CN110063970A - 与irAE相关的肠道菌群及irAE的治疗和预防方法 - Google Patents

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Abstract

本发明鉴别到了影响肿瘤免疫治疗相关不良反应的关键肠道菌属。所述关键肠道菌属可作为检测指标来诊断和预测肿瘤免疫治疗引起的相关不良反应，并可用于预防、缓解或治疗肿瘤免疫治疗的相关不良反应。

Description

与irAE相关的肠道菌群及irAE的治疗和预防方法
技术领域
本发明属于免疫疗法领域，具体涉及与肿瘤免疫治疗相关不良反应相关的肠道菌群及肿瘤免疫治疗相关不良反应的治疗和预防方法。
背景技术
以免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Blockade，ICB)为代表的免疫疗法是当前恶性肿瘤治疗领域最新、最有效的方法。但随着ICB在多种肿瘤治疗中的广泛应用，以及疫苗和嵌合抗原受体T-细胞(CAR T)等其它肿瘤免疫疗法的出现，目前临床面临的最大问题之一是发病率可高达80.2％的免疫相关性不良反应(Immune-Related AdverseEvents，irAE)，即免疫治疗副作用。最近一项发表在顶级肿瘤医学期刊JAMA Oncology上关于免疫检查点抑制剂致死性副作用的评估性研究，报道总结了涉及多达750种致死性免疫相关不良事件。这些免疫相关性副作用可累及胃肠道、皮肤、肝脏、肺、心血管、内分泌系统、肌肉骨骼及中枢神经系统等多个器官组织。
irAE的发生主要与ICB或CAR-T等免疫治疗后引起的大量细胞因子释放以及各类脏器的活化T细胞等免疫细胞的大量浸润相关。irAE的发生可影响或中断ICB或CAR-T等治疗的进程，严重者可导致ICB或CAR-T等治疗患者的死亡。目前除了对于irAE严患者给予皮质类固醇或其他免疫抑制药物处理外，临床尚缺乏针对相关副反应的针对性的安全、有效的治疗方案。
在所有irAE中，消化系统毒性即免疫性肠炎是最常见的，同时也是3-4级以及导致死亡人数最多的一类irAE。临床上可表现为严重腹泻、结肠炎、腹痛、消化道糜烂或溃疡等症状。目前随着ICB临床治疗适应症的逐渐增多，特别是抗CTLA-4抗体和抗PD-1/PDL-1抗体等的联用，出现irAE的患者将越来越多。如何预测以及治疗ICB或CAR-T等免疫治疗诱导的免疫相关不良反应是临床上急需解决的难题之一。因此，根据肿瘤免疫治疗irAE的发生机制设计针对性的治疗方案对于解决这一难题具有重要临床意义。
最新的研究显示ICB治疗的疗效以及相关性副作用的发生与肠道微生物关系密切。人体肠道内寄居着大约1014个的微生物，这些微生物通称为“肠道菌群”，它们影响了宿主的免疫系统、糖脂代谢等多种病理生理过程。同时，肠道菌群改变对免疫治疗效果及副反应的发生、严重程度、患者耐受度、是否出现耐药等都有密切的关系。由ICB抗体引起的胃肠道irAE与炎症性肠病有相似之处，以腹泻和小肠和结肠炎症为主，可导致肠道菌群失调，这说明肠道菌群对ICB治疗抗体引发的消化道副反应产生具有一定的影响。大量临床ICB治疗资料显示由CTLA-4抗体治疗引起的胃肠道irAE比较常见；而由阻断PD-1或CAR-T等引起的全身临床症状更多样化。
发明内容
本发明提供来自Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属中的至少一个属的至少一种细菌，或至少两个属的至少两种细菌，或者至少三个属的至少三种细菌，或全部四个属的细菌，以及任选的来自Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属中的至少一个属的至少一种细菌在制备预防或治疗使用免疫检查点抑制剂或嵌合抗原受体基因修饰细胞进行的肿瘤免疫治疗引起的相关不良反应的细菌制品或药物中的应用。
在所述应用的一个或多个实施方案中，所述应用为Bifidobacterium属的细菌和/或Lactobacillus属的细菌在制备预防或治疗所述相关不良反应的细菌制品或药物中的应用。
在所述应用的一个或多个实施方案中，所述相关不良反应由抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体引起、或由抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体与抗CTLA-4抗体两者共同给药引起、或由CAR-T细胞治疗引起。
在所述应用的一个或多个实施方案中，所述Bifidobacterium属的细菌包括两歧双歧杆菌(B.bifidum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、长双歧杆菌(B.longum)、乳双歧杆菌(B.lactis)和短双歧杆菌(B.breve)。
在所述应用的一个或多个实施方案中，所述Lactobacillus属的细菌包括罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri)、嗜酸乳杆菌(Lactobicillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobicillus bulgaricus)、德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobicillusdeibrueckii subsp，Bulgaricus)、短乳杆菌(Lactobicillus brevis)、乳酸乳杆菌(Lactobicillus lactis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobicillus rhammosus)、植物乳杆菌(Lactobicillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobicillus paracasei)、干酪乳杆菌(Lactobicillus casei)和瑞士乳杆菌(Lactobicillus helveticus)。
在所述应用的一个或多个实施方案中，所述Lactobacillus属的细菌为罗伊氏乳酸杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。在所述应用的一个或多个实施方案中，所述Bifidobacterium属的细菌为短双歧杆菌和/或乳双歧杆菌。
在所述应用的一个或多个实施方案中，所述Lactobacillus属的细菌为乳双歧杆菌，如HN019；所述Bifidobacterium属的细菌为鼠李糖乳杆菌，如NH001。
在所述应用的一个或多个实施方案中，所述应用为Bifidobacterium属的细菌(如短双歧杆菌和/或乳双歧杆菌)在制备预防或治疗由抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体引起的相关不良反应、或由抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体与抗CTLA-4抗体两者共同给药引起的相关不良反应、或由CAR-T细胞治疗引起的相关不良反应的细菌制品或药物中的应用。
本发明还提供一种细菌制品或药物组合物，含有来自Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属中的至少一个属的至少一种细菌，或至少两个属的至少两种细菌，或者至少三个属的至少三种细菌，或全部四个属的细菌，以及任选的来自Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属中的至少一个属的至少一种细菌。在一个或多个实施方案中，所述细菌制品或药物组合物至少含有来自Lactobacillus属的罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillusreuteri)。
在所述细菌制品或药物组合物的一个或多个实施方案中，所述细菌制品或药物组合物不同时含有乳双歧杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌NH001。
在所述细菌制品或药物组合物的一个或多个实施方案中，所述细菌制品或药物组合物含有Bifidobacterium属的细菌和Lactobacillus属的细菌，其中，所述Lactobacillus属的细菌至少包括罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri)；任选地，所述细菌制品或药物组合物还含有乳双歧杆菌(如HN019)和鼠李糖乳杆菌(如NH001)中的任意一种或两种。
