
Ванкомицин 30 мкг	16	ч
Ципрофлоксацин 5 мкг	8	п
Офлоксацин 5 мкг	10	п
Амикацин 30 мкг	0	У

Для метода серийных разведений использовали жидкую питательную среду MRS с цистеином и аскорбиновой кислотой и антимикробные вещества (см. табл. 6) для биохимических исследований. Лекарственные препараты на основе данных веществ наиболее часто применяются в современной терапии. Для каждого вещества готовили серию последовательных двукратных разведений в стерильной среде от 512 до 0,125 мкг/мл. Инокулировали 10% суточной культурой штамма, предварительно стандартизованной по OD₅₆₀=1,5. Через 10 ч инкубирования при температуре 37°C в анаэробных условиях (2% углекислого газа, 98% азота) и при постоянном перемешивании измеряли мутность суспензии, кривые зависимости данной величины от концентрации антимикробного вещества носили сигмоидальный характер. Из зависимостей определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) и минимальную концентрация антимикробного вещества, при которой начинается наблюдаемое подавление роста (табл. 6). Определение данной величины связано со следующими соображениями. Для достижения лечебного действия необходимо попадание в кишечник человека или животного определенного количества живых клеток бифидобактерий, что может быть обеспечено только при минимальном воздействии антибактериальных веществ. Поэтому устойчивость определяли с учетом указанной величины, а не только с учетом МПК, как это принято для патогенных микроорганизмов, когда выживание доже небольшого количества клеток может привести к заболеванию.

- 5 043487

Таблица 6

Исследование чувствительности штамма к антимикробным веществам методом серийных разведений в жидкой питательной среде

Антимикробное вещество	Минимальная концентрация начала наблюдаемого подавления роста, мкг/мл	МПК, мкг/мл	Чувствительность
Амоксицилин	0,125	0,125	Ч
Цефтриаксон	0,125	1	Ч
Тетрациклин	0,125	2	ч
Доксициклин	0,25	2	ч
Азитромицин	0,125	0,125	ч
Кларитромицин	0,125	0,125	ч
Ципрофлоксацин	2	16	п
Левофлоксацин	0,125	32	п
Метронидазол	0,5	16	п
Нифуроксазид	4	32	п
Триметоприм	4	128	п
Канамицин	64	более 512	У
Г ентамицин	16	128	У

Штамм устойчив (У) к канамицину, гентамицину, амикацину. Чувствителен (Ч) к амоксицилину, цефтриаксону, цефепиму, имипенему, тетрациклину, доксициклину, азитромицину, кларитромицину, линкомицину, ванкомицину. В отношении офлоксацина, ципрофлоксацина, левофлоксацина, метронидазола, нифуроксазида, триметоприма является промежуточным (П) с учетом минимальной концентрации начала наблюдаемого подавления роста.

Результаты полногеномного исследования показали отсутствие генов с маркерами устойчивости к тетрациклину tet(W) (SEQ ID NO: 2) и trp-tet(W) (SEQ ID NO: 3), что также подтверждено фенотипически.

Пример 5.

Молекулярно-биологические признаки штамма определяли на основании полногеномного исследования.

Анализ полученного генома показал, что штамм Bifidobacterium bifidum 8 не содержит плазмид.

Анализ полученного генома показал наличие генов, кодирующих пептиды клеточной стенки, отвечающие за специфическую адгезию. Коллаген связывающий протеин участвует в адгезии к эпителию. Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 4) с пептидом фимбринального пили Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: BBA48285.1) составляет 99%.

Протеин, кодируемый геном OppA, отвечает за связывание с клетками эпителия кишечника Caco-2 (Guglielmetti S. ety al., 2008). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 5) с олигопептид связывающим протеином OppA Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: KLN80891.1) составляет 100%.

Образование трансальдолазы значительно увеличивает степень связывания клеток бактерий - представителей кишечной микробиоты с муцином (Gonzalez-Rodriguez I. et al., 2012). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 6) с трансальдолазой Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP003813255.1) составляет 100%.

Эндо альфа-N-ацетилгалактозаминидаза участвует в гидролитическом разложении муцина (отщеплении от пептидной цепи углеводных остатков). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 7) с эндо альфа-N-ацетилгалактозаминидазой Bifidobacterium bifidum ATCC 29521 (NCBI GenBank SEQ ID NO: BAQ97477.1) составляет 99%.

Одним из основных механизмов, обуславливающих устойчивость бактерий кишечника к солям желчи, секретируемым печенью, является их расщепление ферментами (Ruiz L. et al., 2013). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 8) с гидролазой солей желчи Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: AAR39435.1) составляет 99%.

Фосфопируват гидролаза также участвует в расщеплении желчных солей. Г омологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 9) с фосфопируват гидролазой Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP_003812660.1) составляет 100%.

Пример 6.

Использование штамма Bifidobacterium bifidum 8 в лекарственных средствах.

- 6 043487

На основе штамма Bifidobacterium bifidum 8 получали лиофилизированную биомассу бифидобактерий. Из чистой культуры путем проведения 2-3 пассажей получали маточную культуру (инокулят) в среде Блаурокка по одному из известных способов. Инкубирование проводили при 37°C. Далее проводили культивирование с поддержанием pH в интервале 5,5-7,0. Полученную культуру, содержащую не менее 2х10⁹ КОЕ/мл, отделяли от среды культивирования с применением центрифугирования, сепарирования, либо других способов, применяемых для суспензий бактериальных клеток. К полученному концентрату добавляли сахарозо-желатиновую среду высушивания, замораживали во флаконах или на поддонах для сушки из пищевой легированной стали до температуры не выше минус 40-45°C и подвергали лиофильному высушиванию. Остаточная влажность составляла не более 5%. Полученную лиофилизированную биомассу, содержащую не менее 5х10¹⁰ КОЕ/г, используют в качестве активного компонента лекарственных средств, стандартизуя наполнителем из расчета разовой дозы (5-10)х10⁸ КОЕ.

Пример 7.

Использование штамма Bifidobacterium bifidum 8 в функциональных и специализированных пищевых продуктах, в том числе, биологически активных добавках к пище.

