CN112011602A - 与免疫恢复相关的肠道菌群及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与免疫恢复相关的肠道菌群及其应用。本发明首次发现特定肠道细菌物种具有促进机体免疫恢复的作用。本发明提供的与免疫恢复相关的生物标志物包括32种肠道细菌物种，右旋乳酸脱氢酶、以及18个乳酸菌物种。利用该生物标志物可以对患者免疫受损后的免疫恢复预后进行风险评估，具有较高的准确性、敏感性和特异性，且样本采集便捷、不会造成机体损伤、检测方便快速、可进行定期检测，同时这些肠道物种可以用来开发预防及治疗性产品，辅助免疫功能受损患者的治疗，以降低其免疫恢复不良的发生率。

Description

与免疫恢复相关的肠道菌群及其应用
技术领域
本发明涉及微生物组学和医学分子生物学技术领域，具体地说，涉及与免疫恢复相关的肠道菌群及其应用。
背景技术
CD4+细胞(CD4+T细胞)受损，计数下降是HIV感染后最主要的病理改变和导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的主要原因。因此，治疗HIV感染最主要的目标即为恢复患者的CD4+细胞计数。抗逆转录病毒治疗(ART)能有效抑制HIV感染者的病毒复制，使大多数患者CD4+细胞计数恢复正常(>500/mm3)，称为免疫恢复者(免疫应答者，immune responders，IRs)。然而，即使经过多年的抗逆转录病毒治疗，15-20％的患者的CD4+细胞计数仍低于500/mm3，这些患者被称为免疫恢复不良者(免疫无应答者，immune non-responders，INRs)。在INRs中，即使改变ART方案或增加剂量也不能使CD4+细胞计数恢复正常。导致免疫恢复不良的相关的因素包括ART开始时间、最低CD4细胞计数、治疗前病毒载量、年龄和机体系统炎症。如果患者体内持续存在炎症状态，表现为CD8+T细胞计数增加，CD4/CD8比值降低(<1)，血浆IL-6、CRP升高，提示患者免疫恢复不良，且死亡风险增高。
近年来，肠道微生物组逐渐被认为是HIV感染患者中与炎症和CD4恢复相关的重要因素。肠道菌群失调，即肠道微生物群失调和肠道通透性增加导致全身炎症增强，常见于慢性疾病，如肥胖症和焦虑症。在HIV感染者中，肠道相关淋巴组织是HIV病毒攻击CD4+细胞的主要部位，一些证据表明，肠道CD4+T细胞的数量减少与肠道失调、肠粘膜屏障功能受损和系统炎症有关。即使ART能完全控制病毒复制，肠道失调和全身炎症仍然持续存在，尤其是在INRs中，并增加了发生炎症性非艾滋病合并症(如心血管疾病、糖尿病、肝脂肪变性和癌症)的风险。然而，肠道微生物群的哪些组成部分以及它们如何影响HIV患者以及其他免疫受损患者的恢复过程尚未厘清。
因此，发现肠道菌群中参与或影响机体免疫恢复过程的关键物种和机制，并开发相应的诊断或预后评估方法，以及通过纠正肠道失调促进免疫恢复的治疗策略是改善HIV感染患者，以及其他免疫受损患者预后的亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供与免疫恢复相关的肠道菌群及其应用。
本发明通过对大量HIV感染后免疫受损患者的粪便样本进行宏基因组shotgun测序分析发现，与免疫恢复不良患者样本相比，免疫恢复患者的肠道菌群中与链球菌属、Gemella菌属相关联的一组乳酸菌功能集群在丰度上显著富集，这些乳酸菌携带的右旋乳酸脱氢酶(D-LDH)在肠道局部产生更多乳酸，并刺激肠粘膜淋巴组织和系统CD4+细胞的增生，从而使患者的免疫功能更快恢复。利用这些乳酸菌及其功能集群中的物种在肠道菌群中的丰度，可以构建随机森林分类器(预测模型)，用于判断免疫受损后恢复情况。此外，利用这些物种中的一种或几种预防性灌胃治疗免疫受损小鼠，可以有效帮助其免疫快速恢复。基于此，本发明通过宏基因组研究和筛选获得与免疫受损后恢复能力相关的肠道细菌物种，可以作为生物标志物的组合构建预后诊断模型，对于免疫受损后恢复能力的预后判断具有较好的作用，还可以作为治疗或预防免疫恢复不良的药物或益生菌，改善免疫受损患者的预后。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与免疫恢复良好相关的肠道菌群，包括如下22种肠道微生物：Bacteroides clarus，Bacteroides caccae，Sutterellawadsworthensis，Pantoea unclassified，Granulicatella unclassified，Gemellaunclassified，Escherichia coli，Klebsiella unclassified，Clostridium bolteae，Lachnospiraceae bacterium 1-4-56FAA，Fusobacterium ulcerans，Leuconostoclactis，Klebsiella pneumoniae，Bacteroides plebeius，Lactobacillussanfranciscensis，Prevotella bivia，Lactococcus garvieae，Clostridiumclostridioforme，Streptococcus infantis，Enterobacter cloacae，Megasphaeramicronuciformis和Akkermansia muciniphila。
