KR102181606B1 - 설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주들 - Google Patents

설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주들 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 결장 내 물의 흡수에 작용할 수 있는 생균제 균주를 식별하거나 선택하는 방법, 및 설사의 치료 및/또는 예방에 있어 의약품으로서의 그들의 사용에 관한 것이다. 본 발명은, 특히, 설사의 치료 및/또는 예방에의 사용을 위한 Bacillus subtilis CU1의 균주에 관한 것이다.

Description

설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주들{PROBIOTIC STRAINS FOR THE TREATMENT AND/OR PREVENTION OF DIARRHEA}
본 출원은 2012년 12월 12일자에 출원된 프랑스 특허 출원 번호 FR 1261916에 대해 우선권을 주장한다. 상기 프랑스 특허 출원의 내용은 그것의 전부가 참조로서 합체된다.
본 발명은, 설사의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 생균제 균주들, 특히 Bacillus의 생균제 균주들에 관한 것이다. 상기 발명은 또한, 결장 내 물의 흡수에 작용하는 특정한 특징을 갖는 생균제 균주들을 선택하는 방법에 관한 것이다.
정상적으로 기능할 때, 인간의 결장은, 하루에 약 2리터의 물에 해당하는, 내강(lumen)으로 들어오는 물의 약 99%를 흡수한다. 상기 결장은 추가적인 4 리터의 물까지 흡수할 수 있는 용량을 가진다. 그러나, 하루의 6리터의 물, 즉, 흡수를 위한 용량이 포화상태가 되면, 설사가 발생한다.
설사는, 평소보다 대형으로(bulky) 그리고 더 자주(하루에 3번 이상 배변), 액체 또는 묽은 농도의 대변으로 특징되는 흔한 문제다(전세계적으로, 매년 약 20억 정도의 케이스). 극단적으로는, 하루에 20리터 이상의 액체가 손실될 수 있다.
설사는 질환이 아니라 증상이다. 그것의 가장 흔한 원인은 오염된 물 또는 음식의 섭취이다; 이 경우, 그것은 별도의 치료 없이 하루, 이틀 정도 지속된다. 그러나, 설사 그 자체는, 특히 유아에게, 치명상이 될 수 있는 탈수를 야기할 수 있다. 여기서, 10%를 초과하는 체중 감소는 병원 응급 상황이다. 세계 보건 기구(World Health Organization)에 따르면, 설사는 제 3 세계 국가에서 유아 사망의 두번째로 흔한 원인이며, 5세 이하 아이들의 죽음의 18%를 차지한다(Bryce et al., Lancet, 2005, 365: 1147-1152).
유체의 손실이 보충되지 않는 경우, 설사로 인한 탈수가 발생한다. 일반적인 경우, 결장 내에서 물이 대변으로부터 제거 된다. 섭취된 물질에 함유된 물의 재흡수 현상은 물과 전해질의 능동 및 수동 수송의 조합에 의해 결장 세포들의 수준에서 발생한다. 결장 상피의 함입 음와(crypts of the invaginations) 수준에서는, 혈액으로부터 외부 환경으로의 물의 분비가 있다. 이러한 두 현상은 인간이 좋은 건강 상태에 있도록 상호 보완하며, 분자들의 장내 수송을 촉진시키고 순환 조건을 향상시키는, 대변의 적절한 수분을 유지할 수 있게 해준다.
설사에는, 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의한 병원균에 의해 유발되는 감염성 근원의 설사와, 음식 과민증(food intolerance), 지방 다이어트(a fatty diet), 알코올(alcohol), 심리적 요인(a psychological factor), 의약품의 투여, 치료 과정 중의 투여로부터 유발된 설사와 같은 비감염성 설사, 질병 또는 임상 조건에 관련된 설사, 또는 약물 금단에 관련된 설사를 포함하여 매우 다양한 원인이 있다.
증상의 지속 기간에 따라, 급성 및 만성 설사인지가 구별되며, 각각의 증상은 2주 미만과 2주 이상으로 지속된다.
설사의 치료를 위한 종래 통상적인 약물에는, 예를 들어, 물과 전해질의 흡수 자극 및 수송 시간 감속의 두 가지 작용을 하는 로페라마이드(loperamide)가 있다. 그러나, 수송 시간의 감속은, 병원성 박테리아가 오랜 시간동안 장내에 남아있게 되기 때문에 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 또는 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 타입의 몇 가지 감염이 문제가 될 수 있다.
생균제들은 설사의 치료 및/또는 예방에 있어서 흥미로운 대안으로 상징된다. 여기서 사용되는 대부분의 생균제들은 젖산균(lactic bacteria)이다. 상기 생균제들은 일반적으로 면역 시스템과 장내 미생물상(intestinal flora)의 평형에 유익한 작용을 갖는 것으로서 설명되어 있다.
다른 연구들은 설사의 치료 또는 예방을 위한 새로운 타겟들을 발견하기 위해 노력하여 있다. 그러므로, 문서 WO 2004/028480은 CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) 단백질에 의해 염소 이온의 수송의 효율을 저하시킬 수 있는 티아졸리다이논(thiazolidinone) 타입의 화합물과, 분비성 설사의 치료에서의 그것의 사용을 기재하고 있다. 브래드 포드 등(Bradford et al.) (Am. J. Physiol. Gastrointes. Liver Physiol., 2009, 296: G886-G898)은 (CFTR의 변형 발현이 있는) 췌장섬유증(mucoviscidosis) 환자들에서 장 폐색증과 탈수의 문제를 치료하기 위한 수단을 조사하여 왔다
더욱이, 췌장섬유증을 앓는 생쥐에서 NHE3(Sodium Hydrogen Exchanger 3) 단백질의 일부 또는 전부 손실이, 현저히 장내 유동성이 증가함에 의한 장 폐색증의 발생을 감소시킴을 기재하고 있고, NHE3가 CFTR의 변형 발현 및 췌장섬유증을 앓는 환자들에 있어서 장관의 유동성을 조절하기 위한 잠재적인 타켓이라고 결론지었다.
그러므로, 설사의 치료 및/또는 예방을 위한 새로운 전략에 대한 요구가 여전히 존재한다.
따라서, 본 발명의 목적들 중의 하나는, 설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주를 선택하는 선택하는 방법을 제안하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 현재 연구, 제안되고 있는 설사의 치료 또는 예방을 위한 새로운 화합물이 아니라, 설사의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것으로서 특정 기능을 수행하는 생균제 균주와, 이들의 배양에 의해 얻어지는 세포들, 또는 이들을 포함하는 조성물을 제안하는 것이다.
전반적으로, 본 발명은, 상당히 본질적인 방식으로, 특정한 생균제 균주들이, 결장 내에 과량으로 존재하는 물의 흡수를 유도함으로써, 설사에 직접적으로 작용할 수 있음을 발견함에 근거한다. 놀랍게도, 그리고 예기치 않게, 본 발명자들은 특정 생균제 균주가 결장 내 물의 분비와 관련된 수송체의 발현을 금지하고, 결장 내 물의 흡수에 관련된 수송체의 발현을 자극시킬 수 있고, 설사의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있음을 보여주었다.
따라서, 상당히 본질적인 방식으로, 이러한 생균제 균주들은 수송체의 억제제로서 작용하지 않고, 즉, 수송체에 결합되어 그들의 기능을 방해하는 것으로써 작용하지 않고, 그들의 발현에 대해 작용하여 그에 따라 존재하는 수송체들의 집단에 작용한다.
더욱이, 이러한 생균주 균주들은 결장 내 과량으로 존재하는 물의 흡수에 직접적으로 작용함으로써, 어떠한 유형의 설사든지, 특히, 설사가 감염성 또는 비감염성 근원인지 여부, 및 미생물 불균형의 존재여부에 관계 없이, 그것의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있는 이점을 가진다.
따라서, 본 발명은, 설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주(probiotic strain)를 선택하는 방법으로서,
- 결장 내 물의 흡수 또는 분비에 관련된 적어도 하나의 수송체(transporter)의 발현에 대한 적어도 하나의 시험 균주의 효과를 측정하는 과정; 및
- 결장 내 물의 분비에 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현의 감소, 및/또는 결장 내 물의 흡수에 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현의 증가를 유도하는 적어도 하나의 균주를 선택하는 과정;
을 포함하는 선택 방법에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, 하나의 측면에서, 본 발명은, 설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주(probiotic strain)를 선택하는 방법으로서,
- CFTR 단백질(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) 의 발현 및/또는 NHE3 단백질(Sodium Hydrogen Exchanger 3)의 발현에 대한 적어도 하나의 시험 균주의 효과를 측정하는 과정; 및
- CFTR 단백질 발현의 감소 및/또는 NHE3 단백질 발현의 증가를 유도하는 적어도 하나의 균주를 선택하는 과정;
을 더 포함하는 선택 방법에 관한 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 시험 균주는 효모 균주 또는 박테리아 균주이다. 특히, 시험되는 박테리아 균주는 Bacillus의 균주, 바람직하게는 Bacillus subtilis의 균주일 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현은 전기 영동(electrophoresis), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역 검정(immunoassay), 면역 조직 화학(immunohistochemistry), 면역 세포 화학(immunocytochemistry), 질량 분석(mass spectrometry), RT-PCR 또는 노던 블롯(Northern blot)에 의해 측정된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 설사의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것으로, 상기 발명에 따른 방법을 사용하여 선택된 생균제 균주에 관한 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 생균제 균주는 Bacillus subtilis의 균주이고, 바람직하게는, 2001년 10월 25일자로 CNCM(National Collection of Cultures of Microorganisms, 프랑스 CEDEX 15 파리 75724 뤼 드 독티어 록스 25)에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주이다.