Полученную аналогично описанному в примере 6 методу лиофилизированную биомассу применяют в качестве основного ингредиента пробиотических биологически активных добавок к пище в различных товарных формах (порошки, капсулы и т.п.) из расчета 1 х 10⁸ - 1х10⁹ КОЕ в разовой дозе. Лиофилизированную биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 8 вносят в жидкие ферментированные продукты для заквашивания и сквашивания, либо для обогащения в ферментированные или не ферментированные продукты из расчета 106-10⁷ КОЕ в 1 г готового продукта. Благодаря этому получаемые продукты могут быть отнесены к функциональным продуктам питания.

Пример 8.

Полученную, как описано в примере 6, суспензию клеток штамма Bifidobacterium bifidum 8 в среде высушивания дозировали в пенициллиновые флаконы из расчета разовой дозы (5-10)х10⁸ КОЕ и лиофилизировали. Применение лиофилизированной биомассы в указанной разовой дозе 4 раза в день внутрь курсами от 8 до 32 дней у добровольцев мужчин и женщин в возрасте 45 лет, 61 год, 66 лет, 72 года, 93 года приводило к исчезновению выраженных болей в желудке, развившихся на фоне обострения хронического гастрита (без приема лекарственных препаратов); исчезновению проявлений дисбактериоза (дисбиоза) кишечника (метеоризм, боли в животе, нерегулярный стул, разжиженный стул, задержка стула); быстрому купированию симптомов ОРВИ (в течение 1-3 дней), особенно при приеме в ранние сроки заболевания; исчезновению лабиального герпеса; улучшению общего состояния, повышению физической, умственной активности, работоспособности, улучшению эмоционального состояния (исчезновение пониженного настроения, раздражительности, эмоциональной лабильности).

Пример 9.

Женщина, 57 лет. Многократные курсы химиотерапии в связи с раком яичников. На этом фоне выраженный дисбактериоз (дисбиоз) кишечника, боли в животе, прием любых продуктов сопровождается метеоризмом, диарейный синдром с водянистым стулом. Употребляла кефир, обогащенный бифидобактерими штамма Bifidobacterium bifidum 8 в количестве 10⁶ КОЕ в 1 мл в течение 4 дней, первые два дня по 300 мл в день, последующее дни по 200 мл в день. Общий объем кефира 1 литр. Диарея полностью исчезла на второй день приема кефира, на четвертый день стул приобрел оформленную консистенцию, исчезли боли в животе, значительно уменьшился метеоризм, улучшилось общее состояние.

Библиография.

1. Терешкова Е.А., Кареткин Б.А., Дорошенко Е.О., Ланских А.Г. Сорбированные пробиотики. Механизм действия. - М.: ТД ДеЛи, 2020 - 36 с.

2. Иванова Е.В. Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной миробиоты человека. Дисс. д.м.н. Оренбург. 2018:295.

3. Turroni F., Duranti S., Milani C., Lugli G.A., van Sinderen D., Ventura M. Bifidobacterium bifidum: A Key Member of the Early Human Gut Microbiota. //Microorganisms. 2019, 9; 7(11).

4. Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Fernandez-Garcia M., de los Reyes-Gavilan C.G., Margolles A. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. //Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 1936-1940.

- 7 043487

5. Turroni F., Milani C., van Sinderen, D., Ventura, M. Genetic strategies for mucin metabolism in Bifidobacterium bifidum PRL2010: An example of possible human-microbe co-evolution. Gut Microbes 2011, 2, 183-189.

6. Rokhsefat S., Lin A.F., Comelli E.M. Mucin-Microbiota Interaction During Postnatal Maturation of the Intestinal Ecosystem: Clinical Implications. Dig. Dis. Sci. 2016, 61, 1473— 1486.

7. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics П The Journal of Nutrition. 1995, Vol. 125, p. 14011412

8. Roberfroid M., Gibson G.R., Hoyles L., et al. Prebiotic effects: metabolic and health benefits. //Br J Nutr. 2010, Vol. 104, S. 2, S1-S63

9. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5: The Actinobacteria Editors: Whitman, W., Goodfellow, M., Kampfer, P., Busse, H.-J., Trujillo, M., Ludwig, W., Suzuki, K.-L, Parte, A. (Eds.) 2012

10. Karetkin B. A., Guseva E. V., Evdokimova S. A. et al. A quantitative model of Bacillus cereus ATCC 9634 growth inhibition by bifidobacteria for synbiotic effect evaluation // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019. Vol. 35. P. 89

11. Lo T.S., Borchardt S.M. Antibiotic-associated diarrhea due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Diagnostic microbiology and infectious disease. 2009. Vol.63 (4), P. 388-389

12. Guglielmetti S., Tamagnini I., Mora D., Minuzzo M., Scarafoni A., Arioli S., Hellman J., Karp M., Parini C. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco-2 cells. Applied and environmental microbiology, 2008, 74(15), 4695-4702

13. Gonzalez-Rodriguez I., Sanchez B., Ruiz L., Turroni F., Ventura M., Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Margolles A. Role of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum in mucin adhesion and aggregation. Applied and environmental microbiology, 2012,78(11),3992-3998.

14. Ruiz L., Margolles A., Sanchez B. Bile resistance mechanisms in Lactobacillus and Bifidobacterium. //Frontiers in microbiology, 2013, 4, 396

- 8 043487

Перечень последовательностей.

