JPH08259597A - 病原体付着阻害蛋白質及びその生産方法 - Google Patents

病原体付着阻害蛋白質及びその生産方法

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JPH08259597A
JPH08259597A JP7087626A JP8762695A JPH08259597A JP H08259597 A JPH08259597 A JP H08259597A JP 7087626 A JP7087626 A JP 7087626A JP 8762695 A JP8762695 A JP 8762695A JP H08259597 A JPH08259597 A JP H08259597A
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protein
asialo
bifidobacterium
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affinity
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JP7087626A
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Shigeru Fujiwara
茂 藤原
En Hashiba
炎 橋場
Tetsuji Hirota
哲二 廣田
Efu Fuoosunaa Jiyanetsuto
エフ フォースナー ジャネット
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Snow Brand Milk Products Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 アシアロＧＭ１に親和性を有する病原体の前
記アシアロＧＭ１への付着を阻害することを特徴とする
ビフィドバクテリウム属に属する細菌が生産する蛋白
質。脱脂乳培地または半合成培地で、ビフィドバクテリ
ウム属に属する細菌を培養し、培養後に培養上清から蛋
白質を分離することを特徴とする前記蛋白質の生産方
法。前記蛋白質に結合性を有する抗体。 【効果】 本発明の蛋白質を使用することにより、アシ
アロＧＭ１に親和性を有する病原体への感染を予防する
こと及びその感染症の治療をすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビフィドバクテリウム
（Bifidobacterium ）属に属する細菌が生産する新規な
病原体付着阻害蛋白質、その生産方法及びその蛋白質に
対する抗体に関する。本発明の新規な蛋白質は、医薬
品、食品、食品添加物、生化学試薬等の多様な用途に利
用することが可能である。
【０００２】
【従来の技術】ラクトバシラス（Lactobacillus）また
はビフィドバクテリウム（Bifidobacterium ）属に属す
る所謂腸内細菌は、ヒト消化管における主要細菌であ
る。これら腸内細菌は有機酸を生産し、さらにこれらの
あるものは、抗菌物質を生産すること等の性質を有する
ことから、腸内環境の維持改善に寄与するものと期待さ
れている。このため、予防的生物（probiotics）とし
て、整腸作用、便秘改善作用、感染防御作用の用途に使
用されている。また、最近では、宿主免疫系に対する活
性化因子としての働きも明らかとなり、種々のデータが
蓄積されている。このため最近では特に、潜在的な免疫
活性化因子としての作用も期待されるようになってきて
いる。
【０００３】ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium
）属に属する細菌の感染防御活性に関する知見として
は、主としてインビボ（in vivo）の研究、特に臨床実
験や微生物叢がすべて知られているノトバイオート動物
（gnotobiotic animal）を用いた研究から、ビフィドバ
クテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）と大
腸菌（E.coli）との腸内フローラ内での拮抗現象が観察
され、この結果、両属の拮抗関係が存在することが知ら
れていた（Shoji Yamazaki et al. Bifidobacteria Mic
roflora,Vol.1,p55-59,1982) 。しかしながら、そのメ
カニズムについては、明らかとはなっていなかった。ま
たインビトロ（in vitro）の実験系においても、ビフィ
ドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve ）
の培養上清中には、Ｈｅｌａ細胞への赤痢菌（Shigella
flexineri）の付着を阻害する蛋白性因子が存在するこ
とが知られていた(Rintaro Nakaya,Bifidobacteria Mic
roflora,Vol.3,p3-9,1984) 。しかし、この因子がどの
ような特性を有するものであるのか、あるいはその付着
阻止のメカニズムや有効スペクトルがいかなるものであ
るのかについては全く検討されていなかった。さらに、
その活性因子の単離に関しても、全く検討されていなか
った。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、ビ
フィドバクテリウムに属する細菌が生産する新規な感染
防御蛋白質、その生産方法及びその蛋白質に対する抗体
を提供することを目的とする。本発明は、特に、アシア
ロＧＭ１に親和性を示す病原体（パソジェン）（例：病
原性大腸菌、緑膿菌、プロテウス、カンピロバクター、
ロタウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シュー
ドモナススペーシア等）が、アシアロＧＭ１へ付着する
ことにより感染が成立する際に、このアシアロＧＭ１へ
の病原体の付着を拮抗的に阻害する新規蛋白質及びその
生産方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記ビフ
