CN114806949B - 乳酸乳球菌s133及其在改善肠道健康和提升免疫中的应用 - Google Patents

乳酸乳球菌s133及其在改善肠道健康和提升免疫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，提出了乳酸乳球菌S133及其在改善肠道健康和提升免疫中的应用，所述乳酸乳球菌S133保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N.23689。通过上述技术方案，解决了现有技术中的乳酸乳球菌无法改善肠道健康、提高免疫力的问题。

Description

乳酸乳球菌S133及其在改善肠道健康和提升免疫中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体的，涉及乳酸乳球菌S133及其在改善肠道健康和提升免疫中的应用。
背景技术
肠道菌群为人体提供营养，调节代谢、免疫调节，保护肠道健康，而肠道菌群紊乱、菌群多样性降低是导致便秘和腹泻发生的主要因素。
目前，市面上公认的可以改善肠道健康的菌株、调节免疫的菌株有动物双歧杆菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等，而对于乳酸乳球菌的应用及研究主要集中在其产酸特性，如发明专利申请201610652096.9公开了一种乳酸乳球菌WH101，其具有较好的酸耐受性，在食品、发酵等领域具有巨大的应用价值；发明专利申请201710049506.5公开了一种乳酸乳球菌Lla-lab2014h30，对马奶具有更好的适应性，可以更有效的发酵马奶；产酸速率较快，有利于马奶的乳酸发酵；菌株发酵速度较快，为其他发酵菌株提供良好的酸性环境，从而提高整体的发酵速率；发明专利申请201910088938.6公开了一株乳酸乳球菌ZF625，用于液态发酵法酿制食醋能够显著提高食醋中的乳酸含量，改善食醋风味，降低食醋酸味刺激性，提升醇厚感。
因此，急需开发一种具有改善肠道健康、提升免疫的乳酸乳球菌，以填补乳酸乳球菌在改善肠道健康和提升免疫方面的空白。
发明内容
本发明提出乳酸乳球菌S133及其在改善肠道健康和提升免疫中的应用，解决了现有技术中的乳酸乳球菌无法改善肠道健康、提高免疫力的问题。
本发明的技术方案如下：
一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)S133，所述乳酸乳球菌S133保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23689。
本发明还提出乳酸乳球菌制剂，所述乳酸乳球菌制剂所述的乳酸乳球菌S133，所述乳酸乳球菌制剂为固态或液态菌制剂。
作为进一步的技术特征，所述乳酸乳球菌制剂包括乳酸乳球菌S133活菌、乳酸乳球菌S133灭活菌、乳酸乳球菌S133代谢产物中的任一种。
本发明还提出了所述的乳酸乳球菌S133或所述的乳酸乳球菌制剂在制备改善肠道健康的组合物中的应用，所述组合物包括食品、药品或保健品。
本发明还提出了所述的乳酸乳球菌S133或所述的乳酸乳球菌制剂在制备提升免疫的组合物中的应用，所述组合物包括食品、药品或保健品。
本发明还提出了所述的乳酸乳球菌S133或所述的乳酸乳球菌制剂在制备修复肠道黏膜屏障损伤的组合物中的应用，所述组合物包括食品、药品或保健品。
本发明还提出了所述的乳酸乳球菌S133或所述的乳酸乳球菌制剂在制备缓解肠上皮细胞水通道蛋白表达异常引起的便秘的组合物中的应用，所述组合物包括食品、药品或保健品。
本发明还提出了所述的乳酸乳球菌S133或所述的乳酸乳球菌制剂在制备防治神经递质表达异常及产肠毒大肠杆菌感染引起的腹泻的组合物中的应用，所述组合物包括食品、药品或保健品。
本发明还提出了所述的乳酸乳球菌S133或所述的乳酸乳球菌制剂在制备提升肠道短链脂肪酸含量的组合物中的应用，所述组合物包括食品、药品或保健品。
本发明还提出了所述的乳酸乳球菌S133或所述的乳酸乳球菌制剂在制备促进巨噬细胞增殖和吞噬的组合物中的应用，所述组合物包括食品、药品或保健品。
作为进一步的技术方案，所述组合物的剂型包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、溶液剂中的一种。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明的乳酸乳球菌S133在促进肠上皮细胞增殖、提高肠道吸水能力、修复肠道黏膜屏障损伤、调节神经递质、提升肠道短链脂肪酸含量等方面具有良好的作用，可用于缓解肠上皮细胞水通道蛋白表达异常引起的便秘产品中，也可用于防治神经递质表达异常及产肠毒大肠杆菌感染引起的腹泻产品中。
