JPH01157387A - ヘモフィラス・インフルエンザワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） ｂ型ヘモフィラス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏ−ｐ
ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は長い間、特に胎
児及び子供に対して頻繁に起こる病気の病原であること
が分っているが、一方、区別不能Ｅ、イーンフルエンザ
エが重大な病原であることが最近になって分ってきた。

現在、区別不能Ｈ，インフルエンザエは、肺炎、菌属症
、軟膜炎、分娩後敗血症及び急性発熱性気管支炎を成人
に引き起こすことがよく分っている。さらに、区別不能
Ｈ，インフルエンザエは、新生児の敗血症を起こし、ま
た、しばしば幼児及び子供の急性中耳炎の病因である。

それゆえ、喀痰、脳髄液、血液及びその他のもののよう
な臨床試料を検定し、Ｈ，インフルエンザエの存在を確
認する方法を発見することは、明らかに重要である。

区別不能Ｈ，インフルエンザエが成人及び子供に重大な
感染を引き起こすという観察は、この細菌に関連する病
原及び潜在的発病因子の研究に対する興味を刺激する。

ｂ型Ｈ，インフルエンザエのアトニット膜は人間に対す
る発病因子であり、そして、膜に対する抗体は、殺菌的
そして、またはオプソニン作用によって、宿主を保護す
る。これらの観察から、ｂ型Ｈ，インフルエンザエでの
感染における膜条糖類の働き、及びこれらの感染からの
保護に関する多くの研究が発生した。しかし、区別不能
Ｈ，インフルエンザエは多１！類膜を欠いており、そし
て、他のダラム陰性細菌の外膜と同様に、Ｈ，インフル
エンザエの外膜は、外膜タンパク質類（ＯＭＰｓ　）及
び脂質多糖類（ＬＰＳ）を含んでいる。それゆえ、区別
不能Ｈ，インフルエンザエの発病性と、表面抗原との関
係の研究はＯＭ　Ｐ　ｓとＬ　Ｐ　Ｓに集中する。

区別不能Ｈ，インフルエンザエのＯＭ　Ｐ　ｓの分析は
、各株のＯＭＰ組成に著しい差があることを示した。例
えば、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）等の、ジャーナル・
オン・インフエクシャス・デシーズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃ
ｔ、　Ｄｉｓ、）　、１９８３年、１４７巻、８３８〜
８４６頁の“外膜タンパク質によるヘモフィラス・イン
フルエンザエの亜型化システム”；バーレンカンブ（Ｂ
ａｒｅｎｋａｍｐ）等の、インフエクション・アンド・
イムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）１９８
２年、３６巻、５３５〜５４０頁の病原性の区別不能ヘ
モフィラス・インフルエンザエの外膜タンパク質及びバ
イオタイプの分析”−ローブ（Ｌｏｒｂ）等の、インフ
エクション・アンド・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ、　
Ｉｍｍｕｎ、）　　１９８０年、３０巻、７０９〜７１
７頁の“ヘモフィラス・インフルエンザエの病気単離物
中の外膜タンパク質組成”参照。

区別不能Ｈ，インフルエンザエに対する、主要ＯＭＰｓ
に基づく亜型化システムは以前に開発されている。もし
、全ての株に保存されている表面露出抗原（免疫原）を
発見できれば、それは、Ｈ。

インフルエンザエに対するワクチン同様、臨床標本中の
Ｈ，インフルエンザエを同定する方法の開発のための重
要な道具となる。それゆえ細菌性軟膜炎を引き起こすこ
とが知られているｂ型のような区別可能Ｈ，インフルエ
ンザエを含む、全ての株中に保存されている、区別可能
及び区別不能Ｈ。

インフルエン（ドエの両方に存在する表面露出抗原を見
つけることが、本発明の目的となる。さらに、そのよう
な保存されている表面露出抗原を予め同定する方法を開
発することが本発明のもう１つの目的である。さらに、
そのような表面露出抗原に対するモノクローナル抗体を
開発することがもう１つの目的である。さらに、本発明
のもう１つの目的は、大量のそのような抗原を生産する
方法を開発することであり、そして、もう１つの目的は
、そのような抗原のための遺伝的配列を単離し、それを
新し２いプラスミド中に導入し、そして、大腸菌のよう
な細菌中でその配列を発現させ、そのような抗原を生産
することである。

本発明のもう１つの目的は、全ての株中に保存されてい
る、区別可能及び区別不能Ｈ，インフルエンザエ中の表
面露出抗原及びそのモノクローナル抗体の組合せを通し
て、Ｈ，インフルエンザエを検出するための診断テスト
に使われるＤＮＡプローブを構築することである。

（本発明の内容） 本発明に従うと、区別不能ヘモフィラス・インフルエン
ザエの免疫原領域で、その免疫原領域が、区別不能の多
くのＨ，インフルエンザエ株中に保存されているものの
遺伝コードを含むプラスミドが提供される。さらに本発
明は、上記プラスミドを含み、そして、上記遺伝配列を
発現する細菌を包含し、そして、その免疫原領域に対す
るモノクローナル抗体を包含し、さらに、上記モノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマを包含する。

その免疫原領域は、Ｈ，インフルエンザエの外膜タンパ
ク買上のエピトープであることが好ましく、そして、特
にそれが１６，６００ダルトンの外膜タンパク質である
ことが望ましい。この１６．６００ダルトンの外膜タン
パク質を発現する遺伝子の　ＤＮＡ配列は１２５番目の
ヌクレオチドから始まり、そして、５２６番目のヌクレ
オチドまで続くと考えられている。その免疫原領域はそ
の純粋な状態もしくはより長い鎖状タンパク質の一部と
して生産される。

臨床試料中のＨ，インフルエンザエを検出する診断テス
トは、多くの区別不能Ｈ、インフルエンザエ株中に保存
されている免疫原領域をコードする核酸に対応するよう
構築されたＤＮＡプローブで行なわれる。このプローブ
は、例えば放射性マーカーで標識する。

ここで用いている“区別不能ヘモフィラス・インフルエ
ンザエ”とは、多糖類膜を欠き、そして、外膜タンパク
質’Ｉ（ＯＭＰｓ）を含む外膜を有し、そしてまた、脂
質多ＩＰ［（ＬＰＳ）を含むＨ，インフルエンザエを意
味している。

“免疫原領域”とは、宿主生物中で免疫学的抗体の応答
を示す領域を意味する。そのような領域は抗原と考える
ことができる。

“エピトープ゛とは、特異的な免疫学的応答を行う限ら
れた免疫原領域を意味する。

本発明に従って、１６，６００ダルトンの外膜タンパク
質（ｐ６）上のエピトープを認識する、マウスのモノク
ローナル抗体を、区別不能ヘモフィラス・インフルエン
ザエに対して開発した。このエピト−プは、区別可能及
び区別不能株を含む、テストした、１１５個のＨ，イン
フルエンザエ単離物全てに存在した。その他の８９株の
細菌のスクリーニングは、このエピトープは、テストし
た、事実１全てのその他の細菌種には存在しないので、
それが、［（、インフルエンザエに対する非常に特異的
なマーカーであることを示した。ウェスタン・プロット
検定法を、２人の正常なヒトの血清試料及び区別不能な
Ｈ，インフルエンザエによる菌血症の成人に由来する回
復期の血清を使って行った。

１６．６００ダルトンの外膜タンパク質に対する抗体は
、全ての三人のヒトの血清試料中に存在した。

８個のＯＭＰ亜型を示す、区別不能Ｈ，インフルエンザ
エの原型株を我々自身のコレクションから得た。前述の
マーフィー（Ｍｕｒｐｔ＋ｙ）等の文献参照せよ。３５
２４株をエリ−・カランティー・メディカル・センター
　（Ｔｈｅ　Ｅｒ１ｅ　Ｃｏｕｎｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ）　　（Ｎ　Ｙ　、バッファロー）の、慢
性気管支炎患者の喀痰から単離した。Ｓ、パーク（Ｂｅ
ｒｋ）博士（Ｔｅｎｎ、マウンテン・ホーム（Ｍｏｕｎ
ｔａｉｎ　Ｉｌｏｍｅ）、Ｖ、Ａ、メディカル・センタ
ー）は、血液又は気管吸引物からの区別不能Ｈ，インフ
ルエンザエの１４株を提供した。区別不能Ｈ，インフル
エンザエの残りの株は、エリ−・カランティー・メディ
カル・センター（Ｔｈｅ　Ｅｒ１ｅ　Ｃｏｕｎｔｙ　Ｍ
ｅｄｉｃａｌＣｅｎ　ｔｅｒ）及びバッファローＶ、Ａ
、　メディカル。