ィドバクテリウム（Bifidobacterium ）属に属する細菌
が生産する有機酸（乳酸及び酢酸）以外の感染防御因子
のうち、従来知られていなかった機作を有する新規な感
染防御蛋白質を初めて見い出し、本発明を完成した。即
ち、本発明は、アシアロＧＭ１に親和性を有する病原体
の前記アシアロＧＭ１への付着を阻害することを特徴と
するビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属
する細菌が生産する新規蛋白質からなる。本発明の蛋白
質は下記の特性を有しており、下記の特性値〜に
より特定される。 アシアロＧＭ１に付着性を有する病原体のアシアロＧ
Ｍ１への付着を阻害または抑制する性質を有する。 分子量：ゲルろ過法で測定した場合は、約１０４,０
００であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した場合は、約
５２,０００である。 等電点：約５.８ サブユニット構造：ホモダイマー構造 Ｎ末端アミノ酸配列： Val-Asp-Pro-His-Ala-Ile-Val-Pro-Ser-Asn-Phe-Asp-Ph
e-Ala-Phe-Leu- また、本発明の蛋白質は、アシアロＧＭ１をレセプター
とする大腸菌、緑膿菌、プロテウス、カンピロバクタ
ー、ロタウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス等の
病原体がこのレセプターに結合することを阻害する機能
を有する。
【０００６】本発明の蛋白質を生産するビフィドバクテ
リウム（Bifidobacterium）属に属する細菌としては、
特に限定されず、いずれの細菌であっても本発明の蛋白
質を生産することができる。これらの細菌の例として
は、例えば、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B.an
imalis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B.bifi
dum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.i
nfantis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム
（B.pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・アドレセ
ンティス（B.adrescentis） 、ビフィドバクテリウム・
ブレーベ（B.breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガ
ム（B.longum）等の代表的なビフィドバクテリウム（Bi
fidobacterium）属に属する細菌を挙げることができ
る。本発明者らは、これらのビフィドバクテリウム（Bi
fidobacterium）属に属する細菌が、それらの培養液中
に本発明の蛋白質を生産することを確認している（下記
実施例１（２）及び図１参照）。
【０００７】これらのビフィドバクテリウム（Bifidoba
cterium）属に属する細菌の中でも、特にビフィドバク
テリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に属す
る細菌を用いることが好ましい。ビフィドバクテリウム
・ロンガム（Bifidobacterium longum）は、成人消化管
内に存在し、感染防御に重要な役割を果しており、また
入手も容易である。ビフィドバクテリウム・ロンガム
（Bifidobacterium longum）は、種々の菌株が入手可能
であるが、特に本発明において好ましい株として、工業
技術院生命工学工業技術研究所（旧：工業技術院微生物
工業技術研究所）に寄託されているBifidobacterium lo
ngum ＳＢＴ ２９２８（微工研菌寄第１０６５７号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１０６５７号））を使用することが好まし
い。本株は容易に入手することができる。また、本株
は、特に発酵特性に優れ、マイトージェン活性やオーラ
ルアジュバント活性（日本栄養・食糧学会誌、４３巻３
号 p203-208 （1990）、同４３巻５号 p327-333（199
0）、同４４巻４号 p261-266 （1991））を有する等の
特性を保持している。
【０００８】本発明はまた、本発明の蛋白質を生産する
方法にも関する。本発明の蛋白質は、一般的に次の方法
により生産され得る。即ち、ビフィドバクテリウム（Bi
fidobacterium）属に属する細菌を、ヒト、牛、羊、山
羊等の乳またはそれらの脱脂乳を基本とした培地におい
て培養した後に得られるホエー画分、または上記細菌を
ブリッグス肝臓培地（Briggs liver broth）やＭＲＳ培
地（MRS broth）等の半合成培地において培養した後に
得られる培養上清を出発物質として、アシアロＧＭ１に
親和性を示す蛋白質画分を調製し、この蛋白質画分を精
製することにより得ることができる。尚、精製の前に、
後に詳しく説明するＴＬＣオーバーレイ阻害アッセイ法
または細胞付着阻害アッセイ法により、目的の活性の存
在を確認することが好ましい。
【０００９】本発明の蛋白質は、ビフィドバクテリウム
属（Bifidobacterium）に属する細菌を培養することに
よって、それらの菌体外に産生されるが、場合によって
は、菌体内から菌体を破砕して回収することもできる。
本発明の蛋白質の精製は、通常、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の公知の精製操作を適宜組み合
わせて行うことができる。特にアフィニティークロマロ
グラフィーは、本発明の蛋白質が親和性を有する糖脂質
アシアロＧＭ１を固定化した担体を用いることもでき
る。また、このような公知のクロマトグラフィーにより
部分精製した蛋白質を抗原として動物を免疫し、ポリク
ローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を得て、これ
を用いて精製することもできる。
【００１０】以下、本発明を、ビフィドバクテリウム・
ロンガム（Bifidobacterium longum）を使用した場合を
例に挙げてさらに詳しく説明するが、本発明はこの菌種
及び下記の方法、手順等に限定されるものではない。ビ
フィドバクテリウムに属する細菌を、乳若しくは脱脂乳
培地または合成若しくは半合成培地を用いて培養する。
特に、脱脂乳培地及び半合成培地が好ましい。培養は、
それぞれの菌種や菌株の最適条件において行なえばよ
い。通常は、０.３％酵母エキスを含む１０％脱脂乳に
おいて培養したシードカルチャーを、直前に調製したブ
リッグス肝臓培地に、０.１〜０.５％になるように接種
する。ブリッグス肝臓培地は、「JCM Catalogue of Str
ains」に記載の方法に従って調製する（JCM Catalogue
of Strains、Fifth Edition、p402；Edited by Takashi
Nakase）。その後、恒温槽に静置し、３５〜４０℃で
４８〜９６時間、特に好ましくは３７℃で７２時間培養
を行う。
【００１１】培養終了後に、培養物を遠心分離（１５,
０００rpm、１０分間）し、沈殿を除去した後、グラス
ファイバーフィルターを用いて培養上清を吸引ろ過す
る。この上清を、１０Ｎ ＮａＯＨで中和（ｐＨ６.０〜
７.０）した後、硫酸アンモニウム沈殿法等の方法によ
り蛋白質画分を回収する。硫酸アンモニウム沈殿を行う
場合は、粉砕硫酸アンモニウムを使用して、８５％飽和
とする。４℃において一晩放置した後、再度、遠心分離
（１５,０００rpm、１０分間）し、生じた沈殿画分を回
収する。この沈殿を水に再溶解し、水に対して充分に透
析を行う。透析膜は、１０,０００カット以上の能力を
有する膜を用いて行なえばよいが、特に、１２,０００
〜１４,０００の分画分子量を透析処理する能力を有す
る膜を用いることが望ましい。約１昼夜透析した後、凍
結乾燥を行い、粉末化するかまたは凍結保存し、次の精
製工程を行う。
【００１２】（１）第１回クロマトグラフィーゲルろ過クロマトグラフィー 上記の凍結乾燥した試料を、約６〜８倍量の蒸留水に溶
解し、これをゲルろ過クロマトグラフィーにかける。ゲ
ルろ過クロマトグラフィー用担体としては、分画分子量
１００,０００以下のものが好ましく、例えば、０.０４
％濃度のＮａＮ3を含む生理食塩緩衝液（ＰＢＳ）で平
衡化したアクリルアミドゲルカラム、例えば、バイオラ
ッドバイオゲル（BioRad Biogel）Ｐ１００カラム（バ
イオラッド社製）等を挙げることができる。この担体
に、上記凍結乾燥試料を蒸留水に溶解した溶液または凍
結から解凍した試料を負荷し、最初に溶出してくるフラ
クションを回収する。この画分を回収し、上記と同様の
膜を用いて水に対して透析を行い、透析を終了した後、
−８０℃で凍結保存する。
【００１３】（２）第２回クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィー イオン交換クロマトグラフィー用担体としては、ジエチ
ルアセチルエチル化架橋セルロース、例えばＤＥＡＥ−
セファロース（ファルマシア製）を用いる。このクロマ
トグラフィーカラムを２５mＭのジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）緩衝液（ｐＨ８.５）で平衡化し、上記
（１）のＰ１００カラムにより得られたボイドボリュー
ム画分を負荷し、さらに上記（１）と同じ緩衝液で洗浄
し、ＮａＣｌの直線濃度勾配で蛋白質を溶出する。活性
は下記実施例に記載の方法でモニタリングし、活性画分
を含む蛋白質画分を濃縮脱塩した後、−８０℃で保存す
る。
【００１４】（３）第３回クロマトグラフィー疎水性クロマトグラフィー 疎水性クロマトグラフィー用担体としては、疎水性クロ
マトグラフィー用担体で架橋セルロースにオクチル基を
導入したもの、例えばオクチルセファロース（ファルマ
シア製）カラムを用いる。この疎水性クロマトグラフィ
ー用カラムを、１.２Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０m
Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８.５）により平衡化し、上
記（２）のＤＥＡＥ−セファロース調製蛋白画分（２０
mＭトリス−塩酸緩衝液）を添加し、同緩衝液にて洗浄
した後、硫酸アンモニウムの直線濃度減少勾配を用いて
蛋白質を溶出する。活性を有する蛋白質画分を、濃縮脱
塩した後に、−８０℃で凍結保存する。さらに、この画
分を用いてＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動を行
い、活性と精製純度の関係を測定しておく。
【００１５】（４）第４回クロマトグラファイーゲルろ過クロマトグラフィー ゲルろ過クロマトグラフィー用担体として、アガロース
ビーズ、例えばバイオラッドバイオゲル（BioRad Bioge
l）Ａ（バイオラッド社製）カラムを用いる。このゲル
ろ過クロマトグラフィー用カラムをＮａＮ3を含むＰＢ
Ｓにより平衡化し、上記（３）の疎水性クロマトグラフ
ィーによって調製した活性蛋白質画分を負荷し、上記
（３）と同一の緩衝液を用いて溶出する。活性を有する
蛋白質画分を、濃縮脱塩した後に、−８０℃で凍結保存
する。
【００１６】（５）クロマトフォーカシング イオン交換カラム、例えばＰＢＥ９４（ファルマシア
製）カラムを、２５mＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（p
H７.４）により平衡化する。このカラムに上記（４）で
得た活性蛋白質画分を負荷し、上記（４）と同じ緩衝液
により洗浄する。次いで、希釈したポリバッファー７４
−ＨＣｌ（pH５.０）で溶出する。活性を有する画分
を、脱塩した後、濃縮乾燥し、粉末とする。次いで、食
塩濃度勾配で溶出を行い、脱塩後、凍結乾燥粉末として
同様に保存する。活性を測定し、活性画分を集める。こ
の段階で、ほぼ単一ピークを示すように精製される。