在所述细菌制品或药物组合物的一个或多个实施方案中，所述细菌制品或药物组合物含有Bifidobacterium属的细菌和Lactobacillus属的细菌，但不同时含有乳双歧杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌NH001。
在所述细菌制品或药物组合物的一个或多个实施方案中，所述细菌制品或药物组合物含有罗伊氏乳酸杆菌，任选地含有短双歧杆菌、乳双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌中的任意一种或多种。在一些实施方案中，所述细菌制品或药物组合物含有罗伊氏乳酸杆菌和短双歧杆菌，任选地含有乳双歧杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。
在所述细菌制品或药物组合物的一个或多个实施方案中，所述药物组合物还含有用于肿瘤免疫疗法的免疫检查点抑制剂和/或嵌合抗原受体基因修饰细胞。
本发明还提供一种检测试剂盒，其含有：用于检测以下属的肠道菌的试剂：Escherichia/Shigella、Lactobacillus、Bacteroides、unclassified、Allobaculu、Barnesiella、Parabacteroides、Romboutsia、Enterococcus、Alistipes、Helicobacter、Olsenella、Bifidobacterium、Akkermansia、Blautia、Klebsiella、Clostridium XlVa、Parasutterella、Clostridium XVIII、Turicibacter、Veillonella、Bilophila、Desulfovibrio、Clostridium sensu stricto、Clostridium IV、Flavonifractor、Eubacterium和Pseudoflavonifractor；或用于检测以下菌属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Helicobacter、Mycoplasmataceae、Bacteroides、Dehalobacterium、Lactobacillus、Clostridium、Lachnospiraceae、Anaeroplasma、Bacteroidales S24-7group、Turicibacter、Oscillospira、Prevotella、Aggregatibacter、Parabacteroides、Ruminococcus、Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Sutterella、Anaerotruncus、Mucispirillum、Chlamydia和Escherichia；或用于检测以下菌属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Bacteroides、Bifidobacterium、Enterococcus、Helicobacter、Lactobacillus、Parabacteroides、Turicibacter和Escherichia。
本发明还提供选自以下的试剂在制备诊断免疫检查点抑制剂或嵌合抗原受体基因修饰细胞治疗诱导的副作用的诊断试剂盒中的应用：用于检测以下属的肠道菌的试剂：Escherichia/Shigella、Lactobacillus、Bacteroides、unclassified、Allobaculu、Barnesiella、Parabacteroides、Romboutsia、Enterococcus、Alistipes、Helicobacter、Olsenella、Bifidobacterium、Akkermansia、Blautia、Klebsiella、Clostridium XlVa、Parasutterella、Clostridium XVIII、Turicibacter、Veillonella、Bilophila、Desulfovibrio、Clostridium sensu stricto、Clostridium IV、Flavonifractor、Eubacterium和Pseudoflavonifractor；或用于检测以下属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Helicobacter、Mycoplasmataceae、Bacteroides、Dehalobacterium、Lactobacillus、Clostridium、Lachnospiraceae、Anaeroplasma、Bacteroidales S24-7group、Turicibacter、Oscillospira、Prevotella、Aggregatibacter、Parabacteroides、Ruminococcus、Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Sutterella、Anaerotruncus、Mucispirillum、Chlamydia和Escherichia；或用于检测以下属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Bacteroides、Bifidobacterium、Enterococcus、Helicobacter、Lactobacillus、Parabacteroides、Turicibacter和Escherichia。
附图说明
图1为肠道irAE小鼠模型示意图。其中：(A)模型对照组(DSS单独)和处理组(DSS+ICB)小鼠的生存率；(B)对照组和ICB处理组小鼠血液中的细胞因子含量。
图2为肠道irAE小鼠模型的肠道菌群变化分析。其中：(A)正常组(Nor)、模型对照组(Ctrl)和ICB处理组(ICB)小鼠体内肠道菌群的组成(Genus水平)；(B)正常组(Nor)、模型对照组(Ctrl)和ICB处理组(ICB)小鼠体内肠道菌群含有主要细菌的相对丰富度(Genus水平)。
图3为全身irAE小鼠模型示意图。其中：(A)野生型小鼠(WT)与Foxp3基因敲除(MT)小鼠结肠的生存率曲线；(B)WT和MT小鼠血液中TNF-α、IL-6、IFN-γ等细胞因子的含量。
图4为全身irAE小鼠体内肠道菌群的组成及变化分析。其中：(A)野生型(WT)和基因敲除(MT)小鼠体内肠道菌群的聚类分析；(B)WT和MT小鼠体内肠道菌群含有主要细菌的相对丰富度(Genus水平)。
图5为不同肠道菌用于分类辨别野生型和基因敲除小鼠的能力分析。
图6为补充乳酸杆菌改善肠道副作用模型小鼠的生存率和肠道炎症研究结果。其中：(A)模型对照组(Ctrl)和乳酸杆菌(L.reuteri)处理组(LR)小鼠的生存率；(B)对照组和乳酸杆菌组小鼠血液中的TNF-α、IL-6、IFN-γ等细胞因子含量。
图7为补充短双歧杆菌改善全身副作用模型小鼠的生存率和全身炎症研究结果。其中：(A)对照组(MTC)和短双歧杆菌(B.breve)处理组(MTB)基因敲除小鼠的生存率；(B)MTC组和MTB组小鼠血液中的TNF-α、IL-6、IFN-γ等细胞因子含量。
图8为混合菌制剂对改善改善全身副作用模型小鼠生存率及全身炎症反应的作用研究结果。其中：(A)对照组(MTC)和混合菌制剂(B.breve+L.reuteri)处理组(MTBL)基因敲除小鼠的生存率；(B)MTC组和MTBL组小鼠血液中的TNF-α、IL-6、IFN-γ等细胞因子含量。
具体实施方式
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案或实施例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案或实施例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。
本发明通过构建两种不同小鼠疾病模型，模拟临床ICB或CAR-T等治疗相关副作用，筛选到影响irAE的关键肠道菌群。这些影响irAE的关键肠道菌群的筛选和鉴定对临床肿瘤免疫治疗副作用的判断以及开发针对这些关键肠道菌群的治疗策略具有重要的临床应用价值。
本文中，肿瘤免疫治疗指通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环、恢复或增强机体正常的抗肿瘤免疫反应、从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。肿瘤免疫疗法包括使用以CTLA-4抗体和PD1/PD-L1抗体为代表的免疫检查点抑制剂(ICB)等治疗性抗体、癌症疫苗、细胞免疫治疗(如CAR-T等)和以增强免疫反应或消除免疫抑制反应为目的的小分子化合物等进行的治疗。本发明特别涉及使用免疫检查点抑制剂或CAR-T进行的肿瘤免疫治疗。