부수적인 측면에 있어서, 본 발명은, 설사의 치료 및/또는 예방에 사용되기 위한, 상기 발명에 따른 방법을 사용하여 선택된 생균제 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들에 관한 것이다.
특히, 상기 발명은 설사의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어지는 Bacillus subtilis 의 세포들에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 발명에 따른 방법을 사용하여 선택된 생균제 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자들에게 있어 설사의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 설사의 치료 및/또는 예방 방법은, Bacillus subtilis의 생균제 균주, 바람직하게는, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어지는 Bacillus subtilis의 세포들의 투여를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명은, 설사의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 상기 발명에 따른 적어도 하나의 생균제 균주, 또는 상기 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들을 포함한다. 특히, 상기 조성물은, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어지는 Bacillus subtilis의 세포들을 포함한다.
상기 발명에 따라 예방적으로 및/또는 치료적으로 다뤄질 수 있는 설사의 형태는, 급성 설사 및 만성 설사를 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 발명에 따라 치료되는 설사는, 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의한 병원균에 의해 유발되는 감염성 근원의 설사이다.
다른 실시예들에 있어서, 상기 발명에 따라 치료되는 설사는, 비감염성 근원의 설사이다.
비감염성 근원의 설사는, 예를 들어, 음식 과민증(food intolerance)에 의해 유발된 설사, 지방 다이어트(a fatty diet)에 의해 유발된 설사, 알코올(alcohol)에 의해 유발된 설사, 심리적 요인(a psychological factor)에 의해 유발된 설사, 의약품의 투여 에 의해 유발된 설사, 치료 과정 중의 투여로부터 유발된 설사, 질병 또는 임상 조건에 관련된 설사, 또는 약물 금단에 관련된 설사를 들 수 있다.
이하에서는, 상기 발명의 특정한 바람직한 실시예들의 더욱 구체적인 설명을 제공한다.
본 발명에 따른, 생균제 균주의 선택 방법은 설사의 예방 및/또는 치료에 효과적인 생균제 균주를 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법을 사용하여 선택된 생균제 균주, 이의 배양으로부터 얻어지는 세포들, 및 이들을 포함하는 조성물은, 결장 내 과량으로 존재하는 물의 흡수에 직접적으로 작용함으로써, 어떠한 유형의 설사든지, 특히, 설사가 감염성 또는 비감염성 근원인지 여부, 및 미생물 불균형의 존재여부에 관계 없이, 그것의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있는 효과를 가진다.
도 1은 CFTR 단백질의 결장 발현에 대한 균주 Bacillus subtilis CU1로의 치료 효과를 보여주는 것이다. 형광 강도/㎛2는 대조군(흰색), 그리고 CU1으로 치료한 후(검정색)에 대한 것이다. *p<0.005
도 2는 NHE3 단백질의 결장 발현에 대한 균주 Bacillus subtilis CU1로의 치료 효과를 보여주는 것이다. 형광 강도/㎛2는 대조군(흰색), 그리고 CU1으로 치료한 후(검정색)에 대한 것이다. *p<0.005
도 3는 CFTR 단백질의 결장 발현에 대한 균주 Lactobacillus plantarum로의 치료 효과의 부재를 보여주는 것이다. 형광 강도/㎛2는 대조군(흰색), 그리고 LR 로 치료한 후(검정색)에 대한 것이다. *p<0.005
도 4는 NHE3 단백질의 결장 발현에 대한 균주 Lactobacillus plantarum로의 치료 효과의 부재를 보여주는 것이다. 형광 강도/㎛2는 대조군(흰색), 그리고 LR 로 치료한 후(검정색)에 대한 것이다. *p<0.005
도 5는 생쥐에게 LPS(15 mg/kg) 또는 식염수를 정맥내 투여한 후 60분 동안(검정색)과 60 내지 120분 사이(흰색)에 대변으로 배출된 물(mg) (평균값± SEM, n=10-20)을 보여주는 것이다. T-: 식염수의 주사를 맞은 CU1으로 처리되지 않은 생쥐들, T+: LPS의 주사를 맞은 CU1으로 처리되지 않은 생쥐들, T-/CU1: 식염수의 주사를 맞은 CU1으로 처리된 생쥐들, T+/CU1: LPS의 주사를 맞은 CU1으로 처리된 생쥐들. * P<0.05 대 T-; † P<0.05 대 T+
도 6는 생쥐에게 피마자유(castor oil)(200 L) 또는 식염수를 위내 투여한 후 60분 동안(검정색), 60 내지 120분 사이(회색), 및 120분 내지 180분 사이(흰색)에 대변으로 배출된 물(mg) (평균값± SEM, n=10-19)을 보여주는 것이다. T-: 식염수의 주사를 맞은 CU1으로 처리되지 않은 생쥐들, T+: 피마자유의 주사를 맞은 CU1으로 처리되지 않은 생쥐들, T-/CU1: 식염수의 주사를 맞은 CU1으로 처리된 생쥐들, T+/CU1: 피마자유의 주사를 맞은 CU1으로 처리된 생쥐들. * P<0.05 대 T-; † P<0.05 대 T+
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은, 장내 유체의 조절과 관련된 수송체의 수준에서, 직접적인 작용에 의해 결장 내 물의 흡수에 작용할 수 있는 생균제 균주들의 식별, 및 설사의 치료 및/또는 예방에 있어 의약품으로서의 그들의 사용에 관한 것이다.
I. 생균제 균주들의 선택 방법
상기 발명에 따른 선택 방법은, 설사의 치료 및/또는 예방에 유용한 생균제 균주를 식별하는 것을 목적으로 한다.
따라서, 본 발명은, 설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주(probiotic strain)를 선택하는 방법으로서,
- 결장 내 물의 흡수 및 분비에 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현에 대한 적어도 하나의 시험 균주의 효과를 측정하는 과정; 및
- 결장 내 물의 분비에 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현의 감소, 및/또는 결장 내 물의 흡수에 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현의 증가를 유도하는 적어도 하나의 균주를 선택하는 과정;
을 포함하는 방법에 관한 것이다.
상기 결장 내 물의 분비에 관련된 수송체의 예는 CFTR 단백질(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator)이다.
상기 결장 내 물의 흡수에 관련된 수송체의 예는 NHE3 단백질이다(Sodium Hydrogen Exchanger 3).
상기 발명에 따른 바람직한 방법은,
- CFTR 단백질의 발현 및/또는 NHE3 단백질의 발현에 대한 적어도 하나의 시험 균주의 효과를 측정하는 과정; 및
- CFTR 단백질 발현의 감소 및/또는 NHE3 단백질 발현의 증가를 유도하는 적어도 하나의 균주를 선택하는 과정;
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 발명에 따른 방법의 결과로서 선택된 균주는, 그러므로, 설사의 치료 및/또는 예방에 유용한 생균제 균주이다.
여기서, “생균제 균주”는 호스트(host)의 건강에 유익한 효과를 발휘하는 살아있는 미생물의 균주를 의미하는 것이다.
상기 호스트는 일반적으로 인간이나, 상기 호스트는, 다른 포유 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 반추 동물, 특히 양, 염소, 송아지, 소, 사슴과 동물 ,낙타과 동물, 말, 구세계의 돼지, 특히 돼지, 새끼 돼지, 토끼, 쥐, 및 천축서과의 설취류 또한 될 수 있다.
시험 균주들
상기 발명에 따른 방법을 사용하여 시험되는 균주는 미생물의 임의의 균주가 될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 시험 균주는 효모 균주이다. 상기 시험될 수 있는 효모들로는, 예를 들어, Saccharomyces 속(genus)의 효모, 특히 Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae 종(species), Kluyveromyces 속의 효모, 특히 Kluyveromyces marxianus 종을 들 수 있다.
다른 실시예들에 있어서, 상기 시험 되는 균주는 박테리아 균주이다.
상기 시험 균주는, 바람직하게는, 인간 및/또는 동물들에게 무해한 것으로서 인식되는 박테리아로부터 선택된다.