【００１７】（６）純度検定 上記操作で得られた活性画分を、純度検定の目的と分子
量の推定の目的のために、アガロースアクリルアミドポ
リマー、例えばウルトロゲル（Ultrogel）ＡｃＡ２２
（ＬＫＢ製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにか
ける。ウルトロゲルを用いた場合、本発明の蛋白質は、
分子量約１０万の位置に溶出される。また、１１％アク
リルアミドゲルを用いたＳＤＳ電気泳動を行った場合、
本発明の蛋白質は、還元条件下、非還元条件下のいずれ
においても、５２kDのシングルバンドを与える。
【００１８】（７）アシアロＧＭ１コーティングポリス
チレンビーズを用いた精製 本発明の蛋白質は、アシアロＧＭ１に親和性を有する。
従って、アシアロＧＭ１を担体に固定化することによ
り、アシアロＧＭ１を本発明の蛋白質の精製に用いるこ
とができる。アシアロＧＭ１の担体への固定化は、タキ
（Taki）らが報告しているアシアロＧＭ１コーティング
ポリスチレンビーズ法 （Taki et al, J.Biochem., 91,
p1813-1816,1982）に従って行なうことができる。上記
（１）−（６）の各工程にこのカラム処理を組み込んで
精製を行うことにより、本発明の蛋白質の精製効率をさ
らに向上させることができる。
【００１９】（８）固定化抗体による精製 上記（７）の方法で精製した本発明の蛋白質若しくは部
分精製した本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体を用いて、本発明の蛋白質を
精製することができる。抗体は、上記の精製または部分
精製蛋白質を抗原として常法に従って調製することがで
きる。得られた抗体を、担体に固定化する。固定化方法
としては、架橋化法または包埋法等の公知の抗体固定化
方法を使用することができる。この抗体固定化担体をカ
ラムに充填した抗体固定化カラムを用いた精製を、上記
（１）の第１回クロマトグラフィーの工程の後に行うこ
とにより、本発明の蛋白質を容易に精製することができ
る。以下に実施例を示し本発明をさらに詳細に説明す
る。
【００２０】
【実施例】
実施例１ 本実施例では、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifi
dobacterium longum）ＳＢＴ２９２８株の培養上清か
ら、本発明の蛋白質を単離し、得られた蛋白質の各精製
段階の活性を検定した。
【００２１】（１）活性の検定方法 最初に、下記（２）において得られる本発明の蛋白質の
活性を検定するために用いる方法について説明する。 （ａ）ＴＬＣオーバーレイ阻害アッセイ（Overlay inhi
bition assay）法 本方法は、Karlsson及びStroenbergの方法（Karlsson
K.A.,Stroenberg N.,Methods in Enzymology 138, p220
-232,1987）に準じた方法である。アシアロＧＭ１ ５μ
gをスポットし、これを展開（クロロホルム：メタノー
ル：水＝６０：４０：９）したシリカゲルプレートを風
乾した後、一旦水に浸漬し、その後、１％のゼラチン
（ＥＬＩＳＡ−グレード、バイオラッド製）を含むトリ
ス緩衝化生理食塩水（１０mＭＴｒｉｓ−１５０mＭＮａ
Ｃｌ−０.０４％アジ化ナトリウム；pH８.０）にてブロ
ッキング（３７℃、５０rpm 、一晩）した。対象となる
病原菌については、トリプチケースソイブロース（ＴＳ
Ｂ）またはＭ−９培地（Antibodies a laboratory manu
al, p442, Ed Hanlow and David Lanes Eds., Cold Spr
ing Harbor Labolatory Publication）を用いて、35Ｓ
−メチオニン（放射活性１０ml／７４ＭBq）にて代謝ラ
ベル（３７℃、１５０rpm、１２〜２４時間）した。そ
の後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩
衝化生理食塩水（ＰＢＳ；pH７.０）により、病原菌を
遠心洗浄（３回、６,０００rpm、５分間）した。場合に
より、その後、被検定蛋白質画分を含む１％ＢＳＡ添加
ＰＢＳに浸漬し、３７℃において３０分間保持すること
により前処理を行った。
【００２２】一方、シリカゲルプレートは、１％ＢＳＡ
添加ＰＢＳにより３回洗浄し（５０rpm、１０分間）、
場合によってはそのまま、または必要な場合には、同様
に被検定蛋白質画分を含む１％ＢＳＡ添加ＰＢＳにより
３７℃において３０分間保持することにより前処理を行
い、その後、これをアスピレートして除いた。次いで、
被検定蛋白質画分を含む１％ＢＳＡ添加ＰＢＳにて前処
理をしたラベル病原菌または前処理を施さない病原菌を
加え、３７℃にて１時間オーバーレイ（５０rpm）を行
った。オーバーレイは、旋回式のシェーカーにより１０
mlの病原菌懸濁液とＴＬＣプレートを合わせて旋回させ
て行った。オーバーレイ後、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳによ
り６回洗浄し（５０rpm、３分間）、風乾した後、オー
トラジオグラムを撮った。必要に応じ、デンシトメトリ
ーにて定量化した後、被検定蛋白質画分の阻害活性を、
主としてＩＣ50値により判定した。ＩＣ50値は、下記式
の値を５０としたときの被検物質の濃度である。
【００２３】
【数１】付着阻害強度＝１００×（１−被検物質存在下
での付着強度／被検物質存在下での付着強度）
【００２４】尚、抗ロタウイルス付着活性に関しては、
ヨードビーズ（Iodobeads）を使用したＮａ−１２５Ｉ
ラベルを行うウィロービ（Willoughby）ら（J.Virolog
y,64(10),p4830-4835,1990）による方法に準じて、オー
バーレイアッセイを行い、同様に評価することができ
る。
【００２５】（ｂ）細胞付着阻害アッセイ（Cell-bindi
ng inhibition assay）法 本方法は、ラウックス（Laux）Ｄ.Ｃ.らの方法（J.Micr
