ES2692660T3 - Cepas probióticas para el tratamiento y/o la prevención de la diarrea - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de selección de una cepa probiótica para el tratamiento y/o prevención de la diarrea, comprendiendo el procedimiento las etapas de: - medida del efecto de al menos una cepa a estudiar respecto de la expresión de la proteína CFTR en una muestra biológica, y - selección de al menos una cepa que induce una disminución de la expresión de la proteína CFTR, donde la muestra biológica es una muestra de intestino proximal o de los colonocitos.

Description

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DESCRIPCION
Cepas probioticas para el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea Sector de la tecnica
La presente invencion se refiere al campo de las cepas probioticas, en particular de las cepas probioticas de Bacillus, utiles para el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea. La invencion se refiere tambien a un procedimiento de seleccion de cepas probioticas que tienen la particularidad de actuar sobre la absorcion de agua en el colon.
Estado de la tecnica
Durante el funcionamiento normal, En el ser humano, el hombre absorbe aproximadamente un 99 % del agua que entra en su luz, lo que representa aproximadamente 2 litros de agua al dfa. El colon tiene la capacidad de absorber hasta 4 litros de agua adicionales. No obstante, mas alla de 6 litros de agua al dfa, sus capacidades de absorcion se saturan y aparece la diarrea.
La diarrea es un problema frecuente (aproximadamente dos mil millos de casos cada ano en el mundo) que se caracterizan por deposiciones de consistencia lfquida o blanda, mas voluminosas y numerosas que de costumbre (mas de 3 deposiciones al dfa). En los casos mas extremos, se pueden perder mas de 20 litros de fluido al dfa.
La diarrea no es una enfermedad, sino un smtoma. Su causa mas frecuente es la ingestion de agua o alimentos contaminados; dura en este caso uno o dos dfas sin necesidad de tratamiento. Pero la propia diarrea puede provocar una deshidratacion que puede ser mortal, sobre todo en el lactante donde una perdida de peso superior al 10 % es una urgencia hospitalaria. Segun la Organizacion Mundial de la Salud, las diarreas son la segunda causa de mortalidad infantil en los pafses del tercer mundo, y son responsables del 18 % de las muertes de ninos menores de 5 anos (Bryce et al., Lancet, 2005, 365: 1147-1152).
La deshidratacion producida por la diarrea aparece cuando las perdidas de fluido no se compensan. En situaciones normales, las deposiciones se desecan en el colon. Los fenomenos de reabsorcion del agua contenida en las materias ingeridas se producen en las celulas colicas mediante una combinacion de transportes activos y pasivos de agua y de electrolitos. En las criptas de las invaginaciones del epitelio colico, se produce una secrecion de agua que va desde la sangre hasta el medio exterior. En una persona con buena salud, estos dos fenomenos estan compensados y permiten mantener una hidratacion conveniente de las deposiciones, lo que favorece el transito intestinal y mejora las condiciones de circulacion de las moleculas.
Existen numerosas causas posibles de diarrea, entre las que se encuentran las diarreas de origen infeccioso inducidas por un patogeno vmco, bacteriano o parasitario, y las diarreas no infecciosas, como las diarreas inducidas por una intolerancia alimentaria, un regimen de grasas, alcohol, un factor psicologico, la administracion de un medicamento, la administracion de un procedimiento terapeutico, las diarreas asociadas a una enfermedad o dolencia clmica, o las diarreas asociadas a una abstinencia de un estupefaciente.
Segun la duracion de los smtomas, se distingue entre diarreas agudas y diarreas cronicas, cuyos smtomas duran respectivamente menos de dos semanas y al menos dos semanas.
Un medicamento clasico para el tratamiento de la diarrea es, por ejemplo, la loperamida, que actua al mismo tiempo estimulando la absorcion de agua y electrolitos y ralentizando la duracion del transito. No obstante, la ralentizacion de la duracion del transito puede ser un problema en caso de infecciones grabes del tipo Salmonella, Shigella o Clostridium difficile, puesto que la duracion de la residencia en el intestino de la bacteria patogena se prolonga.
Los probioticos constituyen una alternativa interesante para el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea. Los probioticos mas utilizados para esta indicacion son las bacterias lacticas. En este caso, se describe que los probioticos tienen una accion beneficiosa sobre el sistema inmunitario y sobre el equilibrio de la flora intestinal.
Otros estudios han buscado poner de manifiesto novedosas dianas para el tratamiento o la prevencion de la diarrea. De este modo, el documento WO 2004/028480 describe compuestos de tipo tiazolidinona que permiten disminuir la eficacia del transporte de iones cloruro mediante la protema CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator [regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis cistica]) y su uso en el tratamiento de la diarrea secretora. Bradford et al. (Am. J. Physiol. Gastrointes. Liver Physiol., 2009, 296: G886-G898) se interesaron en los medios para tratar los problemas de obstruccion intestinal y de deshidratacion en pacientes afectados de mucoviscidosis (en los que la expresion de CFTR esta alterada).
Por otro lado, se ha descrito que la perdida parcial o total de la protema NHE3 (Sodium Hydrogen Exchanger [intercambiador de sodio-hidrogeno] 3) en ratones afectados de mucoviscidosis reduce la incidencia de obstrucciones intestinales, especialmente aumentando la fluidez intestinal, y concluyen que NHE3 es una diana potencial para regular la fluidez del tracto intestinal en pacientes afectados de mucoviscidosis y en los que la
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expresion de CFTR esta alterada. Geetu Raheja et al. (Amer. J. Physiol. Gastroint. and Liver Physiol., 2010, 298(3): G395-G401) han mostrado que una cepa probiotica que induce el aumento en la expresion de un transportador (SCL26A3) implicado en la absorcion de agua en el colon puede ser beneficioso para el tratamiento de la diarrea.
Por tanto, sigue existiendo necesidad de disponer de novedosas estrategias para el tratamiento y/o la prevencion de las diarreas.
Objeto de la invencion
De una forma general, la presente invencion se refiere a la puesta de manifiesto que, de forma totalmente original, algunas cepas probioticas pueden actuar directamente sobre la diarrea, induciendo una absorcion de agua presente en exceso en el colon. De manera sorprendente e inesperada, los inventores han mostrado que algunas cepas probioticas pueden inhibir la expresion de los transportadores implicados en la secrecion de agua en el colon y/o estimular la expresion de los transportadores implicados en la absorcion de agua en el colon, y se pueden utilizar para el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
De este modo, de forma totalmente original, las cepas probioticas no actuan como inhibidores de los transportadores, es decir, no actuan fijandose a los transportadores, impidiendo asf su funcionamiento, pero actuan sobre su expresion y, por tanto, sobre el numero de transportadores presentes.
Por otro lado, dichas cepas probioticas que actuan directamente sobre la absorcion del agua presente en exceso en el colon tienen la ventaja se poderse utiliza para la prevencion y/o el tratamiento de todo tipo de diarreas, especialmente que la diarrea sea de origen infeccioso o no infeccioso y en presencia o no de una disbiosis.
De esta forma, la presente invencion tiene por objeto un procedimiento de seleccion de una cepa probiotica para el tratamiento y/o prevencion de la diarrea, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
- medida del efecto de al menos una cepa a estudiar respecto de la expresion de la protema CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator [regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis cistica]) en una muestra biologica, y
- seleccion de al menos una cepa que induce una disminucion de la expresion de la protema CFTR, donde la muestra biologica es una muestra de intestino proximal o de los colonocitos.
En determinadas realizaciones, el procedimiento de seleccion de una cepa probiotica para el tratamiento y/o prevencion de la diarrea de acuerdo con la invencion, comprende ademas las etapas de:
- medida del efecto de al menos una cepa a estudiar respecto de la expresion de la protema NHE3 (Sodium Hydrogen Exchanger [intercambiador de sodio-hidrogeno] 3), en una muestra biologica, y
- seleccion de al menos una cepa que induce un aumento en la expresion de la protema NHE3,
donde la muestra biologica es una muestra de intestino proximal o de los colonocitos.