2、本发明的乳酸乳球菌S133可以激活吞噬细胞，促进吞噬细胞的增殖和吞噬，并且激活吞噬细胞后分泌的IL-6、TNF-α、IL-10均显著提高，进而提高机体免疫，有效调节免疫细胞应对炎症的反应，提升免疫力。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明各实验菌株对肠上皮细胞增殖效果；
图2为本发明各实验菌株对肠上皮细胞水通道蛋白AQP-3mRNA表达影响；
图3为本发明各实验菌株对肠上皮细胞黏蛋白MUC2表达影响；
图4为本发明各实验菌株对肠上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA表达影响；
图5为本发明各实验菌株对对肠上皮细胞五羟色胺转运体SERT mRNA表达影响；
图6为本发明各实验菌株对乙酸含量的影响；
图7为本发明各实验菌株对丙酸含量的影响；
图8为本发明S133活菌对巨噬细胞的增殖效果；
图9为本发明S133活菌对巨噬细胞的吞噬效果；
图10为本发明S133灭活菌对巨噬细胞的吞噬效果；
图11为本发明S133活菌激活巨噬细胞后分泌的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10量
图12为本发明S133灭活菌激活巨噬细胞后分泌的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10量；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1乳酸乳球菌S133
本发明的乳酸乳球菌S133已于2021年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)；保藏编号为CGMCC No.23689。
实验例1
1、肠上皮细胞增殖实验
1.1、实验菌株
(1)不同浓度梯度的乳酸乳球菌S133活菌菌体(按照浓度由高到低依次标记为S133L1、S133L2、S133L3)
(2)不同浓度梯度的乳酸乳球菌S133灭活菌菌体(按照浓度由高到低依次标记为S133D1、S133D2、S133D3)
(3)乳酸乳球菌S133代谢产物(标记为S133S)；
1.2、实验方法
(1)粪便悬液的制备：选择健康成人粪便，使用无氧生理盐水按照1：10稀释成粪便悬液，每个发酵小瓶接入500μL粪便悬液：
(2)制备肠道菌群体外发酵上清液样品：
设置如下组：
干预组(S133)：分别取100μL S133L1、S133L2、S133L3、S133D1、S133D2、S133D3、S133S接入发酵小瓶，在37℃培养箱培养24h；
治疗组(E+S133)：将100μL产肠毒素大肠埃希氏(ETEC)菌液接入发酵小瓶使终浓度为107菌体/mL；在37℃培养箱培养12h，然后分别取100μLS133L1、S133L2、S133L3、S133D1、S133D2、S133D3、S133S接入发酵小瓶中，在37℃培养箱共同培养12h；
预防组(S133+E)：分别取100μLS133L1、S133L2、S133L3、S133D1、S133D2、S133D3、S133S接入发酵小瓶，在37℃培养箱培养12h，之后将100μL ETEC菌液接入发酵小瓶使终浓度107菌体/mL，在37℃培养箱共同培养12h；
ETEC组：将100μL ETEC菌液接入发酵小瓶使终浓度为107菌体/mL，于37℃培养箱培养24h；
空白对照组：在发酵小瓶中加入100μL无氧生理盐水，于37℃培养箱培养24h。
各实验菌株在发酵小瓶的终浓度分别为：高浓度(S133L1、S133D1)：109CFU/mL；中浓度(S133L2、S133D2)：108CFU/mL；低浓度(S133L3、S133D3)：107CFU/mL；
上述各组培养完成后取发酵液以12000r/min离心2min，将上清液用0.22μm滤膜过滤除菌，得到各组肠道菌群体外发酵上清液样品。
(3)肠道菌群体外发酵上清液样品与HT29细胞共孵育：