センター（Ｂａｆｆａｌｏ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ
ｅｒ　）からの臨床単離株である。

Ｊ、ワード（Ｗａｒｄ）博士（ロサンゼルス、カリホル
ニア大学）は、ｂ型のＨ，インフルエンチエ５４株を提
供した。Ｈ，インフルエンザエの残りの株は、バッファ
ロー・チルドレンズ・ホスピタル（Ｂａｆｆａｌｏ　Ｃ
ｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ　１ｌｏｓｐｉｔａｌ）からの臨床
単離株である。他の膜血清型のＨ，インフルエンザエの
参照株は、センター・フォー・デシーズ・コントロール
（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　
Ｃｏｎｔｒｏｌ）（アトランタ）から得たものである。

ヘモフィラス・パラフロフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉ　
１ｕｓｐａｒａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ
２９２４０、ヘモフィラス・セグニス（Ｈａｅｍｏｐｈ
ｉ　ｌｕｓ　ｓｅｇｎｉｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１０９７７
、ヘモフィラス・バラインフルエンザ工（Ｈａｅｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　Ａ　Ｔ
　ＣＣ７９０１及び９２７６、ヘモフィラス・アエジプ
チカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｅｇｙｐｔｉｃｕ
ｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣｌ　１１１６、ヘモフィラス・パラ
ヘモリチカス（Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　ｌｕｓｐａｒａｈ
ｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１００１４、区
別不能Ｈ，インフルエンザエ（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１９４１８、アクチノバチルス・ア
クチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ−ｃｏｍｉｔａｎｓ
）　ＡＴＣＣ２９５２２，ＡＴＣＣ２９５２３、ＡＴＣ
Ｃ２９５２４，ＮＣＴＣ９７０７、及びＮＣＴＣ９７１
０、アクチノバチルス・エクイリ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｅｑｕｉｌｉ）八ＴＣＣ１９３９２、アク
チノバチルス・セミニス（Ａｃｔｉｎｏ−ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｓｅｍｉｎｉｓ）　ＡＴ　ＣＣ１５７６Ｂ　、及
びアクチノバチルス・スイス（八ｃｔｉｎｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｉｓ）ＡＴＣＣ１５５５７は、Ｊ、ザムボ
ン（Ｚａｍｂｏｎ）博士（バッファローのニューヨーク
州立大学、歯′　　学教室）から提供された。その他の
全ての単離株は、エリ−・カランティー・メディカル・
センター　（Ｔｈｅ　Ｅｒ１ｅ　Ｃｏｕｎｔｙ　Ｍｅｄ
ｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）の臨床微生物学ラボラトリ−
から提供された。

Ｈ，インフルエンザエ株の同定は、コロニーの形態、及
びヘミン及びニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチ
ドの生長要求性によって行った。膜の血清型は参照株及
び前述のマーフィ＝（Ｍｕｒｐｈｙ）等（センター・フ
ォー・デシーズ・コントロール（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒ
　ｆｏｒ　Ｄｅｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）由来の血
清を用いたＣＩＥにより決定した。株は、ミュラー・ヒ
ントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）培地＋１０％
グリセリン中、−７０℃で保存した。

ＢＡＬＢ／ｃマウスを、区別不能Ｈ，インフルエンザエ
３５２４株、１０９個細胞０．１ｍｊで０日目及び２８
日目に免疫化した。初期免疫後３２日目に、選択したマ
ウスをクロロホルムで殺し、その肺臓を取り出し、モし
て肺臓リンパ球を、最小基本培地を用いた胛髄の潅流に
より収穫した。

供与体の肺臓細胞をＮＳＩ　　（ＩｇＧＩ　　ＢＡ／Ｃ
血漿細胞腫Ｐ　３　ｘＡｇ　８の非分泌型変異株）の血
漿細胞腫細胞（国立がん研究所約定Ｎｏ　１−ＣＢ−２
３８８６の下にソータ・インキュベ−ト・オン・バイオ
ロジー（ｔｈｅ　５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｙ）　（カリホルニア・ラジョラ）から入
手した）に融合することによりハイブリドーマを発生さ
せるために、メソソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　１９７９年、５８巻
、３４５〜３５９頁のケネット（Ｋｅｎｎｅｔｔ）の操
作の修正法において、３５％のポリエチレン・グリコー
ルを用いた。簡単に言うと、血清を入れた最小基本培地
中で、１０７個の肺臓細胞を１０ｂ個のＮ５−１細胞と
合せた。その細胞を２５℃、１７０ｇで１０分間遠心し
た。全て上清を除き、そしてそのペレットを軽くたたい
て、はぐす。血清を含まない最小基本培地中の３５％ポ
リエチレングリコール１０００　　（シグマ・ケミカル
（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）セントルイス
）溶液０．２ミリリツトルを加え、そして、その混合物
を緩やかに攪拌し、さらに２５℃で、最後の３分間、５
００ｇの遠心により、その細胞をペレット化するよう８
分間放置した。

その８分間の後、血清を含む５ｍ／の最小基本培地を加
え、そして緩やかなピペット操作により、そのペレット
を再懸濁した。その混合物を室温（２５°Ｃ）、２５０
ｇで５分間遠心した。全ての上清を除去する。完全最小
基本培地（グルコース（４，５■／ｍｅ’）及び２０％
胎児ウシ血清を含む培地）５ｍｌ！を添加し、そのペレ
ットを再）Ｕ濁した。その混合物を、適当量の完全最小
基本培地を入れた２　５ｍ＃のアーレンマイヤー・フラ
スコに移し、３Ｘ１０５個／　ｍ　ｌの血漿細胞腫細胞
を得た。その細胞を緩やかに攪拌し、そして、マイクロ
プレートのウェル中にある０、０５ｍ１の試料に分配し
た。

ポリエチレン・グリコール融合後２４時間後に、ヒポキ
サンチン（１３，６μｇ／ｍ＃）、アミノプテリン（０
，３６μｇ／ｍｌ）及びチミジン（３，８７μｇ／ｍｅ
）を各ウェルに加えた。そのマイクロプレートを５％Ｃ
Ｏ２及び９５％空気の雰囲気で、８５％湿度の組織培養
インキュヘーター中に置いた。ヒボキサンチン、アミノ
プテリン及びチミジンを含む新しい培地を７日目に加え
、そして、そのプレートを１０日後、顕微鎮火のプラー
クの存否をチエツクした。全てのウェルからの上清をイ
ライザ法（酵素結合最小吸着検定法）を用いて、抗体の
存否をテストした。

イライザ法は、ポリビニル製の９６穴マイクロプレート
（ＶＡ、アレキサンドリア・ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈ、）中で行った；各ステップで２００μｌの体積を
採用した。

ウェルは、アメリカン・ソサイヤティー・フォー・マイ
クロバイオロジー（八ｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｅｉｔｙ
　ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　、１９７８年、
１２１−１２９頁の“ネイセリアゴノルホカエ（Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒ−ｈｏｃａｅ）の免疫生物学
”中のジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）の方法により、調
製した区別不能Ｈ，インフルエンザエ３５２４株の細胞
外被調製物（１０μｇ／ｍｆｆ）でコートした。そのプ
レートを３７℃で１時間インキュベートし、ついで４℃
で１晩インキユベートした。ウェルをＰＢＳ　（リン酸
緩衝食塩水）＋０．０５％トウィーン２０Ｒ表面活性剤
で各ステップ３度づつ洗浄した。そのプラスチックの未
結合部位は、ＰＢＳ中３％のウシ血清アルブミンを用い
、３７℃、２時間でブロックした。モノクローナル抗体
を含む組織培養上清（又は、ひきつづく実験におけるマ
ウス腹水液の希釈液）を４℃で一晩、ウェル中でインキ
ュベートした。マウスＩｇＧ及びＩｇＭに対するウサギ
の抗体を３７°Ｃで２ｈｒインキユベートし、ついで、
プロティンＡ・パーオキシダーゼにより、３７℃で２時
間処理した。それから基質２００マイクロリツトルを各
ウェルに加えた。基質は、１＋＋＋４２メタノールに１
０■の０−フェニル・エチレンジアミンを？容かし、こ
の溶液を９９ｍ１のクエン酸−リン酸バッフｙ　（ｐＨ
５，０）　＋０．１ｍｊ！の３％Ｈ２０□に添加した。