<160>9 <210>1 <211>1534 < 212> DNA < 213> Bifidobacterium bifidum < 400> 1

ttttttgtgg	agggttcgat	tctggctcag	gatgaacgct	ggcggcgtgc	ttaacacatg	60
caagtcgaac	gggatccatc	aagcttgctt	ggtggtgaga	gtggcgaacg	ggtgagtaat	120
gcgtgaccga	cctgccccat	gctccggaat	agctcctgga	aacgggtggt	aatgccggat	180
gttccacatg	atcgcatgtg	attgtgggaa	agattctatc	ggcgtgggat	ggggtcgcgt	240
cctatcagct	tgttggtgag	gtaacggctc	accaaggctt	cgacgggtag	ccggcctgag	300
agggcgaccg	gccacattgg	gactgagata	cggcccagac	tcctacggga	ggcagcagtg	360
gggaatattg	cacaatgggc	gcaagcctga	tgcagcgacg	ccgcgtgagg	gatggaggcc	420
ttcgggttgt	aaacctcttt	tgtttgggag	caagccttcg	ggtgagtgta	cctttcgaat	480
aagcgccggc	taactacgtg	ccagcagccg	cggtaatacg	tagggcgcaa	gcgttatccg	540
gatttattgg	gcgtaaaggg	ctcgtaggcg	gctcgtcgcg	tccggtgtga	aagtccatcg	600
cttaacggtg	gatctgcgcc	gggtacgggc	gggctggagt	gcggtagggg	agactggaat	660
tcccggtgta	acggtggaat	gtgtagatat	cgggaagaac	accgatggcg	aaggcaggtc	720
tctgggccgt	cactgacgct	gaggagcgaa	agcgtgggga	gcgaacagga	ttagataccc	780
tggtagtcca	cgccgtaaac	ggtggacgct	ggatgtgggg	cacgttccac	gtgttccgtg	840
tcggagctaa	cgcgttaagc	gtcccgcctg	gggagtacgg	ccgcaaggct	aaaactcaaa	900
gaaattgacg	ggggcccgca	caagcggcgg	agcatgcgga	ttaattcgat	gcaacgcgaa	960
gaaccttacc	tgggcttgac	atgttcccga	cgacgccaga	gatggcgttt	cccttcgggg	1020
cgggttcaca	ggtggtgcat	ggtcgtcgtc	agctcgtgtc	gtgagatgtt	gggttaagtc	1080
ccgcaacgag	cgcaaccctc	gccccgtgtt	gccagcacgt	tatggtggga	actcacgggg	1140
gaccgccggg	gttaactcgg	aggaaggtgg	ggatgacgtc	agatcatcat	gccccttacg	1200
tccagggctt	cacgcatgct	acaatggccg	gtacagcggg	atgcgacatg	gcgacatgga	1260
gcggatccct	gaaaaccggt	ctcagttcgg	atcggagcct	gcaacccggc	tccgtgaagg	1320
cggagtcgct	agtaatcgcg	gatcagcaac	gccgcggtga	atgcgttccc	gggccttgta	1380
cacaccgccc	gtcaagtcat	gaaagtgggc	agcacccgaa	gccggtggcc	taaccccttg	1440
tgggatggag	ccgtctaagg	tgaggctcgt	gattgggact	aagtcgtaac	aaggtagccg	1500
taccggaagg	tgcggctgga	tcacctcctt	tcta			1534

- 9 043487 < 210> 2 < 211> 23 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence < 400> 2 tggaattctt gcccatgtag acg 23 < 210> 3 < 211> 22 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence < 400> 3 attcagcgac gaactggcac ag 22 < 210> 4 < 211> 534 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 4

Met Lys Phe Lys Lys Leu Phe Ala Gly Vai Ala Ala Ala Ala Thr Leu

5 1015

Leu Ala Gly Met Ala Phe Gly Thr Gly Ala Ala Asn Ala Ala GluThr

2530

Thr Vai Asp Thr Ala Ala Thr Vai Thr Phe Lys Ala Ser Lys Glu Lys 35 4045

Gin Leu Thr Ser Ala Gin Leu Ser Ala Tyr Lys He Ala Asp Tyr Vai 50 5560

Asn Tyr Gly Thr Ala Lys Thr Pro Vai Tyr Gly Vai Lys Thr Ala Ala 65 70 7580

Gly Ala Asn Arg Thr Lys Leu Ala Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gly Phe 85 9095

Gin Asn Vai Pro He Asp Gly Thr Thr Asp Leu Met Ala Trp Ala Met 100 105110

Asn Gin Lys Thr Thr Thr Asp Thr Asp Gly Thr Vai Thr Gin Vai Gin 115 120125

- 10 043487

Phe Asp Gin Ser Glu Thr Arg Pro Trp Asn Asn Pro Ser Vai Thr Arg

130 135140

Lys Phe Ala Asp Ala Leu Gin Ala Gly Asn Pro Phe Thr Ala Thr Ala

145 150 155160

Asp Pro Phe Vai Leu Asn Lys Ala Thr Gly Asn Asp Thr Asp Gly Trp

165 170175

Thr Ala Thr Asn Lys Thr Ala Leu Thr Ala Gly Vai Tyr Leu Phe Leu

180 185190

Asp Gly Asn Ala Ser Thr Asp Thr Leu Thr Gin Ala Vai Pro Met He

195 200205

Vai Ser Thr Gly Ser Vai Asp Ala Glu Gly Vai Leu Ser Leu Gly Asp

210 215220

Ser Thr Ala Glu Vai Asp Met Lys Ser Thr Vai Ser Gly Thr Gin Thr

225 230 235240

Lys Ser Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Vai Gly Glu Thr Vai Pro Phe

245 250255

Glu Leu Gly Tyr Thr He Pro Asn Pro Vai Pro Thr Asp Phe Thr Leu

260 265270

Gin Phe Lys Asp Vai Pro Ser Lys Gly Leu Thr Vai Asn Phe Ala Ser

275 280285

Leu Thr Vai Lys Ala Gly Asp Lys Vai Leu Thr Asp Thr Asp Tyr Thr

290 295300

Vai Glu Asn Asn Leu Thr Asp Asn Lys Gly Asp Gly Thr Asn Thr Phe

305 310 315320

Vai Vai Lys lie Thr Asp Pro Ala Lys Tyr Ala Gly Lys Gin lie Thr

325 330335 lie Thr Tyr Asn Ala Thr Vai Asn Asp Glu Ala Glu Thr Vai Glu Gly

340 345350

Gin Asp Tyr His Ala Vai Thr Asn Lys Leu Vai Gly Asn Asp Gly Thr

355 360365

Pro lie Pro Gly Thr Glu Thr Leu Thr Lys lie Phe Gly Phe Lys Phe

370 375380

Thr Lys Vai Asn Ala Gin Gly Glu Ala Vai Glu Gly Ala Lys Phe Thr

385 390 395400

- 11 043487

Leu Ser Vai Ala Lys Asp Gin Asn Gly Vai Leu Pro Asn Ser Asp Lys

405 410 415

Tyr Pro Leu Glu Vai Thr Ser Gly Ala Asn Gly Vai Vai Lys Phe Asp

420 425 430

Gly Leu Lys Ala Gly Ser Tyr Thr Vai Thr Glu Thr Ala Vai Ala Asp

435 440 445

Gly	Tyr 4 5 0	Gin Asp	Phe Lys Ala Ser Phe Thr Vai Ala He Asp Glu Asn
4 5 5	4 6 0
Gly	Lys	Vai Thr	Phe Ala Gly Thr	Asp Ser Trp Gly Leu Ala Pro Lys
4 6 5			4 7 0	475 480
Gly	Ser	Ala Asp	Asp Tyr Lys Vai	Thr Asn Vai Lys Ser Vai Phe Glu
		L	1 8 5	490 495
Leu	Pro	Lys Thr	Gly Ala Ala Gly	He Ala Leu Phe Vai Vai lie Ala