收集第3代培养2d后的HT-29细胞，按密度105个细胞/mL接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。待细胞贴壁后，弃去上清液，每孔加入100μL MyCoy’s5A培养基，再加入10μL过滤除菌的肠道菌群体外发酵上清液样品，每组5个重复，在37℃、5％CO2条件下孵育12h。
(4)HT-29细胞增殖率测定
采用CCK-8试剂盒测定HT-29细胞增殖率：毎孔内加入10μL的CCK-8溶液，细胞培养箱内孵育1h，在450nm波长下测定OD值，根据如下公式计算细胞增殖指数：
细胞增殖指数＝(As-Ac)/Ac；
式中，As表示实验组OD值，Ac表示空白对照组OD值。
1.3、实验结果
各实验菌株对肠上皮细胞增殖效果如图1所示，具体分析如下：
(1)S133代谢产物均未表现出细胞增殖效果；
(2)干预组中，S133活菌菌体及灭活菌菌体都表现出一定的细胞增殖效果，S133活菌菌体细胞增殖能力随浓度下降而上升，灭活菌菌体随浓度降低呈先上升后下降的趋势；
(3)治疗组中，S133活菌菌体及灭活菌菌体都表现出一定的细胞增殖效果，S133活菌菌体细胞增殖能力随浓度下降而降低；灭活菌菌体则随浓度降低呈先上升后下降的趋势，
(4)预防组中，S133低浓度菌体和高浓度灭活菌菌体表现出一定的细胞增殖能力；
综上，S133活菌菌体和灭活菌菌体均能促进肠上皮细胞增殖，能够修复ETEC造成的肠上皮细胞损伤，同时，还能预防ETEC造成的肠上皮细胞损伤。
实验例2肠道吸水性实验
2.1、实验菌株
同实验例1
2.2、实验方法
(1)粪便悬液的制备：同实验例1；
(2)制备肠道菌群体外发酵上清液样品：同实验例1；
(3)肠道菌群体外发酵上清液样品与HT29细胞共孵育：同实验例1；
(4)RNA水平验证
①RNA提取：采用RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(离心柱型)DP451，按照试剂盒说明书的方法提取各组HT-29细胞总RNA后，得到模板RNA；
②反转录：采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)目录号：KR116
按照FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书的操作步骤合成第一链cDNA，将得到的cDNA可用于后续实验；
(5)荧光定量qPCR检测AQP-3mRNA表达
引物设计：管家基因采用18SrRNA和GAPDH，引物序列如下表：
表1荧光定量qPCR检测AQP-3mRNA表达引物序列
Primer名称 序列(5'to 3')
AQP3-F AGACAGCCCCTTCAGGATTT
AQP3-R TCCCTTGCCCTGAATATCTG
18SrRNA-F TGTGATGCCCTTAGATGTCC
18SrRNA-R GATAGTCAAGTTCGACCGTC
GAPDH-F CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG
GAPDH-R CATGGTGGTGAAGACGCCAG
程序设定：95℃15min；40个循环：95℃10s，60℃30s，72℃30s；融解曲线：65℃-95℃，每步0.5℃保持5s。
2.3实验结果
各实验菌株对肠上皮细胞水通道蛋白AQP-3mRNA表达影响如图2所示，具体分析如下：
(1)干预组中，S133活菌菌体、灭活菌菌体和代谢产物均降低了细胞AQP-3mRNA表达能力；
(2)治疗组中，低浓度S133活菌菌体显著提高了肠上皮细胞AQP-3mRNA表达能力，高浓度S133灭活菌菌体也相对提高了肠上皮细胞AQP-3mRNA表达能力；说明低浓度S133活菌菌体具有较好的提高肠道吸水能力，治疗ETEC造成的腹泻症状的能力；
(3)预防组中，S133活菌菌体、灭活菌菌体和代谢产物均降低了细胞AQP-3mRNA表达能力；
综上，低浓度S133活菌菌体具有较好的提高肠道吸水能力，从而能够治疗ETEC造成的腹泻症状。
实验例3肠道黏膜屏障修复实验
3.1、实验菌株
同实验例1
3.2、实验方法
(1)粪便悬液的制备：同实验例1；
(2)制备肠道菌群体外发酵上清液样品：同实验例1；
(3)肠道菌群体外发酵上清液样品与HT29细胞共孵育：
收集第3代培养2d后的HT-29细胞，按密度2×105个细胞/mL接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。待细胞贴壁后，弃去上清液，每孔加入100μLMyCoy’s 5A培养基，再加入10μL过滤除菌的肠道菌群体外发酵上清液样品，每组5个重复，在37℃、5％CO2条件下孵育12h。