暗所、室温で、その基質を４５分間インキュベートした
後、その反応を５０μｐの４Ｎ硫酸を加えて停止させる
。各セントのイライザ法は、テストされるモノクローナ
ル抗体の代りに、Ｎ５−１組織培養上清又は腹水液を用
いるコントロールと共に行った。イライツ・スクリーニ
ングの結果に基づいて、選択したクローンを、より大き
い組織培養ウェルへ移すことにより増殖させた。大量の
抗体を組織培養において、及びプリスタン感作Ｂ　Ａ　
Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスへの１０″ハイブリドーマ細胞の
ｉｐ注射により生産した。生成した腹水液を３〜４週間
後に収穫し、そして、その特異性をテストした。

検定した株を、９５％空気及び５％ＣＯｚ雰囲気下、３
７°Ｃで一晩、チョコレート寒天培地（又はその種に依
存したその他の適当な培地）で生育した。１つのプレー
トからの細胞を、ＰＢＳ中の懸濁液からの、１００００
ｇ、２０分間の遠心により収［した。生じたベレットを
マイクロピペットでその懸濁液を吸い上げるのに十分な
１）　Ｂ　Ｓに懸濁した。細菌の懸濁液０．１ミリリツ
トルを同バッファ　（０，０６Ｍ１−リス、１．２％Ｓ
ＤＳ、１％Ｂ−メルカプトエタノール、１１．９％グリ
セロール）に加え、その後、沸騰水浴中で５分間加熱し
た。

生成した有機体を全細胞調製物と呼んだ。

全細胞調製物１０μβをニトロセルロース膜（ＮＨ，キ
ーン（Ｋｅｅｎｅ）　、シュＬ／イチャー・アンド・シ
ュニル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｎｅ
ｌｌ、　　Ｉｎｃ、）に滴下し、空気乾燥させた。それ
から、その膜をバッファＡ（０，０１２１ＶＩ）リス及
び０．１５　ＭＮａＣβ（ｐ）１７．４））中の３％ゼ
ラチン溶液中に１時間浸す。その膜をバッファＡで洗浄
した後、適当な抗体希釈物中にその膜を置き、そして、
室温で一晩振盪する。その膜をバッファＡで洗浄し、そ
して、プロティンＡパーオキシダーゼ（サン・フランシ
スコ、ジムド・ラボラトリ−（ＺｙｒｎｅｄＬａｂｏｒ
ａｔｏｒ　１ｅｓ）の３．０００分の１希釈液の中に浸
し、さらに、室温で１時間振盪する。その膜を洗浄し、
ホースラデイツシュ・パーオキシダーゼ発色現像液（０
，０１５％Ｈ，Ｏ□　：カリホルニア・リッチモンド（
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）　、バイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）　）に４５分間浸す、各膜上で検定するコントロール
としては、同バッファを用いた（ネガティブ・コントロ
ール）。ネガティブな結果は、そのドツトが背景の色と
区別がつかない時に記録し、そのドツトが青紫色に変色
したときに、ポジティブな結果として記録した。このド
ツト検定法において、不明確な結果を与えた株は、ウェ
スタン・プロット検定法にかけた。

ＬＰＳの調製 脂質多糖類（ＬＰＳ）は、区別不能Ｈ，インフルエンザ
エ３５２４株から、２つの方法により調製した。第一の
方法は、メソッド・イン・カーボハイドレート・ケミス
トリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏ−ｈｙｄｒ
ａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９６５年、５巻、８
３〜９１頁、“細菌の脂質多糖類″に示されているウェ
スト７７　ル（Ｗｅｓｔ−ｐｈａｌ）及びジャン（Ｊａ
ｎｎ）のフェノール水抽出法の修正法である。第２の方
法は、ジャーナル・オン・バクテリオロジ−（Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１９８３年
、１５４巻、２６９−７７頁に示されているヒツチコッ
ク（Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ）とブラウン（Ｂｒｏｗｎ）の
方法である。後者の方法は、タンパク質は加水分解する
が、ＬＰＳにはなんの影響も与えない酵素プロテアーゼ
Ｋ（西ドイツ・マンハイム（！、ｌａｎｎｈｅｉｍ）、
ベーリンガー・マンハイムＧｍ　ｂ　Ｈ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｇｍｂ）Ｉ）を用いてい
る。

全細胞及びＬ　Ｐ　Ｓ調製物を各々１１％又は１３．２
％分離ゲルを用いた、前述のマーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ
）等の方法による５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナ
トリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）にかけ
た。電気泳動が完了したら、そのゲルを沸騰水中で予め
煮沸したニトロセルロース膜と合せ、さらにその膜を０
．３　Ｍクエン酸ナトリウム＋３ＭＮａＣＲ溶液に浸し
た。電気泳動的トランスファーは、トランス−プロット
７セル（Ｔｒａｎｓ−ＢｌｏｔＲｃｅｌｌ）　　（バイ
オ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製）中、５０Ｖ、９０分で
行った。電極バッファは、０．０２５Ｍトリス（ｐＨ８
，３）　、０．１９２Ｍグリシン及び２０％メタノール
である。それからそのニトロセルロース膜をドツト検定
法と全く同じように処理した；３％ゼラチンでブロック
した後、抗体７Ｆ３、タンパク質入−パーオキシダーゼ
及び基質ホースラディシュ・パーオキシダーゼ発色現像
液で順番処理した。

表面ＯＭＰｓの放射性ヨウ素標識 表面露出ＯＭＰｓの外部からの標識は、インフエクショ
ン・アンド・イムノロジー（Ｔｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、）　　（１９８１年）、３２巻、１０８４
〜１０９２頁に報告されているハンセン（ｔ（ａｎｓｅ
ｎ）等の、ラクトパーオキシダーゼにより触媒される放
射性ヨウ素化操作により行った。

マイクロプレートにコートした、区別不能Ｈ。

インフルエンザ１３５２４株の外膜を使ったイライラ法
で、７Ｆ３と命名したハイブリドーマがその細菌の外膜
中の決定因子を認識する抗体７Ｆ３を生産することを示
した。ゲル免疫拡散法は、この抗体がＩ　ｇｏ、３のア
イソタイプであることを示した。図１は、抗体７Ｆ３に
より認識される決定因子が１６，６００ダルトンの分子
サイズのタンパク買上にあることを示したウェスタンプ
ロットを示している；　レーンＡは、ニトロセルロース
膜上の分子量標【Ｖを示している。そしてレーンＢば、
区別不能Ｈ，インフルエンザエ３５２４株の全細胞調製
物中の抗体７Ｆ３により認識される１６，６００ダルト
ンのタンパク質を示している。特に、レーンＡは、１３
．２％のゲルからトランスファーされた分子量標準を示
し、レーンＢは、抗体７Ｆ３、プロティンＡ−パーオキ
シダーゼ、及びパーオキサイド基質とインキュベートし
た区別不能Ｈ，インフルエンザエ３５２４株の全細胞調
製物を示し、そして、レーンＣは、１２５Ｉで外部から
標識した細菌から作った区別不能Ｈ，インフルエンザ二
３５２４株の全細胞調製物のオートラジオグラフである
。三し−ン全てが同じゲルからのものである。Ｈ，イン
ラルエンザエ２５株について、本方法テ行ったウェスタ
ン・プロット検定法は、全ての株で、抗体７Ｆ３がこの
１６．６００ダルトンのタンパク買上の決定因子を認識
することを示した。この抗体は、多くの株における同分
子サイズのタンパク買上の決定因子を認識するために、
我々は、ウェスタン・プロット法よりもむしろトッド検
定法を用いて、多量の株をスクリーニングした。

抗体７Ｆ３により認識されるそのタンパク質が外部から
標識されるかどうか決定するために、我々は＋２５１で
区別不能Ｈ，インフルエンザエを標識した。そのタンパ
ク質を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、それからニトロセル
ロース膜にトランスファーした。１つのレーンはＸ線フ
ィルムの露光に用い、もう１つは７Ｆ３、プロティンＡ
−パーオキシダーゼ結合物及び基質とインキュベートし
た。

図１は、抗体７Ｆ３により認識されるバンド（レーンＢ
）は、Ｉｚｓ　１標識ハンド（レーンＣ）と対応するこ
とを示している。

さらに、抗体７Ｆ３により認識されるエピトープが、あ
るタンパク買上のものか、又はＬＰＳ上のものかを検定
するために、我々は２つの別の実験を行った。一部のウ
ェルを区別不能Ｈ，インフルエンザエ３５２４株からの
全細胞調製物でコートし、他のウェルは、前述のウエス
トファル（Ｗｅｓｔ−ｐｈａｌ）のフェノール−水洗に
より、区別不能Ｈ。