本发明中，所述免疫恢复良好是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降(如HIV病毒感染后的情况)，经治疗(如抗病毒治疗)后，外周血CD4+T细胞计数恢复至≥350个/mm3。
第二方面，本发明提供与免疫恢复不良相关的肠道菌群，包括如下10种肠道微生物：Coprococcus comes，Subdoligranulum unclassified，Faecalibacteriumprausnitzii，Parabacteroides unclassified，Lachnospiraceae bacterium 8-1-57FAA，Eubacterium rectale，Bacteroides coprocola，Eubacterium eligens，Butyrivibriounclassified和Eubacterium siraeum。
本发明中，所述免疫恢复不良是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降(如HIV病毒感染后的情况)，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数仍低于350个/mm3。
第三方面，本发明提供与免疫恢复相关的肠道乳酸菌集群，包括如下13种乳酸菌和5种在丰度上与乳酸菌密切关联的非乳酸菌：Bifidobacterium dentium,Gemellasanguinis,Streptococcus cristatus,Streptococcus gordonii,Streptococcustigurinus,Gemella unclassified,Streptococcus mitis oralis pneumoniae,Streptococcus australis,Granulicatella unclassified，Actinomyces graevenitzii,Clostridium celatum,Clostridium perfringens,Solobacterium moorei，Gemellahaemolysans,Streptococcus infantis,Streptococcus sanguinis,Granulicatellaadiacens和Stomatobaculum longum。
其中，与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌群，包括如下5种肠道乳酸菌：Gemella unclassified,Streptococcus mitis oralis pneumoniae,Streptococcusaustralis,Granulicatella unclassified和Streptococcus infantis。
第四方面，本发明提供所述与免疫恢复相关的肠道菌群、所述与免疫恢复不良相关的肠道菌群、所述与免疫恢复良好相关的肠道乳酸菌集群和/或所述与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌群的以下任一应用：
1)用作免疫恢复相关的生物标志物；
2)用于评价免疫功能受损患者免疫恢复情况预后；
3)用于制备评价免疫功能受损患者肠道免疫促进能力的试剂、试剂盒或系统；
4)用于制备免疫功能受损患者发生免疫恢复不良概率的检测试剂和指导用药。
优选地，人体免疫受损后，经治疗，肠道中与免疫恢复良好相关的肠道菌群总丰度与免疫恢复不良相关的肠道菌群总丰度的比值>0.6，提示该患者免疫恢复良好。
进一步地，人体免疫受损后，经治疗，将肠道中与免疫恢复良好相关的肠道乳酸菌集群中各菌种的丰度值输入随机森林预测模型，根据模型输出的评分结果，预测免疫恢复的水平(评分越高，免疫细胞计数增长越快)。
第五方面，本发明提供所述与免疫恢复相关的肠道菌群、所述与免疫恢复良好相关的肠道乳酸菌集群和/或所述与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌群在制备用于预防或治疗免疫恢复不良的生物制剂中的应用；
优选地，所述生物制剂包括但不限于活菌制剂、灭活菌制剂、活菌培养物提取物制剂等。
第六方面，本发明提供右旋乳酸脱氢酶作为免疫恢复良好相关的生物标志物中的应用。
进一步地，人体免疫受损后，经治疗，患者肠道中产右旋乳酸脱氢酶的肠道菌群的丰度值>3.5×10-6，提示该患者免疫恢复良好。
第七方面，本发明提供用于检测所述与免疫恢复良好相关的肠道菌群、所述与免疫恢复不良相关的肠道菌群、所述与免疫恢复良好相关的肠道乳酸菌集群或所述与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌群的引物(如16S rDNA检测引物)和/或探针。
