CN114947134B - 嗜热链球菌s131在改善肠道健康及调节肠道菌群中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，提出了嗜热链球菌S131在改善肠道健康及调节肠道菌群中的应用，解决了现有技术中的嗜酸乳球菌在调节肠道菌群及改善肠道健康中技术空白的问题。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体的，涉及嗜热链球菌S131在改善肠道健康及调节肠道菌群中的应用。
背景技术
近年来，益生菌在人体健康方面的研究一直是研究的焦点，适量的服用益生菌能够促进营养物质的消化吸收、提高机体免疫力。
最为常用的人用益生菌主要有乳杆菌、双歧杆菌，乳杆菌包括鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等，双歧杆菌类主要包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌等。
人体肠道中寄居的大量的的微生物，即为肠道菌群，这些肠道菌群依靠人体的肠道生存，同时又能够调节人体生理生化功能，对于人体肠道健康有着重要的作用。
申请号为202110313119.4的专利申请文件一株缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的两歧双歧杆菌及其应用中，公开了一株两歧双歧杆菌CFM1166能够提高粪便含水量、增加结肠组织中血清素的水平等，从而缓解便秘。
但是，嗜酸乳球菌常用于酸奶发酵，在改善肠道健康中的应用鲜见报道。
发明内容
本发明提出嗜热链球菌S131在改善肠道健康及调节肠道菌群中的应用，解决了现有技术中的嗜酸乳球菌在调节肠道菌群及改善肠道健康中技术空白的问题。
本发明的技术方案如下：
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S131在制备用于改善肠道健康及调节肠道菌群的组合物中的应用。
作为进一步的技术方案，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。
作为进一步的技术方案，所述食品采用添加剂与嗜热链球菌S131粉剂混合得到，所述添加剂包括低聚果糖、乳糖醇、水苏糖、低聚异麦芽糖的一种或多种。
作为进一步的技术方案，所述组合物中包括嗜热链球菌S131活菌、灭活菌、代谢产物中的一种或多种。
作为进一步的技术方案，所述组合物是用于修复肠上皮细胞损伤。
作为进一步的技术方案，所述组合物是用于调节肠道吸水性。
作为进一步的技术方案，所述组合物是用于修复肠道黏膜屏障。
作为进一步的技术方案，所述组合物是用于调节肠上皮细胞神经递质能力。
作为进一步的技术方案，所述组合物是用于促进肠道总乳杆菌、双歧杆菌及嗜黏蛋白阿克曼菌繁殖。
作为进一步的技术方案，所述组合物是用于促进肠上皮细胞增殖。
本发明的有益效果为：
1、嗜热链球菌S131菌体在增加肠道润滑度、促进排便方面发挥较好的作用，具有修复ETEC造成的肠道黏膜屏障损伤的能力，具有预防ETEC造成的肠道黏膜屏障受损的能力。
2、嗜热链球菌S131活菌、灭活菌、代谢产物都具有抑制肠道蠕动，从而治疗腹泻的能力，也能够预防ETEC引起的腹泻症状，能够促进肠上皮细胞增殖，修复并预防ETEC造成的肠上皮细胞损伤的能力；嗜热链球菌S131能够调节肠道吸水能力，改善粪便含水量。
3、S131菌体能促进肠道有益菌—总乳杆菌、双歧杆菌及AKK的增殖，提高了肠道有益菌浓度，增强肠道健康。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为不同浓度S131菌株、灭活菌株、代谢产物对肠上皮细胞黏蛋白MUC2 mRNA表达的影响；
图2为不同浓度S131菌株、灭活菌株、代谢产物对肠上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA表达的影响；
图3为不同浓度S131菌株、灭活菌株、代谢产物对对肠上皮细胞五羟色胺转运体表达的影响；
图4为不同浓度S131菌株、灭活菌株、代谢产物对肠上皮细胞增殖率的影响；
图5为不同浓度S131菌株、灭活菌株、代谢产物对肠上皮细胞水通道蛋白AQP-3mRNA表达的影响；
图6为不同浓度S131菌株、灭活菌株、代谢产物对肠道总乳杆菌的影响；
图7为不同浓度S131菌株、灭活菌株、代谢产物对肠道AKK的影响；
图8为不同浓度S131菌株、灭活菌株、代谢产物对肠道双歧杆菌的影响；