インフルエンザ１３５２４株から調製したＬ　Ｐ　Ｓで
コー１−　して、上述のようなイライラ法を行った。

抗体７Ｆ３は、前述のジョンストン（Ｊｏｈｎｓ　ｔｏ
ｎ）の報告されているように、ＯＭＰｓ及びＬＰＳを含
む、全細胞調製物（ＯＤ、、　０．３７５）とは反応す
るが、ＬＰＳ　（○Ｄ、０．０６２）とは反応しなかっ
た。この結果は、抗体７Ｆ３で認識されるエピトープは
、ＯＭＰ上に存在することを示している。

図２は、抗体７Ｆ３でＭＥ　Ｊされるエピトープがタン
パク買上にあるのかＬＰＳ上にあるのかを検定するよう
計画されたもう１つの実験を示したウェスタン・プロッ
ト検定法の図である。Ａと印されたレーンは、ヒツチコ
ック（Ｈｉｔｃｈｃｈｏｃｋ）等により、ジャーナル・
オン・バタテリオロジー（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　　１９８３年、１５４巻、２
６９〜２７７頁に報告された、３５２４株の細胞のプロ
テアーゼＫによる溶菌により調製したＬＰＳを含み、Ｄ
と印をつけたレーンは、前述のウエストファル（Ｗｅｓ
ｔ−ｐｈａｌ）等により報告された、フェノール・水洗
により調製した３５２４株のＬＰＳを含み、そして、Ｃ
と印されたレーンは、３５２４株の全細胞調製物を含ん
でいる。全ての試料を、同じゲルで検定し、同じニトロ
セルロース膜にトランスファーした。図２の左は、抗体
７Ｆ３（ＩＩ！水液５００分の１希釈物）とインキュベ
ートし、そして、図２の右は、Ｈ，インフルエンザエの
ＬＰＳの脂質Ａ領域を認識するモノクローナル抗体、３
Ｄ２（Ｉｌｌ水液５００分の１希釈物）とインキュベー
トした。抗体７Ｆ３はいずれのＬＰＳ調製物とも結合し
なかったが、全細胞調製物中の分子量１６．６００のバ
ンドとのみと結合した。この観察は１、抗体７Ｆ３が、
ＬＰＳ上のものではなく、タンパク買上のエピトープを
認識することを示している。

特に、図２は、１３．２％ゲルからのウェスタン・プロ
ット検定法の結果を示している。（左）、抗体７Ｆ３と
のインキュベーション及び（右）、Ｈ，インフルエンザ
エの脂質Ａ上のエピトープを認識する抗体３Ｄ２とのイ
ンキユベーション。レーンＡは、プロテインナーゼにで
の溶菌により調製した区別不能Ｈ，インフルエンザエの
ＬＰＳを含んでおり、レーンＢは、３５２４株のフェノ
ール・水性によりｍｌしたＬＰＳを含み、そして、レー
ンＣは３５２４株の全細胞調製物を含んでいる。分子標
準は右側に示した。

抗体７Ｆ３により認識される抗原の種特異性を測定する
研究が行なわれた。Ｈ、インフルエンザエの１１５個の
単離株の全細胞調製物を、ドツト検定法又は、ウェスタ
ン・プロット検定法で研究した。その株は、７３個のｂ
型１．３７個の区別不能株及び各々１個のａ型及びＣ％
　ｆ型株が含まれていた。抗体７Ｆ３により認識される
エピトープは、全ての１１５株のＨ，インフルエンザエ
に含まれており、この結果は、このエピトープがＨ。

インフルエンザエの株に共通した抗原であることを示し
た。

Ｈ，インフルエンザエとは異なる細菌中に、このエピト
ープが存在するかどうかを決定するために、種々の細菌
種の６０個の単離株について調べてみた。これら６０株
の全てが抗体７Ｆ３で認識される決定因子を欠いていた
（表１）。

表　　　１ 種々の細菌種に対する抗体７Ｆ３の特異性１丁　　　　
　　　　　拭隨改−−匪件ｑ敗グラム陰性 大腸菌　　　　　　　　　　１０　　　０アクチノハチ
ラス種　　　　１０　　　０プロテウス種　　　　　　
　　　７０ シユ一ドモナス種　　　　　　５０ クレブシ工ラ種　　　　　　　４０ セラチア種　　　　　　　　　４０ エンテロバクタ−・　　　　　　１０ クロアカエ モルガネラ・モルガニイ　　　１０ ネイセリア・　　　　　　　　６０ ゴノルホエアエ ネイセリア・スペシェス　　　２０ グラム陽性 スタフィロコッカス・　　　　５０ アウレウス スタフィロコッカス種　　　　２０ ビリダンス・　　　　　　　　　１０ ストレプトコソシ ストレプトコッカス・　　　　１０ フアエカリス ジフテロイド　　　　　　　　１０ 計　　　　　　　　　　　６０　　　　０１■、インフ
ルエンザエ以外のへモフィラス種の２９個の株を研究し
た。これらの単離株中２５株が７Ｆ３エピトープを有し
ていなかった（表２）。

Ｈ，パラへモリティカス（ｔ（、ｐａｒａｈｅｍｏｌｙ
ｔｉｃｕｓ）の２株はその決定因子を含んでいた。加え
て、Ｈ。

バラフロフィラス（ｔ（、ｐａｒａｐｈｒｏｐｈｉｌｕ
ｓ）の１株及びＨ，アエジプティカス（Ｈ，ａｅｇｙｐ
ｔｉｃｕｓ）の１株は、抗体７Ｆ３により認識される２
　０，０００ダルトンのタンパク質を含んでいた。

表　　　２ 様々な種のへモフィラスに対する 抗体７Ｆ３の特異性 種　　　　　　　　　　試験数　陽性の数Ｈ，パライン
フルエンザエ　　２４　　０Ｈ，パラへモリチカス　　
　　　２２ Ｈ，バラフロフィラス　　　　　１１″′Ｈ、セグニス
　　　　　　　　　１０ Ｈ，アエジフチカス　　　　　　１　　　ビ計　　　　
　　　　　　　　　２９　　　４＊ウエスタン・プロン
ト検定法において、抗体７Ｆ３は、これらの株中の２０
．　ＯＯＯダルトンのタンパク質を認識した。

ヒト血清抗体 ウェスタン・プロット検定法により、１６．６００ダル
トンのＯＭＰに対する抗体の存在について、ヒトの血清
をテストした。図３は、同じゲルで検定し、及び、ニト
ロセルロース紙にトランスファーした、区別不能Ｈ，イ
ンフルエンザエ３５２４株の全細胞調製物について示し
たものである。レーンＡは、７Ｆ３腹水とインキュベー
トしたもので、１６．６００ダルトンのタンパク質に対
応する単一のバンドを示している。レーンＢ及びレーン
Ｃは、２つの異なる正常なヒト血清試料とインキュベー
トしたものであり、そして、レーンＤは区別１不能Ｈ，
インフルエンザエによる菌属症発病７日後の成人から得
られた血清とインキュベートしたものである。全ての三
種のヒト血清は抗体７Ｆ３により認識される決定因子を
含む１６，６００ダルトンのＯＭＰに対する抗体を有し
ている。この１６．６００ダルトンの外膜タンパク質を
発現する遺伝子のＤＮＡ配列は、１２５番目のヌクレオ
チドから始まり、そして、５２６番目のヌクレオチドま
でつづく。このアミノ酸配列は、その挿入物の一部とし
て含まれている。その遺伝子は、次の配列を有すると考
えられている。

このバンドは、ヒトの血清中の抗体により認識される、
最も優越したものの１つであることに注意することは価
値がある。

特に、図３は、１３．２％ゲルからのウェスタンプロッ
ト検定法を示している。全ての４つのレーンは、同じゲ
ルからの、区別不能Ｉ］・インフルエンザ１３５２４株
の全細胞調製物を含んでいるが、各レーンは異なる抗血
清とインキュベートしたものである：レーンＡ；抗７Ｆ
３、レーンＢ及びレーンＣ；２つの異なる正常なヒト血
清試料（５００分の１希釈）、レーンＤ；成人中の、区
別不能Ｈ・インフルエンザ二による菌血症発病後１７日
目に得られた血清（５００分の１希釈）。抗血清とのイ
ンキュベートにつづいて、プロティンＡ−パーオキシダ
ーゼ及びパーオキサイド基質とインキュベートした。矢
印は、全ての三つのヒト血清試料が、７Ｆ３エピトープ
を含む１６，６００ダルトンのＯＭＰに対する抗体を含
むことを示している。