第八方面，本发明提供与免疫恢复相关的肠道乳酸菌群中的一种或几种微生物生长所需营养物或刺激物制剂，用于增加肠道乳酸菌物种丰度以及预防或治疗免疫恢复不良。
第九方面，本发明提供一种用于评价免疫受损患者免疫恢复预后的系统，包括生物标志物丰度检测模块和免疫恢复预测模块；所述生物标志物检测模块用于测定待测样本中所述与免疫恢复相关的肠道菌群、所述与免疫恢复不良相关的肠道菌群、所述与免疫恢复相关的肠道乳酸菌群、所述与免疫恢复紧密相关的肠道乳酸菌群和/或右旋乳酸脱氢酶的丰度；
所述免疫恢复预测模块与所述生物标志物丰度检测模块相连，用于接收所述生物标志物丰度检测模块得到的丰度数据，经随机森林预测模型计算，得出免疫恢复的概率，概率值与免疫恢复水平正相关。
本发明中，随机森林预测模型是根据所述生物标志物在免疫恢复不良患者样本和免疫恢复样本中的丰度差异构建的随机森林分类模型。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明首次发现肠道菌群可以促进免疫受损患者的免疫恢复，这种免疫促进效应由其物种生物学特征(包括乳酸产生能力)导致。
(二)本发明提供的与免疫恢复相关的肠道菌群生物标志物对于评估免疫受损患者肠道免疫促进能力以及患者免疫恢复不良风险评估具有较高的准确性、敏感性和特异性。
(三)利用本发明提供的肠道菌群生物标志物进行免疫受损患者的检测，样本采集便捷、不会造成机体损伤、检测方便快速、可进行定期检测，追踪肠道促进免疫能力的变化，为指导免疫受损患者的治疗及康复方案的及时调整提供依据。
(四)利用本发明提供的肠道乳酸菌群中的物种培养物，可以制备预防性或治疗性产品，用于改善免疫受损患者的预后，提高其免疫恢复水平，降低免疫恢复不良发生的概率。
附图说明
图1a为本发明较佳实施例中22种IR相关物种和10种INR相关物种与CD4/CD8比值、CD4细胞、CD8细胞以及其各亚群细胞计数之间的相关关系。
图1b为本发明较佳实施例中22种IR相关物种和10种INR相关物种的丰度总和及其比值在IR和INR患者中的丰度比较。
图2a为本发明较佳实施例中D-LDH与L-LDH在IR和INR患者中的丰度比较。
图2b为本发明较佳实施例中混合酸发酵代谢通路在IR和INR患者中的丰度比较。
图3a为本发明较佳实施例中HIV患者肠道菌群的主要物种群和其中最大的集群I和集群II。
图3b为本发明较佳实施例中集群I和集群II在IR和INR患者中丰度比较。
图4a为本发明较佳实施例中集群I和集群II的治疗前后平均丰度与ART治疗后CD4细胞及其亚群细胞计数的增长率之间的相关关系。
图4b为本发明较佳实施例中集群I和集群II的治疗前丰度及治疗前后平均丰度与ART治疗后CD4细胞、CD8细胞及其各自亚群细胞计数的增长率之间的相关关系。
图4c为本发明较佳实施例中集群I和集群II的在ART治疗前后丰度比较。
图5a为本发明较佳实施例中随机森林预测模型的ROC评价曲线。
图5b为本发明较佳实施例中随机森林预测模型中对模型贡献度最大的5个物种及其模型贡献度。
图5c为本发明较佳实施例中患者随机森林预测模型评分与其ART治疗后CD4细胞计数增长率之间的关系。
图6a为本发明较佳实施例中不同实验和对照组小鼠的CD4细胞和CD8细胞在T淋巴细胞中所占比例。
图6b为本发明较佳实施例中不同实验和对照组小鼠的结肠派氏结节的免疫组化结果比较。
具体实施方式
本发明的目的在于提供与免疫恢复相关的肠道菌群生物标志物以及该生物标志物的检测试剂及其应用。
具体地，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一组可用于预测免疫受损后恢复情况预后的肠道菌群物种，其包括:
利于免疫恢复的相关物种(肠道菌群)包括：Bacteroides clarus，Bacteroidescaccae，Sutterella wadsworthensis，Pantoea unclassified，Granulicatellaunclassified，Gemella unclassified，Escherichia coli，Klebsiella unclassified，Clostridium bolteae，Lachnospiraceae bacterium 1-4-56FAA，Fusobacteriumulcerans，Leuconostoc lactis，Klebsiella pneumoniae，Bacteroides plebeius，Lactobacillus sanfranciscensis，Prevotella bivia，Lactococcus garvieae，Clostridium clostridioforme，Streptococcus infantis，Enterobacter cloacae，Megasphaera micronuciformis，Akkermansia muciniphila，共22种。