상기 시험될 수 있는 박테리아는, 예를 들어, the bacteria of the genus Bifidobacterium 속(genus)의 박테리아, 특히 Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, 및 Bifidobacterium breve 종(species); Lactobacillus 속의 박테리아, 특히Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, 및 Lactobacillus salivarius 종; Weisella 속의 박테리아, 특히 Weisella cibaria, Weisella kimchii, Weisella thailandensis 종; Bacillus 속의 박테리아, 특히 Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, 및 Bacillus clausii 종; Lactococcus 속의 박테리아, 특히 Lactococcus lactis 종; Enterococcus 속의 박테리아, 특히 Enterococcus faecium, Enterococcus fecalis 종; Streptococcus 속의 박테리아, 특히Streptococcus thermophilus 종; Escherichia 속의 박테리아, 특히 Escherichia coli 종을 들 수 있다.
CFTR 및/또는 NHE3의 발현
상기 발명에 따른 방법은, 결장 내 물의 흡수 또는 분비와 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현에 대한 시험 균주의 효과를 측정하는 과정을 포함한다.
여기서 사용되는, “CFTR 단백질”은, 염색체 7의 장완(long arm)의 q31.2 부위 내, 유전자 자리 7q31.2에 위치하는 CFTR 유전자("Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator")에 의해 암호화된 인간 종 내의 단백질을 의미한다. 상기 CFTR 유전자는 종들 가운데 고도로 보존된다. 인간에 있어서, 상기 CFTR 단백질은 예를 들어, 1480개 아미노산 길이인 GenBank 수탁 번호 NP_00483의 폴리펩티드(polypeptide) 서열을 갖는다.
상기 CFTR 단백질은 상피 세포의 염화물(chloride) 및 티오시아산염(thiocyanate) 이온에 대해 투과성인 채널을 형성한다.
상기 CFTR 단백질은, 생식기 및 땀샘의, 세뇨관의, 기관-기관지 수상 구조(tracheo-bronchial tree)의, 장내 음와들의, 췌장 및 담도관의 상피세포의 첨극에서 발현된다.
티아졸리다이논(thiazolidinone)과 같은 CFTR의 억제제는 설사의 치료 및/또는 예방에의 적용이 확인되었다고 입증되었다(Verkman 등., Curr. Pharm. 2006년 12월, 12: 2235-2247).
그러므로, 상기 발명에 따른 선택 방법에 있어서, 상기 CFTR 단백질의 발현의 감소를 유도하는 시험 균주는 설사의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다.
여기서 사용된, “NHE3 단백질’은 염색체 13에 위치하는 NHE3 유전자("Sodium-Hydrogen Exchanger 3", 또한, SLC9A3("Solute Carrier Family 9 Member 3") 명칭으로도 알려져 있다)에 의해 암호화된 인간 종 내의 단백질을 의미한다. 인간에 있어서, 상기 NHE3 단백질은, 예를 들어, 834개 아미노산 길이인 GenBank 수탁 번호 NP_004165의 폴리펩티드(polypeptide) 서열을 갖는다.
상기 NHE3 단백질은, 주로 나트륨 균형의 유지를 담당하는, 신장의 네프론(nephron) 내 및 장의 상피 세포의 정단막 내에서 발현된다.
NHE3 유전자를 비활성화시키도록 유전적으로 수정된 생쥐들이 설사로 고통받는 것을 보여주고 있다(Schultheis 등., 1998, Nat. Genet 19: 282-285).
그러므로, 상기 발명에 따른 선택 방법에 있어서, 상기 NHE3 단백질의 발현의 증가를 유도하는 시험 균주는 설사의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 결장 내 물의 흡수 또는 분비에 관련된 수송체의 발현, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현에 대한 시험 균주의 효과의 측정은, 사용되는 방법의 특성상, 대단히 중요하다거나 제한 요소가 아니기 때문에 당업자에 의해 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY을 보라).
일반적으로, 단백질의 발현 정도는, 전기 영동 방법, 웨스턴 블롯 방법, 면역 검정 방법, 면역 조직 화학 방법, 면역 세포 화학 방법, 또는 질량 분석 방법과 같은 직접적인 방법에 의해 측정된다.
또한, 간접적인 방법에 의해 상기 단백질의 발현 정도를 측정하는 것도 가능하다.
상기 간접적인 방법은, 예를 들어 RT-PCR(중합 효소 연쇄 반응에 따르는 역전사), 바람직하게는 정량적 RT-PCR 또는 노던 블롯 방법에 의해 대응 유전자의 전사 정도를 측정하는 것으로 구성될 수 있다.
간접적인 방법의 또 다른 예는, 단백질의 활성, 즉, 존재하는 기능 단백질의 양과 상관되는 단백질의 활성을 측정하는 것으로 구성되는 방법이다.
특정한 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현 정도는 전기 영동에 의해 측정된다.
전기 영동은 단백질이 그들의 분자량에 따라 분리되도록 한다. 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulphate)를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 대한 전기 영동(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동: Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE)이라 명명됨)이 일반적으로 사용된다. 또한, 그들의 분자량 및 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리하는 것이 가능한, 등전점 전기 영동과 같은 이차원 전기 영동일 수도 있다.
상기 발명의 특정 실시예들에 있어서, 상기 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현 정도는 웨스턴 블롯에 의해 측정된다.
웨스턴 기술이라고도 명명되는 웨스턴 블롯은, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 단백질을 분리하고, 폴리아크릴아미드 겔로부터, 목적 단백질이 상기 단백질에 대해 특이적인 표지 항체를 사용하여 검출되는, 지지 막으로 단백질을 이동시키는 것으로 구성된다.
바람직한 실시예들에 있어서, 상기 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현정도는, 면역 검정에 의해 측정된다. 여기서 사용되는, “면역 검정”은 항원, 항체 또는 유사한 물질들을 검출하고 정량하기 위한 항원-항체 반응을 사용하는 임의의 기술을 의미한다. 항체-항원 복합체는 여러 가지 방법으로 시각화될 수 있다. 대부분의 경우, 항체는 색을 만드는 반응(에: 면역 페록시다아제 염색)을 촉진시킬 수 있는 효소(예: 페록시다아제(peroxidise))에 접합된다. 그렇지 않으면, 항체는 형광으로 표지될 수 있다(예: FITC, Rhodamine, Texas Red or Alexa Fluor). 상기 항체-항원 복합체는 면역 형광법에 의해 검출된다.
인간의 CFTR 단백질 및 인간의 NHE3 단백질에 대해 특이적인 단클론성 항체는 당업계에 공지되어 있고, 상용화되어 있다.
상기 발명의 특정 실시예들에 있어서, 상기 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현 정도는, 면역 조직 화학에 의해 측정된다. 상기 용어 “면역 조직 화학”은 조직 내 단백질을 위치시키기 위한 항체의 사용에 근거한 방법을 의미한다. 상기 조직은 일반적으로 고정되고, 세정된 후 투과된다. 그런 다음, 구체적으로 목적 단백질(여기서, 예를 들어, CFTR 단백질 또는 NHE3 단백질)을 인식하는 1차 항체로 배양된다. 검출 시스템에 결합된 2차 항체가 추가된다. 상기 검출 시스템은 예를 들어 형광 색소, 또는 기질의 존재 하에 둘 때, 색의 반응을 일으키는 효소이다. 이러한 2차 항체는 1차 항체의 상수부 Fc를 인식하고, 1차 항체의 종 외의 종들로부터 유도되어야 한다. 만일 형광 색소라면, 상기 시료의 형광을 보호하는 매체에, 만일 그것이 효소라면, 기질의 존재 하에, 상기 조직은 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 분석된다. 상기 목적 단백질의 발현 정도는 또한, 밀도 측정에 의해, 형광 강도를 측정함으로써, 또는 분광 광도법에 의해 측정될 수 있다.
상기 발명의 특정 실시예들에 있어서, 상기 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현 정도는, 면역 세포 화학에 의해 측정된다.
면역 세포 화학은, 초기 시료가 조직 대신 세포학적 제제임을 제외하면 면역 조직 화학과 유사한 기술이다.
상기 발명의 특정 실시예에 있어서, 상기 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현 정도는, 질량 분석에 의해 측정된다.
상기 발명의 특정 실시예에 있어서, 상기 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현 정도는, RT-PCR에 의해 측정된다.
RT-PCR은 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 따르는, RNA의 cDNA로의 역전사로 구성된다. RT-PCR은 목적 단백질에 대응하는 초기 RNA를 정량화하는 것을 가능하게 하는 정량적 RT-PCR이 바람직하다.
상기 발명의 특정 실시예에 있어서, 상기 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현 정도는, 노던 블롯에 의해 측정된다.
노던 이송이라고도 명명되는, 노던 블롯은, 겔 전기 영동에 의해 크기에 따라 RNA를 분리하고, 상기 RNA를 겔로부터, 정량화된 단백질의 RNA에 대해 특이적인 표지 혼성화 탐침(labeled hybridization probe)으로 검출될 수 있는 막으로 보내는 것으로 구성된 기술이다.