obiological Methods2:p27-39,1984）に準じた方法であ
る。回盲部アデノカルシノーマ細胞株ＨＣＴ−８（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ２２４）を検定細胞として用いる。このＨ
ＣＴ−８細胞を、ＡＴＣＣの培養指針に従って、１００
Ｕ／mlペニシリンＧ、１００mg／mlストレプトマイシン
及び１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む２５mＭ ヘペス
（ＨＥＰＥＳ）緩衝化ＲＰＭＩ１６４０（ＨＥＰＥＳ−
ＲＰＭＩ−ＦＣＳ）により継代培養した。アッセイに
は、２４穴カルチャープレート（コスター製）を用い
た。通常、１ウェル当たり１×１０5の細胞（１ml）を
シードし、加湿された５％炭酸ガス雰囲気下で、３７℃
において４８〜７２時間培養し、コンフリュエントの状
態にした。コンフリュエントの状態に達した細胞を、加
温した２５mＭ ヘペス緩衝化ハンクスＢＳＳ（ＨＥＰＥ
Ｓ−ＨＡＮＫ'Ｓ）１mlにより洗浄した後、０.５mlの５
％ＢＳＡ−ＰＢＳを加えて、１時間ブロッキングした。
１mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより２回洗浄した
後、さらに目的蛋白質画分を含む０.５mlのＨＥＰＥＳ
−ＨＡＮＫ'Ｓにて３０分間プレインキュベート（コン
トロールは、ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓのみ）した。こ
れをアスピレートした後、35Ｓ−メチオニン（１０ml／
７４ＭBq）により代謝ラベルした病原菌（１×１０9cfu
／０.５mlＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓ）を加え、（場合に
よっては、病原菌自体も、目的蛋白画分を含む０.５ml
のＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより３０分間プレインキ
ュベートしておく）、約２時間インキュベートして付着
を完了させた。１.０mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓによ
り６回洗浄した後、０.５mlの１％ＳＤＳを含む０.１Ｎ
ＮａＯＨにより３７℃において１時間インキュベート
した。
【００２６】その後、すべてを１０mlのシンチレーショ
ンカクテル（Ready Protein+、ベックマン製）に加え、
ベータ線の放射活性より付着菌数を測定した。尚、抗ロ
タウイルス付着活性については、ＨＣＴ−８細胞を標的
として用いた上で、ウィロービ（Willoughby）ら（J.Vi
rology, 64(10), p4830-4835,1990）の方法に従ってア
ッセイを行い、付着阻害活性を測定した。阻害活性は、
上記（ａ）のオーバーレイアッセイと同様の計算方法に
より、ＩＣ50値を求めて判定した。尚、精製工程での検
定はすべて病原性大腸菌を用いて行った。
【００２７】（２）ビフィドバクテリウム・ロンガム
（Bifidobacterium longum）ＳＢＴ２９２８株培養上清
からの目的蛋白質の単離 ビフィドバクテリウム・ロンガムの代表的な株である上
記ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium
longum）ＳＢＴ２９２８株を用いて、本発明の蛋白質を
調製した。この株を、最初に０.３％酵母エキスを含む
１０％脱脂乳で培養し、シードカルチャーを調製した。
このシードカルチャーを、直前に調製したブリッグス肝
臓培地（Briggs liver broth）に約３％接種した。その
後、静置で３７℃において７２時間培養を行った。
【００２８】培養物を遠心分離（１５,０００rpm、１０
分間）した後、グラスファイバーフィルターでろ過して
調製した培養上清を、１０Ｎ ＮａＯＨにより中和（pH
６.０）し、粉砕硫酸アンモニウムを添加して、８５％
飽和とした。４℃において、一晩放置した後、生じた沈
殿画分を、再度遠心分離（１５,０００rpm、１５分間）
して回収した。この沈殿を水に溶解し、その後、水に対
して充分に透析（分画分子量：１２,０００〜１４,００
０）し、凍結乾燥した。ビフィドバクテリウムに属する
細菌６菌種（ビフィドバクテリウム・アニマリス（B.an
imalis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B.bifi
dum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.i
nfantis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム
（B.pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・アドレセ
ンティス（B.adrescentis）及びビフィドバクテリウム
・ブレーベ（B.breve））を同様に培養し、蛋白質画分
を同様に調製した。
【００２９】この試料を用いて、上記の細胞付着阻害ア
ッセイ（Cell-binding inhibitionassay）法で、アシア
ロＧＭ１に対する大腸菌の結合阻害活性を測定した。対
照として、ブリッグス培養基、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳを
用いた。各細菌から調製した蛋白質画分は、もとの培養
上清の４分の１の量になるように蒸留水に溶解して試験
を行った。試験はＴＬＣオーバーレイアッセイ法で検定
を行ったが、各細菌の培養上清はいずれも強い結合阻害
活性を示した。この結果を図１に示す。尚、この結合阻
害活性は、プロテアーゼ処理によって失活した。
【００３０】第１回クロマトグラフィーゲルろ過クロマトグラフィー ０.０４％ＮａＮ3を含むＰＢＳにて平衡化したバイオラ
ッドバイオゲル（BioRad Biogel）Ｐ１００カラム（１
５０ml：２７.６mm内径×２５０mm長）を用いてゲルろ
過クロマトグラフィーを行った。上記の硫酸アンモニウ