免疫恢复不良的相关物种(肠道菌群)包括：Coprococcus comes，Subdoligranulum unclassified，Faecalibacterium prausnitzii，Parabacteroidesunclassified，Lachnospiraceae bacterium 8-1-57FAA，Eubacterium rectale，Bacteroides coprocola，Eubacterium eligens，Butyrivibrio unclassified，Eubacterium siraeum，共10种。
上述生物标志物的组合能够在保证较少的检测靶标的同时，更加特异、准确地预测免疫功能受损后恢复情况，更适于在实践中用于预测免疫受损患者的预后。
第二方面，本发明提供一组乳酸菌集群，可以用于开发预测免疫受损患者预后的生物标志物。
乳酸菌集群I(Cluster I)：Bifidobacterium dentium,Gemella sanguinis,Streptococcus cristatus,Streptococcus gordonii,Streptococcus tigurinus,Gemella unclassified,Streptococcus mitis oralis pneumoniae,Streptococcusaustralis,Granulicatella unclassified；Actinomyces graevenitzii,Clostridiumcelatum,Clostridium perfringens,Solobacterium moorei。
乳酸菌集群II(Cluster II)：Gemella haemolysans,Streptococcus infantis,Streptococcus sanguinis,Granulicatella adiacens,Stomatobaculum longum。
上述乳酸菌集群生物标志物中，应用其全部或高贡献度的几个物种(Gemellaunclassified,Streptococcus mitis oralis pneumoniae,Streptococcus australis,Granulicatella unclassified和Streptococcus infantis)，可以构建预测免疫受损患者预后的随机森林分类模型。其ROC曲线的AUC值可达0.81，应用随机森林模型可以计算出每个患者的免疫促进评分，此评分可以用于预测患者CD4细胞增长率。证明本发明所述的生物标志物可较为准确地预测免疫受损患者的预后。
第三方面，本发明提供的肠道细菌产右旋乳酸脱氢酶丰度作为免疫恢复预后的生物标志物。
第四方面，本发明提供所述生物标志物的检测试剂。
具体地，所述检测试剂包括用于所述生物标志物的丰度检测的引物和/或探针，如16S rDNA检测引物。
所述检测试剂还可包括用于宏基因组测序分析所需的试剂。
第五方面，本发明提供所述生物标志物或所述生物标志物的检测试剂在制备用于辅助诊断免疫受损患者恢复不良风险的试剂、试剂盒或系统中的应用。
第六方面，本发明提供所述生物标志物或所述生物标志物的检测试剂在制备用于评价肠道免疫促进能力的试剂、试剂盒或系统中的应用。
第七方面，本发明提供所述生物标志物或所述生物标志物的检测试剂在制备用于免疫受损患者指导用药或评价免疫受损患者预后的试剂、试剂盒或系统中的应用。
具体地，上述应用中，通过检测所述生物标志物在待测样本中的丰度，根据所述生物标志物在待测样本和免疫恢复样本中的丰度差异，辅助评价免疫受损患者肠道免疫促进能力或免疫恢复情况的预后。
第八方面，本发明提供包含所述生物标志物的检测试剂的试剂或试剂盒。
第九方面，本发明提供一种用于评估免疫受损患病预后的系统，其包括生物标志物检测模块和数据处理模块；所述生物标志物检测模块用于检测待测样本中所述生物标志物的丰度；所述数据处理模块与所述生物标志物检测模块相连，用于接收所述生物标志物检测模块得到的丰度数据，输入预测模型，输出结果为其获得免疫恢复的概率。
优选地，所述免疫恢复概率通过调用数学预测模型进行。
更优选地，所述数学预测模型为根据所述生物标志物在免疫受损患者样本和免疫恢复样本中的丰度差异构建的随机森林分类模型。
第十方面，本发明提供一组可用于改善免疫受损患者免疫恢复的肠道乳酸菌集群。其包含集群中的一种或几种物种制成的预防性或治疗性产品。
第十一方面，本发明提供乳酸菌集群中的物种培养后所制成的活菌、灭活菌体或培养物提取物制剂。
第十二方面，本发明提供促进乳酸菌集群物种生长所需的物质，如乳酸、乳糖，以及乳制品等，以提高本发明的乳酸菌集群物种在患者或亚健康人群肠道中的丰度。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1 ART治疗后，免疫恢复患者的肠道菌群与恢复不良患者相比富集了更多乳酸菌
以ART治疗2年后，免疫恢复患者(IR)和免疫恢复不良患者(INR)为研究对象。其中IR和INR分别是指ART治疗2年后，HIV病毒完全抑制，同时CD4+T细胞计数分别大于350/mm3和小于350/mm3的HIV患者。
通过对患者粪便微生物群落进行shotgun测序后，获得其宏基因组数据。通过数据分析，分别鉴定了33个和25个在IR和INR组中富集的肠道物种。如图1a所示，在这些物种中，IR组的22个物种和INR组的10个物种分别与免疫恢复的重要预后标志物CD4/CD8比值呈正相关和负相关。