分子量標準は左に示した。

本発明に従って、区別不能Ｈ・インフルエンザ二の表面
の１６，６００ダルトンのＯＭＰ上のエピトープを認識
する１ｇＧ３マウス・モノクローナル抗体を開発した。

このエピトープは、区別可能又は区別不能株を含む、全
ての１１５個のＨ・インフルエンザエ単離株中に存在し
た。非−へモフィラス種の６０種の株のスクリーニング
により、そのエピトープは、これら細菌の全てに存在し
ていないことが分った。そのエピトープは、Ｈ・パライ
ンフルエンザエ（トｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　
２４株中には存在しなかったが、その他のへモフィラス
種の４〜５株中には存在した（表２）。これらの種は、
ヒトの異常な病原となる。それゆえ、臨床的に関連した
単離株の立場から、抗体７Ｆ３はＨ・インフルエンザ二
に非常に特異的である。

Ｈ・インフルエンザ二に非常に特異的な、共通エピトー
プを認識するこのモノクローナル抗体は、臨床的微生物
学研究室における道具として有用である。Ｈ・インフル
エンザ二のようなく区別可能も区別不能も）臨床的単離
株の同定する迅速テストは、そのような抗体に基づいて
開発することができる。この特異的エピトープを利用す
るためのＤＮＡプローブを構築するため、Ｐ６をコード
する遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。このＤＮＡ配列に
基づき、活性のあるＰ６タンパク質のアミノ酸配列を導
くことができる。この情報は、エピトープマツピングと
して知られることをするのに用いることができる。

エピトープ・マツピングとは、多くの小さなペプチドを
構築し、そしてそれらのペプチドをモノクローナル抗体
７Ｆ３との反応性についてテストすることを含んでいる
。７Ｆ３により認識されるエピトープはＨ・インフルエ
ンザ二に特異的なので、その抗体により認識されるペプ
チドは、Ｈ・インフルエンザエ上の特異的決定因子を代
表していることになる。ひとたびそのペプチドのアミノ
酸配列が知れれば、その断片のＤＮＡ配列が導びかれる
。Ｈ・インフルエンザ二は、このエピトープをヒコード
する遺伝子を含んでいるので、この細菌は、この配列に
反応する配列を存しているＤＮＡを含むことが分る。そ
れゆえ、ＤＮＡプローブを、Ｐ６上の特異的エピトープ
をコードする核酸に対応するよう構築することができる
。そのプローブがひとたび構築されれば、例えばその−
部を放射活性で標識することができる。

そうすれば、このプローブを、喀痰、脳髄液、血液及び
その他の臨床試料の、Ｈ・インフルエンザ二の存否に対
する検定に用いることができる。

このことは、そのＤＮＡプローブがＨ・インフルエンザ
二の遺伝子内に存在する、それと相補的な塩基と結合す
るという理由で、可能であろう。このプローブがひとた
び構築されてしまえば、この方法は、ヘミン及びニコチ
ンアミド・アデニン・ジヌクレオチドに対する生育要求
性を示す、現在広く採用されている方法を越えた利点を
示すことであろう。特異的モノクローナル抗体を用いた
検定法では２４時間も短かい時間で、結果がでるであろ
う。

ＯＭ　Ｐ　ｓ及びＬＰＳは、ダラム陰性細菌の外膜上で
密接に関連している。抗体７Ｆ３により認識される決定
因子が、ＬＰＳが分離する分子量範囲内に存在するとい
う事実及び観察結果は、この決定因子がタンパク買上に
あるのか、ＬＰＳ上にあるのかという問題を引き起こす
、いくつかの証拠は、抗体７Ｆ３により認識されるエピ
トープがタンパク買上にあることを示している。第１に
、ＳＤＳゲルのコマージ・ブルーによる染色は、全ての
Ｈ・インフルエンザエ株中の１６，６００ダルトンの位
置に、抗体７Ｆ３により認識されるバンドの存在を示し
た。コマージ・ブルーはタンパク質は染めるがＬＰＳは
染めないので、この観察は、抗体７Ｆ３は、タンパク質
の決定因子を認識していることの推定証拠である。第２
に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・プロットにおけ
るバンドの構成がタンパク質に典型的なものである；Ｌ
ＰＳは抗体７Ｆ３エピトープが存在する位置のバンドよ
りも一般的により不明瞭な多くのバンドを示す。さらに
、この点は、ＬＰＳ決定因子を認識するモノクローナル
抗体は、全細胞調製物のウェスタン・プロット検定法に
おいて、抗体７Ｆ３により認識される明瞭な単一バンド
と対照的な、典型的”　ＬＰＳ　”パターンを示すとい
う観察により確証された。第３に、イライザ法により、
抗体７Ｆ３は、ＯＭ　Ｐ　ｓ及びＬＰＳを含む全細胞調
製物との反応性を示したが、その抗体は、単離したＬＰ
Ｓとは反応しなかった。最後に、ウェスタン・プロット
検定法において（図２）、抗体７Ｆ３は、全細胞調製物
中のバンドは認識したが、２つの異なる方法により精製
したＬＰＳ上の決定因子は認識できなかった。総合して
みると、これらの観察は、抗体７Ｆ３によって認識され
るエピトープはＯＭＰ上に存在することを示している。

抗体７Ｆ３のエピトープを含むＯＭＰが表面に露出して
いるかどうかを検定するために、ＯＭ　Ｐを、前述のハ
ンセン（Ｈａｎｓｅｎ）等が報告した、ラクトパーオキ
シダーゼで触媒される放射性ヨウ素化操作を用いて標識
した。図１は、その抗体７Ｆ３のエピトープを含むタン
パク質が放射性標識されていることを示している。ここ
での目的に対し、“表面露出”又は“外膜”という言葉
は、抗体結合に利用可能であることを意味している。

区別不能Ｈ・インフルエンザ二のＯＭＰ類は、５ＤＳ−
ＰＡＧＥ分析で示されているように、株によって異なる
。３２，０００から４２，０００ダルトンの範囲にある
主要ＯＭＰのこの変化は、前述のマーフィー（Ｍｕｒｐ
ｈｙ）等により報告された、区別不能Ｈ・インフルエン
ザ二に対する亜型システムの基礎となっている。三つの
研究室でのＨ・インフルエンザ二のＯＭＰ類の研究で、
前述のマーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）等、バレンカンプ（
Ｂａｒｅｎｋａｍｐ）等及びロエブ（Ｌｏｅｂ）等によ
り報告されているとおり、独立に、研究された全てのＨ
・インフルエンザ二の株において、１６，６００ダルト
ンのＯＭＰの存在に注目していることは興味深い。抗体
７Ｆ３により認識される抗原決定因子を含むのは、まさ
にこのタンパク質である。本研究は、この低分子ＯＭＰ
上の抗体７Ｆ３により認識されるエピトープは、Ｈ・イ
ンフルエンザ二の全ての株に共通した抗原であることを
示している。多くの株に共通した表面抗原を同定するこ
とは、単一の共通した抗原を使った免疫化が、多くの株
に帰因する病気を予防するという理由で、ワクチン開発
の見地から有用である。さらに、この１６，６００ダル
トンのタンパク質が進化の過程において、その他のＯＭ
Ｐはど変化しなかったという観測は、このタンパク質が
、その細菌に対し、重要な機能を果しており、そして、
その機能がその構造の保存に密接に関係しているという
推測へと誘導する。

ダラム陰性細菌の外股は、宿主防御メカニズムへの接近
しやすさのために、免疫学的に重要な構造体である。事
実、ｂ型ＩＩ・インフルエンザ二のＯＭ　Ｐ　類に対す
る抗体は、成人中に広く存在しており、また、Ｈ・イン
フルエンザ二の感染から回復した幼児の血清中にも検出
される。ここでは、１６．６００ダルトンのＯＭＰ　（
Ｐ６）に対する抗体がヒトの血清中に存在することが示
された（図３）。正常なヒトの血清中のこのＯＭＰに対
する抗体の存在は、このＯＭＰが、Ｈ・インフルエンザ
二に対するヒトの抗体応答に関して重要なものであるこ
とを指差している。