(4)RNA水平验证
①RNA提取：采用RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(离心柱型)DP451，按照试剂盒说明书的方法提取各组HT-29细胞总RNA后，得到模板RNA；
②反转录：采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)目录号：KR116
按照FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书的操作步骤合成第一链cDNA，将得到的cDNA可用于后续实验
③荧光定量PCR检测黏蛋白MUC2、MUC5AC基因表达
引物设计：管家基因采用18SrRNA和GAPDH，引物序列见下表：
表2光定量PCR检测黏蛋白MUC2、MUC5AC基因表达引物序列
Figure BDA0003630083370000061
Figure BDA0003630083370000071
程序设定：95℃15min；40个循环：95℃10s，60℃30s，72℃30s；融解曲线：65℃-95℃，每步0.5℃保持5s。
3.3、实验结果
各实验菌株对肠上皮细胞黏蛋白MUC2、MUC5AC mRNA表达影响如图3、图4所示，具体分析如下：
(1)治疗组中，S133仅低浓度活菌菌体同时促进了MUC2与MUC5AC基因表达，能够修复ETEC造成的肠道黏膜屏障损伤；
(2)预防组中，S133仅高浓度灭活菌菌体同时对细胞黏蛋白MUC2和MUC5AC mRNA表达有促进作用，能够预防ETEC造成的肠道黏膜屏障受损；
综上，低浓度S133活菌菌体具有修复ETEC造成的肠道黏膜屏障损伤的能力，高浓度S133灭活菌菌体具有预防ETEC造成的肠道黏膜屏障受损的能力，而肠道黏膜屏障具有保护肠道健康的能力，在便秘及腹泻中均具有重要作用。
实验例4神经递质调节实验
4.1、实验菌株
同实验例1
4.2、实验方法
(1)粪便悬液的制备：同实验例1；
(2)制备肠道菌群体外发酵上清液样品：同实验例1；
(3)肠道菌群体外发酵上清液样品与HT29细胞共孵育：同实验例1；
(4)荧光定量PCR检测五羟色胺转运体基因sert表达
引物设计：管家基因采用18SrRNA和GAPDH，引物序列见下表：
表3荧光定量PCR检测五羟色胺转运体基因sert表达
Figure BDA0003630083370000072
Figure BDA0003630083370000081
程序设定：95℃15min；40个循环：95℃10s，60℃30s,72℃30s；融解曲线：65℃-95℃，每步0.5℃保持5s。
4.3、实验结果
各实验菌株对对肠上皮细胞五羟色胺转运体SERT mRNA表达影响如图5所示，具体分析如下
(1)干预组中，除中浓度S133灭活菌菌体外，S133活菌菌体、灭活菌菌体以及代谢产物均降低了细胞SERT mRNA表达水平，说明S133具有抑制肠道蠕动，从而治疗腹泻的能力；
(2)治疗组中，中浓度S133活菌菌体以及高、中、低三种浓度的S133灭活菌菌体能够降低SERT基因表达水平，说明S133具有治疗ETEC引起的腹泻的能力；
综上，S133具有抑制肠道蠕动，治疗ETEC等引起的腹泻的能力。
实验例1-4中各实验菌株对便秘和腹泻的改善情况汇总如下表4、表5：
表4 S133对便秘的改善情况
Figure BDA0003630083370000082
表5 S133对腹泻的改善情况
Figure BDA0003630083370000083
Figure BDA0003630083370000091
实验例5对肠道短链脂肪酸的影响实验
5.1、实验菌株
同实验例1
5.2、实验方法
(1)样品的制备：
①粪便悬液的制备：同实验例1；
②制备肠道菌群体外发酵上清液样品：分别取100μL S133L1、S133L2、S133L3、S133D1、S133D2、S133D3、S133S接入发酵小瓶，在37℃培养箱培养24h；
各实验菌株在发酵小瓶的终浓度分别为：高浓度(S133L1、S133D1)：109CFU/mL；中浓度(S133L2、S133D2)：108CFU/mL；低浓度(S133L3、S133D3)：107CFU/mL；
(2)样品前处理：取样品0.1mL，加100μL15％磷酸，再加50μg/mL的内标(异己酸)溶液100μL和乙醚400μL匀浆1min，于4℃12000rpm离心10min，取上清上机测试。