IR相关物种包括：Bacteroides clarus，Bacteroides caccae，Sutterellawadsworthensis，Pantoea unclassified，Granulicatella unclassified，Gemellaunclassified，Escherichia coli，Klebsiella unclassified，Clostridium bolteae，Lachnospiraceae bacterium 1-4-56FAA，Fusobacterium ulcerans，Leuconostoclactis，Klebsiella pneumoniae，Bacteroides plebeius，Lactobacillussanfranciscensis，Prevotella bivia，Lactococcus garvieae，Clostridiumclostridioforme，Streptococcus infantis，Enterobacter cloacae，Megasphaeramicronuciformis，Akkermansia muciniphila，共22种。
INR相关物种包括：Coprococcus comes，Subdoligranulum unclassified，Faecalibacterium prausnitzii，Parabacteroides unclassified，Lachnospiraceaebacterium 8-1-57FAA，Eubacterium rectale，Bacteroides coprocola，Eubacteriumeligens，Butyrivibrio unclassified，Eubacterium siraeum，共10种。
经比较，如图1b所示，IR相关的22个物种的丰度总和与INR相关的10个物种的丰度总和的比值在IR患者中显著高于INR患者，以其比值>0.6为阈值，可以较好地区分IR和INR患者。
在22个IR相关物种中，有6个是乳酸菌(LAB)，包括Streptococcus infantis、Gemella unclassified、Granulicatella unclassified、Lactococcus garvieae、Lactobacillus sanfranciscensis，而在INR相关的10个物种中未发现乳酸菌。这些乳酸菌大多属于乳杆菌目，它们具有共同的产乳酸能力，并且经常表现出形态和生理上的相似性。
如图1所示，Spearman相关系数(rho)分析显示，上述22个IR相关和10个INR相关物种与CD4+和CD8+细胞及其亚群细胞计数之间呈现关联关系：IR相关物种与CD4+细胞及其亚群CD4+CD28+、原始CD4+、归巢原始CD4+和记忆CD4+细胞，这些预后良好的标志物呈正相关，而与CD8+细胞及其亚群CD8+CD38+和CD8+DR+细胞计数，这些炎症激活和预后不良的标志呈负相关。而INR相关物种则呈现几乎相反的关联关系，即与CD4+及其亚群呈负相关，而与CD8+及其亚群呈正相关，但是关联程度较弱。IR相关物种中，两个乳酸菌物种—Streptococcusinfantis和Gemella unclassified—与CD4/CD8比值的相关性最强(rho值大于0.6)，并且与CD4+细胞计数和其亚群CD4+CD28+、原始CD4+、归巢原始CD4+，记忆性CD4+细胞正相关，而与CD8+细胞计数呈负相关。因此，在IR相关物种中，LAB的比例很高，并且与预后标志物的相关性最强，这表明产乳酸菌在促进ART后患者的免疫恢复方面发挥了作用。
实施例2免疫恢复患者的乳酸生成代谢显著高于恢复不良患者
利用宏基因组测序数据定量评估每个患者肠道菌群乳酸生成通路中的关键酶的丰度，分析实施例1中的IR和INR患者肠道菌群的乳酸生成的潜力。乳酸脱氢酶(LDH)是厌氧糖酵解过程中丙酮酸转化为乳酸的关键酶，所有乳酸都由LDH产生。LDH有两种形式L-LDH和D-LDH分别产生L-乳酸和D-乳酸。通过注释宏基因组数据中各代谢途径和酶的丰度，如图2a所示，IR组中D-LDH的丰度(EC1.1.1.28)显著高于INR组，以丰度值>3.5×10-6为阈值，可以较好的区分IR和INR患者。而L-LDH(EC1.1.1.27)丰度则在两组间无差异。此外，如图2b所示，仅利用D-LDH产生乳酸的“混合酸发酵”代谢通路在IR患者中显著高于INR患者(Wilcoxon符号秩检验，p<0.001)。D-LDH是微生物特异的乳酸脱氢酶，并且不能反向将乳酸催化成丙酮酸；与之相反，L-LDH为人体宿主和细菌共同表达，并能有效反向催化生成丙酮酸，因此D-LDH的丰度能更好的代表肠道微生物产生乳酸的能力。D-LDH和相关代谢通路的增加与IR患者肠道菌群中乳酸菌富集的结论相一致，并意味着局部微生物乳酸的产生增加对于促进免疫恢复具有作用。
实施例3相比免疫恢复不良患者，乳酸菌功能群在免疫恢复患者肠道中更为富集