いくつかの観測は、Ｐ６がヘモフィラス・インフルエン
ザエに対する免疫における重要な標的であることを指差
している。

１）ｂ型株から単離したＰ６から生じた抗体は、子ネズ
ミモデルで予防効果を示した。

２）Ｐ６に対するモノクローナル抗体、７Ｆ３は、ヘモ
フィラス・インフルエンザエに対するヒトの殺菌活性（
ＮｔＨｉ）をブロックする。

３）アフィニティ・クロマトグラフィーにより、正常な
ヒトの血清からＰ６を除くと、ヘモフィラス・インフル
エンザエに対するその血清の殺菌活性が減少する。

４）ヒトの血清由来のＰ６に対する免疫的精製を行った
抗体は殺菌作用があった。

従って、本発明は、細菌の染色体ＤＮＡ源としてＨ・イ
ンフルエンザエ、染色体ライブラリーの構築におけるベ
クターとしてのラムダｇｔｌｌバクテリオファージ、遺
伝子をサブクローニングして、配列決定させるのに用い
るベクターとしてｐＵｃ１８プラスミド、及び宿主株と
して大腸菌を用いたＰ６の分子クローニングを含んでい
る。

この結果はＰ６に対する実験的及びヒトの免疫機構の分
子的基礎を解析を可能にし、そしてひとたび、ヘモフィ
ラス・インフルエンザエに対するワクチンの使用が認め
られれば、大量のＰ６の生産が許される。

Ｐ６の分子クローニング ここでＰ６と命名した、１６，６００ダルトンのタンパ
ク質は、区別可能及び区別不能へモフィラス・インフル
エンザ二株の外膜中に存在しており、そして、ヘモフィ
ラス・インフルエンザエに対する免疫における重要な標
的となっている。この１６．６００ダルトンの外膜タン
パク質を発現する遺伝子のＤ　Ｎ　Ａ配列は、１２５番
目のヌクレオチドから始まり、５２６番目のヌクレオチ
ドまで続くと考えられている。本発明に従って、細菌染
色体ＤＮＡ源として、ヘモフィラス・インフルエンザエ
の区別不能株、染色体ライブラリー構築におけるベクタ
ーとして、ラムダｇｔｌｌバクテリオファージ、その遺
伝子をサブクローニングして、配列決定を可能にするベ
クターとしてｐＵＣ１８プラスミド及び宿主株として大
腸菌を用いて、Ｐ６を分子的にクローニングする。先に
議論したモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清
を、Ｐ６の発現によるスクリーニングに用いた。この染
色体ライブラリーの一部をスクリーニングし、４個の陽
性組み換え体を検出した。その１つクローンＯは、高頻
度で発現する全長遺伝子産物を生産しているようだ。こ
のクローンのＤＮＡ挿入物は、プラスミドベクターへ、
この遺伝子をサブクローンするのに用いた。大腸菌のト
ランスフォーマント、７−９Ｂも、全長遺伝子産物を発
現するようだ。クローンＯ及びトランスフォーマント７
−９Ｂの両方とも、非誘導及び誘渾状態でその遺伝子産
物を発現するので、転写はＰ６遺伝子の事実上のプロモ
ーターから開始するようだ。Ｐ６のための遺伝子の単離
及び配列決定は、Ｐ６に対する実験的及びヒトの免疫機
構の分子的基礎の解析を可能にする。

特に、組み換えＤＮＡ技術が、区別不能ヘモフィラス・
インフルエンザエ（ＮｔＨｉ）の１６，６００タルトン
の表面タンパク質Ｐ６のための遺伝子を大腸菌中にクロ
ーン化するのに用いた。臨床単離株からの染色体ＤＮＡ
を切断し、ラムダｇｔｌｌのアームに連結し、そしてフ
ァージの頭部に包み込んだ。４個の組み換えファージを
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を用いた
スクリーニングにより検出した。その１つ、クローン０
をＥｃｏＲｌで切断し、配列決定するために、プラスミ
ドベクターｐＵｃ１８に連結した。組み換えプラスミド
を含む大腸菌をスクリーニングし、１つの陽性株、７−
９Ｂを得た。クローン０及び７−９Ｂを両方とも、ウェ
スタン・プロット分析により決定されたように本来のＰ
６と等しいか又は同様のみかけの分子量をもつタンパク
質を生産する。

スクリーニングにおいて、ヘモフィラス・インフルエン
ザエのＰ６遺伝子の転写及び翻訳は、１３Ｃオペレータ
ー及び各ベクターのプロモーターに依存しないことが判
明した。免疫螢光法を用いて、その組み換え遺伝子産物
のＰ６エビトープはこれら大腸菌の表面上にあり、抗体
が接近可能であることが分った。

ヘモフィラス・インフルエンザエ１４７９株を、ヘム（
１０μｇ／ｍｊり及びニコチンアミド・アデニン・ジヌ
クレオチド（１０μｇ／ｍｊりを補った、プレイン・ハ
ート・インフュージョン培地中、３７°Ｃで生育させた
。

大腸菌ＹＩ　Ｏ９０（ｒ−ｍ”　）株をバタテリオファ
ージ・ラムダｇｔｌｌの溶菌的生育に用い、そして、Ｊ
Ｍ８３株を、プラスミドｐＵｃ１８に対する宿主として
用いた。大腸菌を、その株に応じて、アンピシリン５０
μｇ／ｍｌを添加又は、非添加のし培地又はＬＢ寒天培
地で生育させた。

各々の宿主株の使用に対するより詳細な記述は、他の文
献を参照されたい。ヤング（Ｙｏｕｎｇ）等、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　　２２２巻、７７８−７８２頁
；マーシング（Ｍｅｒｓｉｎｇ）　、リコンビナント−
ＤＮＡテクノロジー・オプ・ブレチン（Ｒｅｃ、　ＤＮ
Ａ　Ｔｅｃｈ。

Ｂｕｌｌ、）　２巻、４３〜４８頁参照。

７５０ｎｌ培養からのへモフィラス・インフルエンザ１
１４７９株細胞のベレットを１０ｍｌの１０　ｍ　Ｍへ
ベスバッファ　（ｐＨ７，４）に再％３ｉした。

この混合物にＥＤＴＡを５ｍＭ濃度となるよう、そして
、ＳＤＳを０．５％ｗ／ｖ濃度となるよう添加し、そし
て、６０℃で３０分間インキニベートした。この溶菌物
を０．、５　ｍ　ｌのプロナーゼ（１０ｍｇ／ｍβ）を
用い、３７℃、２時間で消化し、そして、２度のフェノ
ール／ＣＩＡＡ抽出にかけ、つづいて、１度のＣＩＡＡ
抽出を行った。その水層に、０．２Ｍとなるよう塩化ナ
トリウムを加え、そして２．５培容の水冷エタノールを
加え、ＤＮＡを沈殿させた。低温での沈殿化につづいて
、そのＤＮＡを遠心によりペレット化し、トリス−Ｅ　
Ｄ　Ｔ　Ａバッファに再懸濁した後、０．１ｍｇ／ｍβ
の濃度のＤＮａｓｅ７リーのＲＮａｓｅで３７℃、１時
間の処理を行った。最後に、そのＤＮＡをフェノール／
ＣＩＡＡで抽出した後、塩化ナトリウム及びエタノール
で沈殿化し、遠心によってペレット化した。

そのＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡバッファに再懸濁してか
ら、Ａ２６０　／　Ａ２８０を測定することでその濃度
を測定し、そして、４℃で保存した。

ファージ・ライブラリーをモノクローナル抗体７Ｆ３で
スクリーニングした。また、ヘモフィラス・インフルエ
ンイエ１８０８株の可溶化したＰ６調製物で免疫化する
ことで生産したウサギのポリクローナル抗血清をスクリ
ーニングに用いた。

ヘモフィラス・インフルエンザエ１４７９株の染色体ラ
イブラリーの構築 図４に示した、このライブラリーを構築するための戦略
は、基本的には、Ｎ、　Ｙ、プレナム・プレス（Ｐｌｅ
ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、遺伝子工学、１９８５年、７巻
、２９〜４１頁にヤング（Ｙｏｕｎｇ）及びデービス（
Ｄａｖｉｓ）　によって報告されたものである。ヘモフ
ィラス・インフルエンイエ１４フ９株のＤＮＡを１回の
１０秒間の超音波照射（出力コントロール設定２）し、
平均鎖長２〜４キロベースペア（ｋｂ）に切断した。切
断の程度はアガロース・ゲル電気泳動によりモニターし
た。５０μｇのこの切断ＤＮＡのＥｃｏＲ１部位を、Ｅ
ｃｏＲメチラーゼでメチル化した。このメチル化したＤ
ＮＡの末端を、クレノー・ポリメレース及びヌクレオチ
ド・三リン酸を添加することでフラッシュエンドとした
。この反応及び、Ｑ、３　Ｍ　ｆ７３度となるような酢
酸ナトリウムの添加後、そのＤＮＡを沈殿化した。