本文中，ICB包括但不限于抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗CD47抗体、抗IL-2R抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体以及双特异性抗体等。示例性的抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体包括但不限于特瑞普利单抗、纳武单抗(nivolumab)、帕姆单抗(pembrolizumab)、信迪利单抗、替雷利珠单抗(Tislelizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐单抗(durvalumab)、pidilizumab、MEDI0680、BMS936559和SHR-1210等。示例性的抗CTAL-4抗体包括伊匹单抗(Ipilimumab)和曲美母单抗(Tremelimumab)等。ICB既包括已批准上市的药物，也包括正临床研发或进行临床前研究的ICB。
本文中，嵌合抗原受体基因修饰细胞疗法包括靶向本领域已知肿瘤细胞表面抗原的各种CAR-T细胞或CAR-NK细胞，如靶向间皮素、Her2、MUC1、ErbB、EGFR、CD19、CD40和Claudin18等的CAR-T细胞。CAR-T既包括已批准上市的CAR-T治疗，也包括正临床研发或进行临床前研究的CAR-T或CAR-NK等嵌合抗原受体基因修饰细胞疗法。
本文所述的肿瘤可以是本领域周知的可采用肿瘤免疫疗法进行治疗的各种癌症。具体的癌症例子包括但不限于食管鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、白血病、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、子宫颈癌、脑癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、和头颈部癌等。例如，在一些实施方案中，所述肿瘤特别包括本领域常规用抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体以及抗CTLA-4抗体进行治疗的那些癌症，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌和膀胱上皮癌等。
本文中，ICB治疗的相关不良事件或嵌合抗原受体基因修饰细胞(尤其是CAR-T细胞)治疗诱导的免疫相关不良反应(irAE)具有相同的含义，指进行ICB或嵌合抗原受体基因修饰细胞等免疫治疗后引起的大量细胞因子释放以及各类脏器的活化T细胞等免疫细胞的大量浸润造成脏器或全身过度免疫反应相关的副作用。ICB或嵌合抗原受体基因修饰细胞诱导的相关不良反应包括几乎所有的器官，包括胃肠道、皮肤、肝脏、肺、心血管、内分泌系统、肌肉骨骼及中枢神经系统，如皮肤的斑丘疹、白癜风、银屑病、莱尔综合征、药物相关多器官迟发超敏反应等，胃肠道的小肠结肠炎、胃炎、胰腺炎、乳糜泻等，内分泌器官的甲状腺功能亢进或减低、垂体炎、肾上腺功能不全、糖尿病等，肺部的免疫性肺炎、胸膜炎和肺肉瘤等，外周和中枢神经系统的外周神经病变、无菌性脑膜炎、格林巴利综合症、脑神经病变、脊髓炎、脑膜脑炎和肌无力等，肝脏的免疫性肝炎，肾脏的间质性肾炎和狼疮性肾小球肾炎等，血液系统的溶血性贫血、血小板减少症、粒细胞减少症和三系减少症等，肌肉关节系统的关节炎和肌肉病变等，心脏的心包炎和心肌炎等，眼睛的葡萄膜炎、结膜炎、视网膜炎、脉络膜炎、眼睑炎和眶周肌炎等。如前文所述，所有irAE中，消化系统毒性是最常见的，临床上可表现为严重腹泻、结肠炎、腹痛、消化道糜烂或溃疡等症状。在本发明的一些实施方案中，irAE尤其指使用抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体进行肿瘤免疫治疗而引起的irAE。
本文中，受试者、个体或患者可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。
本文涉及与ICB或CAR-T治疗诱导的irAE的诊断、预防和治疗。本文中，治疗指对患者进行的任何类型的干预或过程，或给与患者活性制剂，目的在于逆转、缓解、改善、减缓或预防症状、并发症(如irAE)或病症的发作、进展、严重性或复发，或与疾病相关的生化指标。
本文发现，与常规的提高机体免疫力显著不同的是，通过给予患者预防有效量或治疗有效量的本文所述的细菌，可抑制ICB(尤其是抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)或嵌合抗原受体基因修饰细胞(如CAR-T细胞)等治疗后引起的大量细胞因子释放以及各类脏器的活化T细胞等免疫细胞的大量浸润而导致的局部脏器及全身的过度免疫反应。更具体而言，本发明发现，采用本文所述的治疗或预防方案，如给予患者预防剂量或治疗有效量的本文所述细菌，肠道固有淋巴细胞(Innate Lymphoid cells，ILCs)，特别是第三类固有淋巴细胞ILC3的数量和功能均出现明显的下降，因此肠道局部和全身的过度炎症反应得以明显减少，从而实现了ICB或CAR-T等免疫治疗相关不良反应的预防或治疗。
因此，本发明提供一种细菌制品，该细菌制品所含有的细菌(本文也称为“活性菌”)包括来自Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属中的至少一属的至少一种细菌，或至少两个属的至少两种细菌，或者至少三个属的至少三种细菌，或全部四个属的细菌。本文中，除非另有说明，否则涉及细菌的各种、属名称均为本领域通用的名称，其涵盖的菌株范围为本领域周知的范围。例如，Bifidobacterium属细菌可包括两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、长双歧杆菌(B.longum)、乳双歧杆菌(B.lactis)和短双歧杆菌(B.breve)等。Lactobacillus属细菌可包括罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri)、嗜酸乳杆菌(Lactobicillusacidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobicillus bulgaricus)，德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobicillus deibrueckii subsp，Bulgaricus)、短乳杆菌(Lactobicillus brevis)、乳酸乳杆菌(Lactobicillus lactis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobicillus rhammosus)、植物乳杆菌(Lactobicillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobicillus paracasei)、干酪乳杆菌(Lactobicillus casei)、瑞士乳杆菌(Lactobicillus helveticus)等。适用于本发明的各种细菌还可以是本领域周知的各种亚种，包括在各保藏单位保藏的各种细菌，例如，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)可包括保藏号为ATCC 15698、ATCC15700和ATCC 15701的短双歧杆菌。应理解的是，本发明的细菌制品中可含有来自同一个属、同一个种的细菌，也可以含有同一个属、不同种的两种以上细菌。
在一些实施方案中，本文所述的细菌制品所含的细菌中包括益生菌。本文中，益生菌指定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内的益生菌包括但不限于Bifidobacterium属和Lactobacillus属的细菌。因此，在一些实施方案中，本发明的细菌制品至少含有来自Bifidobacterium属的细菌，或至少含有来自Lactobacillus属的细菌。在一些实施方案中，本发明的细菌制品至少含有来自Bifidobacterium属的细菌和来自Lactobacillus属的细菌。在一些实施方案中，本发明的细菌制品至少含有罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillusreuteri)，如保藏号为ATCC55730、ATCC23272、ATCC PTA-4964、ATCC PTA-4965、ATCC PTA-4659、ATCC PTA-5290、ATCC PTA-4659、ATCC 55148、ATCC 53608和ATCC PTA-6475的罗伊氏乳酸杆菌中的任意一种或多种。例如，在一些实施方案中，本发明的细菌制品中的益生菌为罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri)，或者为罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillusreuteri)与来自Bifidobacterium属的至少一种细菌如短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)的混合物；除所述罗伊氏乳酸杆菌和任选的来自Bifidobacterium属的细菌外，本发明的细菌制品中还可含有一种或多种来自Akkermansia属和/或Turicibacter属的细菌。在优选的实施方案中，本发明的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)为保藏号为ATCC15698、ATCC 15700或ATCC15701的短双歧杆菌。