ム沈殿粉末を、６〜８倍量の水に溶解し、得られた溶解
液１５mlをこのカラムに負荷した。０.０４％ＮａＮ3を
含むＰＢＳで溶出を行った。溶出画分は、フェノールレ
ッドを７４０ｎｍ、デキストランブルーを５５０ｎｍで
モニターし、ボイド部分とカラム容量の溶出を確認し
た。次いで、２８０ｎｍの吸収をモニタリングし、ボイ
ドボリュームに相当する部分を回収した（図２）。この
画分を水に透析した後、−８０℃に凍結保存した。
【００３１】第２回クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィー ２０mＭ ＤＥＡＥ緩衝液（ジエチルアミノエチル：pH
８.５）にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム
（５０ml：１４６mm内径×３００mm長）を用いてイオン
交換クロマトグラフィーを行った。このカラムに２０m
ＭＤＥＡＥ緩衝液で緩衝化した上記のボイドボリューム
画分を負荷した。次いで、このカラムを同じ緩衝液で洗
浄した後、食塩の直線濃度勾配（０−５００mＭ）で溶
出した（図３）。蛋白画分は５つのフラクションに分け
て分取し、活性をＴＬＣオーバーレイアッセイ法で検定
した。活性画分は主としてフラクション３に存在した。
この活性画分を濃縮脱塩後、−８０℃に凍結保存した。
【００３２】第３回クロマトグラフィー疎水性クロマトグラフィー １.２Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０mＭトリス−塩酸
バッファー（pH８.５）で平衡化したオクチルセファロ
ースカラム（１５ml：９.７mm内径×２００mm長）を用
いたクロマトグラフィーを行った。上記ＤＥＡＥ−セフ
ァロースカラムクロマトグラフィーによって得られた活
性画分を、このカラムの平衡化に用いた緩衝液で平衡化
した後カラムに負荷した。次いで、カラムを同一の緩衝
液で洗浄し、硫酸アンモニウムの直線濃度勾配で溶出し
た。硫酸アンモニウムは１.２Ｍ〜０.０Ｍ、その後の未
溶出の蛋白質は、ＣＨＡＰＳの０.０％〜１.０％の濃度
勾配で、図４に示したパターンで溶出を行った。蛋白質
画分は、フラクション１〜フラクション９にわけて分取
し、濃縮脱塩後に凍結保存した。活性は主にフラクショ
ン５に集中していた。各フラクションについて、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、活性画分の存在を確認し
た。７.５％のポリアクリルアミドゲルを用いてレムリ
ーの方法で電気泳動を行った結果を図５に示した。
【００３３】第４回クロマトグラフィーゲルろ過クロマトグラフィー 上記疎水性クロマトグラフィーで得た活性フラクション
をゲルろ過クロマトグラフィーに付した。０.０４％Ｎ
ａＮ3を含むＰＢＳにより平衡化したバイオラッドバイ
オゲル（BioRad Biogel）Ａ０.５mカラム（１１５ml：
１４.５６mm内径×６９０mm長）を用いてクロマトグラ
フィーを行った。上記、疎水性クロマトグラフィーによ
り調製した活性蛋白質試料１.５mlを負荷し、平衡化に
用いたものと同じ緩衝液を用いて溶出した。溶出は２８
０nmの吸収でモニタリングし、６つのフラクションを分
取した（図６）。活性の中心はフラクション１に存在し
た。蛋白質画分を濃縮脱塩した後、−８０℃に凍結保存
した。
【００３４】クロマトフォーカシング 上記のゲルろ過クロマトグラフィーで得た活性画分を、
さらにクロマトフォーカシングにより精製を行った。２
５mＭイミダゾール−ＨＣｌ（pH７.４）で平衡化したＰ
ＢＥ９４カラム（１０ml：６.５mm内径×３００mm長）
を用いてクロマトグラフィーを行った。上記のフラクシ
ョン１の試料を負荷した後、平衡化に使用したものと同
じ緩衝液により洗浄した。次いで、８倍に希釈したポリ
バッファー74−ＨＣｌ（pH５.０）を用いて、カラムの
１０倍容積で溶出し、次いで溶出液を０〜１.０Ｍ食塩
の濃度勾配で溶出した。溶出の経過を図７に示す。目的
蛋白質画分は、溶出液を食塩に代えた直後に溶出され
た。図７に示されるメインピークが活性の中心であっ
た。この画分をバイオゲル（バイオラッド社製）Ｐ６０
により脱塩した後、凍結乾燥にて濃縮し、粉末として−
２０℃に保存した。以上の各精製工程での回収率、精製
率及び付着阻害ＩＣ50を下記表１に示す。
【００３５】
【表１】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− フラクション 容量 蛋白質量 回収率 精製率 付着阻害ＩＣ50 （L） （mg） （倍） （mg／ml） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 中和培養上清 20 5000 − − − 塩析沈殿 3500 100 1 0.8 バイオラッド 1600 73.2 1.71 0.5 Ｐ１００ ＤＥＡＥ− 112 25.6 8.01 0.1 セファロース オクチル− 11.3 5.2 16.09 0.05以下 セファロース バイオゲルＡ − ０.５ｍ ＰＢＥ９４ 0.5 0.46 32.2 0.025 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００３６】表１に示されるように、本発明の蛋白質は
３２.２倍に精製され、その回収率は０.４６％であっ
た。
【００３７】実施例２ 本実施例では、実施例１で得た本発明の蛋白質の特性値
の分析例を示す。 （１）純度検定、分子量測定 実施例１により得られた蛋白質を、ウルトロゲル（Ultr
ogel）ＡｃＡ２２を用いたゲルろ過クロマトグラフィー
（０.０４％ＮａＮ3を含むＰＢＳにより平衡化：120m
l；10 mm×1200 mm長）にかけ、ゲルろ過法による分子
量測定を行なった。結果を図８に示す。図８より明らか
であるように、ゲルろ過法により単一のピークを示し
た。この溶出位置から、標準蛋白質をもとに作成したキ
ャリブレーションカーブにより分子量を決定した。本蛋
白質の分子量は、１０４,０００であった（図９）。