(3)GC-MS检测程序：
①色谱条件：色谱柱Agilent 122-7032UI DB-WAX UI毛细管柱(30m*0.25mm ID*0.25μm)；分流进样，进样量1μL，分流比10:1。进样口温度250℃；离子源温度230℃；传输线温度250℃，四极杆温度150℃。程序升温起始温度50℃；以20℃/min升温至90℃；然后以10℃/min升温至120℃；再以5℃/min升温至150℃；最后以25℃/min升温至250℃维持2min。载气为氦气，载气流速1.0mL/min。
②MS条件：电子轰击电离(EI)源，全扫及SIM扫描方式，电子能量70eV。
5.3、实验结果
各实验菌株对肠道短链脂肪酸(如乙酸、丙酸)含量的影响如图6、7所示，具体分析如下：
(1)从对乙酸、丙酸含量的提升效果上看，S133代谢产物优于S133活菌菌体和灭活菌菌体，加入S133代谢产物对乙酸和丙酸浓度分别提升了3.8倍和2.2倍；
(2)S133活菌菌体和灭活菌菌体均提高了乙酸浓度但降低了丙酸浓度：
①从对乙酸含量的提升效果上看，S133灭活菌菌体明显优于S133活菌，其中高浓度S133灭活菌菌体和活菌菌体对乙酸含量的提升最为明显，分别为45％和18％；
②从对乙酸含量的降低上看，S133活菌菌体降低的更明显；
综上，S133高剂量灭活菌菌体和S133代谢产物对肠道短链脂肪酸含量的提升效果最好。
综合实验例1-5可以看出，本发明的乳酸乳球菌S133在促进肠上皮细胞增殖、提高肠道吸水能力、修复肠道黏膜屏障损伤、调节神经递质、提升肠道短链脂肪酸含量等方面具有良好的作用，可用于缓解肠上皮细胞水通道蛋白表达异常引起的便秘产品中，也可用于防治神经递质表达异常及产肠毒大肠杆菌感染引起的腹泻产品中。
实验例6细胞实验
6.1、实验菌株
乳酸乳球菌S133活菌菌悬液(标记为S133)和乳酸乳球菌S133灭活菌菌悬液(标记为灭活型S133)，由以下方法得到：
乳酸乳球菌S133接种于MRS液体培养基中活化3代后，37℃培养18h，4℃5000r/min离心5min，分别收集菌体；
活菌菌悬液制备：收集的菌体用PBS洗涤1次，4℃、5000r/min离心5min后，去除上清，菌体用含10％胎牛血清的DMEM培养液重悬混匀，用0.9％生理盐水对重悬后的1mL菌液进行梯度稀释，用流式细胞仪检测菌浓，调整菌液浓度1.5×108CFU/mL，得到S133活菌菌悬液。
灭活菌菌悬液制备：收集的菌体用PBS洗涤1次，4℃、5000r/min离心5min后，去除上清，菌体用PBS重悬，于水浴锅中80℃灭活30min，离心后去除上清，用含10％胎牛血清的DMEM培养液重悬混匀，用0.9％生理盐水对重悬后的1mL菌液进行梯度稀释，用流式细胞仪检测菌浓，调整菌液浓度1.5×108CFU/mL，得到S133灭活菌菌悬液；
6.2实验方法
实验细胞为RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)，其细胞培养方法为：RAW264.7细胞复苏后，置于含有DMEM完全培养液的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中孵育，待细胞生长良好密度达80％左右进行传代，传代3次进行实验。
6.2.1细胞增殖实验
(1)实验方法：细胞收集RAW264.7细胞传3代后的细胞，用0.4％台盼蓝染色液进行细胞染色，染色时，取40μL细胞悬液与40μL的0.4％台盼蓝溶液以体积比1：1混匀，3分钟后，取20μL用自动细胞计数仪计数，将细胞稀释，接种于96孔板中，接种密度为1.5×105个/mL，每孔100μL细胞悬液在37℃、5％CO2培养箱中过夜孵育；
各实验菌株与RAW264.7细胞共孵育：待细胞贴壁后，弃去上清液，每孔加入100μL细胞培养液(含10％胎牛血清的DMEM培养基)再各自加入100μL的活菌菌悬液或灭活菌悬液，空白对照组为100μL细胞培养液，每组5个重复，在37℃、5％CO2条件下活菌组与细胞共孵育4h，灭活菌组与细胞共孵育24h；
(2)CCK-8法检测细胞活性及增殖情况：具体为，毎孔内加入10μL的CCK-8溶液，37℃、5％CO2培养箱内孵育1h，在450nm波长下测定吸光度OD值，根据如下公式计算细胞增殖指数和增殖率：
细胞增殖指数＝(As-Ac)/Ac；增殖率＝细胞增殖指数×100％；
式中：As表示实验组OD值，Ac表示空白对照组OD值。