En determinadas realizaciones, la cepa a estudiar es una cepa de levadura o una cepa de bacteria. En particular, una cepa de bacteria a someter a ensayo puede ser una cepa de Bacillus, preferentemente una cepa de Bacillus subtilis.
En determinadas realizaciones, la expresion de la protema CFTR y/o de la protema NHE3 se mide por electroforesis, transferencia Western, inmunoensayo, inmunohistoqmmica, inmunocitoqmmica, espectrometna de masas, RT-PCR o transferencia Northern.
Una cepa probiotica seleccionada segun un procedimiento de acuerdo con la invencion se puede utilizar en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una cepa probiotica para el tratamiento, o una composicion que comprende la cepa probiotica, para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea, donde la cepa probiotica es la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Pans Cedex 15) el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745.
El presente documento tambien describe las celulas obtenidas mediante el cultivo de una cepa probiotica seleccionada segun un procedimiento de acuerdo con la invencion, para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea, en particular, las celulas de Bacillus subtilis obtenidas por el cultivo de la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745, para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea.
El presente documento tambien describe un metodo de tratamiento y/o prevencion de la diarrea en un paciente que
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comprende la administracion al paciente de una cantidad eficaz de celulas obtenida mediante el cultivo de una cepa probiotica seleccionada segun un procedimiento de acuerdo con la invencion.
La aplicacion del metodo de tratamiento y/o de prevencion de la diarrea comprende preferentemente la administracion de celulas de Bacillus subtilis obtenidas por cultivo de una cepa probiotica de Bacillus subtilis, preferentemente la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I- 2745.
Las diarreas que se pueden tratar de forma preventiva y/o curativa de acuerdo con la invencion incluyen las diarreas agudas y las diarreas cronicas.
En determinadas realizaciones, la diarrea tratada de acuerdo con la invencion es una diarrea de origen infeccioso inducida por un patogeno vmco, bacteriano o parasitario.
En otras realizaciones, la diarrea tratada de acuerdo con la invencion es una diarrea de origen no infeccioso.
Una diarrea de origen no infeccioso es, por ejemplo, una diarrea inducida por una intolerancia alimentaria, una diarrea inducida por un regimen de grasas, una diarrea inducida por alcohol, una diarrea inducida por un factor psicologico, una diarrea inducida por la administracion de un medicamento, una diarrea inducida por la administracion de un procedimiento terapeutico, una diarrea asociada a una enfermedad o dolencia clmica, o una diarrea asociada a la abstinencia de un estupefaciente.
Se proporciona a continuacion una descripcion mas detallada de algunas realizaciones preferidas de la invencion. Descripcion detallada de la invencion
Como se menciona anteriormente, la presente invencion se refiere a la identificacion de cepas probioticas capaces de actuar sobre la absorcion de agua en el colon por accion directa en los transportadores implicados en la regulacion del fluido intestinal, y su uso como medicamentos en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
I - Procedimiento de seleccion de cepas probioticas
Un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento tiene por objeto identificar una cepa probiotica que sea util en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
El procedimiento de seleccion de una cepa probiotica para el tratamiento y/o prevencion de la diarrea comprende las etapas de:
- medir el efecto de al menos una cepa a someter a ensayo sobre la expresion de al menos un transportador implicado en la absorcion o la secrecion de agua en el colon, y
- seleccion de al menos una cepa que induce una disminucion de la expresion de al menos un transportador implicado en la secrecion de agua en el colon y/o un aumento en la expresion de al menos un transportador implicado en la absorcion de agua en el colon.
Un ejemplo de transportador implicado en la secrecion de agua en el colon es la protema CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator [regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis cistica]).
Un ejemplo de transportador implicado en la absorcion de agua en el colon es la proteccion NHE3 (Sodium Hydrogen Exchanger [intercambiador de sodio-hidrogeno]3).
Un procedimiento de seleccion de acuerdo con la invencion se caracteriza por que comprende:
- la medida del efecto de al menos una cepa a estudiar respecto de la expresion de la protema y/o de la protema NHE3, et
- la seleccion de al menos una cepa que induce una disminucion de la expresion de la protema CFTR, y opcionalmente:
- la medida del efecto de al menos una cepa a estudiar respecto de la expresion de la protema NHE3, y
- la seleccion de al menos una cepa que induce un aumento en la expresion de la protema NHE3.
La cepa seleccionada al finalizar el procedimiento de seleccion es, por tanto, una cepa probiotica util en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
Por "cepa probiotica", se entiende disenar en el presente documento una cepa de un microorganismo vivo que ejerce un efecto beneficioso sobre la salud del hospedador.
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El hospedador es, generalmente, un ser humano, pero se puede considerar que el hospedador sea otro mairnfero, como por ejemplo perros, gatos, rumiantes, especialmente corderos, cabras, vacas, vacas, cervidos, camelido, equidos, sumidos, especialmente cerdos y lechones, leporidos, muridos y los cavidos.
Cepas a estudiar
La cepa a estudiar segun un procedimiento de seleccion puede ser cualquier cepa de microorganismos.
La cepa a estudiar puede ser una cepa de levadura. Entre las levaduras que se pueden estudiar, se pueden citar, por ejemplo, las levaduras del genero Saccharomyces, especialmente las especies Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae, las levaduras del genero Kluyveromyces, especialmente las especies Kluyveromyces marxianus.
La cepa a estudiar puede ser una cepa de bacteria.
La cepa a estudiar se selecciona preferentemente entre las bacterias reconocidas por no representar un peligro para el ser humano y/o los animales.
Entre las bacterias que se pueden estudiar, se pueden citar, por ejemplo, las bacterias del genero Bifidobacterium, especialmente las especies Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, y Bifidobacterium brevis; las bacterias del genero Lactobacillus, especialmente las especies Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, y Lactobacillus salivarius; las bacterias del genero Weisella, especialmente las especies Weisella cibaria, Weisella kimchii, Weisella thailandensis; las bacterias del genero Bacillus, especialmente las especies Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus et Bacillus clausii; las bacterias del genero Lactococcus, especialmente las especies Lactococcus lactis; las bacterias del genero Enterococcus, especialmente las especies Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis; las bacterias del genero Streptococcus, especialmente las especies Streptococcus thermophilus; las bacterias del genero Escherichia, especialmente las especies Escherichia coli.
Expresion de CFTR y/o NHE3
Un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento comprende la medida del efecto de la cepa a estudiar sobre la expresion de al menos un transportador implicado en la absorcion o la secrecion de agua en el colon, especialmente sobre la expresion de la protema CFTR y/o de la protema NHE3.
En el presente documento, se entiende por "protema CFTR", la protema que en la especie humana esta codificada por el gen CFTR (por "Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator' [regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis dstica]") que se encuentra en el locus 7q31.2, en la region q31.2 del brazo largo del cromosoma 7. El gen CFTR esta muy conservado entre las especies. En el ser humano, la protema CFTR tiene por ejemplo la secuencia polipeptfdica con numero de orden GenBank NP_00483 que tiene una longitud de 1480 aminoacidos.
La protema CFTR forma un canal permeable a los iones cloruro y tiocianato de las celulas epiteliales.
La protema CFTR se expresa en el polo apical de las celulas epiteliales de los canales pancreaticos, biliares, las criptas intestinales, del arbol traqueobronquial, los tubulos renales, el aparato genital y las glandulas sudonparas.
Se ha demostrado que los inhibidores de CFTR, como la tiazolidinona, son de aplicacion en el tratamiento y/o la prevencion de diarreas (Verkman et al., Curr. Pharm. Des., 2006, 12: 2235-2247).
En un procedimiento de seleccion de acuerdo con la invencion, una cepa estudiada que induce una disminucion de la expresion de la protema CFTR puede ser util, por tanto, en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
En el presente documento, se entiende por "protema NHE3", la protema que en la especie humana esta codificada por el gen NHE3 (por "Sodium-Hydrogen Exchanger [intercambiador de sodio-hidrogeno] 3», tambien conocido con el nombre SLC9A3 por "Solute Carrier Family 9 Member 3 [miembro 3 de la familia del transportador en solucion 9]"), que se encuentra en el cromosoma 13. En el ser humano, la protema NHE3 tiene por ejemplo la secuencia polipeptfdica con numero de orden GenBank NP_004165 que tiene una longitud de 834 aminoacidos.