【００３８】さらに、本蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（還元及び非還元の２条件）によるゲル電気泳動を行っ
た。アクリルアミドゲルは１１％濃度のものを用い、レ
ムリーの方法により行った。還元は２−メルカトールエ
タノールを添加することにより行った。図１０に示すよ
うに、いずれの条件下でも単一バンドとなり、またゲル
電気泳動による分子量は、５２,０００であった。本発
明の蛋白質は、この分子量５２,０００の蛋白質が二量
体となったホモダイマーであると推定される。
【００３９】（２）等電点電気泳動 本発明蛋白質の等電点を、バイオラッド社の等電点測定
キットを用いて測定した。本発明の蛋白質は単一のバン
ドとなり、等電点（ｐＩ）は、５.８５であった（図１
１）。
【００４０】（３）活性 本発明の蛋白質の生物活性を検定した。実施例１におい
て精製された本発明の蛋白質及び病原性大腸菌（E.coli
Pb176;CFA/II(CS1+CS3)）株を用いて、アシアロＧＭ１
への付着阻止を検定した。検定は、ＴＬＣオーバーレー
ヤー（OVER LAYER）法で行った。図１２に示される結果
から明らかなように、本発明の蛋白質は、病原性大腸菌
のアシアロＧＭ１に対する付着を投与濃度に応じて阻害
した。また、本発明の蛋白質の部分精製物もこの活性を
有していた。実施例１に記載したバイオゲルＰ１００に
よるゲルろ過のボイドボリューム画分と上記病原性大腸
菌株を用いて、細胞付着阻害アッセイ（Cell-binding i
nhibition assay）法で活性を検定した。結果を図１３
に示す。本発明の蛋白質は、ＨＣＴ−８細胞への大腸菌
の付着を顕著に抑制することが明らかである。
【００４１】（４）Ｎ末端アミノ酸配列 アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社
のモデル４７７Ａを用いて、実施例１で得られた本発明
の蛋白質のＮ末端アミノ酸配列分析を行い、Ｎ末端から
１６個目までの配列を決定した。この配列は下記の通り
である。 Val-Asp-Pro-His-Ala-Ile-Val-Pro-Ser-Asn-Phe-Asp-Ph
e-Ala-Phe-Leu-
【００４２】実施例３ 本実施例では、アシアロＧＭ１をコーティングしたポリ
スチレンビーズを用いた本発明の蛋白質の精製方法を示
す。タキ（Taki）らの方法（J.Biochem., 91,p1813-181
6,1982）により、アシアロＧＭ１コーティングポリスチ
レンビーズを調製し、これを充填したアフィニティカラ
ムを作製した。このカラムを、実施例１の第１回クロマ
トグラフィー後に使用した。カラムは、カラム容量０.
２５ml（５mm×１２.７mm）で、０.０４％ＮａＮ3を含
むＰＢＳで平衡化した後、クロマトグラフィー操作を行
った。１０mlの試料（蛋白質濃度１mg／ml程度）をカラ
ムに負荷し、その後、０.０４％ＮａＮ3を含むＰＢＳで
洗浄した。次いで、５mlの１Ｍ ＮａＳＣＮで蛋白質を
溶出し、この溶出蛋白質を水に対して透析した。蛋白質
画分は−８０℃で凍結保存するかまたは凍結乾燥した。
このカラム操作により、純度８５％以上の本発明の蛋白
質を得ることができた。その後の操作は、実施例１と同
様のクロマトグラフィー操作を行い、純粋な本発明の蛋
白質を得ることができた。回収率は、ほぼ５０％であっ
た。
【００４３】実施例４ 本実施例では、実施例１で得た蛋白質を抗原としてモノ
クローナル抗体を得て、この抗体により本発明の蛋白質
を精製した例を示す。実施例１で得た精製蛋白質で免疫
したＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞とマウスミエローマ細
胞（SP2/O-Ag14）を、常法に従って、ポリエチレングリ
コール存在下で融合させ、ハイブリドーマを作製した。
このハイブリドーマを培養し、得られた目的とするＩｇ
Ｇクラスの抗体（IgG1）を産生するハイブリドーマを選
択した。無血清培地で培養した当該ハイブリドーマの培
養上清をプロテインＡカラム（プロテインＡ−セファロ
ースカラム）を通過させ、さらに吸着された抗体を、常
法に従ってメチルピメリミデートで固定化した。この抗
体固定化カラムを、実施例１に記載した最初のゲルろ過
クロマトグラフィーの後に使用して、精製を行った。調
製した抗体固定化カラムは、ゲル５ml当たりに蛋白質と
して５mgが固定化されていた。抗体を固定化した担体
を、１０mＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）で洗浄した
後、４℃で１０mＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）に懸濁
し、試料を加え、２時間撹拌を続け、抗体に本発明の蛋
白質を吸着させた。同一の緩衝液で洗浄した後、担体を
カラム（１cm×６.３６cm）に充填し、さらに２５mlの
同一緩衝液で洗浄した。１００mＭのグリシン緩衝液
（ｐＨ２.５）で溶出し、蛋白質のフラクションに直ち
に、フラクション量の１／２０容量の１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８.０）を加えて、中和した。活性の失活はほと
んど認められず、本カラムを用いた１回のクロマトグラ
フィー操作で純度９５％以上の本発明の蛋白質を回収す
ることができた。尚、本発明蛋白質で免疫した動物の抗
血清を用いたポリクロナール抗体カラムを用いても同様
の純度の本発明の蛋白質を回収することができた。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、アシアロＧＭ１に親和
性を有する病原体の前記アシアロＧＭ１への付着を阻害
するビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属
する細菌が生産する新規蛋白質及びその生産方法が提供
される。本発明のビフィドバクテリウム（Bifidobacter
ium ）属に属する細菌が生産する蛋白質を使用すれば、
アシアロＧＭ１に親和性を有する病原体への感染を予防
すること及びそれらの病原体の感染症の治療をすること
