TWI602921B - 用於治療及／或預防腹瀉的益生菌菌株 - Google Patents

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Description

用於治療及/或預防腹瀉的益生菌菌株 〔本專利申請案之母案〕
本專利申請案主張2012年12月12日提交之法國專利申請案第FR 12 61916號之優先權。該法國專利申請案之全部內容以引用方式被納入本文。
本發明關於用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株，尤其是芽孢桿菌之益生菌菌株的領域。本發明亦關於選擇具有作用於結腸中之水分吸收的特殊特性之益生菌菌株的方法。
當正常運作時，人體結腸吸收約99%之進入其內腔的水分(代表約每天2升水)。結腸具有額外吸收多達4升水之能力。然而，每天超過6升水時，其吸收能力達到飽和而發展出腹瀉。
腹瀉為常見的問題(全球每年約20億個病例)，其特徵為較平常大量且頻繁(每天排便多於3次)之水狀或 軟便。在極端情況下，每天可損失超過20升之流體。
腹瀉不是疾病，而是一種症狀。其最常見的原因是攝入受污染的水分或食物；在這種情況下，其持續一、兩天，而無需治療。然而，腹瀉本身可引起可能致命之脫水，尤其是在嬰兒中，當體重減少超過10%時需送院急診。根據世界衛生組織，腹瀉是第三世界國家中嬰兒致死原因中第二常見的，且5歲以下兒童之死亡病例中有18%係由其造成。(Bryce et al.,Lancet,2005,365：1147-1152)。
由腹瀉引起之脫水係在損失的流體未被補償時發生。在正常情況中，水分係在結腸中從糞便移除。包含在攝入物中之水分被再吸收的現象係在結腸細胞的層級中發生，其經由組合水分及電解質之主動和被動運輸進行。在結腸上皮之內陷隱窩的層級中，水分從血液分泌到外部環境中。在健康良好的人體中，這兩種現象彼此互補，因而能保持大便適度含水，從而促進腸道轉運並改善分子循環的條件。
腹瀉有許多可能的原因，包括由病毒、細菌或寄生性病原體引起之傳染性起源腹瀉及非傳染性腹瀉，諸如由食物不耐性、脂肪飲食、酒精、心理因素、投服醫藥產品、投服治療程序引起之腹瀉、與疾病或臨床病況相關之腹瀉、或與停藥相關之腹瀉。
根據症狀之持續時間可區分急性腹瀉及慢性腹瀉，其症狀分別持續不到兩週及至少兩週。
用於治療腹瀉的典型藥物為，例如洛哌丁胺(loperamide)，其經由刺激水分和電解質吸收，及減緩通過時間來作用。然而，通過時間減緩在沙門氏菌、志賀氏菌或困難梭狀芽孢桿菌型之嚴重傳染中可能會產生問題，因為該病原菌長時間保持在腸道內。
益生菌提供治療及/或預防腹瀉之引人關注的替換選擇。最常用於此適應症之益生菌為乳酸菌。因此，該益生菌通常被描述為具有有於免疫系統及腸道菌群平衡之作用。
其他研究試圖鑑定用於治療或預防腹瀉的新標的。因此，文件WO 2004/028480描述用於降低藉由CFTR蛋白(囊性纖維化跨膜轉導調節因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator))轉運氯離子之效率的噻唑烷酮型化合物及其於治療分泌型腹瀉的用途。Bradford等人(Am.J.Physiol.Gastrointes.Liver Physiol.,2009,296：G886-G898)已檢驗用於治療罹患膠稠性黏液病(mucoviscidosis)(其中CFTR之表現改變)之患者的腸阻塞及脫水的方法。
此外，據描述，在患有膠稠性黏液病之小鼠中部分或完全喪失NHE3蛋白(鈉氫交換體3)會降低腸阻塞的發病率，特別明顯的為腸道流動性增加，因而歸結出NHE3為調節罹患膠稠性黏液病且其CFTR之表現改變的患者之腸道流動性的潛在標的。
因此，用於治療及/或預防腹瀉之新策略仍然是有需 要的。
一般而言，本發明係基於發現某些益生菌菌株能夠以完全新穎的方式經由誘導存在於結腸中之過量水分被吸收而直接作用在腹瀉上。令人驚訝且出乎意料的是，本案發明人證明某些益生菌菌株能夠抑制涉及結腸中水分分泌之轉運體(transporter)的表現及/或刺激涉及結腸中水分吸收之轉運體的表現，因而可用於治療及/或預防腹瀉。
因此，這些益生菌菌株以相當新穎之方式，不作為轉運體之抑制劑(即，不經由結合轉運體來作用)從而阻礙其功能，而是作用在轉運體之表現，而藉此作用在轉運體之存在數量。
再者，由於這些益生菌菌株係直接作用在結腸中過量存在之水分的吸收，其具有用於預防及/或治療任何類型之腹瀉的優勢，尤其是無論該腹瀉是否為傳染性或非傳染性起源，以及有無菌叢失衡(dysbiosis)存在。