图9为便秘人群试服前后症状体征量化积分值。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S131在专利公报中公开，公开的专利申请文件申请号202111242232.4，申请日2021.10.25，发明名称为一株嗜热链球菌S131及其在免疫调节领域中的应用，并且已经经过国家知识产权局承认的用于专利程序的保藏机构保藏，可以认定为公众可以得到，而不要求进行保藏的情形。
本发明的实施例中：
S131L1代表高浓度的S131活菌菌体；
S131L2代表中浓度的S131活菌菌体；
S131L3代表低浓度的S131活菌菌体；
S131D1代表高浓度的S131灭活菌体；
S131D2代表中浓度的S131灭活菌体；
S131D3代表低浓度的S131灭活菌体；
S131S代表代谢产物。
实验例1
将成人健康粪便与生理盐水按照1:10的比例稀释得到粪便悬液，并分别取500μL置于发酵小瓶中。
(每个发酵小瓶中含有5mL YCFA培养基，成分为：1g/L阿拉伯半乳聚糖、2g/L果胶、1g/L木聚糖、3g/L淀粉、0.4g/L葡萄糖、3g/L酵母膏、3g/L蛋白胨、0.8g/L NaCl、0.5g/LKH2PO4、0.5g/L K2HPO4、0.4g/L CaCl2.2H2O、0.08g/L MgSO4.7H2O、0.01g/L氯化血红素，并加入0.3μg/L维生素混合物)
本实验例中实验菌株为S131L1、S131L2、S131L3、S131D1、S131D2、S131D3、S131S。
(1)设置如下益生菌组：
干预组(S131)：将实验菌株各100μL接入上述发酵小瓶，在37℃培养箱培养24h；
治疗组(E+S131)：将100μL产肠毒素大肠埃希氏(ETEC)菌液接入上述发酵小瓶使终浓度为107菌体/mL，于37℃培养箱培养12h，之后加入实验菌株各100μL，在37℃培养箱共同培养12h；
预防组(S131+E)：将实验菌株各100μL接入上述发酵小瓶，在37℃培养箱培养12h，之后将100μL ETEC菌液接入发酵小瓶，在37℃培养箱共同培养12h；
ETEC组：将100μL产肠毒素大肠埃希氏(ETEC)菌液接入发酵小瓶，使终浓度为107菌体/mL，于37℃培养箱培养24h；
对照组(control)：在发酵小瓶中加入100μL无氧生理盐水，于37℃培养箱培养24h；培养完成后取发酵液离心得上清液过滤除菌。
上述益生菌组中，实验菌株在发酵小瓶中的终浓度分别为109菌体/mL、108菌体/mL、107菌体/mL，对应高中低三个浓度梯度。
(2)将HT-29细胞复苏后，于5％培养箱中37℃培养，收集第3代HT-29细胞，调整细胞浓度，按密度2.5×105个细胞/mL接种于24孔板，每孔2mL，在37℃培养箱中孵育24h。待细胞贴壁后，弃去上清液，每孔加入2mL MyCoy’s 5A培养基(10％血清)，再加入200μL肠道菌群体外批量培养中获得的益生菌组上清液，空白组加200μL MyCoy’s 5A培养基(10％血清)，每组3个重复，在37℃、5％CO2条件下孵育24h，收集各孔细胞。
(3)采用RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(离心柱型)DP451，按照说明书的步骤提取RNA，然后检测RNA的完整性、纯度、浓度，达标后使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA。
(4)荧光定量PCR检测黏蛋白MUC2、MUC5AC基因表达：
引物设计：管家基因采用18SrRNA和GAPDH
| Primer名称 | 序列(5'to 3') |
| MUC2-F | GACCCGCACTATGTCACCTT |
| MUC2-R | GGACAGGACACCTTGTCGTT |
| MUC5AC-F | CCAGCTCTGTGGCTTACTCC |
| MUC5AC-R | TCGGAGGTGGATATTGAAGG |
| 18SrRNA-F | TGTGATGCCCTTAGATGTCC |
| 18SrRNA-R | GATAGTCAAGTTCGACCGTC |
| GAPDH-F | CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG |
| GAPDH-R | CATGGTGGTGAAGACGCCAG |
程序设定：95℃15min；40个循环：95℃10s，60℃30s，72℃30s；融解曲线：65℃-95℃，每步0.5℃保持5s。