在一些实施方案中，本发明的细菌制品中还可含有来自Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属中的任一属或任一多个属的任意一种或多种细菌。
对于本发明细菌制品中细菌的含量并无特殊限制。例如，通常，细菌制品中细菌的含量可在1×1010cfu活菌/克细菌制品到1×1012cfu活菌/克细菌制品。当含有两种或两种以上细菌时，对其含量配比并无特殊限制。例如，各种细菌的含量可相同，或者可根据患者检出的肠道菌含量进行调配。例如，当检出患者肠道中的Bifidobacterium属的细菌与正常人群相比的降低幅度高于Lactobacillus属的细菌与正常人群相比的降低幅度，则本发明的益生菌中Bifidobacterium属的细菌的含量可高于Lactobacillus属的细菌。
在一些实施方案中，本文所述的细菌制品还可含有益生元，如碳水化合物、大豆、豌豆、燕麦、芦笋、朝鲜蓟、洋葱、小麦、菊苣、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶或其任意组合。可以使用任意适合的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉及其混合物。在一些实施方案中，本文所述的细菌制品中还可以加入膳食纤维，包括可溶性的或不溶性的。膳食纤维的适合来源包括但不限于大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、低聚果糖和低聚半乳糖等。进一步地，本文所述的细菌制品中还可含有矿物质和微量营养素，包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和L-肉碱。矿物质通常以盐形式添加。
本发明的细菌制品可以是固体分散剂的形式，也可以是液体形式，混悬剂、胶囊、即饮型饮料和食品补充剂等。
本发明的细菌制品可被制成药物的形式，用于治疗或预防ICB(尤其是抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)或嵌合抗原受体基因修饰细胞(如CAR-T细胞)等免疫治疗诱导的irAE。因此，在一些实施方案中，本申请提供一种药物或药物组合物，其含有本文任一实施方案所述的细菌或细菌制品以及药学上可接受的载体或赋形剂。例如，在某些特别优选的实施方案中，本发明的药物组合物含有的活性菌至少包括本文所述的益生菌，优选为罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri)，如保藏号为ATCC 55730、ATCC23272、ATCC PTA-4964、ATCC PTA-4965、ATCC PTA-4659、ATCC PTA-5290、ATCC PTA-4659、ATCC55148、ATCC 53608和ATCC PTA-6475的罗伊氏乳酸杆菌的任意一种或多种，或者为Bifidobacterium属的至少一种细菌如短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，如保藏号为ATCC 15698、ATCC 15700和ATCC 15701的短双歧杆菌中的任意一种或多种，或者为罗伊氏乳酸杆菌与短双歧杆菌的混合物。除此之外，药物组合物中还可任选地含有一种或多种来自Akkermansia属和/或Turicibacter属的细菌，任选的来自Lactobaccillus属和Bifidobacterium属的一种或多种罗伊氏乳酸杆菌和短双歧杆菌以外的任意一种或多种其它菌(如乳双歧杆菌和/或鼠李糖乳杆菌)，以及任选的来自Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属中的任一属或任意多个属的任意一种或多种细菌。
本文中，药学上可接受的载体和赋形剂为本领域常规用于细菌药物的载体和赋形剂，其存在通常不损害到药物所含活性菌的活性。合适的药学上可接受的载体或赋形剂包括但不限于水、明胶、植物树胶、滑石粉、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、矫味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、湿润剂和填充剂等。可根据药物的剂型选择合适的载体或赋形剂。
本发明的药物通常是口服剂型，如片剂、干粉剂、溶液、悬浮剂或胶囊等。
药物组合物中，活性菌以治疗有效量或预防有效量存在。本文中，治疗有效量是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时保护患者免于疾病发作或促进疾病消退的任何量的药物，所述疾病消退通过疾病症状的严重性的降低，疾病无症状期的频率和持续时间的增加，或由疾病痛苦引起的损伤或失能的预防来证明。预防有效量是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需预防结果的量，例如，预防有效量指预防irAE的发生或减轻其发生的严重程度和/或进展速度所需的量。通常，由于在疾病之前或疾病的早期阶段在患者中使用预防剂量，因此预防有效量将小于治疗有效量。可根据患者的年龄、性别、所患疾病、疾病的严重程度等相关因素确定所述预防有效量和治疗有效量。
在一些实施方案中，本发明提供的药物中还可含有ICB或嵌合抗原受体基因修饰细胞(如CAR-T细胞)。例如，本发明的药物中，ICB与本文所述的活性菌可以单一的混合物的形式提供，也可以独立的制剂形式提供于同一药品中。
本发明还包括一种预防或治疗ICB或嵌合抗原受体基因修饰细胞治疗诱导的irAE的方法，该方法包括给予患有irAE或预期将患有irAE的患者预防或治疗有效量的本文所述的细菌中的一种或多种，或本文所述的细菌制品，或本文所述的药物组合物。通常，以口服方式给药。可在进行ICB治疗或嵌合抗原受体基因修饰细胞治疗之前、同时或之后给予所述细菌、细菌制品或药物组合物。
在一些实施方案中，在给予所述细菌、制剂制品或药物组合物前，本发明所述的治疗或预防方法还包括对患者的肠道菌进行检测的步骤。在一些实施方案中，肠道菌的检测包括检测以下属的肠道菌：Escherichia/Shigella、Lactobacillus、Bacteroides、unclassified、Allobaculu、Barnesiella、Parabacteroides、Romboutsia、Enterococcus、Alistipes、Helicobacter、Olsenella、Bifidobacterium、Akkermansia、Blautia、Klebsiella、Clostridium XlVa、Parasutterella、Clostridium XVIII、Turicibacter、Veillonella、Bilophila、Desulfovibrio、Clostridium sensu stricto、Clostridium IV、Flavonifractor、Eubacterium和Pseudoflavonifractor。在一些实施方案中，肠道菌的检测包括检测以下属的肠道菌：Akkermansia、Helicobacter、Mycoplasmataceae、Bacteroides、Dehalobacterium、Lactobacillus、Clostridium、Lachnospiraceae、Anaeroplasma、Bacteroidales S24-7group(拟杆菌S24-7群细菌)、Turicibacter、Oscillospira、Prevotella、Aggregatibacter、Parabacteroides、Ruminococcus、Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Sutterella、Anaerotruncus、Mucispirillum、Chlamydia和Escherichia。在一些实施方案中，肠道菌的检测包括以下属的肠道菌：Akkermansia、Bacteroides、Bifidobacterium、Enterococcus、Helicobacter、Lactobacillus、Parabacteroides、Turicibacter和Escherichia。
