CN102732464A - 一种用于快速初步筛选具有免疫调节功能益生菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用体外评价体系，快速初步筛选具有免疫调节功能益生菌的方法。本发明所述的一种用于快速初步筛选具有免疫调节功能益生菌的方法是对待筛选的乳酸菌先进行耐酸、耐胆盐的筛选，再从中选留促进淋巴细胞增殖指数大于3.0，促进巨噬细胞吞噬指数大于2.0的菌株；所述的耐酸是指在pH3.0的环境下耐受3h；所述的耐胆盐是指在0.3％的胆盐环境下耐受3h。本发明方法可初步快速判别该菌株是否具有免疫调节功能。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种快速初步筛选具有免疫调节功能益生菌的方法。
背景技术
免疫是动物在长期进化中所形成的一种保护性生理功能，提高免疫力可以减少很多疾病，开发能提高免疫力的保健品具有重要意义。乳酸菌作为一类重要免疫功能调节剂，其对机体免疫促进作用得到了大量研究。乳酸菌的免疫活性可能与菌体中特定的活性成分相关，大量研究通过体内动物实验评价乳酸菌免疫调节作用，不仅时间长，且费用大。
随着对益生菌研究的不断深入，利用现代生物技术，建立功能益生菌的定向筛选模型，从而可以大大提高目标（功能）益生菌的高效定向筛选效率。
发明内容
本发明鉴于上述现状，建立一种用于快速筛选具有免疫调节功能益生菌的方法，目的是提高具有免疫调节功能益生菌的筛选针对性，大幅度提高筛选效率。
本发明中所述的快速筛选具有免疫调节功能益生菌的方法，是在对大量乳酸菌进行体内外免疫调节功能比较基础上，从大量的体内外评价指标中筛选适于免疫调节功能的体外筛选指标。具体而言是将分离菌株进行耐酸、耐胆盐试验基础上，再进行淋巴细胞增殖指数（SI值）、巨噬细胞吞噬指数（PI值）研究。
一种用于快速初步筛选具有免疫调节功能益生菌的方法，是对待筛选的乳酸菌先进行耐酸、耐胆盐的筛选，再从中选留促进淋巴细胞增殖指数大于3.0，促进巨噬细胞吞噬指数大于2.0的菌株；
所述的耐酸是指在pH3.0的环境下耐受3h；所述的耐胆盐是指在0.3％的胆盐环境下耐受3h。
本发明中耐酸性实验是指将分离乳酸菌于pH3.0的MRS液体培养基中，37℃下培养3h后，测定活菌数量的变化。
本发明中耐胆盐实验是指将分离乳酸菌于胆盐浓度0.3%的MRS液体培养基中，37℃下培养3h后，测定活菌数量的变化。
本发明中淋巴细胞增殖指数（SI值）实验，其测定方法为：制备小鼠脾细胞，浓度为107个细胞/mL；将收集的乳酸菌重悬于PBS溶液中，调整细胞悬液OD600=1.0，即乳酸菌悬液活菌数为108CFU/mL。空白组为培养液孔，消零组为培养液加乳酸菌悬液孔，对照组为培养液加细胞孔，实验组为培养液加乳酸菌悬液和细胞孔。MTT法测定细胞含量，酶标仪上测定490nm处吸光度。计算淋巴细胞增殖指数SI。
本发明中巨噬细胞吞噬指数（PI值）实验，其测定方法为：制备107个细胞/mL的脾细胞，加入96孔板中，5%CO2培养箱中37℃培养3h，弃去上清，即得巨噬细胞，加入100μL培养液与100μL中性红溶液；制备乳酸菌悬液，将乳酸菌浓度调整至OD600=1.0，活菌数为108CFU/mL。空白组加PBS孔，实验组加乳酸菌悬液孔。测定吞噬中性红能力，酶标仪上测定490nm处吸光度，计算细胞吞噬指数PI。PI=实验组OD值/空白组OD值。
附图说明
图1体外指标与小鼠体内免疫指标相关性。
具体实施方式
本发明将分离获得的乳酸菌菌株，利用耐酸、耐胆盐、淋巴细胞增殖指数（SI值）、巨噬细胞吞噬指数（PI值）实验，建立一种用于快速初步筛选具有免疫调节功能益生菌的方法，并对筛选菌株进一步鉴定，具体包括以下几个方面：
1.乳酸菌的分离与纯化
将采集的样品用无菌水进行梯度稀释到10-8，选取10-6、10-7、10-8三个梯度涂布MRS培养基培养，挑取疑似菌落，划线培养，对分离获得的菌株采用平板划线法纯化，获得候选菌株。
2.乳酸菌的耐酸能力试验
将分离获得的候选菌株按3%（v/v）接种量分别接入pH 3.0的MRS液体培养基中，在37℃下培养3h，测定培养前后活菌数，分别用S1和S2表示。
且耐受率越高，表明乳酸菌耐酸能力越强。
对分离的101株乳酸菌耐酸能力试验得出，乳酸菌在37℃下于pH 3.0的MRS液体培养基中能存活，但耐受率差异较大。pH 3.0耐受3h，耐受率大于30%的乳酸菌有22株，结果如表1所示。
表1乳酸菌酸耐受率试验结果
3．乳酸菌的耐胆盐能力试验
将筛选获得的耐酸性乳酸菌按3%（v/v）接种量分别接入含猪胆酸盐浓度0.3%的MRS液体培养基中，37℃培养3h，测定培养前后的活菌数，分别用S1和S2表示。
且耐受率越高，表明乳酸菌耐胆盐能力越强。
对耐酸较强的22株乳酸菌耐胆能力试验得出，乳酸菌在37℃下于胆盐浓度0.3%的MRS培养基中能存活，但耐受率差异较大。胆盐浓度0.3%耐受3h，耐受率大于30%的乳酸菌有14株，其胆盐耐受结果见表2。