생물학적 시료
상기 발명에 따른 하나의 방법은, 생물학적 시료 내에서, 결장 내 물의 흡수 및 분비에 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현, 특히, CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현에 대한 시험 균주의 효과를 측정하는 과정을 포함한다.
여기서 사용되는 상기 용어 “생물학적 시료”는, 넓은 의미로 사용된다. 생물학적 시료는 목적 단백질(특히, CFTR 단백질 또는 NHE3 단백질)이 발현되고, 따라서 검출 및 정량화될 수 있는 임의의 생물학적 조직일 수 있다.
상기 발명에 따른 선택 방법을 적용할 때 사용될 수 있는 생물학적 시료는, 예를 들어, 장, 췌장관, 담도관, 콩팥 세뇨관, 기관-기관지 수상 구조, 생식기 시스템, 땀샘, 및 신장의 네프론으로부터 얻은 시료일 수 있다.
바람직한 실시예들에 있어서, 상기 생물학적 시료는 장으로부터 얻은 시료일 수 있고, 바람직하게는, 결장으로부터 얻은 시료일 수 있다.
조직 시료는, 바람직하게는, 동물 모델로부터, 예를 들어 생검에 의해 채취한 것일 수 있다. 상기 동물 모델은 바람직하게는, 포유 동물, 예를 들어, 생쥐, 쥐, 토끼, 돼지, 닭, 원숭이를 들 수 있다. 상기 동물 모델은 유전자 변형 동물일 수 있다.
상기 발명에 따른 바람직한 생물학적 시료는 결장 세포(colonoctyes), 즉, 결장 점막으로부터 얻는 세포를 포함하는 조직 시료다.
상기 생물학적 시료는, 또한, 조직으로부터 얻어지고, 목적 단백질을 발현시키는 생물학적 물질일 수 있다.
상기 얻어진 생물학적 물질은 예를 들어, 조직 시료로부터 분리된 세포들, 또는 조직 시료로부터 분리된 세포들로부터 추출된 단백질로부터 선택된다.
상기 용어 “생물학적 시료”는 또한, 목적 단백질, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질을 발현시키는 것으로 알려진 세포계의 세포들을 포함한다.
상기 CFTR을 발현시키는 세포계의 예들은, 결장으로부터 분리된 Caco-2 세포들, 결장으로부터 분리된 HT-29 세포들, 또는 결장으로부터 분리된 T84 세포들을 포함한다.
상기 NHE3 단백질을 발현시키는 세포계의 예들은, 결장으로부터 분리된 Caco-2 세포들, 결장으로부터 분리된 HT-29 세포들, 또는 결장으로부터 분리된 T84 세포들을 포함한다.
이러한 세포계들은, 예를 들어 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 상용화되어 있다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 생물학적 시료는 목적 단백질, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질을 발현시키는 세포들 또는 조직으로부터 분리된 단백질 추출물이다. 상기 단백질들을 추출하는 방법은 당업자에 의해 공지되어 있다(예를 들어, "Protein Methods", D.M. Bollag et al., 2nd Ed., 1996, Wiley-Liss; "Protein Purification Methods: A Practical Approach", E.L. Harris and S. Angal (Eds.), 1989; "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", S. Roe, 2nd Ed., 2001, Oxford University Press; "Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization", H. Ahmed, 2005, CRC Press: Boca Raton, FL를 보라). 또한, 조직 또는 생물학적 유체로부터 단백질을 추출하기 위한 상업 키트도 있다. 이러한 키트는, 예를 들어, BioRad Laboratories (Hercules, CA), BD Biosciences Clontech (Mountain View, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), Calbiochem (San Diego, CA), Pierce Biotechnology (Rockford, IL), and Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) 에 의해 판매된다. 당업자는 상황에 가장 적합한 키트를 선택하는 방법을 알고 있다.
시험 균주의 효과
상기 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 결장 내 물의 흡수 및 분비와 관련된 수송체, 특히 CFTR 단백질 및/또는 NHE3 단백질의 발현에 대한 시험 균주의 효과는, 시험 균주로 다뤄지는 동물 모델로부터 얻어지는 생물학적 시료 내에서 측정되는 목적 단백질의 발현 정도와, 시험 균주로 다뤄지지 않는 (동종의) 동물 모델로부터 얻어지는 (동종의) 생물학적 시료 내에서 측정되는 목적 단백질의 발현 정도를 비교함으로써 결정된다. 여기서, 마지막으로 언급한 동물은 대조 동물이라고 명명된다.
그러므로, 예를 들어, 동물 모델로부터 채취한 생물학적 시료에 상기 발명에 따른 방법을 적용할 때, 시험 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들의 주어진 양은 동물 모델에 투여된다.
상기 세포들의 양은 한번에 투여될 수 있다.
그렇지 않으면, 상기 세포들의 양은 여러 번에 걸쳐, 같은 날 또는 여러 날이나 여러 주에 걸쳐서 투여될 수 있다.
상기 시험 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들은 사용되는 동물 모델에 적합한 임의의 투여 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 적당한 매개체와 시험 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들의 주어진 양을 포함하는 용액 또는 현탁액의 주사, 특히 위장 내 주사에 의해 수행될 수 있다. 동일한 부피의 매개체만을 포함하는 용액은 대조 동물에 투여된다.
더욱이, 생물학적 시료가 세포계인 경우에 상기 발명에 따른 방법을 적용할 때, 상기 시험 균주의 효과는, 시험 균주로 다뤄지는 세포계의 세포들에서 측정되는 목적 단백질의 발현 정도와 시험 균주로 다뤄지지 않는 (동일한 세포계의) 세포들에서 측정되는 목적 단백질의 발현 정도를 비교함으로써 결정된다. 여기서 마지막에 언급한 세포들은 대조 세포들이라고 명명된다.
그러므로, 예를 들어, 생물학적 시료가 세포계인 경우에 상기 발명에 따른 방법을 적용할 때, 세포계의 세포들은, 적당한 매개체와 시험 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들의 주어진 양을 포함하는 용액 또는 현탁액의 주어진 양으로 배양된다. 상기 세포계의 대조 세포들은 오직 매개체만을 포함하는 동일한 부피의 용액의 존재 하에 동일한 조건으로 배양된다.
상기 균주의 배양 방법은, 효모 균주이든지 박테리아 균주이든지, 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 각각의 균주들에 대해 그것의 특성과 관련하여 배양 조건을 최적화하는 방법을 알고 있다.
또한, 당업자는, 동물 모델에의 투여 또는 세포계의 세포들로 배양하기 위한, 시험 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들의 최적화된 양을 결정하는 방법을 알고 있다.
예를 들어, Bacillus subtilis 세포들은, 특히 ‘Biotechnology, 5th edition, R. Scriban, Edition Tec. ＆ Doc., 1999, ISBN: 2-7430-0309-X’의 책에 기재된 바와 같이, 배양기에서 Bacillus subtilis의 균주의 배양에 의해 얻어진다.
전형적으로, Bacillus subtilis의 균주의 배양에 의한 Bacillus subtilis의 세포들을 생산하는 방법은,
- Bacillus subtilis의 균주의 접종원으로 배양기를 찾는 과정,
- 세포들의 증식을 얻기 위해, 호기성 조건하에서 배양하는 과정,
- Bacillus subtilis의 세포들을 얻기 위해, 그것의 배양기에서 바이오매스(biomass)을 분리하는 과정
를 포함한다.
그러므로, 상기 Bacillus subtilis의 세포는 대부분 발육형(vegetative form)으로 얻어진다.
상기 표현 “대부분 발육형”은 세포들의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%가 발육형이라는 것을 의미한다.
박테리아의 “발육형”은 유리한 환경에 있는 박테리아의 형태를 나타낸다.
상기 유리한 환경의 예는 박테리아의 증식에 유리한 온도 및 pH에서의 비제한적 배양기이다.
비제한적 배양기는 세포들의 증식을 위해 필요한 모든 영양분을 포함한다.
상기 Bacillus subtilis의 세포들을 생산하는 방법은 또한, 호기성 조건에서 배양하는 단계와 바이오매스를 분리하는 단계 사이에, 세포들을 불리한 조건에 두는 중간 단계를 포함할 수 있다. 그러므로, 생산 방법의 끝에 얻어지는 Bacillus subtilis의 세포들은 대부분 포자형이다.
상기 표현 “대부분 포자형”은 세포들의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%가 포자형이라는 것을 의미한다.
박테리아의 “포자형”은 불리한 환경에 있는 박테리아의 형태를 나타낸다. 그러므로, 상기 포자형은 그것이, 예를 들어 영양분의 부족, 즉, 제한적인 영양분 배지, 물 부족, pH 또는 온도의 광범위한 변동, 또는 소화관의 통과와 같은 어려운 환경에 저항할 수 있게 하는 저항의 형태이다.
불리한 조건에 박테리아의 세포들을 두는 것은, 예를 들어, 박테리아의 배양 배지를 교체하지 않는 것, 배양 배지에 영양분 공급을 멈추는 것, 제한적인 배양 배지를 사용하는 것, 온도의 변화, pH의 변화, 또는 이들의 조합에 의해 얻어진다.