可通过对比患者体内上述菌与正常人群体内上述菌的丰度，判断患者是否已发生irAE或存在发生irAE的风险，从而适时给予本文所述的细菌、细菌制品或药物组合物。通常，若检测到Akkermansia属、Bacteroides属、Bifidobacterium属、Enterococcus属、Helicobacter属、Lactobacillus属、Parabacteroides属、Turicibacter属和Escherichia属的细菌与正常人群体内相应菌的丰度发生了变化，则可得出患者需要及时补充本文所述的细菌、细菌制品或药物组合物的结论。更具体而言，若检测到Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属的丰度相较于正常人群降低，Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属的丰度相较于正常人群升高，则可得出患者已经发生irAE或存在发生irAE的风险的结论。
可采用本领域周知的方法检测各属的细菌在患者体内的丰度。例如，可收集患者的新鲜粪便，对粪便中的细菌进行16s rRNA的测序分析，根据测序结果计算细菌相对丰富度。
在一些实施方案中，本文还提供一种检测试剂盒，其含有用于检测以下属的肠道菌的试剂：Escherichia/Shigella、Lactobacillus、Bacteroides、unclassified、Allobaculu、Barnesiella、Parabacteroides、Romboutsia、Enterococcus、Alistipes、Helicobacter、Olsenella、Bifidobacterium、Akkermansia、Blautia、Klebsiella、Clostridium XlVa、Parasutterella、Clostridium XVIII、Turicibacter、Veillonella、Bilophila、Desulfovibrio、Clostridium sensu stricto、Clostridium IV、Flavonifractor、Eubacterium和Pseudoflavonifractor。在一些实施方案中，本文还提供一种检测试剂盒，其含有用于检测以下属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Helicobacter、Mycoplasmataceae、Bacteroides、Dehalobacterium、Lactobacillus、Clostridium、Lachnospiraceae、Anaeroplasma、Bacteroidales S24-7group、Turicibacter、Oscillospira、Prevotella、Aggregatibacter、Parabacteroides、Ruminococcus、Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Sutterella、Anaerotruncus、Mucispirillum、Chlamydia和Escherichia。在一些实施方案中，本文还提供一种检测试剂盒，其含有用于检测以下属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Bacteroides、Bifidobacterium、Enterococcus、Helicobacter、Lactobacillus、Parabacteroides、Turicibacter和Escherichia。检测试剂包括但不限于采用基因检测方法所需的试剂，如能特异性检测上述属的细菌的各种引物和任选的进行PCR所需的试剂。所述引物通常能用来扩增出所述各菌的特征序列，从而能表征患者肠道内该菌存在与否以及存在的量。
进一步地，本发明提供本文所述的活性菌在制备预防或治疗ICB(尤其是抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)或嵌合抗原受体基因修饰细胞(如CAR-T细胞)治疗诱导的irAE用的细菌制品或药物中的应用。更具体而言，所述应用包括本文所述的来自Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属中的至少一属的至少一种细菌，或至少两个属的至少两种细菌，或者至少三个属的至少三种细菌，或全部四个属的细菌在制备预防或治疗ICB或嵌合抗原受体基因修饰细胞治疗诱导的irAE的细菌制品或药物中的应用。在一些实施方案中，所述应用还包括Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属中的至少一个属的至少一种细菌。
在一些实施方案中，本发明还提供预防或治疗ICB(尤其是抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)或嵌合抗原受体基因修饰细胞治疗诱导的irAE的本文所述的任意一种或多种细菌或其制品，尤其是来自Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属的任意一种细菌，尤其包括罗伊氏乳酸杆菌和短双歧杆菌，以及任选的乳双歧杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。
在一些实施方案中，本发明还包括检测上述肠道菌的试剂在制备irAE的诊断试剂盒中的应用。在优选的实施方案中，所述试剂至少包括检测患者肠道内的Akkermansia、Bacteroides、Bifidobacterium、Enterococcus、Helicobacter、Lactobacillus、Parabacteroides、Turicibacter和Escherichia属细菌的试剂。在一些实施方案中，所述试剂至少包括检测患者肠道内Escherichia/Shigella、Lactobacillus、Bacteroides、unclassified、Allobaculu、Barnesiella、Parabacteroides、Romboutsia、Enterococcus、Alistipes、Helicobacter、Olsenella、Bifidobacterium、Akkermansia、Blautia、Klebsiella、Clostridium XlVa、Parasutterella、Clostridium XVIII、Turicibacter、Veillonella、Bilophila、Desulfovibrio、Clostridium sensu stricto、Clostridium IV、Flavonifractor、Eubacterium和Pseudoflavonifractor属的细菌的试剂。在一些实施方案中，本文还提供一种检测试剂盒，其含有用于检测以下属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Helicobacter、Mycoplasmataceae、Bacteroides、Dehalobacterium、Lactobacillus、Clostridium、Lachnospiraceae、Anaeroplasma、Bacteroidales S24-7group、Turicibacter、Oscillospira、Prevotella、Aggregatibacter、Parabacteroides、Ruminococcus、Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Sutterella、Anaerotruncus、Mucispirillum、Chlamydia和Escherichia属的细菌的试剂。所述试剂可以是能特异性扩增出所述各菌的特征序列的引物。
下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容，而非限制本发明的保护范围。对于本文以及实施例中所用到的试剂，除非另有说明，否则均为从市场上直接购得的，其均依常规方法使用。对于本文以及实施例中所涉及的方法和条件，除非另有说明，否则均为常规的方法和条件。下列实施例中未注明具体条件的测试方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件或制造厂商所建议的条件进行。