表2乳酸菌胆盐耐受率试验结果
4．乳酸菌对淋巴细胞增殖指数（SI值）影响的测定
将乳酸菌接入MRS液体培养基中37℃培养24h，转移到50mL的离心管中，4℃条件下4000r/min离心15min，弃去上清，将乳酸菌沉淀重悬于PBS溶液中，将乳酸菌浓度调整至OD600=1.0，即乳酸菌悬液活菌数为108CFU/mL。制备小鼠脾细胞，1000r/min离心10min，弃去上清，用新鲜1640培养基重悬，台盼蓝染色，耐受率不低于95%的脾细胞用于进一步实验，血球计数板计数，细胞浓度调整至107个细胞/mL，即浓度为107的细胞悬液。各组设置及加样量如表3。
表3各组加样量
96孔板于5%CO2培养箱中37℃培养20h，加入MTT继续培养4h后，吸取培养液，加入100μL DMSO使结晶物溶解，酶标仪上测定490nm处吸光度。计算淋巴细胞增殖指数SI，其中
结果如表4所示。
5．乳酸菌对巨噬细胞吞噬指数（PI值）影响的测定
将乳酸菌按上述方法制备乳酸菌悬液，活菌数为108CFU/mL。制备上述小鼠脾细胞，将其加入96孔板中，5%CO2培养箱中37℃培养3h，弃去上清，即得巨噬细胞，加入1640培养液100μL，每孔加中性红100μL。
实验组为乳酸菌悬液孔（10μL、30μL、50μL、70μL、100μL），空白组为PBS孔（与对应乳酸菌悬液等体积）。
培养6h后，弃去上清，PBS洗3遍，每孔加入100μL细胞溶解液（冰醋酸:乙醇=1:1），4℃放置4h后，酶标仪上测定490nm处吸光度。计算细胞吞噬指数PI，其中PI=实验组OD值/空白组OD值，结果如表4所示。
表4乳酸菌对淋巴细胞增殖与巨噬细胞吞噬的影响
对筛选获得的耐酸耐胆较强的14株乳酸菌SI值与PI值研究发现，SI值大于3.0、PI值大于2.0的菌株有3株，分别为M71、M02和M16。
6．乳酸菌的体内免疫调节作用验证
选取体外免疫调节作用差异较大的5株乳酸菌（由强到弱分别为：M16、M17、M12、M22、M06）进行动物实验，进一步验证其免疫调节作用。
动物实验测定灌胃乳酸菌后小鼠免疫脏器、免疫细胞、免疫分子的变化。设置对照组与实验组，实验组灌胃108CFU/mL乳酸菌，灌胃剂量0.3mL/10g，对照组灌胃等体积的PBS。灌胃7天后进行各项指标测定。结果表5和表6。
表5小鼠免疫分子水平的变化
注：与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01
表6小鼠免疫分子水平的变化
注：与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01
动物实验研究结果显示，5株乳酸菌均不同程度的促进小鼠免疫指标的提高，其中M16组最好，对小鼠胸腺指数、脾脏指数、淋巴细胞增殖、血清中IgG含量、血清中IL12含量的促进作用最强。
7．体内外免疫调节作用比较
根据5株乳酸菌体内外免疫指标的测量结果，进一步作相关性分析（图1），结果显示体外确定的SI值、PI值与体内免疫指标呈现较好的相关性，表明体外确定的四个指标可作为免疫调节功能益生菌初步快速筛选方法。
应用示例
实施例1.
利用MRS培养基从广西巴马长寿人群粪便中累计分离获得324株乳酸菌，通过耐酸、耐胆盐研究发现，在pH3.0和3%猪胆酸盐的MRS液体培养基中经37℃培养3h，有16株乳酸菌存活率超过30%，对16株乳酸菌的淋巴细胞增殖指数（SI值）和巨噬细胞吞噬指数（PI值）研究发现，有2株菌SI值和PI值分别超过3.0和2.0，其中Lactobacillus rhamnosus grx19的SI值和PI值分别为3.54和2.56，经动物试验发现，L.rhamnosus grx19显著具有增强小鼠的免疫能力。
实施例2.
利用MRS培养基从新疆和布克赛尔马奶酒等传统乳制品中累计分离获得143株乳酸菌，通过耐酸、耐胆盐研究发现，在pH3.0和3%猪胆酸盐的MRS液体培养基中经37℃培养3h，有12株乳酸菌存活率超过30%，对12株乳酸菌的淋巴细胞增殖指数（SI值）和巨噬细胞吞噬指数（PI值）研究发现，有3株菌SI值和PI值分别超过3.0和2.0，其中Streptococcus thermophilus grx90（CGMCCNo：3622）的SI值和PI值分别为3.09和2.22，经动物试验发现，S.thermophilus grx90增强了小鼠的免疫能力。
Claims (1)
1.一种用于快速初步筛选具有免疫调节功能益生菌的方法，其特征在于对待筛选的乳酸菌先进行耐酸、耐胆盐的筛选，再从中选留促进淋巴细胞增殖指数大于3.0，促进巨噬细胞吞噬指数大于2.0的菌株；所述的耐酸是指在pH3.0的环境下耐受3h；所述的耐胆盐是指在0.3％的胆盐环境下耐受3h。
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