상기 Bacillus subtilis의 세포들의 생산 방법은 또한, 건조 형태의 Bacillus subtilis의 세포들을 얻기 위해, 세포들을 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 표현 “건조 형태의 Bacillus subtilis의 세포들”은 Bacillus subtilis의 세포들의 생산 방법의 끝에 얻어지는 바이오매스가 90% 이상의 건조물, 상세하게는, 95% 이상의 건조물을 포함함을 의미한다.
상기 건조는 예를 들어, 동결 건조, 유동층 건조, 또는 분무 건조에 의한 건조이다.
설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주의 식별
시험 균주로 다뤄지는 시료에서 측정된 단백질의 발현 정도와 대조 시료에서 측정된 목적 단백질의 발현 정도를 비교함으로써, 시험되는 균주가 목적 단백질의 발현의 증가 또는 감소를 유도하는지, 또는 상기 발현에 대한 효과를 가지지 않는지 여부를 결정할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, 결장 내 물의 분비와 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현의 감소 및/또는 결장 내 물의 흡수와 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현의 증가를 유도하는, 상기 발명에 따른 선택 방법에 의해 결정되는 균주는, 설사의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있는 생균제 균주이다.
본 출원의 발명자들은 이러한 생균제 균주가 결장 내 과량으로 존재하는 물의 흡수를 유도할 수 있고, 따라서, 설사의 치료 및/또는 예방에의 적용될 수 있음을 입증하였다 .
“결장 내 물의 분비와 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현의 감소”는 상기 시험 균주의 부재 하에 발현에 대한 상기 수송체의 발현의 상당한 감소를 나타내는 것이다.
이러한 감소의 상기 “상당한” 이라는 특징은 통계 분석에 의해 결정된다.
상기 수송체의 발현에 대한 효과가 면역 조직 화학에 의해 측정될 때, 상기 “수송체의 발현의 감소”는, 시험 균주의 부재 하에 발현에 대한 상기 수송체의 발현에 대응하는 형광 강도/㎛2의 상당한 감소에 대응한다.
“결장 내 물의 흡수와 관련된 적어도 하나의 수송체의 발현의 증가”는 상기 시험 균주의 부재 하에 발현에 대한 상기 수송체의 발현의 상당한 증가를 나타내는 것이다.
이러한 증가의 상기 “상당한” 이라는 특징은 통계 분석에 의해 결정된다.
상기 수송체의 발현에 대한 효과가 면역 조직 화학에 의해 측정될 때, 상기 “수송체의 발현의 증가”는, 시험 균주의 부재 하에 발현에 대한 상기 수송체의 발현에 대응하는 형광 강도/㎛2의 상당한 증가에 대응한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 설사의 치료 및/또는 예방에 유용한 생균제 균주의 식별은, 단지 상기 발명에 따른 하나의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 발명에 따른 방법은 생물학적 시료의 단일 유형, 예를 들어 주어진 동물 모델을 사용하거나, 생물학적 시료들의 다양한 유형, 예를 들어 세포계, 및 적어도 하나의 동물 모델을 사용하여 수행될 수 있다.
그렇지 않으면, 상기 결장 내 물의 흡수에 작용할 수 있는 생균제 균주의 식별은 상기 발명에 따른 선택 방법을 사용하거나, 당업자에 의해 공지된, 일련의 시험 및 임상 시험에 이러한 선택을 보충함으로써 수행될 수 있다.
II. 설사의 치료 및/또는 예방에의 생균제 균주의 사용
본 발명은, 설사의 치료 및/또는 예방에의 사용을 위해, 결장 내 과량으로 존재하는 물의 흡수를 유도할 수 있는 것으로써, 상기 발명에 따른 방법에 의해 식별된 임의의 생균제 균주에 관한 것이다. 상기 발명은 또한, 설사의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품의 제조에 사용하기 위한 생균제 균주에 관한 것이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 상기 생균제 균주는 임의의 미생물의 균주, 특히, 상기에서 언급한 건들과 같은 효모 균주 또는 박테리아 균주가 될 수 있다.
특히, 상기 발명자들은, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주가 결장 내 초과된 물의 흡수에 작용하는 생균제 균주이고, 따라서, 이들이 설사의 치료 및/또는 예방에 유용함을 입증하였다.
이러한 균주는, 위장 점막의 수준에서 면역을 위해 상기 균주를 포함하는 살아있는 보조제를 개시하는, 문서 FR 2 837 835에 기재되어 있다.
상기 발명은 또한, 설사의 치료 및/또는 예방에의 사용을 위한, 상기 발명에 따른 방법에 의해 식별된 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진, 모든 효모 세포들 또는 박테리아 세포들에 관한 것이다.
상기에서 지적한 바와 같이, 상기 균주의 배양 조건은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 당업자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.
특히, 상기 발명은, 설사의 치료 및/또는 예방에의 사용을 위한, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들에 관한 것이다.
상기 “2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들”은, 이하부터는, “CU1 세포들”로 명명한다.
상기 CU1 세포들의 생산은 상기에서 설명한 바와 같이 수행될 수 있다.
설사의 치료 및/또는 예방에 사용되는 상기 CU1 세포들은, 포자형 및/또는 발육형의 세포들이다.
하나의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 CU1 세포들은 대부분 포자형이다.
하나의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 설사의 치료 및/또는 예방에 사용되는 CU1 세포들은 건조 형태이다.
특히 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 설사의 치료 및/또는 예방에 사용되는 CU1 세포들은 대부분 포자형 및 건조 형태이다.
상기 발명은 또한, 임의의 생균제 효모 세포 추출물 또는 생균제 박테리아 세포 추출물과, 생균제 균주의 배양으로부터 얻어지는 임의의 여과액에 관한 것이고, 상기 추출물과 여과액은 CFTR 단백질의 발현의 감소 및/또는 NHE3 단백질의 발현의 증가를 유도하는 능력을 갖고, 따라서, 결장 내 초과된 물의 흡수를 유도할 수 있다.
상기 발명에 따른 설사의 치료 및/또는 예방 방법은, 본원에 기재된 방법에 의해 식별된 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진, 효모 세포들 또는 박테리아 세포들의 유효량의 환자에게의 투여를 포함한다. 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있는 상기 효모 세포들 또는 박테리아 세포들의 유효량은, 의사에 의해 결정될 수 있다. 상기 투여될 정확한 양은, 환자의 나이, 몸무게, 전반 상태, 설사의 특성과 심각성 등에 따라 환자들마다 달라질 수 있다. 상기 투여될 정확한 양은, 또한, 소망하는 치료 효과(즉, 설사의 예방을 위함인지 설사의 치료를 위함인지). 에 따라도 달라질 수 있다.
투여의 경로, 경구 또는 비경구는, 설사의 특성에 따라 및/또는 환자의 나이와 전반 상태에 따라 선택될 수 있다.
설사의 예방의 경우, 상기 발명에 따른 방법에 의해 식별된 생균제 균주의 배양에 의해 얻은 효모 세포들 또는 박테리아 세포들은, 증상이 나타나기 전에 투여된다.
설사의 치료의 경우, 상기 발명에 따른 방법에 의해 식별된 생균제 균주의 배양에 의해 얻은 효모 세포들 또는 박테리아 세포들은, 증상이 나타난 후에 투여된다.
일반적으로, 설사의 급성 형태와 설사의 만성 형태를 포함하는, 설사의 어떤 형태도 상기 발명에 따른 생균제 균주 또는 상기 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들을 사용하여 치료될 수 있다.
“급성 설사”는 증상이 2주 미만으로 지속되는 설사를 의미하고, “만성 설사”는 증상이 적어도 2주 이상 지속되거나, 바람직하게는, 적어도 한달 이상 지속되는 설사를 의미한다.
급성 설사는, 예를 들어, 바이러스성 위장염, 박테리아성 위장염, 및 식중독(예를 들어, 살모넬라증(salmonelloses), 시겔라증(shigelloses), Staphylococcus aureus 감염, Bacillus cereus 감염, Escherichia coli 감염)을 포함한다.
만성 설사는, 예를 들어, 흡수 장애 증후군, 위장병(만성 소화 장애증, 휘플병(Whipple's disease), 크론병(Crohn's disease) 등), 모터 설사(즉, 장내 이동능의 가속화에 따른 설사), 분비성 설사(즉, 소장 및/또는 결장 내 수분-전해질 분비의 가속화에 따른 설사), 삼투성 설사(즉, 위장관에서, 거의 흡수되지 않고 삼투 효과를 발생시키는 용질의 존재로부터 유발되는 설사)를 포함한다.