6.2.2细胞吞噬实验
(1)实验方法：收集对数生长期的RAW264.7细胞，用0.4％台盼蓝染色液进行细胞染色，取40μL细胞悬液与40μL的0.4％台盼蓝溶液以1：1混匀，3分钟后，取20μL用自动细胞计数仪计数，将细胞稀释，接种于96孔板中，接种密度为1.5×105个/mL，96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，37℃、5％CO2培养箱培养过夜；
各实验菌株与RAW264.7细胞共孵育：弃去培养液，随后加入100μL细胞培养液(含10％胎牛血清的DMEM培养基)和100μL乳酸菌活菌菌悬液或灭活菌悬液，每组5个复孔，同时设定空白组(含10％胎牛血清的DMEM培养基)，其中活菌组与细胞共孵育4h，灭活菌组与巨噬细胞共孵育24h；
(2)中性红试剂盒检测细胞吞噬效果：孵育结束后，吸出96孔板中的上清液，用PBS洗涤2次，随后加入200μL细胞培养液，同时加入20μL中性红染液，在细胞培养箱内孵育2h。除去含有中性红染液的细胞培养液，PBS洗涤1次，于每孔加入200μL中性红检测裂解液，至室温摇床裂解10min。于540nm波长处测定OD值，根据如下公式计算细胞吞噬指数：
细胞吞噬指数＝As/Ac；吞噬率＝细胞吞噬指数×100％。
式中：As表示实验组OD值，Ac表示空白对照组OD值
6.2.3ELISA法检测细胞因子的含量
(1)实验方法：细胞培养方法和制备菌悬液方法同上，以2×105个/mL浓度的细胞2mL接种于24孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中过夜培养，去掉上清液，加入2mL含10％胎牛血清的DMEM培养基。以LPS介导细胞产生炎症细胞，LPS的浓度为1μg/mL。设置下列不同组与细胞共孵育设置(每组5个重复)：
①阴性对照组(DMEM)
24孔板中加100μL/孔DMEM，置于细胞培养箱中，阴性对照组一孵育4h，阴性对照组二孵育24h；
②阳性对照组(LPS)
24孔板中加LPS使其终浓度为1μg/mL，置于细胞培养箱中，阳性对照组一孵育4h，阳性对照组二孵育24h；
③S133组
24孔板中加100μL/孔乳酸乳球菌S133活菌菌悬液或灭活菌菌悬液，置于细胞培养箱中，活菌组孵育4h，灭活菌组孵育24h；
收集各个组别的细胞培养上清液，1000r/min离心10min去除颗粒和聚合物，分别分装到无菌离心管中，-80℃保藏备用。
(2)检测TNF-α、IL-6、IL-10细胞因子的分泌量：按ELISA试剂盒说明书的方法测定上述6组上清液中的TNF-α、IL-6、IL-10细胞因子的分泌量。
6.2.4荧光定量QPCR检测细胞因子mRNA表达量
(1)实验方法：同6.2.3，设置组别如下：
①阴性对照组(DMEM)
24孔板中加100μL/孔DMEM，置于细胞培养箱中，阴性对照组一孵育4h，阴性对照组二孵育24h；
②S133组
24孔板中加100μL/孔乳酸乳球菌S133活菌菌悬液或灭活菌菌悬液，置于细胞培养箱中，活菌组孵育4h，灭活菌组孵育24h；
(2)检测细胞因子mRNA表达量：采用荧光定量QPCR测定细胞因子mRNA水平的表达量。
6.3、实验结果
6.3.1细胞增殖实验结果
S133灭活菌对巨噬细胞的增殖无显著效果，故其结果省略；S133活菌对巨噬细胞的增殖效果如图8所示，具体分析如下：
乳酸乳球菌S133活菌可促进巨噬细胞的增殖，增殖率为54.74％。
6.2.2细胞吞噬实验结果
S133活菌和灭活菌对巨噬细胞的吞噬效果如图9、10所示，具体分析如下：
乳酸乳球菌S133活菌和灭活菌均可以激活巨噬细胞，促进巨噬细胞的吞噬，吞噬率分别为58.61％、40.231％。
6.2.3ELISA法检测细胞因子的含量结果
S133活菌和灭活菌对巨噬细胞分泌细胞因子的影响如表6、7所示：
表6 S133活菌与巨噬细胞共培养4h分泌细胞因子量
Figure BDA0003630083370000121
Figure BDA0003630083370000131
注：“-”代表细胞因子分泌量小于检出限；“+”代表分泌量15.625-125pg/mL；“++”代表分泌量125-500pg/mL；“+++”代表分泌量500-1000pg/mL；“++++”代表分泌量大于1000pg/mL；
表7 S133灭活菌与巨噬细胞共培养24h分泌细胞因子量
Figure BDA0003630083370000132