因此，本發明關於選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，該方法包含以下步驟：-測量至少一種測試菌株對至少一種涉及結腸中水分之吸收或分泌的轉運體的表現之影響，及-選擇至少一種引起至少一種涉及結腸中水分之分泌的轉運體之表現減少及/或至少一種涉及結腸中水分之吸收的轉運體之表現增加之菌株。
更具體地說，於第一態樣中，本發明關於選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，該方法包含以下步驟：-測量至少一種測試菌株對CFTR蛋白(囊性纖維化跨膜轉導調節因子)之表現及/或NHE3蛋白(鈉氫交換體3)之表現的影響，及-選擇至少一種引起CFTR蛋白之表現減少及/或NHE3蛋白之表現增加的菌株。
於某些實施態樣中，該測試菌株為酵母菌株或細菌菌株。尤其是，欲測試之細菌菌株可為芽孢桿菌菌株，較佳為枯草芽孢桿菌菌株。
於某些實施態樣中，該CFTR蛋白及/或NHE3蛋白之表現係藉由以下技術測量：電泳、西方印漬、免疫分析法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法、質譜分析法、RT-PCR或北方印漬。
於另一態樣中，本發明關於使用根據本發明方法所選擇之用於治療及/或預防腹瀉的益生菌菌株。
於某些實施態樣中，該益生菌菌株為枯草芽孢桿菌菌株，較佳為於2001年10月25日寄存在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes/國家微生物菌種保藏中心，25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15)，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1。
於一附屬態樣中，本發明關於經由培養根據本發明方 法選擇之益生菌菌株所取得之用於治療及/或預防腹瀉的細胞。
尤其是，本發明關於經由培養於2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1所取得之用於治療及/或預防腹瀉的枯草芽孢桿菌細胞。
本發明亦關於治療及/或預防患者之腹瀉的方法，其包含投予該患者有效量之經由培養根據本發明方法選擇之益生菌菌株所取得的細胞。
於某些實施態樣中，該治療及/或預防腹瀉的方法包含投服經由培養枯草芽孢桿菌之益生菌菌株所取得之枯草芽孢桿菌細胞，較佳為該於2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1。
於另一態樣中，本發明關於用於治療及/或預防腹瀉之組成物，該組成物包含至少一種根據本發明之益生菌菌株，或經由培養該菌株所取得之細胞。尤其是，該組成物包含經由培養該於2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1所取得之枯草芽孢桿菌細胞。
可根據本發明預防性及/或治療性治療之腹瀉形式包括急性腹瀉及慢性腹瀉。
於某些實施態樣中，根據本發明治療之腹瀉為由病毒、細菌或寄生性病原體引起之傳染性起源之腹瀉。
於其他實施態樣中，根據本發明治療之腹瀉為非傳染 性起源之腹瀉。
非傳染性起源之腹瀉為，例如由食品不耐受引起的腹瀉、由脂肪飲食引起的腹瀉、由酒精引起之腹瀉、由心理因素引起之腹瀉、由投服醫藥產品引起之腹瀉、由投服治療程序引起之腹瀉、與疾病或臨床病況相關之腹瀉、或與停藥相關之腹瀉。
本發明之某些較佳實施態樣的更詳細描述列於下文中。
發明之詳細說明
如上文所述，本發明關於鑑別能經由直接作用在涉及調控腸液之轉運體層級而作用在結腸中之水分吸收的益生菌菌株，及彼等於作為治療及/或預防腹瀉之醫藥產品的用途。
I.選擇益生菌菌株之方法
根據本發明之選擇方法具有鑑別可用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的目標。
因此，本發明關於選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，該方法包括以下步驟：-測量至少一種測試菌株對至少一種涉及結腸中水分吸收或水分分泌之轉運體的表現之影響，及-選擇至少一種引起至少一種涉及結腸中水分分泌之轉運體的表現減少及/或至少一種涉及結腸中水分吸收之 轉運體的表現增加之菌株。
涉及結腸中水分分泌之轉運體的實例為CFTR蛋白(囊性纖維化跨膜轉導調節因子)。
涉及結腸中水分吸收之轉運體的實例為NHE3蛋白(鈉氫交換體3)。