상기 발명에 따른 생균제 균주 또는 상기 발명에 따른 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들을 사용하여 치료될 수 있는 다른 설사들은, 걱정 또는 긴장감에 따른 설사, 음식 과민증(예를 들어, 소의 우유, 소르비톨(sorbitol), 글루텐(gluten) 등의 유당), 마그네시아 요법, 방사선 요법 또는 화학 요법과 같은 특정 치료, 또는 위절제술 또는 회장 절제술과 같은 특정 형태의 수술에 따른 설사, 위, 장, 결장 등의과부화 또는 자극에 따른 설사, 헤로인과 같은 약물의 중단에 따른 설사, 항생제와 같은 특정 약물에 따른 설사를 포함한다.
상기 발명에 따른 생균제 균주 또는 상기 발명에 따른 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들을 사용하여 치료될 수 있는 설사의 다른 예들은, bilious 공격이나 소화 불량을 동반하는 설사, 특정 완화제 식품류의 과소비에 따른 설사, 및 운동성 설사(runner’s diarrhea) 를 포함한다.
특정의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 발명에 따른 생균제 균주 또는 상기 발명에 따른 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들을 사용하여 치료되는 설사는 항생제의 투여, 또는 더욱 일반적으로는 의약품의 투여에 의해 유도되는 설사가 아니다.
다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 발명에 따른 생균제 균주 또는 상기 발명에 따른 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들을 사용하여 치료되는 설사는 비감염성 근원의 설사가 아니다.
III. 조성물
본 발명은 또한, 설사의 치료 및/또는 예방에의 사용을 위한 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 상기 발명에 따른 적어도 하나의 생균제 균주, 또는 더욱 상세하게는, 상기 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들을 포함한다. 특히, 상기 조성물은, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들의 유효량을 포함한다.
상기 발명에 따른 조성물은 식품 조성물, 식품 보충제, 또는 약제학적 조성물일 수 있다.
상기 식품 조성물은 음식, 음료, 또는 제과의 임의의 유형을 나타낸다.
상기 식품 조성물은, 예를 들어 음료, 시리얼 바, 츄잉 검, 초콜릿, 발효유제품과 같은 유제품, 식물성 근원의 발효 제품일 수 있다.
“식품 보충제”는 일상 식이를 보충하는 목적을 갖는 식품을 의미한다. 식품 보충제는 영양분 또는 영양 또는 생리적 효과를 갖는 다른 물질의, 단독 또는 조합의 농축 소스를 구성한다.
식품 보충제는, 투여 형태, 예컨대, 캡슐(capsule), 캔디형 알약(pastille), 정제(tablet), 환제(pill), 및 이와 유사한 형태, 소량의 단위로 측정되어 섭취되도록 의도된 분말 봉지(sachet of powder), 액체 앰플(ampule of liquid), 점적기가 장착된 병(bottle equipped with a dropper), 및 이와 유사한 액체 또는 분말 조제품과 같은 투여 형태로 판매된다.
상기 발명에 따른 조성물은, 예를 들어, 인체 사용으로 의도된 경우, 1.108 CFU 내지 1.1011 CFU의 양, 바람직하게는, 1.109 CFU 내지 1.1010 CFU 의 양으로 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들의 일용에 적합하다.
상기 발명에 따른 조성물은, 예를 들어, 수의적 용도로 의도된 경우, 1.105 CFU 내지 1.1011 CFU의 양, 바람직하게는, 1.106 CFU 내지 1.1010 CFU 의 양으로 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들의 일용에 적합하다.
용어 CFU는 콜로니 형성 단위(Colony Forming Unit )를 나타낸다.
IV. 약제학적 조성물
장내 유체의 조절에 관련된 수송체에 직접적인 작용 때문에, 상기 발명의 방법에 의해 식별되는 생균제 균주, 또는 더욱 상세하게, 상기 균주의 배양에 의해 얻어지는 효모 세포들 또는 박테리아 세포들은 치료제로서 사용될 수 있다.
이러한 효모 또는 박테리아 세포들은 적어도 하나의 생리적으로 허용 가능한 매개체 또는 부형제의 존재 하에 약제학적 조성물 또는 조제품의 형태와 같은 형태로 투여될 수 있다. 상기 본 발명의 문맥에서, “생리적으로 허용 가능한 매개체 또는 부형제”는 활성 성분(여기서, 상기 효모 또는 박테리아 세포들)의 생물학적 활성의 효능에 지장을 주지 않고, 그것이 투여되는 농도에서 환자 또는 대상에게 과도한 독성이 되지 않는 임의의 매질 또는 첨가제를 의미한다. 생리적으로 허용 가능한 매개체 또는 부형제는 인간 및/또는 동물(특히, 포유 동물)에게 투여하기에 적합한 매개체 또는 부형제일 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 소망하는 치료 효과를 얻기 위해 투여량과 경로의 임의의 효과적인 조합을 사용하여 투여될 수 있다. 투여될 정확한 양은, 환자의 나이, 몸무게, 및 전반 상태, 설사의 특성과 심각성 등에 따라 환자들마다 달라질 수 있다. 상기 투여의 경로(경구 또는 비경구)는, 설사의 특성에 따라, 및/또는 환자의 나이 및/또는 건강에 따라 선택될 수 있다.
예로서, 상기 발명은, 인체 사용으로 의도된 경우, 1.108 CFU 내지 1.1011 CFU의 양, 바람직하게는, 1.109 CFU 내지 1.1010 CFU 의 양으로 상기 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들의 일용을 위한, 상기에서 정의한 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 발명은 또한, 수의적 용도로 의도된 경우, 1.105 CFU 내지 1.1011 CFU의 양, 바람직하게는, 1.106 CFU 내지 1.1010 CFU 의 양으로 생균제 균주의 배양에 의해 얻어진 세포들의 일용을 위한, 상기에서 정의한 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제형은 투여의 경로 및 조성물이 사용되도록 의도된 투여량에 따라 달라질 수 있다. 적어도 하나의 생리학적으로 허용 가능한 매개체 또는 부형제와 배합 후, 상기 발명의 약제학적 조성물은 포유 동물, 특히 인간에 투여하기 위한 적합한 임의의 형태, 예를 들어, 캔디형제, 정제, 당-코팅 환제, 캡슐, 시럽, 연고, 주사 용액, 좌제 등일 수 있다. 당업자는 주어진 제형의 제조를 위한 가장 적합한 매개체 및 부형제를 선택하는 방법을 알고 있다. 그러므로, 예를 들어, 물, 2, 3-부탄디올(2,3-butanediol), 링거액(Ringer solution), 등장 식염 용액(isotonic solutions of sodium chloride), 합성 모노 또는 디글리세리드(synthetic mono- or diglycerides ), 올레산(oleic acid)와 같은 부형제는 주로 주사제의 제형에 사용된다. 에멀젼, 마이크로 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 엘릭서(elixirs) 등을 포함하는 액체 조성물은, 용매, 가용화제, 유화제, 오일, 지방산, 및 현탁제, 방부제, 감미제, 향미제, 점도 조절제, 착색제 등과 같은 다른 첨가제들의 존재 하에 제형화될 수 있다. 경구 경로에 의한 투여를 위한 고체 조성물은, 시트르산 나트륨(sodium citrate)과 같은 불활성 부형제, 및 선택적으로 바인더, 습윤제, 붕괴제, 흡수 촉진제, 윤활제 등과 같은 첨가제의 존재 하에서 제형화될 수 있다.
특정 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 활성 성분 또는 활성 성분들, 특히 생균제 균주의 배양에 의해 얻어지는 효모 세포들 또는 박테리아 세포들의 즉각적인 방출을 위해 제형화된다. 그렇지 않으면, 약제학적 조성물은, 지속적인 또는 표적화된 활성 성분 또는 활성성분들의 방출, 또는 예를 들어, 위산과 효소에 대한, 활성 성분 또는 활성 성분들의 보호를 위해 제형화될 수 있다.
그러므로, pH 및/또는 위효소의 활성에 저항하는 코팅, pH 및/또는 효소 작용에 민감한 코팅, 또는 위 또는 장의 벽에 부착하는 생체접착 코팅을 사용하거나, 캡슐화 시스템을 사용함으로써 가능하다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 더욱이, 적어도 하나의 추가적인 활성 약제학적 성분을 포함할 수 있다(즉, 상기 생균제 균주의 배양에 의해 얻어지는 효모 및 박테리아 세포들에 더하여).
“활성 약제학적 성분”은 투여될 환자 또는 대상의 건강 또는 전반 상태에 치료 효과 또는 유익한 효과를 갖는 임의의 투여 물질 또는 화합물을 의미한다.
그러므로, 활성 약제학적 성분은, 약제학적 조성물의 투여에 의해 예방 또는 치료되기 위한 설사에 대해 활성화될 수 있고; 설사와 관련된 상태 또는 증상(예를 들어, 발열, 구토, 경련성 복통)에 대해 활성화 될 수 있다; 또는, 약제학적 조성물의 활성 성분 또는 활성 성분들의 가용성 및/또는 활동성을 증가시킬 수 있다.