La protema NHE3 se expresa en la nefrona del rinon y en la membrana apical de las celulas endoteliales del intestino, donde es principalmente responsable del mantenimiento del equilibrio del sodio.
Se ha mostrado que ratones geneticamente modificados para inactivar el gen NHE3 padecen diarrea (Schultheis et al., 1998, Nat. Genet 19: 282-285).
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En un procedimiento de seleccion de acuerdo con la invencion, una cepa estudiada que induce un aumento de la expresion de la protema NHE3 puede ser util, por tanto, en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
La medida del efecto de la cepa a estudiar sobre la expresion de un transportador implicado en la absorcion o la secrecion de agua en el colon, especialmente sobre la expresion de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede realizar utilizando cualquier metodo conocido del experto en la materia (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratories Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY), la naturaleza del metodo utilizado no es un elemento cntico o limitante.
En general, el mdice de expresion de una protema se puede determinar por un metodo directo, tal como por un metodo de electroforesis, por un metodo de transferencia Western, por un metodo de inmunoensayo, por un metodo de inmunohistoqmmica, por un metodo de inmunocitoqmmica, por un metodo de espectrometna de masas.
Tambien es posible determinar el mdice de expresion de una protema por un metodo indirecto.
Un metodo indirecto puede consistir en medir la tasa de transcripcion del gen correspondiente, por ejemplo, por RT- PCR (transcripcion inversa seguida de una amplificacion en cadena con polimerasa), preferentemente mediante RT- PCR cuantitativa, o por un metodo de transferencia Northern.
Otro ejemplo de metodo indirecto puede consistir en medir la actividad de la protema, estando la actividad de la protema correlacionada con la cantidad de protema funcional presente.
El mdice de expresion del transportador y, especialmente, de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede determinar mediante electroforesis.
La electroforesis permite separar las protemas segun su masa molecular. Se trata generalmente de una electroforesis en gel de poliacrilamida que contiene laurilsulfato de sodio (denominado SDS-PAGE por Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis [electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio]). Tambien se puede tratar de una electroforesis bidimensional, tal como un isoelectrofocalizacion que permite separar las protemas segun su masa molecular y su punto isoelectrico.
El mdice de expresion del transportador y, especialmente, de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede determinar mediante transferencia Western.
La transferencia Western, tambien denominada tecnica de Western, consiste en separar las protemas por electroforesis sobre un gel de poliacrilamida, transferir posteriormente las protemas desde el gel de poliacrilamida a una membrana de soporte, sobre la que se marcan las protemas de interes mediante el uso de anticuerpos marcados espedficos contra dichas protemas.
El mdice de expresion del transportador y, especialmente, de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede determinar mediante inmunoensayo. Por "inmunoensayo", se designa en el presente documento cualquier tecnica que utiliza la reaccion antfgeno-anticuerpo para la deteccion y la cuantificacion de antfgenos, anticuerpos o sustancias parecidas. El complejo anticuerpo-antfgeno se puede visualizar de varias formas. En la mayona de los casos, un anticuerpo esta conjugado a una enzima (por ejemplo: peroxidasa) que puede catalizar una reaccion de produccion de color (por ejemplo: coloracion con inmunoperoxidasa). De forma alternativa, los anticuerpos se pueden marcar con un fluoroforo (por ejemplo: FITC, rodamina, Texas Red o Alexa Fluor). La deteccion del complejo anticuerpo-antfgeno se realiza seguidamente por inmunofluorescencia.
Los anticuerpos monoclonales espedficos de la protema CFTR humana y de la protema NHE3 humana son conocidos en el estado de la tecnica y estan comercialmente disponibles.
El mdice de expresion del transportador y, especialmente, de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede determinar mediante inmunohistoqmmica. El termino "inmunohistoqmmica" se refiere a un metodo basado en el uso de anticuerpos para situar una protema en tejidos. Por lo general, el tejido se fija, lava, despues se permeabiliza. A continuacion, se incuba con un anticuerpo primario que reconoce espedficamente la protema de interes (aqm, por ejemplo, la protema CFTR o la protema NHE3). Se anade un segundo anticuerpo acoplado con un sistema de deteccion. El sistema de deteccion es, por ejemplo, un fluorocromo o una enzima cuya puesta en presencia del sustrato produce una reaccion coloreada. Este segundo anticuerpo reconoce la parte constante Fc del anticuerpo primario y debe proceder de una especie diferente a este ultimo. Tras montaje en un medio que proteja la fluorescencia de la muestra si se trata de un fluorocromo o en presencia de un sustrato si se trata de una enzima, el tejido se analiza con el microscopio de fluorescencia o confocal. El mdice de expresion de la protema de interes se puede determinar seguidamente mediante analisis densitometrico, por media de la intensidad de fluorescencia, o por espectrofotometna.
El mdice de expresion del transportador y, especialmente, de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede determinar mediante inmunocitoqmmica.
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La inmunocitoqmmica es una tecnica similar a la inmunohistoqmmica, salvo que la muestra de partida es una preparacion citologica en lugar de un tejido.
El mdice de expresion del transportador y, especialmente, de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede determinar mediante espectrometna de masas.
El mdice de expresion del transportador y, especialmente, de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede determinar mediante RT-PCR.
La RT-PCR consiste en una transcripcion inversa del ARN en ADNc, seguido de una amplificacion en cadena mediante polimerasa (PCR). La RT-PCR es, preferentemente, una RT-PCR cuantitativa que permite cuantificar el ARN inicial correspondiente a la protema de interes.
El mdice de expresion del transportador y, especialmente, de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se puede determinar mediante transferencia Northern.
La transferencia Northern, tambien denominada transferencia de Northern, es una tecnica que consiste en separar las moleculas de ARN dependiendo de su tamano por electroforesis en gel, y posteriormente transferir el ARN a una membrana donde se puede detectar mediante una sonda de hibridacion marcada que es espedfica del ARN de la protema a cuantificar.
Muestra biologica
Un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento comprende la medida del efecto de la cepa a estudiar sobre la expresion de al menos un transportador implicado en la absorcion o la secrecion de agua en el colon, especialmente sobre la expresion de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, en una muestra biologica.
La expresion "muestra biologica", como se utiliza en el presente documento, tiene su sentido mas amplio. Una muestra biologica puede ser cualquier tejido biologico en el que la protema de interes (especialmente la protema CFTR o la protema NHE3) se expresa y, por tanto, se puede detectar y cuantificar.
Las muestras biologicas que se pueden utilizar en la aplicacion de un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento pueden proceder, por ejemplo, del intestino, los canales pancreaticos, los canales biliares, los tubulos renales, el arbol traqueobronquial, el aparato genital, las glandulas sudonparas, y la nefrona del rinon.
Preferentemente, la muestra biologica es una muestra que procede del intestino, preferentemente una muestra del colon.
Preferentemente se extirpa una muestra de tejido de un animal modelo, por ejemplo, mediante biopsia. El animal modelo es preferentemente un mairnfero, por ejemplo, un raton, una rata, un conejo, un cerdo, un pollo, un simio. El animal modelo puede ser un animal transgenico.
Una muestra biologica preferida es una muestra tisular que comprende colonocitos, es decir, las celulas de la mucosa colica.
La muestra biologica tambien puede ser un material biologico derivado de un tejido y que expresa la protema de interes.
El material biologico derivado se selecciona, por ejemplo, entra las celulas aisladas de la muestra tisular o tambien de las protemas extrafdas de las celulas aisladas de la muestra tisular.
La expresion "muestra biologica" tambien incluye las celulas de una lmea de celulas conocida por expresar la protema de interes, especialmente la protema CFTR y/o la protema NHE3.