实施例中使用到的小鼠模型、检测方法、小鼠处理方法和统计学方法说明如下：
(1)ICB治疗相关肠道irAE模型
构建ICB治疗葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的肠炎小鼠模型，模拟临床ICB治疗引发的肠道炎症免疫副作用。建模小鼠采用8-10周龄C57BL/6品系雌鼠，购自上海斯莱克动物有限公司。造模期间，将小鼠日常饮用水换成3％DSS(一种可诱导小鼠发生结肠炎症的药物)。同时在DSS诱导前隔天经腹腔注射ICB类药物(抗CTLA-4抗体100μg/只/次，抗PD-1抗体250μg/只/次)共两次。已有多个文献报道，ICB治疗引起的肠道炎症与炎性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)在临床表现及病理学上有很多类似点，如肠道溃疡、结肠炎症、大量CD4+T细胞浸润等。而DSS诱导的小鼠模型是经典模拟人类炎性肠病的模型。另外，ICB治疗可增加DSS处理后的肠道炎症，加重irAE。因此正常小鼠用DSS处理基础上加用CTLA-4和PD-1抗体可更好的模拟临床ICB治疗引起的严重消化道irAE。
(2)ICB治疗相关全身irAE模型
利用Foxp3基因敲除(Foxp3-/-)小鼠模拟ICB等免疫治疗引起的全身性免疫相关不良反应。实验小鼠选用B6.129(Cg)-Foxp3tm3(DTR/GFP)Ayr/J，购自美国Jackson实验室。研究已证实，临床ICB治疗(抗CTLA-4和PD-1/PD-L1抗体)发挥作用的关键机制之一是大量T淋巴细胞等免疫细胞的活化，浸润肿瘤以及其他脏器组织。。因此利用该小鼠由于Treg重要的转录因子Foxp3敲除后，调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)发生缺失，大量T细胞活化的特点，可用于模拟免疫检查点阻断剂CTLA-4抗体和PD-1抗体等免疫治疗引起的全身性免疫反应副作用。如Treg细胞长期缺乏可导致小鼠体重降低、慢性眼睑炎症、活跃度下降，多个脏器出现大量淋巴细胞和单核细胞的浸润、脾脏增大、肺部和结肠炎症以及血清IFN-γ和TNF-α显著增高等全身性的炎性病变。
(3)小鼠血清细胞因子的测定
在实验观察终点收集每只小鼠的血清用于检测各组细胞因子的含量。使用基于磁珠原理的Luminex多重细胞因子分析技术(Magnetic Luminex Assay Kit，R&D Systems，USA)进行定量分析收集的血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)，白介素-6(IL-6)和干扰素-γ(IFN-γ)等炎性细胞因子的水平。
(4)小鼠肠道菌群的检测
在实验观察终点收集每只小鼠的粪便。然后，对小鼠的肠道菌群进行16S rDNA测序，全程按照操作及试剂盒说明进行操作，并进一步分析肠道菌群的变化。
(5)小鼠粪便16S rRNA细菌测定
小鼠16S rRNA测序送至上海生工生物工程公司测定。全程按照操作及试剂盒说明进行操作。
从粪便样本中获取DNA后，将扩增目标区段定为细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区。使用KAPAHiFi热启动预混合物(2x)(TaKaRa Bio Inc.，Japan)扩增16S rRNA V3-V4扩增子。反应设定如下：微生物DNA(10ng/μl)2μl；扩增子PCR正向特异性引物(10μM)1μl(CCTACGGGNGGCWGCAG，SEQ ID NO:1)；扩增子PCR反向特异性引物(10μM)1μl(GACTACHVGGGTATCTAATCC，SEQ ID NO:2)；2×KAPA HiFi热启动预混合15μl(总共30μl)。完成上样后PCR仪(Applied Biosystems 9700，USA)中使用以下程序进行PCR：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃30秒，20个循环；72℃5min。PCR结束后，使用在溴化乙锭(EB)染色的TBE缓冲液(Tris，硼酸，EDTA)中的1％(W/V)琼脂糖凝胶中电泳检查PCR产物，并在UV光下显现。使用AMPure XP磁珠纯化去除扩增产物中的游离引物和引物二聚体。使用通用的Illumina适配器和指数将样品递送至Sangon BioTech(上海)进行文库构建。在测序之前，使用Qubit2.0Green双链DNA测定法测定每种PCR产物的DNA浓度，并使用生物分析仪(Agilent 2100，USA)对其进行质量控制。根据扩增子浓度，将其以等摩尔比汇集。根据制造商的说明，使用Illumina MiSeq系统(Illumina MiSeq，USA)进行测序。
测序后，数据收集如下：两个短的Illumina读数由PEAR(v0.9.6)软件根据重叠组装，并且fastq文件被处理以生成单独的fasta和qual文件，用于后续方法。移除含有模糊碱基和长度大于480碱基对(bp)的序列。去除短于200bp的序列。将所有相同的序列合并为一个。根据定制的参考数据库对序列进行比对。检查索引和适配器的完整性，并删除所有索引和适配器序列。使用Pre.cluster工具消除噪声。使用Chimera UCHIME检测嵌合体。所有的软件都在mothur包中。再次将每个样品的有效序列提交给RDP分类器以鉴定古细菌和细菌序列。使用mothur计算物种丰富度和多样性统计数据，包括覆盖率、chao1、ace、simpson和shannonever。
(6)益生菌株处理小鼠
利用罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri，ATCC PTA-6475)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve，ATCC 15700)或混合双菌的方法，自造模日起在给予免疫检查点阻断剂的同时通过灌胃方式给予每日每只小鼠1×108-1×109cfu活菌(300μl)。每天观察小鼠的不良反应的情况、称重并计算小鼠的生存曲线。试验结束时，收集每只小鼠的各种生物样本，用于细胞因子和肠道菌群的检测。
(7)统计学方法
本发明数据统计学结果均以均数±标准误(means±standard Error of Mean，SEM)的形式呈现。使用SPSS 13.0统计软件以及GraphPad Prism 7.0进行统计学分析，两组比较采用非配对Student’s T检验，多组比较采用单因素方差分析。在分析组间组分差异时，通过STAMP使用Welch’s t-test检验和单因素方差分析及Tukey-Kramer事后检验。使用Eta平方(η2)来估计效应大小。差异P<0.05认为有统计学意义。
实施例1：在DSS模型基础上加用ICB药物对小鼠体重、生存率和关键炎症因子的影响
为了模拟临床上ICB引起的肠道副作用，本实施例用ICB和DSS共同处理小鼠建立肠道irAE模型。根据小鼠生存曲线(图1，A)可知，DSS诱导的基础上加用ICB后小鼠生存率比单用DSS明显降低(P<0.01)。同时，ICB处理后小鼠血清内关键炎性细胞因子例如TNF-α、IL-2和IFN-γ等的含量明显上升(图1，B)。以上结果表明，ICB治疗DSS小鼠模型可成功模拟临床上ICB治疗引起的副作用。
实施例2：ICB药物对小鼠肠道菌群的影响
为了观察ICB引起的肠道副作用与肠道菌群的相关性，本实施例分别收集了三组，即正常无处理组小鼠(Nor)、单用DSS组(Ctrl)、以及DSS联合ICB诱导肠炎组(ICB)小鼠的新鲜粪便样本，并用16S rDNA测序检测了各组小鼠体内的肠道菌群。结果显示，Ctrl组或者ICB组小鼠比较Nor组小鼠，体内肠道菌的组成都出现显著差异(图2，A和B)。其中，比较DSS单用和无处理组，ICB治疗组中Lactobacillus、Alistipes、Olsenella、Turicibacter以及Clostridium sensu stricto菌属出现进行性降低，而Escherichia/Shigella、Bacteroides、Veillonella、Flavonifractor以及Pseudoflavonifractor菌属则出现了含量增加。而Romboutsia菌属的含量显著降低只出现在ICB组，Klebsiella菌属在ICB组含量明显增加而在Ctrl组明显降低(图2，B)。这不但说明了ICB治疗小鼠肠道出现了肠道菌群紊乱，也提示这些变化较大的关键肠道菌群属含量异常与ICB诱导的肠道irAE发生有关。
实施例3：转基因小鼠与野生型小鼠的生存期和关键血清炎症因子含量的比较
由图3(A)可知，Foxp3基因敲除小鼠(MT)比野生型小鼠(WT)生存时间明显缩短。同时，Foxp3基因敲除小鼠血清内关键炎性细胞因子例如TNF-α、IL-2和IFN-γ等的含量明显上升(图3，B)，提示全身炎症反应明显。该转基因小鼠-品系可模拟临床上ICB治疗引起的全身性免疫副作用。