ができる。さらに、本発明によれば、本発明の蛋白質に
結合性を有する抗体が提供される。この抗体を用いれ
ば、本発明の蛋白質を精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属
に属する細菌の培養上清が、病原性大腸菌のアシアロＧ
Ｍ１への付着阻害活性を有することを確認した結果を示
すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤの値を示す。
【図２】バイオラッドバイオゲルＰ１００カラムによる
ゲルろ過クロマトグラフィーのパターンを示す。図中の
デキストランブルーの溶出位置はボイドボリュームを示
し、フェノールレッドの溶出位置はカラムボリュームを
示す。
【図３】ＤＥＡＥ−セファロースカラムによるイオン交
換クロマトグラフィーのパターンを示す。
【図４】オクチルセファロースカラムによるクロマトグ
ラフィーのパターンを示す。上段は、硫酸アンモニウム
の濃度勾配及びＣＨＡＰＳ緩衝液の濃度勾配を示す。
【図５】オクチルセファロースカラムによるクロマトグ
ラフィーで得たフラクションのＳＤＳゲル電気泳動パタ
ーンを示す。
【図６】バイオゲルＡを用いたクロマトグラフィーのパ
ターンを示す。中心の活性は、フラクション１の画分に
存在する。
【図７】ＰＢＥ９４カラムを用いたクロマトグラフィー
のパターンを示す。上段はポリバッファー７４−ＨＣｌ
（ｐＨ７.４）により溶出する際のｐＨ変化及び食塩濃
度勾配を示す。
【図８】ウルトロゲルＡｃＡ２２カラムを用いたゲルろ
過クロマトグラフィーのパターンを示す。
【図９】ゲルろ過法クロマトグラフィーにより測定した
溶出時間から推定した本発明の蛋白質の推定分子量を求
めた検量線を示す。
【図１０】本発明の蛋白質の還元状態、非還元状態のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動パターンを示す。
【図１１】本発明の蛋白質の等電点を決定した検量線を
示す。
【図１２】本発明の蛋白質が大腸菌のアシアロＧＭ１へ
の付着を阻害する活性をＴＬＣオーバーレーヤー法で検
定した結果を示す。
【図１３】本発明の蛋白質が大腸菌のアシアロＧＭ１へ
の付着を阻害する活性を細胞付着阻害アッセイ法で検定
した結果を示す。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アシアロＧＭ１に親和性を有する病原体
    の前記アシアロＧＭ１への付着を阻害することを特徴と
    するビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属
    する細菌が生産する蛋白質。
  2. 【請求項２】 下記特性値で特定される請求項１記載の
    蛋白質。 分子量：ゲルろ過法で測定した場合は、約１０４,００
    ０で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した場合は、約５２,
    ０００ 等電点：約５.８ サブユニット構造：ホモダイマー構造 Ｎ末端アミノ酸配列： Val-Asp-Pro-His-Ala-Ile-Val-Pro-Ser-Asn-Phe-Asp-Ph
    e-Ala-Phe-Leu-
  3. 【請求項３】 アシアロＧＭ１に親和性を有する病原体
    が、大腸菌、緑膿菌、プロテウス、カンピロバクター、
    ロタウイルス、レオウイルスまたはポリオウイルスに属
    するものである請求項１または２記載の蛋白質。
  4. 【請求項４】 ビフィドバクテリウム（Bifidobacteriu
    m）属に属する細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガ
    ム（Bifidobacterium longum）ＳＢＴ ２９２８（工業
    技術院生命工学工業技術研究所（旧：工業技術院微生物
    工業技術研究所）受託番号「微工研菌寄第１０６５７号
    （ＦＥＲＭ Ｐ−１０６５７）」）である請求項１〜３
    のいずれかに記載の蛋白質。
  5. 【請求項５】 脱脂乳培地または半合成培地で、ビフィ
    ドバクテリウム属に属する細菌を培養し、培養後に培養
    上清から蛋白質を分離することを特徴とする請求項１〜
    ４のいずれかに記載の蛋白質の生産方法。
  6. 【請求項６】 培養上清を回収する際に、アシアロＧＭ
    １をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー
    を使用することを特徴とする請求項５記載の蛋白質の生
    産方法。
  7. 【請求項７】 培養上清を回収する際に、請求項１〜４
    いずれかに記載の蛋白質に対する抗体を用いたアフィニ
    ティークロマトグラフィーを使用することを特徴とする
    請求項５記載の蛋白質の生産方法。
  8. 【請求項８】 ビフィドバクテリウム（Bifidobacteriu
    m）属に属する細菌が生産しアシアロＧＭ１に親和性を
    有する病原体のアシアロＧＭ１に対する付着を阻害する
    ことを特徴とする蛋白質に結合性を有する抗体。
  9. 【請求項９】 抗体が、モノクローナル抗体である請求
    項８記載の抗体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2522358A1 (en) 2007-06-27 2012-11-14 Laboratorios Ordesa, S.l. Peptides against rotavirus infection

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2522358A1 (en) 2007-06-27 2012-11-14 Laboratorios Ordesa, S.l. Peptides against rotavirus infection

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