500 505 510

Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ala Ala Thr Vai Tyr Ala Lys Ser Arg Arg 515 520 525

Thr Ser Arg Ala Leu Arg 5 3 0 <210> 5 <211> 596 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 5

Met Gin Ser Met Ser Phe Ala Ser Thr Ala Arg Lys Vai Thr Ala Phe

5 1015

Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Leu Gly Ala Cys Gly Asn Ser

2530

Asn Asn Gly Ser Ala Gly Asn Asn Gly Ala Lys Ser Thr Ser Glu Pro 35 4045

Gin Glu Gly Vai Pro Thr Asn Tyr Thr Gly Ser Phe Pro Met Pro Asp 50 5560

Pro Gly Lys Ala Tyr Asn Asn Pro Lys Asp Arg Gly Glu Leu Lys Gin 65 70 7580

- 12 043487

Gly Gly Thr Leu Thr Leu Pro lie Thr Glu lie Gly Pro Asn Trp Asn
	8 5	9 0	9 5
Ala	lie Asp Vai Asn Gly Asn	Thr Vai Tyr Met Ser	Gly Leu Trp Arg
	1 0 0	1 0 5	1 1 0
Phe	Tyr Met Pro Cys lie Trp	Glu Tyr Pro Ala Asp	Gly Ser Leu Glu
	1 1 5	1 2 0	1 2 5
Asn	lie Lys Pro Asn Thr Asn	Tyr Vai Thr Lys Vai	Glu Gin Thr Ser

130 135 140

Asp Ser Pro Glu Thr Vai Vai Phe Thr He Asn Asp Lys Ala Ser Trp

145 150 155160

Asn Asp Gly Thr Pro He Thr Trp Lys Asp Phe Glu Ser Thr Trp Lys

165 170175

Vai Gin Ser Gly Lys Ser Asp Lys Phe Thr Pro Ala Leu Thr Thr Gly

180 185190

Tyr Asp Gin lie Lys Ser Vai Thr Lys Gly Asp Thr Asp Lys Gin Ala

195 200205

Vai Vai Thr Phe Glu Lys Asp Phe Tyr Pro Tyr Gin Ser Leu Phe Asn

210 215220

Leu Leu Tyr Pro Ser Glu Ala Leu Thr Gly Asp Asp Thr Lys Asp Gly

225 230 235240

Asp Thr Phe Ser Lys Gly Trp Ser Asn Asp Ser His Ser Asp Lys Trp

245 250255

Gly Ala Gly Pro Phe Vai Vai Ser Lys Ser Ser Asp Ser Glu Vai Thr

260 265270

Phe Thr Pro Asn Pro Lys Trp Trp Gly Asp Lys Pro Leu Leu Asp Lys

275 280285

Vai Vai Leu Lys Gin Met Glu Pro Ser Ala Ala Met Asn Ala Phe Lys

290 295300

Asn Gly Glu lie Asp Ala Vai Gly Ala Ser Asp Ala Glu Ser Met Thr

305 310 315320

Ser Ala Lys Thr Vai Lys Asp Ala Tyr Leu Arg Arg Ser Tyr Asp Ser

325 330335

Gly Vai Tyr Thr Leu Thr lie Asn Thr Lys Asn lie Pro Leu Glu Vai

340 345350

- 13 043487

Arg Lys Ala Phe Vai Gin Gly Vai Asp Arg Ser Gin Leu Gin Lys He 355 360365

Asp Phe Gin Gly He Glu Trp Thr Glu Lys Thr Pro Gly Ser Leu lie 370 375380

Leu Pro Gin Phe Gin Asp Gly Tyr Glu Asp Asn Met Pro Ala Glu Ser 385 390 395400

Lys Tyr Ser Thr Ala Asn Ala Thr Lys Thr Leu Glu Asp Ala Gly Tyr 405 410415

Lys Lys Asn Ser Asp Gly Tyr Tyr Glu Lys Gly Gly Lys Vai Ala Ala 420 425430 lie Thr Tyr Thr Thr Phe Ser Asp Ser Ala Ser Thr Lys Ala Lys Ala 435 440445

Thr Ala lie Gin Lys Met Ala Lys Thr Vai Gly lie Lys Vai Ser lie 450 455460

Asp lie Lys Ala Ser Asn Thr Phe Ser Asp Thr Vai Ser Ser Gly Asn 465 470 475480

Trp Asp Met lie Gly Leu Gly Trp Ser Ala Ser Asp Pro Phe Gly Tyr 485 490495

Ala Ser Ser Ala Tyr Gin Leu Tyr Gly Ser Lys Ser Glu Ser Asn Phe 500 505510

Ser Phe Thr Gly Thr Asp Glu lie Asp Lys Glu Leu Glu Ser lie Pro 515 520525

Gly lie Lys Asp Ser Thr Lys Ala He Ala Gin Phe Asn Lys Ala Glu 530 535540

Lys Glu Ala Gin Lys Leu Tyr Ala Gin lie Pro Phe Glu Asn Gly Gin 545 550 555560 lie Thr Vai Ala Vai Lys Lys Gly Leu Ala Asn Tyr Gly Pro Ala Gly 565 570575