实施例4：分析在可模拟irAE的转基因小鼠体内肠道菌群的异常
本实施例收集了WT小鼠和MT小鼠的新鲜粪便样本，并用16S rDNA测序检测了各组小鼠体内的肠道菌群。与ICB诱导的DSS肠炎小鼠模型类似的是，与野生型比较，Foxp3基因敲除小鼠体内肠道菌的组成分布也出现显著差异(图4A)。图4B显示了相对丰度(属水平)最高且变化差异的11个菌属，如Akkermansia、Anaeroplasma、Oscillospira菌属含量减低，而Bacteroides、Anaerotruncus、Escherichia含量增加。有意思的是，这些变化结果与ICB治疗诱导的模型中发生的肠道菌群紊乱基本一致。因此，这两种模型研究结果表明肠道局部irAE以及全身性irAE的发生确实与肠道菌群紊乱有关，特别是与关键肠道菌群的变化显著相关。
实施例5：转基因小鼠模型的肠道菌群
本实施例选择了能够代表WT小鼠和MT小鼠模型肠道菌群最特异性的20种细菌(图5)进行进一步的分析。值得注意的是，常见益生菌，乳酸杆菌和双歧杆菌都在其中(图5)。这些菌属的改变都可能影响ICB副作用的发生。根据Random Forest分析，不同肠道菌(属水平)用于辨别野生型(WT)和基因敲除(MT)小鼠的能力，这些肠道菌可以作为ICB引起副作用的生物标记物或作为可补充的微生态药物作为临床治疗应用。
表1总结了两种小鼠模型中发现丰度差异表达的肠道菌属中。在两种模型中都出现显著差异的肠道菌属，如Akkermansia、Bacteroides、Bifidobacterium、Enterococcus、Helicobacter、Lactobacillus、Parabacteroides、Turicibacter、Escherichia，作为影响ICB类药物治疗所引起irAE副反应的关键肠道菌属(第三列，且在两种模型中丰度变化方向一致)。此外，在两种小鼠模型中反复出现的Clostridium菌属(表1黑体)，以及仅在全身性副作用模型(MT小鼠)中出现丰度异常的Prevotella菌属(表1黑体)都可能对ICB类药物使用后发生irAE有关。
表1：消化系统副作用模型和全身性副作用模型中丰度差异表达的肠道菌属以及副作用关键肠道菌属
消化系统副作用模型 全身性副作用模型 副作用关键肠道菌属*
Escherichia/Shigella Akkermansia Akkermansia↓
Lactobacillus Helicobacter Bacteroides↑
Bacteroides Mycoplasmataceae Bifidobacterium↓
unclassified Bacteroides Enterococcus↑
Allobaculum Dehalobacterium Helicobacter↑
Barnesiella Lactobacillus Lactobacillus↓
Parabacteroides Clostridium Parabacteroides↑
Romboutsia Lachnospiraceae Turicibacter↓
Enterococcus Anaeroplasma Escherichia↑
Alistipes Bacteroidales S24-7 group
Helicobacter Turicibacter
Olsenella Oscillospira
Bifidobacterium Prevotella
Akkermansia Aggregatibacter
Blautia Parabacteroides
Klebsiella Ruminococcus
Clostridium XlVa Bifidobacterium
Parasutterella Enterococcus
Clostridium XVIII Streptococcus
Turicibacter Sutterella
Veillonella Anaerotruncus
Bilophila Mucispirillum
Desulfovibrio Chlamydia
Clostridium sensu stricto Escherichia
Clostridium IV
Flavonifractor
Eubacterium
Pseudoflavonifractor
*：↑表示细菌的丰度在ICB治疗后发生升高；↓表示细菌的丰度在ICB治疗后发生降低。
实施例6：补充乳酸杆菌改善ICB副作用模型小鼠的生存率及肠道炎症
为了验证乳酸杆菌对ICB副作用的影响，本实施例用罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri，LR)处理药物诱导性模型小鼠。研究结果显示，罗伊氏乳酸杆菌显著增加了模型小鼠的生存率(图6，A)。另外，罗伊氏乳酸杆菌也显著降低小鼠体内各种炎性因子的水平(图6，B)，同时改善小鼠便血、体重减轻等不良反应(表2)。这些结果表明：补充罗伊氏乳酸杆菌能显著缓解ICB引起的消化道副作用。
表2
ICB模型 未处理组 处理组
便血 ++ +
体重减轻 +++ ++
活动度减少 ++ ++
表中，+表示引起了相应的副作用，+越多表示副作用越严重。
实施例7：补充双歧杆菌改善MT小鼠的生存率和全身炎症
为了验证双歧杆菌对ICB副作用的影响。本实施例用短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)处理Foxp3缺失转基因小鼠模型。研究结果显示，短双歧杆菌也显著增加了模型小鼠的生存率(图7，A)，降低小鼠体内各种炎性因子的水平(图7，B)，同时改善小鼠眼睑炎症、便血、体重减轻等全身性不良反应(表3)。因此，补充短双歧杆菌也能缓解ICB引起的肠道副作用。
表3
MT小鼠模型 未处理组 处理组
眼睑炎症 ++/+++ ++
便血 ++ +
体重减轻 +++ ++
脾脏增大 +++ ++/+++
活动度减少 ++ ++
表中，+表示引起了相应的副作用，+越多表示副作用越严重。
实施例8：补充混合菌制剂对改善MT小鼠生存率及全身炎症反应的作用
为了验证混合菌制剂对ICB副作用的影响。本实施例用短双歧杆菌(B.breve)加罗伊氏乳酸杆菌(L.reuteri)处理Foxp3缺失转基因小鼠模型。从对照组(MTC)及处理组(MTBL)的研究结果显示，混合菌显著增加了模型小鼠(MTBL)的生存率(图8，A)。同时降低小鼠体内各种炎性因子的水平(图8，B)，改善全身副反应的效果更优于单用短双歧杆菌(表4)。因此，补充混合菌能更好地缓解包括免疫性肠炎在内的各类ICB不良反应。
表4
MT小鼠模型 未处理组 联合处理组
眼睑炎症 ++/+++ +/++
便血 ++ +
体重减轻 +++ ++
脾脏增大 +++ ++/+++
活动度减少 ++ +/++
表中，+表示引起了相应的副作用，+越多表示副作用越严重。
以上虽然以具体实施例的方式阐述了本发明，但应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明做出各种合适的修改和变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
序列表
<110> 上海心脉途医疗科技有限公司
<120> 与irAE相关的肠道菌群及irAE的治疗和预防方法
<130> 192530
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctacgggng gcwgcag 17
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactachvgg gtatctaatc c 21

Claims (10)