Los ejemplos de lmeas celulares que expresan la protema CFTR incluyen las celulas Caco-2 aisladas del colon, las celulas HT-29 aisladas del colon o las celulas T84 aisladas del colon.
Los ejemplos de lmeas celulares que expresan la protema NHE3 incluyen celulas Caco-2 aisladas del colon, celulas HT-29 aisladas del colon o celulas T84 aisladas del colon.
Estas lmeas celulares estan comercialmente disponibles, por ejemplo, de la ATCC (American Type Culture Collection).
La muestra biologica puede ser un extracto proteico aislado de celulas o tejidos que expresan la protema de interes, especialmente la protema CFTR y/o NHE3. Los metodos de extraccion de protemas son bien conocidos del experto en la materia (vease por ejemplo, "Protein Methods", D.M. Bollag et al., 2a Ed., 1996, Wiley-Liss; "Protein Purification
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Methods: A Practical Approach", E.L. Harris y S. Angal (Eds.), 1989; "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", S. Roe, 2a Ed., 2001, Oxford University Press; "Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization", H. Ahmed, 2005, cRc Press: Boca Raton, FL). Tambien existen kits comerciales para la extraccion de protemas a partir de tejidos o fluidos biologicos. Dichos kits se comercializan, por ejemplo, por BioRad Laboratories (Hercules, CA), BD Biosciences Clontech (Mountain View, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), Calbiochem (San Diego, CA), Pierce Biotechnology (Rockford, IL), e Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). El experto en la materia sabe seleccionar el kit mas adaptado a la situacion.
Efecto de la cepa a estudiar
En un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento, el efecto cepa a estudiar sobre la expresion de un transportador implicado en la absorcion o la secrecion de agua en el colon, especialmente de la protema CFTR y/o de la protema NHE3, se determina comparando el mdice de expresion de la protema de interes medido en una muestra biologica obtenida de un animal modelo que se ha tratado con la cepa a estudiar y el mdice de expresion de la protema de interes medido en una muestra biologica (del mismo tipo que la anterior) obtenida de un animal modelo (del mismo tipo que el anterior) que no se ha tratado con la cepa a estudiar. Este ultimo animal se denomina animal de control.
De este modo, por ejemplo, en la aplicacion de un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento en el que la muestra biologica procede de un animal modelo, una cantidad dada de celulas obtenidas por cultivo de la cepa a estudiar se administra al animal modelo.
La cantidad de celulas se puede administrar de una sola vez.
De forma alternativa, la cantidad de celulas se puede administrar en varias veces, bien el mismo dfa o en varios dfas o semanas.
La administracion de las celulas obtenidas por cultivo de la cepa a estudiar se puede realizar por cualquier metodo de administracion adaptado al animal modelo utilizado. Por ejemplo, la administracion se puede realizar por inyeccion, especialmente por inyeccion intragastrica, de una solucion o de una suspension que contiene un vehmulo adecuado y una cantidad dada de celulas obtenidas por cultivo de la cepa a estudiar. Al animal de control se administra el mismo volumen de una solucion que contiene solamente vehmulo.
Asimismo, en la aplicacion de un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento en el que la muestra biologica es de una lmea de celulas, el efecto de la cepa a estudiar se determina comparando el mdice de expresion de la protema de interes medido en las celulas de la lmea de celulas que se han tratado con la cepa a estudiar y el mdice de expresion de la protema de interes medido en las celulas (de la misma lmea celular) que no se han tratado con la cepa a estudiar. Estas ultimas celulas se denominan celulas control.
De este modo, por ejemplo, en la aplicacion de un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento en el que la muestra biologica es de una lmea de celulas, las celulas de una lmea celular se incuban con una cantidad dada de una solucion o de una suspension que contiene un vehmulo adecuado y una cantidad dada de celulas obtenidas por cultivo de la cepa a estudiar. Las celulas control de la lmea celular se incuban en las mismas condiciones en presencia del mismo volumen de una solucion que contiene solamente vehmulo.
Los procedimientos de cultivo de una cepa, independientemente que sea una cepa de lavadura o una cepa de bacteria, son conocidos en la tecnica, y el experto en la materia sabe optimizar las condiciones de cultivo de cada cepa dependiendo de su naturaleza.
Asimismo, el experto en la materia sabe determinar las cantidades optimas de celulas obtenidas por el cultivo de la cepa a estudiar para su administracion a un animal modelo o para su incubacion con las celulas de una lmea de celulas.
Por ejemplo, las celulas de Bacillus subtilis se obtienen por cultivo de una cepa de Bacillus subtilis en un medio de cultivo, especialmente como se describe en la obra Biotechnologie, 5a edicion, R. Scriban, Edition Tec. & Doc., 1999, ISBN: 2-7430-0309-X.
Normalmente, un procedimiento de produccion de celulas de Bacillus subtilis por cultivo de una cepa de Bacillus subtilis comprende las etapas de:
- sembrar un medio de cultivo con un inoculo de la cepa de Bacillus subtilis,
- cultivo en condiciones aerobias, para obtener la multiplicacion de las celulas,
- separacion de la biomasa de su medio de cultivo, para obtener las celulas de Bacillus subtilis.
Las celulas de Bacillus subtilis asf obtenidas se encuentran mayoritariamente en forma vegetativa.
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La expresion "mayoritariamente en forma vegetativa" significa que al menos el 70 % de las celulas estan en forma vegetativa, preferentemente al menos el 80 %, y mas preferentemente al menos el 90 %.
La "forma vegetativa" de una bacteria designa la forma de una bacteria situada en condiciones favorables.
Un ejemplo de condiciones favorables es un medio de cultivo no limitante a una temperatura y un pH favorables a la multiplicacion bacteriana.
Un medio de cultivo no limitante contiene todos los elementos nutritivos necesarios para la multiplicacion de las celulas.
El procedimiento de produccion de celulas de Bacillus subtilis tambien puede comprender una etapa intermedia de puesta de las celulas en condiciones desfavorables, entre la etapa de cultivo en condiciones aerobias y la etapa de separacion de la biomasa. Las celulas de Bacillus subtilis obtenidas al finalizar el procedimiento de produccion se encuentran, por tanto, mayoritariamente en forma esporulada.
La expresion "mayoritariamente en forma esporulada" significa que al menos el 70 % de las celulas estan en forma esporulada, preferentemente al menos el 80 %, y mas preferentemente al menos el 90 %.
La "forma esporulada" de una bacteria designa la forma de una bacteria situada en condiciones desfavorables. Por tanto, la forma esporulada es una forma de resistencia que le permite soportar un medio diffcil, tal como, por ejemplo, una falta de nutrientes, es decir, un medio con limitacion de nutrientes, un estres tndrico, una variacion importante del pH o la temperatura, o incluso el paso por el tubo digestivo.
La puesta en condiciones desfavorables de las celulas de las bacterias se obtiene, por ejemplo, mediante: una no renovacion del medio de cultivo de las bacterias, una detencion de la alimentacion con medio de cultivo, el uso de un medio de cultivo limitante, un cambio de temperatura, un cambio de pH, o su combinacion.
El procedimiento de produccion de celulas de Bacillus subtilis tambien puede comprender una etapa posterior de secado de las celulas, para obtener las celulas de Bacillus subtilis en forma seca.
La expresion "celulas de Bacillus subtilis en forma seca" significa que la biomasa obtenida al finalizar el procedimiento de produccion de las celulas de Bacillus subtilis comprende mas del 90 % de materia seca, preferentemente mas del 95 % de materia seca.
El secado es, por ejemplo, un secado por liofilizacion, un secado en lecho fluidizado o un secado por atomizacion.
Identificacion de una cepa probiotica para el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea
La comparacion entre el mdice de expresion de la protema de interes medido en la muestra tratada con la cepa a estudiar y el mdice de expresion de la protema de interes medido en la muestra de control permite determinar si la cepa estudiada induce una disminucion o un aumento en la expresion de la protema de interes o si no tiene ningun efecto sobre dicha expresion.