Tyr Ser Ser Gly Ala Arg Vai Met Vai Thr Vai His Pro Glu Asn Leu 580 585590

Gly Trp Glu Lys 5 9 5 < 210> 6 < 211> 367

- 14 043487 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 6

Met Thr Glu Ala Thr Gin Arg Thr Ser Asp Asn Gly Vai Ser He Trp 1 5 1015

Leu Asp Asp Leu Ser Arg Thr Arg He Glu Ser Gly Ser Leu Gin Glu 20 2530

Leu He Lys Asp Lys Asn Vai Vai Gly Vai Thr Thr Asn Pro Ser He 35 4045

Phe Gin Lys Ala Leu Ser Gin Vai Gly Pro Tyr Asp Ala Gin Leu Lys 5 0 5 56 0

Glu Leu Gly Lys Vai Asp Vai Glu Thr Ala Vai Arg Glu Leu Thr Thr 65 70 7580

Thr Asp Vai Arg Asn Ala Thr Asp He Phe Arg Glu He Ala Glu Ala 85 9095

Thr Asp Phe Vai Asp Gly Arg Vai Ser He Glu Vai Asp Pro Arg Leu 100 105110

Ala His Asp Thr Glu Asn Thr Glu Lys Gin Ala Vai Glu Leu Trp Glu 115 120125

Lys Vai Asn Arg Pro Asn Ala Met He Lys He Pro Ala Thr Leu Glu 130 135140

Gly Leu Pro Ala He Thr Ala Thr Leu Ala Lys Gly He Ser Vai Asn 145 150 155160

Vai Thr Leu He Phe Ser Leu Glu Arg Tyr Glu Gin Vai He Asp Ala 165 170175

Tyr He Glu Gly He Ala Gin Ala Ala Ala Asn Gly His Asp Leu Lys 180 185190

His He Gly Ser Vai Ala Ser Phe Phe Vai Ser Arg Vai Asp Thr Ala 195 200205

Vai Asp Lys Leu Leu Glu Ala Asn Gly Ser Asp Glu Ala Lys Ala Leu 210 215220

Glu Gly Lys Ala Ala Vai Ala Asn Ala Arg Leu Ala Tyr Glu LeuPhe

225 230 235240

Glu Lys Lys Phe Ala Ala Asp Pro Arg Trp Ala Asp Leu Ala AlaLys

245 250255

- 15 043487

Gly Ala Lys Vai Gin Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Thr Lys Asn 260 265270

Ala Ala Tyr Ser Asp Cys Lys Tyr Vai Asp Glu Leu Vai Ala Lys His 275 280285

He Vai Asn Thr Met Pro Glu Lys Thr Leu Asn Ala Leu Ala Asp His 290 295300

Gly Asn Gly Ala Pro Ser He Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Ser His Ala 305 310 315320

Vai lie Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly lie Asn Leu Lys Asp Vai Thr 325 330335

Asp Lys Leu Glu Ala Asp Gly Vai Ala Ala Phe lie Lys Ser Trp Asp 340 345350

Ser Vai Leu Ala Asp Vai Gin Ser Gly lie Asp Arg Vai Asn Ala 355 360365 < 210> 7 < 211> 1931 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 7

Met Arg Lys Arg Vai Vai Ser Vai Ala Leu Ala Vai Ala Leu Ala Vai 1 5 1015

Ala Pro Leu Gly Vai Gly Ser Thr Ala Ser Ala Ala Pro Leu Ser Ala 20 2530

Ser Asp Leu Gin Thr Leu Ala Leu Arg Ser Ala Ala Ser Ser Asn Asp 35 4045

Ala Asn Ala Asn Asp Vai Ala Thr Vai Ala Asp Asp Ala Ala Vai Asn 50 5560

Gly Trp Thr lie Asp Arg Asn Thr Ala Lys Gly Gly Glu lie Leu Ala 65 70 7580

Ala Gly Thr Gly Asp Tyr Ala Gly Trp Thr His Phe Lys Ser Thr Ser 85 9095

Ala Asn Gly Asn Ala Thr Ser Ser Ser Gly Tyr Pro Ala Vai Ala lie 100 105110

- 16 043487

Ser Gly Lys Thr He Asp Leu Thr Arg Ala Gly Glu Phe Ser He Lys

115 120 125

Vai Lys Ser Pro Gin Ala Gly Ser Ala Asn Arg Phe Gly Phe Tyr Leu

130 135 140

Gly Tyr Lys Asp Pro Gly Asn Ala Leu Phe Leu Gly Tyr Asp Lys Gly

145 150 155160

Gly Trp Phe Trp Gin Lys Tyr Vai Asp Gly Asn Gly Asp Trp Tyr Asn

165 170175

Gly Thr Arg Vai Ala Ala Pro Ala Ala Asn Ala Glu lie Thr Vai Asn 180 185190

Vai Ser Trp Thr Ala Ala Lys Vai Ala Thr Leu Thr lie Asp Gly Gin 195 200205

Lys Ala Phe Asp Vai Asp Tyr Ser Ser Met Thr Ala Leu Thr Asn Lys 210 215220

Leu Ala Met Lys Ala Gly Ser Tyr Ser Gly Thr Ser Glu Vai Thr Asp 225 230 235240

Vai Tyr Phe Lys Asn Phe Thr Vai Gly Glu Vai Ala Lys His Asn Vai 245 250255

Thr Gly Lys Vai Vai Asp Ala Ser Gly Ala Ala lie Ala Gly Ala Glu 260 265270

Vai Vai Thr Gly Lys Asn Ser Ala Thr Thr Ala Ala Asp Gly Thr Phe 275 280285

Thr Leu Thr Gly Leu Ala Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Thr Vai Ser Ala 290 295300

Glu Gly Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Vai Thr Vai Ala Asp Gly Asn 305 310 315320

Ala Ser Vai Gly Asn lie Thr Leu Asn Lys Ser Ala Glu Vai Ala Thr 325 330335

Glu Thr Leu Ser Thr Ala Ala Met Asp Vai Arg Vai Lys Lys Asn Phe 340 345350

Pro Ser Vai Tyr Asp Tyr Thr Met Lys Lys Phe Gly Gly Lys lie Met 355 360365

Tyr Gly Gin Pro Lys Asp Vai Arg Vai lie Thr lie Asn Gly Thr Asp 370 375380

- 17 043487

Vai	Thr	Leu	Lys Asp Ser Asp Vai Thr Phe Lys Lys Vai Ser Ala Thr
3 8 5 Glu	Ala	Gin	390 395 400 Tyr Thr Leu Asn Vai Lys Ser Gly Asn Lys lie Asn Ala
Vai	Vai	Thr	405 410 415 Vai Gin He Lys Vai Vai Asp Asn Thr Leu Lys Leu Asn
Vai	Thr	Lys	420 425 430 He Vai Asn Lys Ala Asp Asp Ala Lys Thr Glu Ala Glu
Glu	Asn	4 3 5 Pro	440 445 Vai Gin Thr He Ala Phe Pro Asn Gin Ser Leu He Ser