根據本發明之較佳方法的特徵在於它包含以下步驟：-測量至少一種測試菌株對CFTR蛋白之表現及/或NHE3蛋白之表現的影響，及-選擇至少一種引起CFTR蛋白之表現減少及/或NHE3蛋白之表現增加的菌株。
因此，由本發明之方法選出之菌株為可用於治療及/或預防腹瀉的益生菌菌株。
本文中之“益生菌菌株”欲指能對宿主健康發揮有益效果之活微生物菌株。
宿主通常是人，但可以想見的是，該宿主可為另一種哺乳動物，例如狗、貓、反芻動物，尤其是綿羊、山羊、犢牛、乳牛、鹿科動物、駱駝科動物、馬科動物、舊大陸豬(Old-World swine)，尤其是豬和小豬、兔科動物、鼠科動物、及豚鼠科族之囓齒動物。
測試菌株
欲使用本發明方法測試之菌株可為任何微生物菌株。
於某些實施態樣中，該測試菌株為酵母菌株。在可測試之酵母菌中，可提出的有，例如酵母屬之酵母菌，尤其 是布拉酵母菌種(Saccharomyces boulardii)、釀酒酵母菌種(Saccharomyces cerevisiae)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)之酵母菌，尤其是馬克斯克魯維菌種(Kluyveromyces marxianus)。
於其他實施態樣中，該欲測試菌株為細菌菌株。
較佳地，該測試菌株係選自被認為對人及/或動物無害的細菌。
在可測試之細菌中，可提出的有，例如雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬之細菌，尤其是動物雙歧桿(Bifidobacterium animalis)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、及短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)種；乳桿菌(Lactobacillus)屬之細菌，尤其是羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)及唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)種；魏斯氏菌屬(Weisella)之細菌，尤其是 食物魏斯氏菌(Weisella cibaria)、泡菜魏斯氏菌(Weisella kimchii)、泰國魏斯氏菌(Weisella thailandensis)菌種；芽孢桿菌(Bacillus)屬之細菌，尤其是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)及克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)種；乳球菌(Lactococcus)屬之細菌，尤其是乳酸乳球菌種(Lactococcus lactis)；腸球菌(Enterococcus)屬之細菌，尤其是屎腸球菌(Enterococcus faecium)、糞腸球菌(Enterococcus fecalis)種；鏈球菌(Streptococcus)屬之細菌，尤其是嗜熱鏈球菌種(Streptococcus thermophilus)；埃希氏桿菌(Escherichia)屬之細菌，尤其是大腸桿菌種。
CFTR及/或NHE3之表現
根據本發明之方法包含測量該測試菌株對至少一種涉及結腸中水分吸收或分泌的轉運體之表現，尤其是對CFTR蛋白及/或NHE3蛋白之表現的影響。
如本文所使用之“CFTR蛋白”意指在人物種中由基因CFTR(指“囊性纖維化跨膜轉導調節因子”)編碼之蛋白質，該基因CFTR係位於7號染色體長臂之q31.2區中的位點7931.2上。CFTR基因在物種中被高度保留。在人 中，該CFTR蛋白具有，例如長度為1480個胺基酸之多肽序列(GenBank登錄編號為NP_00483)。
CFTR蛋白形成上皮細胞之可令氯離子及硫氰酸根離子滲透通過的通道。
CFTR蛋白表現在胰腺和膽管、腸隱窩、氣管支氣管樹、腎小管、生殖系統、及汗腺之上皮細胞的頂極。
現已證明，CFTR之抑制劑，諸如噻唑烷酮被發現可用於治療及/或預防腹瀉(Verkman et al.,Curr.Pharm.Des.,2006,12：2235-2247)。
因此，在根據本發明之選擇方法中，可引起CFTR蛋白之表現減少的測試菌株可用於治療及/或預防腹瀉。