1.来自Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属中的至少一个属的至少一种细菌，或至少两个属的至少两种细菌，或者至少三个属的至少三种细菌，或全部四个属的细菌，以及任选的来自Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属中的至少一个属的至少一种细菌在制备预防或治疗使用免疫检查点抑制剂或嵌合抗原受体基因修饰细胞进行的肿瘤免疫治疗引起的相关不良反应的细菌制品或药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为Bifidobacterium属的细菌和/或Lactobacillus属的细菌在制备预防或治疗所述相关不良反应的细菌制品或药物中的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Bifidobacterium属的细菌包括两歧双歧杆菌(B.bifidum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、长双歧杆菌(B.longum)、乳双歧杆菌(B.lactis)和短双歧杆菌(B.breve)；所述Lactobacillus属的细菌包括罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri)、嗜酸乳杆菌(Lactobicillusacidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobicillus bulgaricus)、德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobicillus deibrueckii subsp，Bulgaricus)、短乳杆菌(Lactobicillus brevis)、乳酸乳杆菌(Lactobicillus lactis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobicillus rhammosus)、植物乳杆菌(Lactobicillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobicillus paracasei)、干酪乳杆菌(Lactobicillus casei)和瑞士乳杆菌(Lactobicillus helveticus)。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Lactobacillus属的细菌为罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri)，所述Bifidobacterium属的细菌为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)。
5.一种细菌制品或药物组合物，含有来自Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属中的至少一个属的至少一种细菌，或至少两个属的至少两种细菌，或者至少三个属的至少三种细菌，或全部四个属的细菌，以及任选的来自Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属中的至少一个属的至少一种细菌，其中，所述细菌制品或药物组合物中至少含有来自Lactobacillus属的罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillus reuteri)。
6.一种细菌制品或药物组合物，含有来自Akkermansia属、Bifidobacterium属、Lactobacillus属和Turicibacter属中的至少一个属的至少一种细菌，或至少两个属的至少两种细菌，或者至少三个属的至少三种细菌，或全部四个属的细菌，以及任选的来自Bacteroides属、Enterococcus属、Helicobacter属、Parabacteroides属以及Escherichia属中的至少一个属的至少一种细菌，其中，所述细菌制品或药物组合物不同时含有乳双歧杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌NH001。
7.如权利要求5或6所述的细菌制品或药物组合物，其特征在于，
所述细菌制品或药物组合物含有Bifidobacterium属的细菌和Lactobacillus属的细菌，其中，所述Lactobacillus属的细菌至少包括罗伊氏乳酸杆菌(Lactobaccillusreuteri)；或
所述细菌制品或药物组合物含有Bifidobacterium属的细菌和Lactobacillus属的细菌，但不同时含有乳双歧杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌NH001。
8.如权利要求5-7中任一项所述的细菌制品或药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有用于肿瘤免疫疗法的免疫检查点抑制剂和/或嵌合抗原受体基因修饰细胞。
9.一种检测试剂盒，其含有：
用于检测以下属的肠道菌的试剂：Escherichia/Shigella、Lactobacillus、Bacteroides、unclassified、Allobaculu、Barnesiella、Parabacteroides、Romboutsia、Enterococcus、Alistipes、Helicobacter、Olsenella、Bifidobacterium、Akkermansia、Blautia、Klebsiella、Clostridium XlVa、Parasutterella、Clostridium XVIII、Turicibacter、Veillonella、Bilophila、Desulfovibrio、Clostridium sensu stricto、Clostridium IV、Flavonifractor、Eubacterium和Pseudoflavonifractor；或
用于检测以下菌属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Helicobacter、Mycoplasmataceae、Bacteroides、Dehalobacterium、Lactobacillus、Clostridium、Lachnospiraceae、Anaeroplasma、Bacteroidales S24-7 group、Turicibacter、Oscillospira、Prevotella、Aggregatibacter、Parabacteroides、Ruminococcus、Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Sutterella、Anaerotruncus、Mucispirillum、Chlamydia和Escherichia；或
用于检测以下菌属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Bacteroides、Bifidobacterium、Enterococcus、Helicobacter、Lactobacillus、Parabacteroides、Turicibacter和Escherichia。
10.选自以下的试剂在制备诊断免疫检查点抑制剂或嵌合抗原受体基因修饰细胞治疗诱导的副作用的诊断试剂盒中的应用：
用于检测以下属的肠道菌的试剂：Escherichia/Shigella、Lactobacillus、Bacteroides、unclassified、Allobaculu、Barnesiella、Parabacteroides、Romboutsia、Enterococcus、Alistipes、Helicobacter、Olsenella、Bifidobacterium、Akkermansia、Blautia、Klebsiella、Clostridium XlVa、Parasutterella、Clostridium XVIII、Turicibacter、Veillonella、Bilophila、Desulfovibrio、Clostridium sensu stricto、Clostridium IV、Flavonifractor、Eubacterium和Pseudoflavonifractor；或
用于检测以下属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Helicobacter、Mycoplasmataceae、Bacteroides、Dehalobacterium、Lactobacillus、Clostridium、Lachnospiraceae、Anaeroplasma、Bacteroidales S24-7 group、Turicibacter、Oscillospira、Prevotella、Aggregatibacter、Parabacteroides、Ruminococcus、Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Sutterella、Anaerotruncus、Mucispirillum、Chlamydia和Escherichia；或
用于检测以下属的肠道菌的试剂：Akkermansia、Bacteroides、Bifidobacterium、Enterococcus、Helicobacter、Lactobacillus、Parabacteroides、Turicibacter和Escherichia。
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