嗜热链球菌S131对肠上皮细胞黏蛋白MUC2、MUC5AC mRNA表达影响如图1、图2所示，干预组中，S131菌体能够提高肠上皮细胞黏蛋白MUC2的基因表达水平，具有提高肠道润滑性，缓解便秘的作用。治疗组中，S131菌体MUC2与MUC5AC基因表达水平都随浓度降低呈先上升后下降的趋势，灭活菌体MUC2与MUC5AC基因表达水平随浓度降低而升高，中浓度S131菌体及低浓度灭活菌体具有较优的提高肠上皮细胞黏蛋白基因表达水平，从而修复ETEC造成的肠道黏膜屏障损伤的能力。预防组中S131菌体及代谢产物提高了细胞黏蛋白基因表达水平，低浓度S131菌体具有显著的提高肠上皮细胞黏蛋白基因表达水平，预防ETEC造成的肠道黏膜屏障受损的能力。
综上，S131菌体在增加肠道润滑度、促进排便方面发挥较好的作用；S131菌体及灭活菌体均具有修复ETEC造成的肠道黏膜屏障损伤的能力，S131菌体和代谢产物具有预防ETEC造成的肠道黏膜屏障受损的能力。
实验例2
采用与实验例1相同的方法对菌体及发酵上清液与HT-29细胞共培养后检测五羟色胺转运体基因SERT表达。
引物设计：管家基因采用18SrRNA和GAPDH
| Primer名称 | 序列(5'to 3') |
| 18SrRNA-F | TGTGATGCCCTTAGATGTCC |
| 18SrRNA-R | GATAGTCAAGTTCGACCGTC |
| SERT-F | AATGGGTACTCAGCAGTTCC |
| SERT-R | CCACAGCATAGCCAATCAC |
| GAPDH-F | CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG |
| GAPDH-R | CATGGTGGTGAAGACGCCAG |
| 18SrRNA-F | TGTGATGCCCTTAGATGTCC |
| 18SrRNA-R | GATAGTCAAGTTCGACCGTC |
程序设定：95℃15min；40个循环：95℃10s，60℃30s，72℃30s；融解曲线：65℃-95℃，每步0.5℃保持5s。
嗜热链球菌S131对肠上皮细胞五羟色胺转运体表达的影响如图3所示，干预组中，S131活菌、灭活菌、代谢产物均降低细胞SERT mRNA表达水平，表示S131具有抑制肠道蠕动，从而治疗腹泻的能力。治疗组中，只有高浓度S131菌体能够降低细胞SERT mRNA表达水平，预防组中，除低浓度S131菌体及灭活菌体外，各实验组均降低了细胞SERT mRNA表达水平，表示其具有抑制肠道蠕动，预防ETEC引起的腹泻症状。
综上，S131活菌、灭活菌、代谢产物具有抑制肠道蠕动，从而治疗腹泻的能力。S131中高浓度活菌和灭活菌以及代谢产物都能够预防ETEC引起的腹泻症状。
实验例3
收集第3代培养2d后的HT-29细胞，按105个细胞/mL接种于96孔板，每孔100μL在37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。细胞贴壁后，除去上清液，每孔中添加100μL MyCoy’s 5A培养基，再添加10μL过滤除菌的肠道菌群体外批量培养中获得的益生菌组上清液样品(与实验例1相同)，每组5个重复，37℃、5％CO2孵育12h。每孔内加入10μL的CCK-8溶液，细胞培养箱内孵育1h后测定OD值(450nm波长下)。
细胞增殖指数＝(As-Ac)/Ac，式中As为实验组OD值，Ac为空白对照组OD值。
S131对肠上皮细胞增殖率的影响如图4所示，S131上清均未表现出细胞增殖效果。干预组中，细胞增殖率随S131菌体浓度的降低呈先上升后下降的趋势，中浓度S131菌体表现出更优秀的细胞增殖效果。治疗组中，S131菌体及灭活菌体细胞增殖能力随浓度下降而升高，低浓度S131菌体及灭活菌体表现出较优的修复ETEC造成的肠上皮细胞损伤的能力。预防组中，S131菌体及灭活菌体细胞增殖能力随浓度降低呈先上升后下降的趋势，中浓度S131菌体及灭活菌体表现出较好的预防ETEC造成的肠上皮细胞损伤的能力。另外，治疗组中S131菌体相比于灭活菌表现出更好的细胞增殖能力。
综上，S131能够促进肠上皮细胞增殖，修复并预防ETEC造成的肠上皮细胞损伤的能力。
实验例4
实验方法及各组设定同实验例1，提取HT-29细胞总RNA后反转录成cDNA，最后采用荧光定量qPCR检测AQP-3mRNA表达，qPCR实验条件参照实验例1。引物序列如下：
| Primer名称 | 序列(5'to 3') |
| AQP3-F | AGACAGCCCCTTCAGGATTT |
| AQP3-R | TCCCTTGCCCTGAATATCTG |
| 18SrRNA-F | TGTGATGCCCTTAGATGTCC |
| 18SrRNA-R | GATAGTCAAGTTCGACCGTC |
| GAPDH-F | CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG |
| GAPDH-R | CATGGTGGTGAAGACGCCAG |
图5为S131对肠上皮细胞水通道蛋白AQP-3mRNA表达影响，干预组中，S131菌体都起到了提高细胞AQP-3mRNA表达能力的作用，其中中浓度S131菌体提高程度最大。治疗组中，中、低浓度S131菌体，灭活菌体、上清及预防组中中、低浓度菌体、上清提高了肠上皮细胞AQP-3mRNA表达能力，表示其具有较好的提高肠道吸水能力，治疗及预防ETEC造成的腹泻症状的能力。另外，干预组中S131灭活菌体与代谢产物显著抑制了肠上皮细胞水通道蛋白AQP-3mRNA的表达，治疗组中S131灭活菌体也能显著抑制肠上皮细胞水通道蛋白AQP-3mRNA的表达，S131灭活菌体降低肠道吸水能力，提高粪便含水量，从而促进排便。
表1 S131对便秘的改善情况
表2 S131对腹泻的改善情况
实验例5
收集实验例1中发酵小瓶样品1mL，离心弃上清保留菌泥，用磁珠法提取粪便样品中微生物的总DNA，采用荧光定量qPCR检测相关菌群。
S131对肠道菌群的影响如图6-8所示，首先，ETEC抑制了肠道总乳杆菌、双歧杆菌及AKK繁殖。干预组中，低浓度S131灭活菌体促进了肠道总乳杆菌的繁殖；治疗组中，低浓度S131菌体及上清促进了肠道总乳杆菌的繁殖；预防组中，不同浓度S131菌体、灭活菌体及上清都促进了肠道总乳杆菌的繁殖。
中、高浓度S131菌体大幅度促进了肠道有益菌AKK的繁殖。而S131上清及高浓度灭活菌体促进了肠道双歧杆菌的繁殖。
因此，S131菌体及灭活菌体显著促进了肠道有益菌—总乳杆菌、双歧杆菌及AKK的增殖，提高了肠道有益菌浓度，增强肠道健康。
综上所述，嗜热链球菌S131灭活菌体及代谢产物可用于缓解肠上皮细胞水通道蛋白表达异常引起的便秘组合物中。同时，S131可用于预防神经递质表达异常的腹泻组合物中。同时，S131可通过调节水通道蛋白表达治疗大肠埃希氏菌感染引起的腹泻。另外，S131在修复肠上皮细胞损伤及修复肠道黏膜屏障方面具有良好作用。
实验例6
嗜热链球菌S131：低聚异麦芽糖＝5％：95％，对进行便秘人群试服，每人每天2条，每条2g，饭后服用，连续服用14天。在试服期间内，要求受试者保持既往生活习惯。试服前后填写问卷调查表，采用自身前后对照，比较干预前后粪便指标及排便情况的变化，试服结果总结如下。
表3 S131试服前后症状体征量化积分值变化显著性水平
注：1.“+”代表P>0.05，即有改善效果但不显著；2.“++”代表0.01<P<0.05，即改善效果显著；3.“+++”代表P<0.01，即改善效果极显著。
S131对患者便秘症状的缓解作用较好，但对患者不同便秘症状的改善程度差异较大。在试服过程中发现S131对患者排便次数和腹痛症状有一定的缓解作用。
表4试服前后症状体征量化积分值变化表
注：1.P>0.05，即有改善效果但不显著；2.P<0.05，即改善效果显著；3.P<0.01，即改善效果极显著。
人群实验共完成25人试服，在试服后24人便秘症状体征量化积分升高，1人没有变化，即24人便秘症状得到缓解。25人全部自评有效，其中24人评价效果很好，1人表示效果不明显。对试服前后各指标评分进行t检验，结果表明，S131组方对患者每周排便次数和排便疼痛情况具有极显著改善(P<0.01)，对大便性状具有显著改善作用(P<0.05)，即S131对患者便秘症状的也有一定缓解作用。试服前2人有腹胀状况，在试服后1人症状得到缓解，1人没有改善；2人存在腹痛状况，服用后情况有所改善。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1. 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S131在制备用于改善肠道健康及调节肠道菌群的组合物中的应用；
所述组合物中包括嗜热链球菌S131活菌、灭活菌中的一种或两种；
所述组合物是用于修复或预防大肠埃希氏菌导致的肠上皮细胞损伤，或调节肠道吸水性，或修复大肠埃希氏菌肠道黏膜屏障损伤，或调节肠上皮细胞神经递质能力。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物中包括嗜热链球菌S131活菌；所述组合物还用于促进肠上皮细胞增殖，或促进肠道润滑、缓解便秘，或预防大肠埃希氏菌肠道黏膜屏障损伤，或促进嗜黏蛋白阿克曼菌繁殖。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物是保健品、药品、饲料中的一种。
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