如本文所使用之“NHE3蛋白”意指在人物種中由NHE3基因(指“鈉-氫交換體3”，亦稱為SLC9A3(指“溶質載體家族9成員3”))編碼之蛋白質，該NHE3基因係位於13號染色體上。在人中，該NHE3蛋白具有例如長度為834個胺基酸之多肽序列(GenBank登錄編號NP_004165)。
NHE3蛋白係表現在腎臟之腎元及腸內皮細胞之頂膜中，其主要負責維持鈉平衡。
經基因改造以將NHE3基因滅活之小鼠已被證明苦於腹瀉(Schultheis et al.,1998,Nat.Genet 19：282-285)。
因此，在根據本發明之選擇方法中，可引起NHE3蛋白之表現增加的測試菌株可用於治療及/或預防腹瀉。
在本發明之背景下，測量試菌株對涉及結腸中水分之吸收或分泌的轉運體之表現的影響(尤其是對CFTR蛋白及/或NHE3蛋白之表現的影響)可使用熟習本技藝之人士已知的任何方法進行(參見，例如Harlow及Lane“Antibodies：A Laboratory Manual”，1988年，紐約冷泉港，冷泉港實驗室)，因為所使用之方法的性質並非關鍵或限制要素。
一般而言，蛋白質之表現量可藉由直接方法測定，諸如藉由電泳法、西方印漬法、免疫分析法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法、或質譜分析法。
另外，亦可藉由間接方法測定蛋白質之表現量。
間接方法可包含：測量對應基因之轉錄量，例如藉由RT-PCR(逆轉錄，隨後進行聚合酶鏈反應)測量，較佳為藉由定量性RT-PCR、或藉由北方印漬法測量。
間接方法之另一實例為包含測量蛋白質活性之方法，該蛋白質之活性與功能性蛋白之存在量相關聯。
於某些較佳之實施態樣中，該轉運體(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之表現量係藉由電泳法測定。
電泳可將蛋白質根據其分子量分開。通常係使用在含有月桂基硫酸鈉之聚丙烯醯胺凝膠上執行的電泳(稱為SDS-PAGE，指硫酸月桂酯鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)。其亦可為二維電泳，諸如等電聚焦法，其可藉由此等電聚焦法來將蛋白質根據其分子量及其等電點分開。
於本發明之某些實施態樣中係藉由西方印漬測定該轉 運體(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之表現量。
西方印漬(亦稱為西方技術)包含藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白質，然後將該蛋白質從聚丙烯醯胺凝膠轉移至支撐膜，在此支撐膜上使用對該蛋白質具專一性之經標示的抗體偵測所欲之蛋白質。
於某些較佳之實施態樣中係藉由免疫分析法測定該轉運體(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之表現量。如本文所使用之“免疫分析法”係指使用抗原-抗體反應偵測及定量抗原、抗體或類似物質之任何技術。抗體-抗原複合物可以數種方式被可視化。於大多數情況中係將抗體與可催化產色反應(例如免疫過氧化物酶染色)之酶(例如過氧化物酶)共軛結合。或者，可以螢光團(例如FITC、羅丹明(Rhodamine)、德州紅或Alexa Fluor)標定該抗體。然後，藉由免疫螢光法偵測該抗體-抗原複合物。
對人CFTR蛋白及人NHE3蛋白具專一性之單株抗體為本技藝所已知且可從市場上購得。
於本發明之某些實施態樣中係藉由免疫組織化學法測定該轉運體(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之表現量。術語“免疫組織化學法”係指以使用用於定位組織中之蛋白質的抗體為基礎的方法。一般而言，係將組織固定、洗滌，再可滲透化。然後，將該組織與專一辨識所欲蛋白(此處為，例如CFTR蛋白或NHE3蛋白)之初級抗體一起培育。添加與偵測系統偶聯之二級抗體。該偵測系統 為，例如螢光染料或酶，當將其置於存有受質之環境中會導致產色反應。此二級抗體識別初級抗體之恆定部分Fc且必須源自與初級抗體之物種不同的其他物種。封固在保護該樣本之螢光的基質中(若偵測系統為一種螢光染料)後，或在受質之存在下(若偵測系統為一種酶)，使用螢光或共聚焦顯微鏡分析組織。然後，可藉由密度測定法、測量螢光強度或分光光度法來測定所欲蛋白質之表現量。
於本發明之某些實施態樣中係藉由免疫細胞化學法測定該轉運體(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之表現量。
免疫細胞化學法為類似於免疫組織化學法之技術，不同之處在於該起始樣本為細胞學製備物，而非組織。