Como se ha indicado anteriormente, una cepa para la que se ha determinado, segun un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento, que induce una disminucion de la expresion de al menos un transportador implicado en la secrecion de agua en el colon y/o un aumento de la expresion de al menos un transportador implicado en la absorcion de agua en el colon es una cepa probiotica que puede ser util en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
Los Inventores han demostrado que una cepa probiotica de ese tipo es capaz de inducir una absorcion de agua presente en exceso en el colon y, por tanto, es de aplicacion en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
Por "disminucion de la expresion de un transportador implicado en la secrecion de agua en el colon", se entiende designar una disminucion significativa de la expresion de dicho transportador con respecto a su expresion en ausencia de la cepa a estudiar.
El caracter "significativo" de dicha disminucion se determina mediante analisis estadfstico.
Cuando el efecto sobre la expresion del transportador se mide por inmunohistoqmmica, una "disminucion de la expresion del transportador" corresponde a una disminucion significativa en la intensidad de la fluorescencia/pm2 correspondiente a la expresion de dicho transportador con respecto a la obtenida en ausencia de la cepa a estudiar.
Por "aumento de la expresion de un transportador implicado en la absorcion de agua en el colon", se entiende designar un aumento significativo de la expresion de dicho transportador con respecto a su expresion en ausencia de la cepa a estudiar.
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El caracter "significativo" de dicho aumento se determina mediante analisis estad^stico.
Cuando el efecto sobre la expresion del transportador se mide por inmunohistoqmmica, un "aumento de la expresion del transportador" corresponde a un aumento significativo en la intensidad de la fluorescencia/|jm2 correspondiente a la expresion de dicho transportador con respecto a la obtenida en ausencia de la cepa a estudiar.
Como reconocera el experto en la materia, la identificacion de una cepa probiotica util para tratar y/o prevenir las diarreas se puede realizar usando solamente un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento. El procedimiento de seleccion se puede llevar a cabo usando un unico tipo de muestra biologica, por ejemplo, un animal modelo dado, o usando varios tipos de muestras biologicas, por ejemplo una lmea de celulas, despues al menos un animal modelo.
De forma alternativa, la identificacion de una cepa probiotica capaz de actuar sobre la absorcion de agua en el colon se puede llevar a cabo usando un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento y posteriormente completando dicha seleccion con una serie de pruebas y ensayos clmicos, bien conocidos del experto en la materia.
II - Utilizacion de una cepa probiotica para el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea
Cualquier cepa probiotica identificada mediante un procedimiento de seleccion como capaz de inducir una absorcion del agua presente en exceso en el colon puede ser util en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea. Una cepa probiotica de ese tipo se puede utilizar en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
Como se ha indicado anteriormente, la cepa probiotica puede ser cualquier cepa de microorganismo, especialmente una cepa de levadura o una cepa de bacteria, como las anteriormente mencionadas.
En particular, los Inventores han demostrado que la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745 es una cepa probiotica que actua sobre la absorcion del exceso de agua en el colon y, por tanto, puede ser utiles para tratar y/o prevenir las diarreas.
Esta cepa se ha descrito en el documento FR 2 837 835 que divulga un adyuvante vivo que comprende dicha cepa para una inmunizacion en la mucosa gastrointestinal.
Las celulas de levadura o las celulas de bacteria obtenidas mediante el cultivo de una cepa probiotica identificada segun un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento son utiles en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
Como se ha indicado anteriormente, las condiciones de cultivo de una cepa son generalmente conocidas en la materia o bien las puede determinar con facilidad el experto en la materia.
En particular, las celulas obtenidas por el cultivo de la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745, son utiles en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea.
Las "celulas obtenidas por el cultivo de la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745 se denominan en lo sucesivo como "celulas CU1".
La produccion de celula CU1 se puede realizar como se ha descrito anteriormente.
Las celulas CU1 utilizadas en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea son celulas en forma esporulada y/o en forma vegetativa.
Preferentemente, las celulas CU1 estan mayoritariamente en forma esporulada.
Preferentemente, las celulas CU1 utilizadas en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea estan en forma seca.
Mas preferentemente aun, las celulas CU1 utilizadas en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea estan mayoritariamente en forma esporulada y en forma seca.
Cualquier extracto de celula de levadura probiotica o de celula de bacteria probiotica y cualquier filtrado de cultivo de una cepa probiotica, que tenga la capacidad de inducir una disminucion de la expresion de la protema CFTR y/o un aumento de la expresion de la protema NHE3, puede inducir una absorcion del agua en exceso en el colon.
Un metodo de tratamiento y/o de prevencion de la diarrea comprende la administracion, al paciente, de una cantidad eficaz de celulas de levadura o celulas de bacteria obtenidas por cultivo de una cepa probiotica identificada segun un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento. La cantidad eficaz de celulas de levadura o de celulas de bacteria, que se pueden administrar en una o varias dosis, se puede determinar por el medico. La
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cantidad exacta a administrar puede variar de un paciente a otro, segun la edad, el peso, el estado de salud general del paciente, la naturaleza y la gravedad de la diarrea, etc. La cantidad exacta a administrar tambien puede variar segun el efecto terapeutico deseado (es decir, prevenir una diarrea o tratar una diarrea).
La via de administracion, oral o parenteral, se puede seleccionar segun la naturaleza de la diarrea y/o segun la edad y el estado de salud general del paciente.
En caso de prevencion de una diarrea, las celulas de levadura o las celulas de bacteria obtenidas por cultivo de una cepa probiotica identificada segun el procedimiento de seleccion descrito en el presente documento se administran antes de la aparicion de los smtomas.
En caso del tratamiento de una diarrea, las celulas de levadura o las celulas de bacteria obtenidas mediante el cultivo de una cepa probiotica identificada segun el procedimiento de seleccion descrito en el presente documento se administran despues de la aparicion de los smtomas.
De una forma general, cualquier diarrea se puede tratar usando una une cepa probiotica identificada segun el procedimiento de seleccion descrito en el presente documento o las celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa probiotica, comprendiendo las diarreas agudas y las diarreas cronicas.
Por "diarrea aguda", se entiende una diarrea cuyos smtomas duran menos de dos semanas, y por "diarrea cronica", una diarrea cuyos smtomas duran al menos dos semanas, preferentemente al menos un mes.
Las diarreas agudas incluyen, por ejemplo, las gastroenteritis vmcas, las gastroenteritis bacterianas, y las toxiinfecciones alimentarias (por ejemplo, las salmonelosis, shigellosis, las infecciones por Staphylococcus aureus, las infecciones por Bacilluscereus, las infecciones por Escherichia Coli).
Las diarreas cronicas incluyen, por ejemplo, el smdrome de mama absorcion, las gastroenteropatfas (enfermedad celfaca, enfermedad de Whipple, enfermedad de Crohn, etc...), la diarrea motriz (es decir, una diarrea debida a la aceleracion del transito intestinal), la diarrea secretora (es decir, una diarrea debida a una aceleracion de la secrecion hidroelectrolttica en el intestino delgado y/o el colon), la diarrea osmotica (es decir, una diarrea que deriva de la presencia, en el tracto gastrointestinal, de solutos que se absorben mal y producen un efecto osmotico).
Otras diarreas que se pueden tratar utilizando una cepa probiotica identificada en un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento o de celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa probiotica, incluyen las diarreas debidas a la ansiedad o a las emociones intensas, las diarreas debidas a intolerancias alimentarias (por ejemplo, lactosa en la leche de vaca, sorbitol, gluten, etc.), las diarreas debidas a determinados tratamientos como la magnesoterapia, la radioterapia o la quimioterapia o a determinadas cirugfas como las gastrectoirna o la reseccion ilfaca, las diarreas debidas a una sobrecarga o una irritacion del estomago, los intestinos, el colon, etc., las diarreas debidas a la abstinencia de estupefacientes tales como la heroma, las diarreas debidas a algunos medicamentos tales como los antibioticos.