상기 본 발명의 조성물에 존재할 수 있는 활성 약제학적 성분들의 예들은, 제한 없이, 항염증제, 항생제, 해열제, 제토제, 항히스타민제, 비타민, 진경제 등을 포함한다.
하나의 바람직한 예에서, 다른 활성 약제학적 성분은 Bacillus subtilis의 균주 또는 상기 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들이 아니고, 바람직하게는, 박테리아 균주 또는 상기 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들이 아니며, 더욱 바람직하게는, 생균제 균주 또는 상기 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들이 아니다.
본 발명에 따른 상기 약제학적 조성물의 하나의 예는, 오직 약제학적 활성 성분으로서, 상기 생균제 균주의 배양에 의해 얻어지는 효모 또는 박테리아 세포들을 포함하는 조성물이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 발명에 다른 조성물은, 임의의 다른 박테리아 균주를 배제하고, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물은, 임의의 다른 박테리아 또는 효모의 균주를 배제하고, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물은, 오직 약제학적 활성 성분으로서, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들을 포함한다
그것들이 다르게 정의되지 않는다면, 상기 설명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 전문가에 의해 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 더욱이, 여기에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 모든 특허 및 모든 다른 참고 문헌은 참조로서 합체된다.
<실시예들>
하기 실시예들은 본 발명의 몇가지 예들을 기재한다. 그러나, 이러한 예들은 오직 실례들을 보여주는 목적일 뿐, 발명의 범위를 한정하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1: 설사의 예방 및/또는 치료를 위해 의도된 생균제 균주의 선택
재료 및 방법
시험된 생균제 균주
시험된 균주는 다음과 같다:
Lactobacillus plantarum의 균주 및 Bacillus subtilis CU1의 균주.
Bacillus subtilis CU1 의 세포(이하부터는 CU1이라 명명한다)는 포자형 및 건조 형태가 사용된다.
Lactobacillus plantarum (hereinafter LR)의 세포는 동결 건조된, 발육형이 사용된다.
CFTR 및 NHE3의 발현에 대한 생균제 균주의 효과의 측정
4마리의 생쥐는 2주동안, 각각 109 CFU / 일씩 CU1으로 처리되었다.
4마리의 생쥐는 2주동안, 각각 109 CFU / 일씩 LR으로 처리되었다.
CU1으로 처리되지 않은 4마리의 생쥐가 대조군으로 사용되었다.
이하에서 설명하는 바와 같이, CFTR 및 NHE3의 발현은, CU1으로 처리된 생쥐들과 대조군의 생쥐들로부터 얻어진 결장 세포에 대해 면역 조직 화학으로 측정하였다.
생쥐들의 희생 후 즉시, 근위 결장의 시료들(1 cm 길이)은 0.9% NaCl 용액으로 세척되었고, 포름알데하이드(formaldehyde)(6시간) 4%의 완충 용액에 고정되었으며, 4℃에서 30%의 수크로오즈(sucrose) 용액에 24시간동안 침지되었다.
시료들은 Tissue Teck 배치(Euromedex, Souffelweyersheim, 프랑스)에 고정되고, -45℃에 이소 펜탄에서 동결되었다. 냉동 절편은 먼저 아세톤에서 고정되고(10 분, -20℃), 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)- 우유 용액(milk solution)으로 수화되었다. 차단 용액(blocking solution)(0.1%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin. BSA)을 함유하는 트리톤 X-100 0.25 %을 포함하는 PBS)에서 배양 후, 상기 절편들은 밤새도록 4℃에서 토끼 항-생쥐 CFTR(rabbit anti-mouse CFTR)(1/100), 항-생쥐 NHE3(anti-mouse NHE3)(1-200), 또는 항-생쥐 TLR4(anti-mouse TLR4)(1/100) 다클론성 항체(Abcam, Cambridge, 영국)로 배양되었다. 그런 다음, 상기 절편들은 1시간 동안 상온에서 FITC-표지 당나귀 항-토끼(FITC-labeled donkey anti-rabbit) 항체(1/2000, Uptima, Montlucon, 프랑스)로 배양되었다. 그리고, 상기 절편들은 "Vectashield HardSet 장착 배지"(Abcys, Les Ulis, 프랑스)에 장착되었고, 니콘 90i 형광 현미경 (Nikon, Champigny-sur-Marne, 프랑스) 하에서 조사되었다. 면역 표지의 형광 강도/㎛2는 Nis-Elements Ar software (Nikon)로 측정되었다. 상기 분석은 4마리의 생쥐군으로부터의 5개의 절편에 대해 수행되었다.
결과
시험된 생균제 균주 사이에서, 오직 Bacillus subtilis의 CU1 균주만이 결장 점막을 통한 물의 이동에 관련된 CFTR 및 NHE3 2개의 수송체의 발현에 대해 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 사실, 도 1에서 보는 바와 같이, 2주동안 Bacillus subtilis CU1의 균주로의 생쥐들의 치료는 건강한 생쥐들의 결장 내에서 결장 세포의 첨극에 대해 CFTR의 발현을 상당히 감소시켰다. 도 2에서 보는 바와 같이, 2주동안 Bacillus subtilis CU1의 균주로의 생쥐들의 치료는 건강한 생쥐들의 결장 내에서 결장 세포의 첨극에 대해 NHE3의 발현을 상당히 증가시켰다.
반면에, 도 3 및 4에서 보는 바와 같이, L. plantarum 의 균주로의 치료는 CFTR 또는 NHE3의 발현을 상당히 변화시키지는 않았다.
실시예 2: 설사의 예방 및/또는 치료에서 생균제 균주 CU1의 사용
재료 및 방법
LPS-유도된 설사의 모델
109 CFU/일/동물 만큼의 평가될 생균제 균주가 14일 동안 수컷 DBA/2 생쥐들에게 위내 경로를 통해 투여되었다.
대조군의 생쥐들(12 마리의 생쥐들)은 정맥내로 200 L의 물을 투여 받았고, 시험군의 생쥐들(12마리의 생쥐들)은, 설사를 유발시키기 위해, 정맥내로 15 mg/kg 양의 Salmonella enteriditis (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France)의 리포다당류(lopopolysaccharide, LPS) 를 투여 받았다. 상기 생쥐들은, LPS의 주입 후에, 120분 동안 매 30 분마다 대변의 수집이 가능하도록 알루미늄 시트로 덮여진 바닥을 갖는 개별 케이지들(cages)에 배치되었다. 상기 수집된 대변 물질을 칭량하고, 100℃에서 24시간 동안 열을 가한 후, 다시 칭량하였다. (가열 전)대변 물질의 습윤 중량과 건조 중량 사이의 차이는, 물의 배출에 대응한다. 상기 설사는 LPS 투여 후 물의 총 배출과 관련하여 평가되었다.
피마자유에 의해 유도된 설사의 모델
109 CFU/일/동물 만큼의 평가될 생균제 균주가 14일 동안 수컷 NMRI 생쥐들에게 위내 경로로 투여되었다.
대조군의 생쥐들(12 마리의 생쥐들)은 위내 경로로 200 L의 물을 투여 받았다. 설사를 유발시키기 위해, 200 ㎕의 피마자유(Sigma)가, “시험”군의 수컷 NMRI 생쥐들(12마리의 생쥐들)에게 위내 경로로 투여되었다. 상기 생쥐들은, 피마자유의 주입 후에, 180분 동안 매 30 분마다 대변의 수집이 가능하도록 알루미늄 시트로 덮여진 바닥을 갖는 개별 케이지들(cages)에 배치되었다. 상기 수집된 대변 물질을 칭량하고, 100℃에서 24시간 동안 열을 가한 후, 다시 칭량하였다. (가열 전)대변 물질의 습윤 중량과 건조 중량 사이의 차이는, 물의 배출에 대응한다. 상기 설사는 피마자유의 투여 후 물의 총 배출과 관련하여 평가되었다.
항생제에 의해 유도된 설사의 모델
항생제에 의해 유도된 동물 모델은 감소된 수의 항생제들(Chen et al., 2008, Gastroenterology, 135(6): 1984-92에 근거)을 사용하여 준비하였다. 항생제의 투여는 미생물의 부조화(불균형)뿐 아니라, 면역 반응과 생쥐 위의 점액-생성 세포의 수의 변화를 유도한다. 항생제 치료는 특히, Clostridium difficile의 발생을 유도할 수 있다.
CU1 균주로의 예방적 치료는, 5 마리의 생쥐 그룹에 14일 및 18일 동안 109 CFU/일/동물의 비율로 이 모델에 시험되었다. CU1 균주의 투여 7일 후, 5가지 항생제의 혼합물을 3일 동안 마시는 물에 투여하였고, 그 다음 날에, 항생제로 처리된 생쥐들은 클린다마이신(clindamycin )의 복강 내 주사를 맞았다. 상기 치료의 효과는 실험을 시작한지 14일과 18일에 관찰되었다. 상기 CU1의 균주로 처리된 생쥐들은 시험 내내 상기 균주를 받았다.