微生物群中相互作用的物种常组织成功能群，并作为一个整体实施代谢功能。利用宏基因组测序数据，分析实施例1中的IR和INR患者肠道菌群。如图3a所示，通过评估所有出现物种两两之间的丰度关联关系，共发现了9个在丰度上呈严格相关(rho>0.8)的物种群。其中，两个最大的物种群(集群I和II)都包含了大量的乳酸菌：集群I有13个物种，其中9个为乳酸菌，集群II有5个物种，其中4种为乳酸菌。这些乳酸菌主要来自链球菌属、Gemella属和Granulicatella属，并在实施例1的样本分析中被认定是IR相关物种。
比较IR和INR组患者样本中集群Ⅰ、Ⅱ的物种总丰度，发现IR患者明显高于INR患者，尤其是集群Ⅱ的物种(图3b)，说明这两个乳酸菌功能集群可能作为整体发挥作用，促进免疫恢复。集群I和II的物种包括：
集群I：乳酸菌：Bifidobacterium dentium,Gemella sanguinis,Streptococcuscristatus,Streptococcus gordonii,Streptococcus tigurinus,Gemellaunclassified,Streptococcus mitis oralis pneumoniae,Streptococcus australis,Granulicatella unclassified；非乳酸菌：Actinomyces graevenitzii,Clostridiumcelatum,Clostridium perfringens,Solobacterium moorei。
集群II：乳酸菌：Gemella haemolysans,Streptococcus infantis,Streptococcus sanguinis,Granulicatella adiacens；非乳酸菌：Stomatobaculumlongum。
实施例4乳酸菌功能群用于评估ART治疗后免疫恢复水平
以初诊尚未治疗的HIV感染患者作为验证队列，评估集群I和II物种对于ART治疗1年后的免疫恢复水平的预测能力。累计招募26例患者，收集ART治疗前和治疗1年后的粪便样本进行宏基因组的shotgun测序。治疗1年后，所有患者均达到完全病毒抑制，其中16例CD4+细胞计数达到350/mm3。
如图4a所示，Spearman相关系数(rho)分析显示，集群I和II中物种的总丰度(前后样本的平均值)与ART治疗后的CD4+细胞、原始CD4+，和CD4+CD28+细胞计数的增长率(后/前比值)密切相关(rho>0.4)。这一结果表明，ART治疗后免疫恢复程度依赖于两个乳酸菌集群中物种的总丰度。而这两个集群的物种丰度(前后样本的平均值)与ART后CD8+细胞计数及其亚群的变化几乎没有相关性(图4b)。单独应用ART治疗前的乳酸菌集群的初始丰度进行预测，则与ART后T细胞亚群的变化之间的相关性不如平均丰度的强(图4b)。
通过比较ART前后样本的物种丰度，发现这两个对于免疫恢复有利的乳酸菌集群的总丰度在ART治疗后显著降低(图4c)。同时，在19种ART后丰度显著下降的物种中有6种是乳酸菌，包括Bifidobacterium longum、Granulicatella unclassified，Streptococcusaustralis，Streptococcus mitis，Streptococcus parasanguinis和Streptococcussalivarias。表明ART药物不利于肠道乳酸菌物种的生长，从这个机理上讲，不利于免疫恢复，对于接受ART治疗的患者，适当补充上述或其他乳酸菌可能有利于免疫恢复。
实施例5用于免疫恢复预测的随机森林分类模型
应用两个乳酸菌集群中的物种丰度，构建随机森林分类器，可以用于预测免疫受损患者的恢复能力。首先应用实施例1的IR和INR样本对随机森林分类器进行训练，并使用ROC曲线评估其区分IR和INR样品的准确性。如图5a所示，ROC曲线下面积(AUC)在1000次自举测试中达到81％，表明两个乳酸菌集群中物种的丰度可以准确地代表了IR和INR之间的差异。如图5b所示，通过评价所有物种对分类器的贡献度，可见Granulicatellaunclassified、Streptococcus infantis、Streptococcus australis，Streptococcus-mitis和Gemella unclassified是对模型贡献最大的前五个物种。利用该分类器可以预测实施例4中所述验证队列的经ART治疗一年后的免疫恢复水平。首先应用分类器计算每个患者的分类评分，这个评分是一个患者被分入IR而非INR的概率，代表乳酸菌集群物种对其免疫促进作用的综合评分，故称之为免疫促进分数。根据验证队列中每个患者的免疫促进评分，将患者平分为人数大致相等的四组，可见ART治疗后的CD4+细胞生长速率具有随着免疫促进评分增高而增加的趋势(图5c)，这进一步证实了这些乳酸菌集群中的物种在预测免疫恢复方面的预测价值。
实施例6口服乳酸菌对促进免疫恢复的治疗作用