Otros ejemplos de diarreas que se pueden tratar utilizando una cepa probiotica identificada en un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento o de celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa probiotica, incluyen las diarreas que acompanan las crisis hepaticas o las indigestiones, las diarreas que son resultado de un consumo en exceso de determinados alimentos laxantes, y las diarreas de los deportistas.
En algunos casos, la diarrea tratada usando una cepa probiotica identificada en un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento, o con celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa probiotica no es una diarrea inducida por la administracion de un antibiotico o, de forma mas general, por la administracion de un medicamento.
En otros casos, la diarrea tratada usando una cepa probiotica identificada en un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento, o con celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa probiotica no es una diarrea de origen infeccioso.
III - Composiciones
Tambien se describe en el presente documento una composicion para su uso en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea, comprendiendo la composicion al menos une cepa probiotica identificada en un procedimiento de seleccion como se ha definido anteriormente o, mas espedficamente, las celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa. En particular, una composicion preferida comprende una cantidad eficaz de celulas obtenidas por el cultivo de la cepa de Bacillus subtilis Cui depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745.
La composicion puede ser una composicion alimentaria, un complemento alimentario o una composicion farmaceutica.
Una composicion alimentaria designa cualquier tipo de alimento, bebida o producto de confitena.
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La composicion alimentaria puede ser, por ejemplo, una bebida, una barrita de cereales, una goma de mascar, chocolate, un producto lacteo, tal como un producto lacteo fermentado, un producido fermentado de origen vegetal.
Por "complemento alimentario" se entiende un producto alimentario cuyo objetivo es completar la dieta alimentaria normal. Un complemento alimentario constituye una fuente concentrada de nutrientes u otras sustancias que tienen un efecto nutritivo o fisiologico, solos o combinados.
Un complemento alimentario se comercializa en forma de dosis, es decir, formas farmaceuticas tales como capsulas, pastillas, comprimidos, pfldoras y otras formas similares, bolsitas de polvo, ampolla de lfquido, envase provisto de cuentagotas y otras formas analogas de preparaciones lfquidas o en polvo destinadas a ingerirse en unidades medidas de escasa cantidad.
Una composicion es adecuada, por ejemplo, para un uso diario de las celulas obtenidas por cultivo de la cepa probiotica en una cantidad de 1,l08 UFC a 1,1011 UFC, preferentemente en una cantidad de 1,109 UFC a 1,1010 uFc cuando se destina a uso humano.
Una composicion es adecuada, por ejemplo, para un uso diario de las celulas obtenidas por cultivo de la cepa probiotica en una cantidad de 1,l05 UFC a 1,1011 UFC, preferentemente en una cantidad de 1,106 UFC a 1,1010 uFc cuando se destina a uso veterinario.
El termino UFC designa Unidades formadoras de colonias.
IV - Composiciones farmaceuticas
Debido a su accion directa sobre los transportadores implicados en la regulacion del fluido intestinal, una cepa probiotica identificada en un procedimiento de seleccion descrito en el presente documento o, mas espedficamente, las celulas de levadura o las celulas de bacteria obtenidas por cultivo de dicha cepa, se pueden utilizar como agente terapeutico.
Dichas celulas de levadura o de bacteria se pueden administrar tal cual o en forma de una preparacion o composicion farmaceutica en presencia de al menos un vedculo o excipiente fisiologicamente aceptable. En el presente documento, por "vedculo o excipiente fisiologicamente aceptable" se entiende cualquier medio o aditivo que no interfiera con la eficacia de la actividad biologica del principio activo (en el presente documento, las celulas de levadura o de bacteria), y que no sea excesivamente toxico para el paciente o el sujeto, en las concentraciones en las que se administra. Un vedculo o excipiente fisiologicamente aceptable puede ser un vedculo o excipiente adecuado para su administracion a seres humanos y/o a los animales (especialmente a los mairnferos).
Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar utilizando cualquier combinacion de dosis y de via de administracion eficaz para obtener el efecto terapeutico deseado. La cantidad exacta a administrar puede variar de un paciente a otro, segun la edad, el peso, el estado de salud general del paciente, la naturaleza y la gravedad de la diarrea, etc. La via de administracion (oral o parenteral) se puede seleccionar segun la naturaleza de la diarrea y/o segun la edad y la salud del paciente.
Como ejemplo, una composicion farmaceutica tal como se ha definido anteriormente puede estar destinada al uso diario de las celulas obtenidas por cultivo de la cepa probiotica en una cantidad de 1,108 UFC a 1,1011 UFC, preferentemente en una cantidad de 1,109 UFC a 1010 UFC, cuando se destina a uso humano.
De forma alternativa, una composicion farmaceutica tal como se ha definido anteriormente puede estar destinada al uso diario de las celulas obtenidas por cultivo de la cepa probiotica en una cantidad de 1,105 UFC a 1,1011 UFC, preferentemente en una cantidad de 1,106 UFC a 1,10 10 UFC, cuando se destina a uso veterinario.
La formulacion de una composicion farmaceutica puede variar dependiendo de la via de administracion y de la dosis para las que la composicion esta destinada a usarse. Tras la formulacion con al menos un vedculo o excipiente fisiologicamente aceptable, una composicion farmaceutica puede estar en cualquier forma adecuada para su administracion a un mam^era, especialmente el ser humano, por ejemplo, en forma de tabletas, comprimidos, grageas, capsulas, jarabes, pomadas, soluciones inyectables, supositorios, etc. El experto en la tecnica sabe seleccionar los vedculos y los excipientes mas adecuados para la preparacion de un tipo dado de formulacion. De este modo, por ejemplo, los excipientes tales como agua, 2,3-butanodiol, solucion de Ringer, soluciones isotonicas de cloruro de sodio, monogliceridos o digliceridos sinteticos, y acido oleico, se utilizan frecuentemente para la formulacion de preparaciones inyectables. Las composiciones lfquidas, comprendiendo las mismas emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires, etc., se pueden formular en presencia de disolventes, agentes solubilizantes, emulsionantes, aceites, acidos grasos, y otros aditivos como agentes de suspension, conservantes, edulcorantes, aromas, agentes viscosificantes, colorantes, etc. Las composiciones solidas para administracion por via oral se pueden formular en presencia de un excipiente inerte como citrato de sodio y, opcionalmente, de aditivos tales como agentes aglutinantes, agentes humectantes, agentes disgregantes, aceleradores de la absorcion, agentes lubricantes, etc.
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Una composicion farmaceutica se puede formular para la liberacion inmediata del uno o varios principios activos, especialmente las celulas de levadura o las celulas de bacterias obtenidas por cultivo de la cepa probiotica. De forma alternativa, una composicion farmaceutica se puede formular para una liberacion prolongada o dirigida del uno o varios principios activos o para una proteccion de los principios activos, por ejemplo, con respecto a la acidez y de las enzimas gastricas.
Por tanto, es posible utilizar revestimientos resistentes al pH y/o a la accion de las enzimas gastricas, revestimientos sensibles al pH y/o a las acciones enzimaticas, o revestimientos bioadhesivos que se pegan a las paredes del estomago o del intestino, o incluso mediante el uso de sistemas de encapsulacion.
Las composiciones farmaceuticas pueden, ademas, contener al menos un principio activo farmaceutico adicional (es decir, ademas de las celulas de levadura o de bacteria obtenidas por cultivo de la cepa probiotica).
Por "principio activo farmaceutico", se entiende cualquier compuesto o sustancia cuya administracion tiene un efecto terapeutico o un efecto beneficioso para la salud o estado de salud general de un paciente o de un sujeto al que se administra.
De este modo, un principio activo farmaceutico puede ser activo contra la diarrea que se quiera prevenir o curar mediante la administracion de la composicion farmaceutica; o puede ser activo contra una dolencia o un smtoma asociado a la diarrea (por ejemplo, fiebre, vomito o calambres abdominales); o tambien puede aumentar la disponibilidad y/o la actividad del o de los principios activos de la composicion farmaceutica.