注：“-”代表细胞因子分泌量小于检出限；“+”代表分泌量15.625-125pg/mL；“++”代表分泌量125-500pg/mL；“+++”代表分泌量500-1000pg/mL；“++++”代表分泌量大于1000pg/mL；
从表6、7中可以看出，乳酸乳球菌S133活菌可刺激巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10(抗炎因子)；乳酸乳球菌S133灭活菌可刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-10(抗炎因子)。
6.2.4荧光定量QPCR检测细胞因子mRNA表达量结果
S133活菌和灭活菌激活巨噬细胞后分泌的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10量如图11、12所示，具体分析如下：
(1)与阴性对照组相比，乳酸乳球菌S133活菌激活巨噬细胞后分泌的细胞因子mRNA水平表达量，与空白对照相比，分泌IL-6量是其59倍，分泌TNF-α量是其10.8倍，分泌IL-10量是其160倍；
(2)乳酸乳球菌S133灭活菌激活巨噬细胞后分泌的细胞因子mRNA水平表达量，与空白对照相比，分泌IL-6量是其20.4倍，分泌TNF-α量是其33.1倍，分泌IL-10量是其52.1倍。
综合实验例6细胞实验可以看出，乳酸乳球菌S133可以激活吞噬细胞，促进吞噬细胞的增殖和吞噬，并且激活吞噬细胞后分泌的IL-6、TNF-α、IL-10均显著提高，说明乳酸乳球菌S133具有良好的免疫调节能力。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）S133，其特征在于，所述乳酸乳球菌S133保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No .23689，所述乳酸乳球菌S133的分类命名为乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp. cremoris）。
2.乳酸乳球菌制剂，其特征在于，所述乳酸乳球菌制剂包括权利要求1所述的乳酸乳球菌S133，所述乳酸乳球菌制剂为固态或液态菌制剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3671212B2 (ja) * 2001-09-17 2005-07-13 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 免疫賦活に有用なラクトコッカス属乳酸菌
JP5158986B2 (ja) * 2010-05-21 2013-03-06 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 免疫調節性機能を有する微生物株・成分の選抜方法
CN106434441B (zh) * 2016-09-21 2019-07-26 光明乳业股份有限公司 一种乳酸乳球菌乳脂亚种及其在干酪生产中的应用
JP2018153177A (ja) * 2017-03-17 2018-10-04 島根県 桑実に由来する乳酸球菌、及びそれを含む経口組成物
CN106957810B (zh) * 2017-05-22 2020-05-05 哈尔滨中科生物工程有限公司 一种乳酸片球菌及其用途
CN112481155B (zh) * 2020-11-24 2023-05-26 杭州娃哈哈科技有限公司 一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用
CN112375712A (zh) * 2020-11-25 2021-02-19 昆明理工大学 一株乳酸乳球菌及其应用
CN112358999B (zh) * 2020-11-26 2022-04-08 中国农业大学 一种罗伊氏乳杆菌及其应用
CN113512514B (zh) * 2021-07-01 2023-05-26 杭州娃哈哈科技有限公司 一株具有改善抑郁功效的乳酸乳球菌及其应用
CN114381411B (zh) * 2022-03-23 2022-05-27 山东中科嘉亿生物工程有限公司 乳酸乳球菌jyll-60及其在制备提高免疫力的产品上的应用

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