450 455460

Vai Arg Ser Gly Gin Asp Gly Ala Gin Phe Thr Gly Ala Arg Met Ser

465 470 475480

Ser Asp Thr Ala Arg Pro Gly Asp Thr Asn Phe Gly He Thr Ala Asp

485 490495

Thr Thr Vai Gly Asn Ala Asn Asp Tyr Thr Tyr Gly Phe Vai Ser Gly

500 505510

Asn Gly Leu Ser Ala Gly Leu Trp Ser Asn Ser Glu His Asp Gly Thr

515 520525

Thr Vai Gly Asn Thr Vai Ala Gly Gly Ala Arg Asn Thr Arg Vai Leu

530 535540

Thr Ser Thr Gin Lys Vai Gly Lys Ala Thr Ser Phe Gly Leu Gly Thr

545 550 555560

Ala Pro Trp Tyr Tyr His Arg Vai Vai Thr Asp Thr Lys Lys Arg Thr

565 570575

Tyr Thr Vai Glu Glu Thr Asp Met Pro Lys Met Ala Vai Ala He Ala

580 585590

Gly Asp Glu Asn Glu Asp Gly Thr Vai Asn Trp Glu Asp Gly Ala He

595 600605

Ala Tyr Arg Asp He Met Asn Asn Pro Tyr Lys Ser Glu Glu Vai Pro

610 615620

Glu Leu Vai Ala Trp Arg He Ala Met Asn Phe Gly Ser Gin Ala Gin

625 630 635640

Asn Pro Phe Leu Thr Thr Leu Asp Asn Vai Lys Lys Vai Ala Leu Asn

645 650655

- 18 043487

Thr Asp Gly Leu Gly Gin Ser Vai Leu Leu Lys Gly Tyr Gly Asn Glu

660 665670

Gly His Asp Ser Gly His Pro Asp Tyr Gly Asp lie Asn Thr Arg Ala

675 680685

Gly Gly Ala Ala Asp Met Asn Thr Leu Met Glu Lys Gly Thr Glu Tyr

690 695700

Gly Ala Arg Phe Gly Vai His Vai Asn Ala Ser Glu Met Tyr ProGlu

705 710 715720

Ala Lys Ala Phe Ser Glu Asp Met Vai Arg Arg Asn Ser Ser GlyGly

725 730735

Leu Ser Tyr Gly Trp Asn Trp Leu Asp Gin Gly lie Gly lie Asp Gly

740 745750 lie Tyr Asp Leu Ala Ser Gly Met Arg Lys Ser Arg Phe Ala Asp Leu

755 760765

Lys Ser Lys Vai Gly Asp Asn Met Asp Phe He Tyr Leu Asp Vai Trp

770 775780

Gly Asn Asn Thr Ser Gly Ala Glu Asp Ser Trp Glu Thr Arg Lys Met

785 790 795800

Ser Gin Met lie Asn Gin Asn Gly Trp Arg Met Thr Thr Glu Trp Gly

805 810815

Ala Gly Asn Glu Tyr Asp Ala Thr Phe Gin His Trp Ala Ala Asp Leu

820 825830

Thr Tyr Gly Gly Ser Gly Met Lys Gly Glu Asn Ser Gin Vai Met Arg

835 840845

Phe Leu Arg Asn His Gin Lys Asp Ser Trp Vai Gly Asp Tyr Pro Ser

850 855860

Tyr Gly Gin Ala Ala Asn Ala Pro Leu Leu Gly Gly Tyr Ser Met Lys

865 870 875880

Asp Phe Glu Gly Trp Gin Gly Arg Asn Asp Tyr Ala Ala Tyr He Arg

885 890895

Asn Leu Tyr Thr His Asp Vai Ser Thr Lys Phe lie Gin His Phe Lys

900 905910

Vai Vai Arg Trp Vai Asn Ser Pro Leu Asp Ala Thr Ser Vai Lys Asp

915 920925

- 19 043487

Ala Ser Vai Asn Asn Gly Asn Glu Gin He Thr Leu Lys Asp Asp His

930 935 940

Gly Asn Vai Vai Vai Leu Ser Arg Gly Ser Asn Asp Thr Asn Asn Gly

945 950 955 960

Ala Tyr Arg Asn Arg Thr He Thr Leu Asn Gly lie Thr Vai Ala Ser 965 970975

Gly Ala Vai Ser Pro Gly Asn Ser Asn Thr Vai Lys Gly Thr Glu Ser 980 985990

Tyr Leu Leu Pro Trp Leu Trp Asp Vai Asn Thr Gly Lys Leu Vai Lys 995 10001005

Ser Ser Asp Glu Lys Leu Tyr His Trp Asn Thr Gin Gly Gly Thr Thr 1010 10151020

Glu Trp Thr Leu Pro Lys Asp Trp Gin Asn Leu Ala Ser Vai Lys Vai 1025 1030 10351040

Tyr Gin Leu Thr Asp Gin Gly Lys Thr Asn Glu Lys Thr Vai Ala Vai 1045 10501055

Ser Gly Gly Lys He Ser Leu Thr Ala Glu Ala Glu Thr Pro Tyr Vai 1060 10651070

Vai Thr Lys Gly Ser Glu Lys Gin lie Ser Vai Lys Trp Ser Glu Gly 1075 10801085

Met His Vai Vai Asp Ala Gly Phe Asn Gly Gly Gin Asn Thr Leu Lys

1090 10951100

Asp	Asn Trp	Ala Vai Ser Gly Thr Gly Lys Ala Glu Vai Glu Gly Thr
110 5	1110 1115 1120
Asn	Asn Ala	Met Leu Arg Leu Thr Gly Asp Vai Lys Vai Ser Gin Lys 1125 1130 1135
Leu	Thr Asp 1	Leu Thr Ala Gly Lys Arg Tyr Ala lie Tyr Vai Gly Vai 140 1145 1150
Asp	Asn Arg 115 5	Thr Asn Ser Pro Ala Lys lie Thr Vai Thr Asn Gly Thr 1160 1165
Lys	Vai Leu 117 0	Ala Thr Asn Glu Thr Gly Lys Ser lie Ala Lys Asn Tyr 1175 1180

lie Lys Ala Tyr Gly His Asn Thr Tyr Ser Asn Thr Glu Gly Gly Ser

1185 1190 11951200

- 20 043487

Ser Tyr Phe Gin Asn Met Tyr Vai Trp Phe Vai Ala Pro Glu Ser Gly 1205 12101215

Asp Vai Lys Vai Thr Leu Ser His Ser Gly Ala Cys Asp Asn Thr Asp 1220 12251230

His Vai Tyr Phe Asp Asp Vai Arg Vai Leu Glu Asn Gly Tyr Lys Gly 1235 12401245

Leu Thr Leu Asn Ala Asp Gly Thr Leu Lys Thr Leu Thr Asn Asp Phe 1250 12551260

Glu Asp Asn Ala Gin Gly He Trp Pro Phe Vai Vai Ser Gly Ser Glu 1265 1270 12751280