首先通过腹腔注射抗CD4抗体建立了短暂性CD4+淋巴细胞减少的免疫受损小鼠模型。16只4周龄无菌C57BL6J小鼠，经两次(间隔三天)腹腔注射50μg抗CD4抗体(cloneGK1.5,BioXCell)构建免疫受损模型。对于这些无菌C57BL/6小鼠，在注射抗体前，分别通过三次灌胃Streptococcus thermophilus(ST，n＝4)或Eubacterium Barkeri(EB，n＝4)观察其预防性治疗免疫恢复不良的效果，剂量为每次1×108个活菌，并与免疫受损阳性对照组(Ctrl，n＝4)，以及没有任何处理的空白对照组(mock，n＝4)进行了平行研究。细菌灌胃的小鼠没有生病或感染的迹象。注射抗体造模后经流式细胞仪检测确认CD4+细胞均显著降低，造模成功，粪便16S rDNA扩增和测序证实两种菌均成功接种，且没有其他菌污染的迹象。Streptococcus thermophilus灌胃组小鼠的粪便乳酸浓度(6.5μM/g)略高于Eubacterium Barkeri灌胃组(4.6μM/g)。其中，Eubacterium Barkeri为ATCC No.25849，可参见E R Stadtman,et al.Clostridium barkeri sp.n.J Bacteriol.1972 May；110(2):758-60.PMID:4553843。
抗CD4抗体注射4周后处死所有小鼠，两组细菌灌胃小鼠的CD4均较阳性对照组恢复更快。如图6a和图6b所示，流式细胞仪检测显示CD4+细胞比例增加，CD4+细胞中原始CD4+细胞亚群的比例增加，T细胞中CD8+细胞比例减少。这一结果表明，两种细菌都能促进CD4+细胞的恢复，并降低CD8+细胞所占比例。相对而言，产乳酸的Streptococcus thermophilus促进CD4+细胞恢复的作用比Eubacterium Barkeri更强，使其T细胞亚群的比例几乎与空白对照组水平相当，表明其对CD4+恢复的作用优于产丁酸的Eubacterium Barkeri。在肠系膜淋巴结(LN)和脾脏收集的T细胞亚群中也观察到类似的作用。然而，这两种细胞对CD8+细胞亚群(效应CD8+细胞、CD8+CD38+细胞)在血液、肠系膜LN和脾脏中的比例的影响并不明显，对γδT细胞的影响也不明显。这些结果表明Streptococcus thermophilus的促进作用似乎更多地作用于提高CD4+细胞，而不是调节CD8+细胞和其他T细胞亚群，这与在实施例4的验证队列中观察到的乳酸菌物种的免疫效应是一致的。此外，在病理切片中观察结肠粘膜下淋巴组织派氏结节的形成，可见在Streptococcus thermophilus的刺激下，派氏结节明显扩大，甚至超过了空白对照小鼠派氏结节的大小，免疫组化染色显示CD4+细胞在Streptococcus thermophilus灌胃小鼠的派氏结节中的信号比Eubacterium Barkeri和阳性对照小鼠更强。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.与免疫恢复良好相关的肠道菌群，其特征在于，包括如下22种肠道微生物：Bacteroides clarus，Bacteroides caccae，Sutterella wadsworthensis，Pantoeaunclassified，Granulicatella unclassified，Gemella unclassified，Escherichiacoli，Klebsiella unclassified，Clostridium bolteae，Lachnospiraceae bacterium 1-4-56FAA，Fusobacterium ulcerans，Leuconostoc lactis，Klebsiella pneumoniae，Bacteroides plebeius，Lactobacillus sanfranciscensis，Prevotella bivia，Lactococcus garvieae，Clostridium clostridioforme，Streptococcus infantis，Enterobacter cloacae，Megasphaera micronuciformis和Akkermansia muciniphila；
所述免疫恢复良好是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数恢复至≥350个/mm3。
2.与免疫恢复不良相关的肠道菌群，其特征在于，包括如下10种肠道微生物：Coprococcus comes，Subdoligranulum unclassified，Faecalibacterium prausnitzii，Parabacteroides unclassified，Lachnospiraceae bacterium 8-1-57FAA，Eubacteriumrectale，Bacteroides coprocola，Eubacterium eligens，Butyrivibrio unclassified和Eubacterium siraeum；
所述免疫恢复不良是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数仍低于350个/mm3。