遠心後、そのベレットをトリス・ＥＤＴＡバッファに再
懸濁した。それから、そのＤＮＡをリン酸化したＥｃｏ
Ｒ１リンカ−（メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ベ
セスダ（Ｂｅ　ｔｈｅｓｄａ）、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に連結した。その混合物を７０
℃に加熱することにより、この連結反応を停止し、さら
に過剰のＥｃｏＲｌを用いることにより、過剰のＥｃｏ
Ｒ１リンカ−を消化した。ＥｃｏＲ１リンカ−にプラン
ト・エンド・ライゲーションにより連結した。メチル化
したヘモフィラス・インフルエンイエ１４フ９株のＤＮ
Ａは、ゲル口過カラム（ＣＡ、　、　　リッチモンド（
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、パイオーラド・ラボラトリ−（Ｂ
ＩＯ−ＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、バイオゲル
Ｐ６０）に、１０ｍＭトリスバッフｙ　（ｐＨ７，５）
、１００ｍＭＮａＣ１，１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むカラ
ムバッファを用いて、通過させることにより、過剰のリ
ンカーから精製した。その両分はＡ　２　Ｂ。及びアガ
ロース・ゲル電気泳動でモニターした。望む大きさのＤ
ＮＡを含む両分を集め、沈殿化した。そのＤＮＡを遠心
によりベレットとし、そして、４μｌのトリス・ＥＤＴ
Ａバッファに再）Ｕ濁した。全反応溶液１０μρ中、そ
のＤＮＡを３　ｐ　ｇＯ脱リす酸化ラうダｇｔｌｌアー
ム（ＣＡ、サンディエゴ（Ｓａｎｄｉｅｇｏ）、ストラ
タジーン・クローニングシステム（ＳＴＲＡＴＡＧＦＮ
Ｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ））と連結した。

その連結混合物を、ｆ！Ａ造業者の指示に従い（ストラ
タジーン・クローニング・システム（ＳＴＲＡＴＡＧＥ
ＮＥＣｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ギガバック”
（Ｇｉｇａｐａｃｋ”））、２つのパッケージ′ング・
イクス１−ラクツを用い、パッケージした。そのパッケ
ージしたファージを大腸菌Ｙ１０９０株上にブレーティ
ングし、プラーク形成単位のタイターを測定し、そして
、ＬＢ＋Ａ　Ｍ　Ｐプレート上のＩＰＴＧ及びＸ−ｇａ
ｌを伴う生育により、非組み換え体のバンクグランドを
測定した。そのライブラリーは、５％以下のバンクグラ
ンドを含むおよそ１．５Ｘ１０”の独立した組換え体ク
ローンを含んでいる。

そのライブラリーのスクリーニング 図５はスクリーニングで用いた方法を示している。Ｙ１
０９０株のブレーティング・ストックの一部、１０ｍＭ
　　Ｍｇ５Ｏａ中に亡懸濁したＹ１０９０株のベレット
液０．２ｍＡを各８５龍プレートに対し、ラムダｇｔｌ
ｌライブラリー１．５Ｘ１０’ｐＦＵで感染させた。吸
着インキュベーションにつづいて、その細胞をＬＢ−ア
ガロースバッファと混合し、ＬＢ＋ＡＭＰプレートに注
ぎ、平均的に拡げた。それからそのプレートを４２℃で
３時間インキュベートした。さらに各プレートに、予め
１０ｍＭのＩ　ＰＴＧで飽和させた、乾燥ニトロセルロ
ースフィルターディスクを重ねた。そのプレートを３７
℃で３時間インキュベートする。そのフィルターを除く
前に、その向きに印をつけそして、そのフィルター及び
各プレートを標識した。

そのフィルターをバッファＡ（０，ＯＩＭ）リス、０．
１５Ｍ　　ＮａＣ１、ｐ）１７．４）で簡単に洗い、そ
してバッファＡ中３％ゼラチン液中に１時間放置した。

再びそのフィルターをバッファＡで洗浄後、それらを、
室温で一晩、抗体のスクリーニング混合物中でインキュ
ベートした。そのスクリーニング混合物は、１０００分
の１のタイターの、７Ｆ３腹水液を含むバッファＡ溶液
である。用いたモノクローナル抗体は、大腸菌宿主株と
交叉反応性を持っておらず、一方抗１８０１抗血清は、
その感度及び特異性を維持するために、１００００分の
１の作業用希釈液を必要とする。そのフィルターをバッ
ファ八で洗浄後、プロティンＡ−パーオキシダーゼ結合
物の、３０００分の１希釈液中に置き、室温で１時間振
盪した。再びそのフィルターをバッファＡで洗浄し、さ
らにホースラデッシュ・パーオキシダーゼ発色現像液（
０，１５％■（２０□、ＣＡ、　　リノチモンド（Ｒｉ
ｃｈｍｏｎｄ）、バイオ・ラド（ＢＩＯ−ＲＡＤ））中
に４５分間浸した。陽性と思われるプラークを各々のプ
レートから取り出し、５００μｐの３Ｍバッファ中に再
＋ｊ％　Ｑし、そして再びスクリーニングした。その再
スクリーニングで陽性のプラークをスクリーニング混合
物ではなく、個々の抗体に対して、再びスクリーニング
した。

ウェスタン・プロット分析 ヘモフィラス・インフルエンザエのコントロール、Ｙ１
０９０株組み換え体及び分子量標準を０、０６　Ｍ　）
リス（ｐｌ＋６．８　）　、１．２％ＳＤＳ、５％ベー
ターメルカプトエタノール、１１．９％グリセリン及び
Ｏ，ＯＯ３％ブロモフェノール・ブルーを含む試料バッ
ファ中で１００℃、５分間加熱することにより調製した
。その調製物を１５％分画ゲルを用いた５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけた。そのゲルを、予め沸騰水中で煮沸したニト
ロセルロースＩり上に置き、そして、０．３Ｍクエン酸
ナトリウム、３Ｍ　　ＮａＣ／９容ン夜中に浸した。ト
ランスファーＲ（ＴｒａｎｓｐｈｏｒＲ）電気泳動ニー
’−７ト（ＣＡ、サンフランシスコ（Ｓａｎ　Ｆｒａｎ
ｃｉｓｃｏ）　、ツーファー・サイエンティフィック・
インスツルメント（ｔ（ｏｅｆｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用い、５０ボルト９
０分間、０．０２５Ｍｌ−リス（ｐｔ１８．３　）　、
０．１９２Ｍグリシン及び２０％メタノールのバッファ
中での電気泳動トランスファーを行った。ブロッキング
、抗体付加、結合体付加及び基質現像を、プラーク・ス
クリーニングで述べたのと同様の方法で行った。

プラスミド・ベクターへのサブクローニング配列決定を
可能とする戦略が考えられた。Ｐ６エピトープを発現す
る（スクリーニングにより分っている）組換え体ファー
ジのＤＮＡ挿入物（８６７残基を含む）をプラスミドベ
クターにサブクローンした。選択手段、誘導可能なプロ
モーター、及びＥｃｏＲ１制限部位、ファージクローニ
ングベクターラムダｇｔｌｌに分は与えられている特性
を含む、いくつかの理由により、サブクローニングのた
めのプラスミド・ベクターとしてｐｔＪｃ１８を選んだ
。１つの組み換え体ファージのＤＮＡをＥｃｏＲｌで制
限切断し、それから、ＥｃｏＲｌで切断し、ウシの腸ア
ルカリホスファターゼを用いて脱リン酸した、ｐＵｃ１
８に連結した。その連結混合物を用いて、大腸菌ＪＭ８
３株のコンピテント細胞をトランスフオームした。その
トランスフォーマントを、Ｉ　ＰＴＧ及びＸｇａｌを重
層したＬＢ＋ＡＭＰプレート上での生育で選択した。挿
入物を含むプラスミドを有するＪＭ８３を示すと考えら
れる白コロニーを個々につり上げ、そして、Ｌ培地、Ａ
ＭＰ、１０％グリセロールを含むマイクロプレートのウ
ェルに移した。

そのプレートを３７゛Ｃで一晩インキユベートした。

そのマイクロプレートから、予めＩ　ＰＴＧ中に浸した
ニトロセルロース膜を重ねたＬＢ＋ＡＭＰプレートへ接
種するのにクシを用いた。このプレートを３７℃で１晩
インキユベートし、その後、そのニトロセルロース膜を
取り除いた。そのコロニーを溶菌するために、クロロホ
ルム蒸気を含むチャンバー中に、そのニトロセルロース
を１５分間つり下げ、つぎに４０μ（＜／ｍｅのリゾチ
ームを含む３％ゼラチン溶液中でブロックし、さらに、
染色体ライブラリーと同様の方法でスクリーニングした
。