Gly Vai Glu Asp Asn Arg lie His Leu Ser Glu Leu His Ala Pro Phe 1285 12901295

Thr Gin Ala Gly Trp Asp Vai Lys Lys Met Asp Asp Vai Leu Asp Gly 1300 13051310

Lys Trp Ser Vai Lys Ala Asn Gly Leu lie Gin Lys Gly Thr Leu lie 1315 13201325

Tyr Gin Thr lie Pro Gin Asn Vai Lys Leu Glu Pro Gly Glu Thr Tyr 1330 13351340

Lys Vai Ser Phe Lys Tyr Gin Ser Gly Ser Asp Asp lie Tyr Ala lie 1345 1350 13551360

Ala Thr Gly Asp Gly Glu Tyr Asn Ala Ser Thr Vai Lys Leu Thr Asn 1365 13701375

Leu Lys Lys Ala Leu Gly Glu Asp Gly Thr Ala Glu Phe Glu lie Thr 1380 13851390

Gly Ser lie Thr Gly Asp Ser Trp Phe Gly lie Tyr Ser Thr Ser Thr 1395 14001405

Ala Pro Asp Leu Gin Asn Thr Ser Asp Ser Ala Ala Ala Phe Gly Gly 1410 14151420

Tyr Lys Asp Phe Vai Leu Asp Asp Leu Lys Vai Glu His Vai Ala Ser 1425 1430 14351440

Ala Glu Arg Thr Lys Ala Asp Ala Glu Ala Lys Leu Lys Glu Vai Lys 1445 14501455

Asp Thr Tyr Asn Gly Lys Ser Gly Asp Tyr Ser Ala Glu Vai Trp Thr 1460 14651470

- 21 043487

Thr Туг Vai Asn Thr Vai Ala Glu He Glu Ala Leu He Ala Lys Asp 1475 14801485

Lys Pro Asp Tyr Thr Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Vai Ala Leu Ala Glu 1490 14951500

Tyr Met Lys Asn Ala Pro Gly Asp Asp Ser Asn Asp Ala Tyr Asp Vai 1505 1510 15151520

Ala Thr Asp Ala Tyr Thr Vai Glu Ala Gly Ser Gin Gin Ala Leu Ser 1525 15301535

Gly Gly Asn Glu Gly Pro Ala Ser Leu Ala Gin Asp Gly Asn Ala Gly 1540 15451550

Thr His Trp His Thr Ser Trp Ser Ala Asn Ala Vai Ser Ala Gly Thr 1555 15601565

Ala Trp Tyr Gin Phe Asn Leu Asn Glu Pro Thr Thr lie Asp Gly Leu 1570 15751580

Arg Tyr Met Ala Arg Ser Gly Ser Ala Asn Ala Asn Gly Lys lie Lys 1585 1590 15951600

Lys Tyr Lys lie Thr Leu Thr Leu Ser Asp Gly Thr Thr Lys Asp Vai 1605 16101615

Vai Thr Asn Gly Thr Phe Thr Thr Thr Ser Gly Vai Trp Gin Lys Vai 1620 16251630

Lys Phe Asp Ala Vai Lys Asn Vai Thr Lys Vai Arg lie Thr Ala Leu 1635 16401645

Glu Thr Ala Gly Gin Ser Ala Gly Glu Vai Asn Thr Tyr Ala Ser Ala 1650 16551660

Ala Glu Leu Arg Vai Thr Thr Vai Arg Asp Vai Pro Ser Thr Glu Vai 1665 1670 16751680

Lys Vai Asn Lys Cys Asp Leu Gin Asn Leu Tyr Asp Asp Ala Ser Ala 1685 16901695

Leu Thr Glu Ala Thr Tyr Thr Ala Asp Thr Trp Lys Vai Leu Vai Ala 1700 17051710

Lys Arg Asp Ala Ala Lys Lys Vai Leu Asp Asp Glu Asn Ala Thr Ala 1715 17201725

Tyr Asp Vai Ala Leu Ala Tyr Gin Asn Leu Lys Asp Ala lie Ala Ala

1730 17351740

- 22 043487

Leu Glu Glu Arg Vai Asp Thr Ser Lys Leu Ala Gly Leu Vai Ala Asp

1745 1750 1755 1760

Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ser Ala Tyr Thr Lys Asp Ser Trp Ala Ala

1765 1770 1775

Phe Lys Lys Ala Leu Asp Ala Ala Lys Ala Vai Leu Asn Asn Ala Asn 1780 17851790

Ala Thr Lys Ala Asp Vai Asp Ala Ala Tyr Asn Ala Leu Asn Ala Ala 1795 18001805

Met Lys Ala Leu Lys Pro Ala Ser Ser Lys Pro Thr Pro Asn Pro Glu 1810 18151820

Thr Thr Asp Lys Ser Lys Leu Gin Ala Thr He Asp Gin Ala Lys Ala

1825 1830 18351840

Leu Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Lys Ser Vai Gin Ala Vai Arg Asp

1845 18501855

Ala Leu Ala Lys Ala Gin Ser Vai Leu Ala Asp Asp Asn Ala Thr Gin 1860 18651870

Ala Asp lie Asp Ala Ala Gin Lys Ala Leu Ala Asp Ala lie Ala Ala 1875 18801885

Leu Glu Lys Ala Asp Ala Asn Gly Asn Ala lie Ser Lys Thr Gly Ala 1890 18951900

Asn Vai Ala Vai He Gly Met Ala Gly Met Met Leu Vai Ala Ala Ala 1905 1910 19151920

Gly Ala Vai Phe lie Ala Arg Lys Arg Ala Glu 19251930 <210> 8 <211 > 316 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 8