Los ejemplos de principios activos farmaceuticos que pueden estar presentes en una composicion incluyen, sin limitacion, antiinflamatorios, antibioticos, agentes antipireticos, agentes antiemeticos, agentes antihistammicos, vitaminas, agentes antiespasmodicos, etc.
Preferentemente, el otro principio activo farmaceutico no es una cepa de Bacillus subtilis ni celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa, preferentemente no es una cepa de bacteria ni celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa, mas preferentemente no es una cepa probiotica ni celulas obtenidas por cultivo de dicha cepa.
Un ejemplo de composicion farmaceutica es una que comprende celulas de levadura o de bacteria obtenidas por cultivo de la cepa probiotica, como unico principio activo farmaceutico.
Preferentemente, la composicion contiene celulas obtenidas por el cultivo de la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745, con exclusion de cualquier otra fuente de bacterias.
Mas preferentemente aun, la composicion de acuerdo con la invencion contiene celulas obtenidas por el cultivo de la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745, con exclusion de cualquier otra fuente de bacterias o de levaduras.
De manera aun mas preferida, la composicion de acuerdo con la invencion contiene celulas obtenidas por el cultivo de la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745, como unico principio activo farmaceutico.
Salvo que se definan de otra forma, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la descripcion tienen el mismo significado que comprende normalmente un especialista habitual del campo al que pertenece la presente invencion.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes describen algunas realizaciones de la presente invencion. Sin embargo, se entiende que los ejemplos solamente se presentan a tftulos ilustrativo y no limitan en ningun caso el alcance de la invencion.
Descripcion de las figuras
Figura 1. Efecto del tratamiento con la cepa Bacillus subtilis CU1 sobre la expresion colica de la protema CFTR. La intensidad de fluorescencia/pm2 se proporciona para el control (en blanco) y despues del tratamiento con CU1 (en negro). * p<0,005
Figura 2. Efecto del tratamiento con la cepa Bacillus subtilis CU1 sobre la expresion colica de la protema NHE3. La intensidad de fluorescencia/pm2 se proporciona para el control (en blanco) y despues del tratamiento con CU1 (en negro). * p<0,005
Figura 3. Ausencia de efecto del tratamiento con la cepa Lactobacillus plantarum sobre la expresion colica de la protema CFTR. La intensidad de fluorescencia/pm2 se proporciona para el control (en blanco) y despues del
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tratamiento con LR (en negro). * p<0,005
Figura 4. Ausencia de efecto del tratamiento con la cepa Lactobacillus plantarum sobre la expresion colica de la protema NHE3. La intensidad de fluorescencia/pm2 se proporciona para el control (en blanco) y despues del tratamiento con LR (en negro). * p<0,005
Figura 5. Agua excretada (en mg) en las deposiciones a 60 minutos (en negro) y entre 60 y 120 minutos (en blanco) tras la administracion intravenosa de LPS (15 mg/kg) o de solucion salina a ratones (promedio ± SEM, n=10-20). T-: ratones no tratados con CU1 que recibieron una inyeccion de solucion salina; T+: ratones no tratados con CU1 que recibieron una inyeccion de LPS; T-/CU1: ratones tratados con CU1 que recibieron una inyeccion de solucion salina, T+/CU1: ratones tratados con CU1 que recibieron una inyeccion de LPS. * P<0,05 vs T-; f P<0,05 vs T+
Figura 6. Agua excretada (en mg) en las deposiciones a 60 minutos (en negro), entre 60 y 120 minutes (en gris) y entre 120 et 180 minutes (en blanco) despues de la administracion intragastrica de aceite de ricino (200 pl) o de solucion salina a los ratones (promedio ± SEM, n=10-19). T-: ratones no tratados con CU1 que recibieron una inyeccion de solucion salina; T+: ratones no tratados con CU1 que recibieron una inyeccion de aceite de ricino; T- /CU1: ratones tratados con CU1 que recibieron una inyeccion de solucion salina, T+/CU1: ratones tratados con CU1 que recibieron una inyeccion aceite de aceite de ricino. * P<0,05 vs T-; f P<0,05 vs T+
Ejemplo 1: Seleccion de cepas probioticas destinadas a la prevencion y/o el tratamiento de la diarrea
Material y metodos
Cepas probioticas estudiadas.
Las cepas estudiadas son las siguientes: una cepa de Lactobacillus plantarum y la cepa Bacillus subtilis CU1.
Las celulas de Bacillus subtilis CU1 (en adelante CU1) se utilizaron en forma esporulada y seca.
Las celulas de Lactobacillus plantarum (en adelante LR) se utilizaron en forma vegetativa y liofilizada.
Medida del efecto de una cepa probiotica sobre la expresion de CFTR y de NHE3.
Cuatro semanas se trataron durante 2 semanas con cada una 109 UFC/dfa de CU1.
Cuatro semanas se trataron durante 2 semanas con cada una 109 UFC/dfa de LR.
Cuatro ratones no tratados con CU1 se utilizaron como control.
La expresion de CFTR y NHE3 se midio por inmunohistoqmmica sobre colonocitos procedentes se ratones tratados con CU1 y de ratones control, como se describe a continuacion.
Inmediatamente despues del sacrificio de los ratones, las muestras del colon proximal (1 cm de longitud) se lavaron con una solucion de NaCl al 0,9 %, se fijaron en una solucion tampon al 4 % de formaldel'ndo (6 h) y se sumergieron durante 24 h en una solucion de sacarosa al 30 % a 4 °C.
Las muestras se fijaron en un medio Tissue Tek (Euromedex, Souffelweyersheim, Francia) y se congelaron en isopentano a -45 °C. Los cortes del criostato se fijaron despues con acetona (10 minutos, -20 °C) y se hidrataron en una solucion salina tamponada con fosfato (PBS) - leche. Tras incubacion con solucion de bloqueo (PBS con Triton X-100 al 0,25 % que contema 0,1 % de albumina de suero bovino (BSA)), los cortes se incubaron durante la noche a
4 °C con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra CFTR de raton (1/100), contra NHE3 de raton (1/200) o
contra TLR4 de raton (1/100) (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Los cortes se incubaron a continuacion durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo de asno dirigido contra Ig de conejo marcado con FITC (1/2000, Uptima, Montlugon, Francia). A continuacion los cortes se montaron en medio "Vectashield Hard-Set mounting medium" (Abcys, Les Ulis, Francia) y se examinaron con un microscopio de fluorescencia Nikon 90i (Nikon, Champigny-sur- Marne, Francia). La intensidad de la fluorescencia/pm2 del inmunomarcado se midio con el programa informatico Nis-Elements Ar (Nikon). Los analisis se realizaron sobre cinco cortes de un grupo de 4 ratones.
Resultados
Entre las cepas probioticas estudiadas, unicamente la cepa de Bacillus subtilis CU1 actua sobre la expresion de los dos transportadores CFTR y NHE3 que estan implicados en los movimientos del agua a traves de la mucosa colica. Efectivamente, como muestra la Figura 1, el tratamiento de los ratones durante dos semanas con la cepa de Bacillus subtilis CU1 produjo una reduccion significativa de la expresion de CFTR en el polo apical de los colonocitos en el colon de ratones sanos. Como muestra la Figura 2, el tratamiento de los ratones durante 2s semanas con la cepa de
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Bacillus subtilis CU1 produjo un aumento significativo de la expresion de NHE3 en el polo apical de los colonocitos en el colon de ratones sanos.
Por el contrario, como muestran las Figuras 3 y 4, el tratamiento con la cepa de L. plantarum no modifico significativamente ni la expresion de CFTR ni la de NHE3.
Ejemplo 2: Utilizacion de la cepa probiotica CU1 en la prevencion y/o el tratamiento de la diarrea
Material y metodos
Modelo de diarrea inducida por LPS.
Una dosis de 109 UFCMa/animal de la cepa probiotica a estudiar se administro por via intragastrica a ratones DBA/2 macho durante 14 d^as.