結果 染色体ライブラリーのスクリーニング及び組み換え体の
特徴およそ４５，０００個のプラークをスクリーニング
し、増殖しなかったライブラリーの残りは、７％ＤＭＳ
Ｏ中−７０°Ｃで子分けをして凍結シタ。ラムダｇｔｌ
ｌ−へモフイラス・インフルエンザ１１４７９株クロー
ンＯ，Ｐ、　　８及び１０と命名した４個の反応性クロ
ーンが見つかった。クローンＯ及びＰは８又は１０より
も大量で、本来のＰ６タンパク質のコンホメーションと
より類似している遺伝子産物を発現すると思われるので
、クローンＯ及びＰに専念した。

クローンＯ及びＰを含むプレートを注意深くかき集めウ
ェスタン・プロット分析のためのタンパク質を収穫した
。ウェスタン・プロットは、クローン０及びＰの両方が
、本来のＰ６とサイズ的に等しいか、又は同様のタンパ
ク質を生産することを示した。しかし、クローン０は、
クローンＰと比較して、より大量のタンパク質を生産す
る。それゆえ、クローン０をプラスミドベクターへサブ
クローンすべく、ＤＮＡ源のための組み換え体ファージ
として選択した。

プラスミドベクターへのサブクローニング及びそのトラ
ンスフォーマントの特徴 同じトランスフォーメーションから１０００個のトラン
スフォーマントを、その１つ、７−９Ｂが陽性であると
分る前にスクリーニングした。７−９Ｂが純粋培養され
たことを確かめるために、陽性のコロニーをつり上げ、
移しかえて、再スクリーニングした。プレート上及び培
地中で生育させた７−９Ｂのウェスタン・プロットは、
この組み換え体も本来のＰ６と同じか、又は類似した見
かけの分子量の遺伝子産物を生産することを示した。７
−９Ｂから単離した組み換え体プラスミドをＥｃｏＲｌ
を用いて制限切断し、アガロース・ゲル電気泳動にかけ
て、挿入物の大きさを測定した。

図７の制限分析は、Ｐ６遺伝子を含む２．５　ｋ　ｂの
ＤＮＡ挿入物の存在を明らかにした。

討論 分子クローニング技術を用いることにより、我々は、１
６．６　ｋダルトンの外膜タンパク質、ヘモフィラス・
インフルエンザ上１４フ９株のＰ６をコードする遺伝子
を含む、組み換え体ファージ及び組み換え体プラスミド
を生産した。このタンパク質は、核酸１２５番及び核酸
５２６番の間の核酸配列に包含する形で記述することが
できる。ファージＯ及び組み換え体プラスミド７−９Ｂ
による遺伝子産物の発現はＢ−ガラクトシダーゼのプロ
モーターの誘ηには依存しない。クローン０及びｆＵみ
換え体７−９Ｂの遺伝子産物の間の電気泳動移動度に見
かけ上蓋がないことを明らかにしたウェスタン・プロッ
ト法と共に、この見解は、この組み換え体遺転子産物が
、自分自身のＰ６ｉＦｔ伝子の木質的ブ、ロモーターか
ら開始するらしいという証１処を提供する。

１６、６　ｋダルトンのタンパク質のエピトープは大腸
菌のトランスフォーマント７−９Ｂの表面上で、モノク
ローナル抗体７Ｆ３の接近を許す。

まとめると、Ｐ６をコードする遺伝子がファージベクタ
ー及びプラスミドベクターを用いて大腸菌中にクローン
化された。その大腸菌の組み換え体は、その表面上に、
十分な免疫原型のタンパク質を発現する。

特筆していないかぎり、全ての微生物学的株は、−Ｃ的
に入手可能である。ここで述べられている全ての株は、
ＮＹ１４２１５、バンファロー（Ｂａｆｆａｌｏ）　、
グライダ−・ストリート（ＧｒｉｄｅｒＳｔｒｅｅｔ）
　　４６２、ニューヨーク州立大学、−クリニカル・セ
ンター、感染症科（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｎＤｉｓｅａｓｅｓ）チモシー・マーフィー　
（Ｔｉｍｏｔｈｙ　Ｍｕｒｐｈｙ）博士から入手できる
。Ｈ・インフルエンザエ３５２４及び１４７９株；プラ
スミド７−９Ｂを含む大腸菌ＪＭ８３株及びハイブリド
ーマ７Ｆ３は、ブダペスト協定に従がい、メリーランド
（Ｍａｒｙｌａｎｄ）２０８５２、ロックビル（Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ）　、バークローン・ドライブ（Ｐａｒｋ
ｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　１２３０１のアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に登録し
た。

【図面の簡単な説明】

図１は抗体７Ｆ３により認識される決定因子が１６．６
００ダルトンの分子サイズのタンパク買上にあることを
示すウェスタンプロット、図２は抗体７Ｆ３で認識され
るエピトープがタンパク買上にあるのかＬＰＳ上にある
のかを検定するウェスタン・プロット検定法を示す図、
図３は１３．２％ゲルからのウェスタンプロット検定法
を示す図、図４は染色体ライブラリーを構築するための
手順、図５はライブラリーのスクリーニングで用いた方
法を示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ５Ｊ ＦＩＧ、３

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）その免疫原領域がヘモフィラス・インフルエンザ
   エの多くの株中に保存されている、区別不能ヘモフィラ
   ス・インフルエンザエの外膜の免疫原領域の遺伝コード
   を含むプラスミド。
2. （２）免疫原が外膜タンパク質のエピトープである、特
   許請求の範囲第１項記載のプラスミド。
3. （３）外膜タンパク質の分子量が１６，６００ダルトン
   の外膜タンパク質である特許請求の範囲第２項記載のプ
   ラスミド。
4. （４）上記免疫原領域を生産する、特許請求の範囲第１
   項記載のプラスミドを含有する大腸菌。
5. （５）上記免疫原領域を生産する、特許請求の範囲第２
   項記載のプラスミドを含有する大腸菌。
6. （６）上記免疫原領域を生産する、特許請求の範囲第３
   項記載のプラスミドを含有する大腸菌。
7. （７）その免疫原領域がヘモフィラス・インフルエンザ
   エの多くの株中に保存されている、区別不能ヘモフィラ
   ス・インフルエンザエの外膜の免疫原領域に対するモノ
   クローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
8. （８）その領域が特許請求の範囲第４項記載の細菌によ
   り生産される領域である、ヘモフィラス・インフルエン
   ザエの免疫原領域に対するモノクローナル抗体を生産す
   るハイブリドーマ。
9. （９）その領域が特許請求の範囲第５項記載の細菌によ
   り生産される領域である、ヘモフィラス・インフルエン
   ザエの免疫原領域に対するモノクローナル抗体を生産す
   るハイブリドーマ。
10. （１０）その領域が、特許請求の範囲第６項記載の細菌
    により生産される領域である、ヘモフィラス・インフル
    エンザエの免疫原領域に対するモノクローナル抗体を生
    産するハイブリドーマ。
11. （１１）特許請求の範囲第７項記載のハイブリドーマに
    より生産されるモノクローナル抗体。
12. （１２）特許請求の範囲第８項記載のハイブリドーマに
    より生産されるモノクローナル抗体。
13. （１３）特許請求の範囲第９項記載のハイブリドーマに
    より生産されるモノクローナル抗体。
14. （１４）特許請求の範囲第１０項記載のハイブリドーマ
    により生産されるモノクローナル抗体。
15. （１５）広範囲の区別可能、及び区別不能Ｈ．インフル
    エンザエに対して、特異的かつ効果的な精製した抗体。
16. （１６）人体中で特異的免疫応答を生ずる抗原タンパク
    質を含有する、広範囲の区別可能、及び区別不能Ｈ．イ
    ンフルエンザエに対するワクチン。
17. （１７）指示薬の存在下、Ｈ．インフルエンザエを含む
    試料を特許請求の範囲第１５項の抗体を接触させること
    により、Ｈ．インフルエンザエの存在を検出する方法。
18. （１８）Ｈ．インフルエンザエの多くの株で保存されて
    いる、区別不能Ｈ．インフルエンザエの免疫原領域をコ
    ードする核酸に対応するよう構築したＤＮＡプローブを
    、Ｈ．インフルエンザエを含む試料と接触させることに
    より、Ｈ．インフルエンザエの存在を検出する方法。
19. （１９）ＤＮＡプローブを標識した、特許請求の範囲第
    １８項記載の方法。
20. （２０）ＤＮＡプローブを放射性マーカーで標識した、
    特許請求の範囲第１８項記載の方法。