3.与免疫恢复良好相关的肠道乳酸菌集群，其特征在于，包括如下13种乳酸菌和5种在丰度上与乳酸菌密切关联的非乳酸菌：Bifidobacterium dentium,Gemella sanguinis,Streptococcus cristatus,Streptococcus gordonii,Streptococcus tigurinus,Gemella unclassified,Streptococcus mitis oralis pneumoniae,Streptococcusaustralis,Granulicatella unclassified，Actinomyces graevenitzii,Clostridiumcelatum,Clostridium perfringens,Solobacterium moorei，Gemella haemolysans,Streptococcus infantis,Streptococcus sanguinis,Granulicatella adiacens和Stomatobaculum longum；
所述免疫恢复良好是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数恢复至≥350个/mm3。
4.与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌，其特征在于，包括Gemella unclassified,Streptococcus mitis oralis pneumoniae,Streptococcus australis,Granulicatellaunclassified和Streptococcus infantis五种肠道乳酸菌；
所述免疫恢复良好是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数恢复至≥350个/mm3。
5.权利要求1所述与免疫恢复良好相关的肠道菌群、权利要求2所述与免疫恢复不良相关的肠道菌群、权利要求3所述与免疫恢复良好相关的肠道乳酸菌集群和/或权利要求4所述与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌作为免疫恢复相关的生物标志物中的应用；
所述免疫恢复良好是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数恢复至≥350个/mm3；
所述免疫恢复不良是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数仍低于350个/mm3。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
人体免疫受损后，经治疗，肠道中与免疫恢复良好相关的肠道菌群总丰度与免疫恢复不良相关的肠道菌群总丰度的比值>0.6，提示该患者免疫恢复良好；和/或
人体免疫受损后，经治疗，将肠道中与免疫恢复良好相关的肠道乳酸菌集群中各菌种的丰度值输入随机森林预测模型，根据模型输出的评分结果，预测免疫恢复的水平。
7.权利要求1所述与免疫恢复良好相关的肠道菌群、权利要求3所述与免疫恢复良好相关的肠道乳酸菌集群和/或权利要求4所述与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌在制备用于预防或治疗免疫恢复不良的生物制剂中的应用；
优选地，所述生物制剂包括活菌制剂、灭活菌制剂、活菌培养物提取物制剂；
所述免疫恢复不良是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数仍低于350个/mm3。
8.右旋乳酸脱氢酶作为免疫恢复良好相关的生物标志物中的应用，其中，所述免疫恢复良好是指人体免疫受损导致外周血CD4+细胞数量下降，经治疗后，外周血CD4+T细胞计数恢复至≥350个/mm3。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，人体免疫受损后，经治疗，患者肠道中产右旋乳酸脱氢酶的肠道菌群的丰度值>3.5×10-6，提示该患者免疫恢复良好。
10.用于检测权利要求1所述与免疫恢复良好相关的肠道菌群、权利要求2所述与免疫恢复不良相关的肠道菌群、权利要求3所述与免疫恢复相关的肠道乳酸菌集群或权利要求4所述与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌的引物和/或探针。
11.一种用于评价免疫受损患者免疫恢复预后的系统，其特征在于，包括生物标志物丰度检测模块和免疫恢复预测模块；
所述生物标志物丰度检测模块用于测定待测样本中权利要求1所述与免疫恢复良好相关的肠道菌群、权利要求2所述与免疫恢复不良相关的肠道菌群、权利要求3所述与免疫恢复相关的肠道乳酸菌集群、权利要求4所述与免疫恢复良好高度相关的肠道乳酸菌群和/或右旋乳酸脱氢酶的丰度；
所述免疫恢复预测模块与所述生物标志物丰度检测模块相连，用于接收所述生物标志物丰度检测模块得到的丰度数据，经随机森林预测模型计算，得出免疫恢复的概率，概率值与免疫恢复水平正相关。
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