Los ratones del grupo control (12 ratones) se trataron a continuacion con 200 pl de agua administrada por via intravenosa y los ratones del grupo de ensayo (12 ratones) recibieron una administracion de lipopolisacarido (LPS) de Salmonella enterocitos (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) por via intravenosa) a una dosis de 15 mg/kg, para inducir diarrea. Los ratones se alojaron en jaulas individuales con la parte inferior cubierta por una lamina de aluminio que permitfa la recogida de heces cada 30 minutos durante 120 minutos despues de la inyeccion de LPS. La materia fecal recogida se peso y se calento a 100 °C durante 24 h y se peso de nuevo. La diferencia entre la masa humeda de materia fecal (antes del calentamiento) y la masa seca corresponde a la excrecion de agua. La diarrea se evaluo con respecto a la excrecion de agua total tras la administracion del LPS.
Modelo de diarrea inducida por aceite de ricino.
Una dosis de 109 UFCMa/animal de la cepa probiotica a estudiar se administro por via intragastrica a ratones NMRI macho durante 14 dfas.
Los ratones del grupo control (12 ratones) se trataron a continuacion con 200 pl de agua administrada por via intragastrica. 200 pl de aceite de ricino (Sigma) se administraron por via intragastrica a los ratones NMRI macho del grupo "de ensayo" (12 ratones), para inducir diarrea. Los ratones se alojaron en jaulas individuales con la parte inferior cubierta por una lamina de aluminio que permitia la recogida de heces cada 30 minutos durante 180 minutos despues de la inyeccion del aceite de ricino. La materia fecal recogida se peso y se calento a 100 °C durante 24 h y se peso de nuevo. La diferencia entre la masa humeda de materia fecal (antes del calentamiento) y la masa seca corresponde a la excrecion de agua. La diarrea se evaluo con respecto a la excrecion de agua total tras la administracion del aceite de ricino.
Modelo de diarrea inducida por un antibiotico.
Se implanto un modelo animal de diarrea inducida por antibioticos mediante el uso de un numero limitado de antibioticos (segun la publicacion de Chen et al., 2008, Gastroenterology, 135(6): 1984-92). La administracion de antibioticos induce una disbiosis (desequilibrio) en la flora asf como una respuesta inmunitaria y una alteracion en el numero de celulas productoras de moco por el intestino del raton. El tratamiento con antibioticos puede inducir especialmente la aparicion de Clostridium difficile.
El tratamiento preventivo de la cepa CU1 se estudio en este modelo a razon de 109 UFCMa/animal durante 14 dfas y 18 dfas en grupos de 5 ratones. Tras 7 dfas de administracion de la cepa CU1, se proporciono una mezcla de 5 antibioticos en agua de bebida durante 3 dfas, al dfa siguiente, los ratones tratados con antibioticos recibieron una inyeccion intraperitoneal de clindamicina. El efecto de los tratamientos se observo en los dfas 14 y 18 desde el inicio del experimento. Los ratones tratados con la cepa CU1 recibieron la cepa durante la totalidad del ensayo.
Resultados
La cepa de Bacillus subtilis CU1 se ha estudiado en diferentes modelos de diarrea en ratones.
Propiedades antidiarreicas de la cepa de Bacillus subtilis CU1.
Como muestran las Figuras 4 y 5, la cepa CU1 previene significativamente la diarrea inducida por LPS (Figura 5) y por aceite de ricino (Figura 6).
Efectivamente, la administracion de celulas CU1 disminuye significativamente el agua excretada en las heces durante la primera hora despues de la administracion de LPS (en 4 ensayos, la disminucion era del 35 %, 38 %, 36 % y 40 %).
La administracion de celulas CU1 disminuye significativamente el agua excretada en las heces durante la 2a hora en
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el modelo de diarrea inducida por aceite de ricino (en 3 ensayos, la disminucion era del 63 %, 46 %, 44 %).
La cepa CU1 tiene tambien un efecto preventivo sobre la diarrea inducida por la administracion de un antibiotico. Este efecto se observo despues del tratamiento preventivo con celulas CU1: los ratones presentaron entonces una normalizacion de la microbiota y una mejora de las alteraciones ocasionadas por los antibioticos en las celulas de la mucosa intestinal productora de moco y sobre los macrofagos.
Comparacion con el efecto de la loperamida.
Un tratamiento preventivo con la cepa CU1 durante 15 dfas redujo la diarrea inducida por el LPS o el aceite de ricino con la misma eficacia que la loperamida, molecula antidiarreica de referencia, administrada en dosis unica (1 mg/kg) por via oral una hora antes de desencadenarse la diarrea. La loperamida redujo en un 50 % la excrecion fecal de agua tras LPS (40 % para CU1) y un 60 % tras el aceite de ricino (60 % para CU1).
Conclusiones
In vivo, la cepa Bacillus subtilis CU1 permite mejorar las capacidades de absorcion del colon en condiciones de exceso de lfquido.
Estudios complementarios han mostrado que la cepa Bacillus subtilis CU1:
- no tiene efectos sobre las capacidades de secrecion/absorcion del intestino delgado en el modelo de aceite de ricino y el modelo LPS,
- elimina el aumento de la permeabilidad paracelular inducida por el LPS en la pared del colon, pero no la inducida por el aceite de ricino,
- reduce la corriente de cortocircuito inducida por el aceite de ricino en la pared del colon, lo que sugiere un refuerzo de las capacidades del colon para absorber agua en situaciones de diarrea laxativa inducida por aceite de ricino (y no en situacion basal).
La cepa Bacillus subtilis CU1 y las celulas obtenidas por cultivo de esta cepa son por tanto utiles para el tratamiento y/o la prevencion de cualquier tipo de diarrea.
Resumen de la invencion
Cepas probioticas para el tratamiento y/o la prevencion de la diarrea
La presente invencion se refiere a un procedimiento de seleccion o de identificacion de cepas probioticas capaces de actuar sobre la absorcion de agua en el colon, y su uso como medicamentos en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea. La invencion se refiere especialmente a la cepa de Bacillus subtilis CU1 para su uso en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea. (sin figura)

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de seleccion de una cepa probiotica para el tratamiento y/o prevencion de la diarrea, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    - medida del efecto de al menos una cepa a estudiar respecto de la expresion de la protema CFTR en una muestra biologica, y
    - seleccion de al menos una cepa que induce una disminucion de la expresion de la protema CFTR, donde la muestra biologica es una muestra de intestino proximal o de los colonocitos.
  2. 2. Procedimiento de seleccion de acuerdo con la reivindicacion 1, comprendiendo el procedimiento ademas las etapas de:
    - medida del efecto de al menos una cepa a estudiar respecto de la expresion de la protema NHE3 en una muestra biologica, y
    - seleccion de al menos una cepa que induce un aumento en la expresion de la protema NHE3, donde la muestra biologica es una muestra de intestino proximal o de los colonocitos.
  3. 3. Procedimiento de seleccion de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, caracterizado por que la cepa a estudiar es una cepa de levadura o una cepa de bacteria.
  4. 4. Procedimiento de seleccion de acuerdo con la reivindicacion 3, caracterizado por que la cepa de bacteria es una cepa de Bacillus, preferentemente una cepa de Bacillus subtilis.
  5. 5. Procedimiento de seleccion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la expresion de la protema CFTR y/o de la protema NHE3 se mide por electroforesis, transferencia Western, inmunoensayo, inmunohistoqmmica, inmunocitoqmmica, espectrometna de masas, RT-PCR o transferencia Northern.
  6. 6. Cepa probiotica, o composicion que comprende dicha cepa probiotica para su uso en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea, caracterizada(s) por que la cepa probiotica es la cepa de Bacillus subtilis CU1 depositada en la CNCM el 25 de octubre de 2001 con el numero I-2745.
  7. 7. Cepa probiotica, o composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, caracterizada(s) por que la diarrea es una diarrea aguda o una diarrea cronica.
  8. 8. Cepa probiotica, o composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, caracterizada(s) por que la diarrea es una diarrea de origen infeccioso o una diarrea de origen no infeccioso.
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