Met Cys Thr Gly Vai Arg Phe Ser	Asp Asp Glu Gly Asn Met Tyr Phe
1 5 Gly Arg Asn Leu Asp Trp Ser Phe	10 15 Ser Tyr Gly Glu Thr lie Leu Vai
2 0 Thr Pro Arg Gly Tyr Gin Tyr Asp	2 5 3 0 Tyr Vai Tyr Gly Ala Glu Gly Lys

- 23 043487

40 45

Ser Glu 5 0	Pro Asn Ala Vai He Gly Vai Gly Vai Vai Met Vai Asp Arg
5 5	6 0
Pro Met	Tyr Phe Asp Cys Ala	Asn Glu His Gly Leu Ala lie Ala Gly
6 5 Leu Asn	7 0 Phe Pro Gly Tyr Ala	7 5 8 0 Ser Phe Ala His Glu Pro Vai Glu Gly
Thr Glu	8 5 Asn Vai Ala Thr Phe	9 0 9 5 Glu Phe Pro Leu Trp Vai Ala Arg Asn
Phe Asp	1 0 0 Ser Vai Asp Glu Vai	105 110 Glu Glu Ala Leu Lys Asn Vai Thr Leu

115 120 125

Vai Ser Gin Vai Vai Pro Gly Gin Gin Glu Ser Leu Leu His Trp Phe 130 135140

He Gly Asp Gly Thr Arg Ser lie Vai Vai Glu Gin Met Ala Asp Gly 145 150 155160

Met His Vai His His Asp Asp Vai Asp Vai Leu Thr Asn Gin Pro Thr 165 170175

Phe Asp Phe His Met Glu Asn Leu Arg Asn Tyr Met Cys Vai Ser Asn 180 185190

Glu Met Ala Glu Pro Thr Thr Trp Gly Lys Ala Glu Leu Ser Ala Trp 195 200205

Gly Ala Gly Vai Ser Met His Gly He Pro Gly Asp Vai Ser Ser Pro 210 215220

Ser Arg Phe Vai Arg Vai Ala Tyr Thr Asn Thr His Tyr Pro Gin Gin 225 230 235240

Asn Asn Glu Ala Ala Asn Vai Ser Arg Leu Phe His Thr Leu Vai Ser 245 250255

Vai Gin Met Vai Asp Gly Met Ser Lys Met Gly Asn Gly Gin Phe Glu 260 265270

Arg Thr Leu Phe Thr Ser Gly Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Thr Tyr Tyr 275 280285

Met Asn Thr Tyr Glu Asp Pro Ala lie Arg Ser Phe Ala Met Ser Asp 290 295300

Phe Asp Met Asp Ser Ser Glu Leu He Thr Ala Asp

305 310315

- 24 043487 < 210> 9 < 211> 432 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 9

Met Ala Ala He Glu Ser Vai Tyr Ala Arg Gin He Leu Asp Ser Arg

5 1015

Gly Asn Pro Thr Vai Glu Vai lie Leu Asp Thr Glu Asp Gly Ala Glu

2530

Gly Arg Gly Leu Vai Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Glu Ala Glu Ala

4045

Trp Glu Arg Arg Asp Gly Asp Lys Ser Vai Tyr Gly Gly Lys Gly Vai

5560

Leu Asn Ala Vai Lys Ala Vai Asn Glu Vai lie Ala Pro Lys Vai lie

70 7580

Gly Met Asp Ala Thr Asp Gin Arg Ala Leu Asp Asp Leu Met lie Glu

9095

Leu Asp Gly Thr Pro Asn Lys Gly Lys Leu Gly Ala Asn Ala lie Leu

100 105110

Gly Vai Ser Leu Ala Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ser Ala Glu Leu

115 120125

Pro Leu Tyr Arg Tyr lie Gly Gly Thr Asn Gly His lie Leu Pro Vai

130 135140

Pro Asn Met Asn lie Met Asn Gly Gly Ala His Ala Asp Phe Ala Thr

145 150 155160

Asp lie Gin Glu Tyr Met He Ser Pro Tyr Gly Phe Asp Thr Tyr Ser

165 170175

Glu Ala Leu Arg Ala Gly Vai Glu Vai Tyr His Thr Leu Lys Asn Vai

180 185190

Leu Lys Lys Glu Gly Leu Asn Thr Gly Leu Gly Asp Glu Gly Gly Phe

195 200205

Ala Pro Lys Met Lys Ser Asn Glu Asp Ser Leu Lys Tyr lie Met Asp

210 215220

Ala lie Ser Ala Ala Gly Tyr Glu Pro Gly Lys Gin lie Gly lie Cys

225 230 235240

- 25 043487

Leu Asp Vai Ala Ser Ser Glu Phe Tyr Asn Lys Glu Thr Gly Lys Tyr

245 250255

Arg Phe Asp Gly Glu Glu Arg Asp Ser Ala Tyr Met Leu Asp Tyr Tyr

260 265270

Glu Asn Leu He Asn Glu Tyr Pro He Vai Ser He Glu Asp Pro Phe

275 280285

Asn Glu Glu Gly Trp Glu Asp Trp Ala Glu lie Thr Arg Arg Leu Gly

290 295300

Asp Arg Leu Gin Phe Vai Gly Asp Asp Leu Leu Vai Thr Asn Pro Ala

305 310 315320

Arg Leu Arg Lys Ala lie Asp Met Gly Ala Ala Asn Ser Leu Leu Vai

325 330335

Lys Leu Asn Gin lie Gly Ser Vai Thr Glu Thr Leu Asp Ala lie Glu

340 345350

Leu Ala Thr Glu Asn Gly Tyr Thr Ser Met Vai Ser His Arg Ser Gly

355 360365

Glu Thr Pro Asp Thr Thr lie Ser Asp Leu Ala Vai Ala Lys Asn Thr

370 375380

Arg Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro Ala Arg Gly Glu Arg Vai Ala Lys

385 390 395400

Tyr Asn Arg Leu Leu Glu lie Glu Glu Glu Leu Gly Ser Thr Ala Gin

405 410415

Tyr Ala Gly Tyr Ser Ala Phe Lys Ala Cys Lys Lys Tyr lie Ala Lys

420 425430

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Штамм Bifidobacterium bifidum 8, коллекционный номер ВКПМ АС-2136, используемый в качестве пробиотика.

   ^gj) Евразийская патентная организация, ЕАПВ