결과
상기 Bacillus subtilis CU1의 균주는 생쥐들에게 다양한 모델의 설사로 시험되었다.
Bacillus subtilis CU1의 균주의 항-설사 특성
도 4 및 5에서 보는 바와 같이, CU1 균주는 LPS(도 5) 및 피마자유(도 6)에 의해 유도된 설사를 상당히 방지하는 것으로 확인되었다.
사실, CU1 세포의 투여는 LPS의 투여 후 처음 1 시간 동안 대변에서 배출되는 물을 상당히 감소시켰다(4가지 시험들에서, 그 감소는 35%, 38%, 36% 및 40%였다).
CU1 세포의 투여는 피마자유에 의해 유도된 설사의 모델에서 처음 2 시간 동안 대변에서 배출되는 물을 상당히 감소시켰다(3가지 시험들에서, 그 감소는 63%, 46%, 44%였다).
상기 CU1 균주는 도한, 항생제의 투여에 의해 유도된 설사에 예방적인 효과를 가졌다. 이러한 효과는 CU1 세포로의 예방적 치료 후에 관찰되었다: 상기 생쥐들은 장내 미생물의 표준화와 대식세포에서 및 장 점막의 점액-생성 세포의 수준에서 항생제에 의해 유발된 변화의 향상을 보여주었다.
로페라마이드(loperamide)의 효과와의 비교
15일 동안 CU1 균주로의 예방적 치료는, 설사 하기 1시간 전에 경구 경로로 단일 복용량(1 mg/kg)으로 투여된 기준 항설사 분자인 로페라마이드와 같은 효과로, LPS 또는 피마자유에 의해 유도된 설사를 감소시키는 것으로 확인되었다. 로페라마이드는 LPS(CU1에 대해 40%) 이후 물의 대변 배출에서 50%, 및 피마자유(CU1에 대해 60%) 이후 60%의 감소를 나타냈다.
결론
생체 내에서, 균주 Bacillus subtilis CU1는 유체 과잉 조건에서 결장의 흡수 능력을 향상시킬 수 있다.
추가적인 연구는, 균주 Bacillus subtilis CU1은,
- 피마자유 모델 및 LPS 모델에서 소장의 분비/흡수 능력에 대한 효과를 갖지 않고,
- 피마자유에 의해 유도된 것은 그렇지 아니하나, 결장의 벽의 수준에서 LPS에 의해 유도된 세포간 투과성의 증가를 상쇄하며,
- 피마자유에 의해 유도된 (기준 상황이 아님) 완화된 설사의 상황에서 물의 흡수를 위한 결장의 능력의 강화를 시사하는, 결장의 벽의 수준에서 피마자유에 의해 유도된 단락 전류를 감소시킨다는 것을,
을 보여주었다.
상기 균주 Bacillus subtilis CU1와 이러한 균주의 배양에 의해 얻어지는 세포들은, 그러므로, 어떠한 유형의 설사에도 치료 및/또는 예방에 유용하다.
<미생물 기탁증>
Figure 112015057052155-pct00001
Figure 112015057052155-pct00002
Figure 112020052620146-pct00003
Figure 112015057052155-pct00004
Figure 112015057052155-pct00005
Figure 112015057052155-pct00006
CNCM(National Collection of Cultures of Microorganisms) CNCMI-2745 20011025

Claims (16)

  1. 설사의 치료 또는 예방을 위한 Bacillus subtilis의 생균제 균주(probiotic strain)를 선택하는 방법으로서,
    - CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) 단백질의 발현에 대한 Bacillus subtilis의 적어도 하나의 시험 균주의 효과를 측정하는 과정; 및
    - CFTR 단백질 발현의 감소를 유도하는 Bacillus subtilis의 적어도 하나의 균주를 선택하는 과정;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 선택 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은,
    - NHE3 (Sodium Hydrogen Exchanger 3) 단백질의 발현에 대한 Bacillus subtilis의 적어도 하나의 시험 균주의 효과를 측정하는 과정; 및
    - NHE3 단백질 발현의 증가를 유도하는 Bacillus subtilis의 적어도 하나의 균주를 선택하는 과정;
    을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 선택 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 CFTR 단백질 또는 NHE3 단백질의 발현은, 전기 영동(electrophoresis), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역 검정(immunoassay), 면역 조직 화학(immunohistochemistry), 면역 세포 화학(immunocytochemistry), 질량 분석(mass spectrometry), RT-PCR 또는 노던 블롯(Northern blot)에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 선택 방법.
  6. 설사의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것으로, 2001년 10월 25일자로 CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms)에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주인 것을 특징으로 하는 생균제 균주.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 설사는 급성 설사 또는 만성 설사인 것을 특징으로 하는 생균제 균주.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 설사는 감염성 근원 또는 비감염성 근원의 설사인 것을 특징으로 하는 생균제 균주.
  11. 설사의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것으로, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어진 것을 특징으로 하는 생균제 세포들(cells).
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 설사는 급성 설사 또는 만성 설사인 것을 특징으로 하는 생균제 세포들.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 설사는 감염성 근원의 설사 또는 비감염성 근원의 설사인 것을 특징으로 하는 생균제 세포들.
  14. 설사의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것으로, 2001년 10월 25일자로 CNCM에 번호 I-2745로 기탁되어 있는 Bacillus subtilis CU1의 균주의 배양에 의해 얻어진 생균제 세포들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 설사는 급성 설사 또는 만성 설사인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 설사는 감염성 근원의 설사 또는 비감염성 근원의 설사인 것을 특징으로 하는 조성물.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3007655B1 (fr) * 2013-06-28 2016-12-23 Lesaffre & Cie Souche bacillus subtilis pour le traitement et/ou la prevention de maladies inflammatoires chroniques
EP3464558A1 (en) * 2016-05-31 2019-04-10 Evonik Degussa GmbH Bacillus subtilis
US11173184B2 (en) 2016-05-31 2021-11-16 Evonik Operations Gmbh Bacillus subtilis strain with probiotic activity
CN113462597A (zh) * 2021-06-29 2021-10-01 广西壮族自治区兽医研究所 一种产木质素过氧化物酶的枯草芽孢杆菌和含有该枯草芽孢杆菌的菌剂及其应用
CN114947134B (zh) * 2022-05-06 2024-01-26 河北一然生物科技股份有限公司 嗜热链球菌s131在改善肠道健康及调节肠道菌群中的应用
CN116463258B (zh) * 2023-04-12 2024-01-09 山东威曼宠物食品有限公司 一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27及菌剂、制备方法和应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2528055B2 (ja) * 1991-10-04 1996-08-28 カルピス食品工業株式会社 鳥類飼料添加用腸内サルモネラ属細菌減少剤及びその使用法
JP2837835B2 (ja) * 1996-05-15 1998-12-16 オリンパス光学工業株式会社 射出成形機における金型要素自動交換方法
FR2837835B1 (fr) 2002-03-29 2007-06-22 Maria Urdaci Souche bacillus subtilis cu1, son utilisation comme agent immunomodulateur du systeme immunitaire et vaccin recombinant vivant contre h. pylori la contenant
JP4977319B2 (ja) 2002-09-30 2012-07-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子蛋白質阻害薬およびその使用方法
RU2246537C2 (ru) * 2002-11-11 2005-02-20 Закрытое акционерное общество "КУЛ" Штамм бактерий bacillus subtilis, используемый для получения пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных, птицы и рыбы
US20080057047A1 (en) 2005-11-29 2008-03-06 Benedikt Sas Use of bacillus amyloliquefaciens PB6 for the prophylaxis or treatment of gastrointestinal and immuno-related diseases
JP4805859B2 (ja) * 2007-02-02 2011-11-02 全国農業協同組合連合会 飼料添加剤
JP2009044971A (ja) * 2007-08-15 2009-03-05 National Agriculture & Food Research Organization 反芻家畜に対するプロバイオティック効果をサイレージ調製用乳酸菌に付加する新規酵母菌およびその利用
KR20100134063A (ko) * 2008-03-25 2010-12-22 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 낭포성 섬유증 막투과 전도성 조절자의 수용성 소분자 억제제
WO2010033626A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising imidazole and triazole derivatives
WO2010088630A2 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Chromocell Corporation Cell lines expressing cftr and methods of using them
JP5769333B2 (ja) * 2010-07-09 2015-08-26 雪印種苗株式会社 セロトニン代謝性バチルス属菌
CN102732464A (zh) * 2012-06-29 2012-10-17 扬州大学 一种用于快速初步筛选具有免疫调节功能益生菌的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Raheja et al., American journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, Vol. 298, 2010, G395-G401.
S.Lin et al., Gastroenterology, Vol. 138, No. 2, 2010, pp. 649-658.
Singh et al., American Journal of Physiology Gastrointest Liver Physiology, 303, (2012.10.18.), pp. G1393-G1401.*
프랑스특허공개공보 제2837835호(2003.10.03.) 1부.*

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