於本發明之某些實施態樣中係藉由質譜分析法測定該轉運體(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之表現量。
於本發明之某些實施態樣中係藉由RT-PCR測定該轉運體(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之表現量。
RT-PCR法包含將RNA逆轉錄成cDNA，隨後進行聚合酶鏈反應(PCR)。較佳地，RT-PCR為定量性RT-PCR，其使定量對應於所欲蛋白質之初始RNA成為可行。
於本發明之某些實施態樣中係藉由北方印漬測定該轉運體(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之表現量。
北方印漬(亦稱為北方轉移)這項技術包含藉由凝膠電泳法根據RNA之尺寸分離RNA，然後將RNA從凝膠轉 移至膜上，在此可以特異於該欲定量之蛋白質的RNA之經標示的雜交探針偵測該RNA。
生物樣本
根據本發明之一種方法包含測量該測試菌株對生物樣本中至少一種涉及結腸中水分吸收或分泌之轉運體的表現(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白之表現)的影響。
如本文所使用之術語“生物樣本”係以其最廣泛的意義使用。生物樣本可為其中表現出所欲蛋白質(尤其是CFTR蛋白或NHE3蛋白)，且因此可以被偵測及定量的任何生物組織。
當應用根據本發明之選擇方法時可以使用的生物樣本可為，例如來自腸、胰管、膽管、腎小管、氣管支氣管樹、生殖系統、汗腺及腎臟之腎元的樣本。
於某些較佳之實施態樣中，該生物樣本為來自腸之樣本，較佳為來自結腸之樣本。
較佳地，組織樣本係藉由，例如活組織檢查取自模式動物。較佳地，該模式動物為哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔子、豬、雞、猴子。該模式動物可為基因轉殖動物。
根據本發明之較佳的生物樣本為包含結腸細胞，即來自結腸黏膜之細胞的組織樣本。
該生物樣本亦可為源自表現所欲蛋白質之組織的生物物質。
該衍生之生物物質為，例如選自從組織樣本分離出之細胞或選自從組織樣本分離出之細胞中萃取出之蛋白質。
術語“生物樣本”亦包括已知可表現所欲蛋白質，尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白之細胞株的細胞。
表現CFTR蛋白之細胞株的實例包括從結腸分離出之Caco-2細胞、從結腸分離出之HT-29細胞或從結腸分離出之T84細胞。
表現NHE3蛋白之細胞株的實例包括從結腸分離出之Caco-2細胞、從結腸分離出之HT-29細胞或從結腸分離出之T84細胞。
這些細胞株可從，例如ATCC(美國菌種保存中心)購得。
於某些實施態樣中，該生物樣本為從表現所欲蛋白質(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白)之細胞或組織中分離出的蛋白質萃取物。該萃取蛋白質之方法為熟習本技藝之人士所周知者(參見，例如"Protein Methods",D.M.Bollag et al.,2nd Ed.,1996,Wiley-Liss；"Protein Purification Methods：A Practical Approach",E.L.Harris and S.Angal(Eds.),1989；"Protein Purification Techniques：A Practical Approach",S.Roe,2nd Ed.,2001,Oxford University Press；"Principles and Reactions of Protein Extraction,Purification,and Characterization",H.Ahmed,2005,CRC Press：Boca Raton,FL)。亦有用於從組織或從生物體液中萃取蛋白質之套組商品。這類套 組為，例如BioRad實驗室(加州Hercules)、BD Biosciences Clontech公司(加州Mountain View)、Chemicon國際公司(加州Temecula)、Calbiochem公司(加州聖地亞哥)、Pierce生物技術公司(伊利諾州Rockford)及Invitrogen公司(加州Carlsbad)所販售者。
熟習本技藝之人士知道如何選擇最適合該情況的套組。
測試菌株之影響
在根據本發明之方法中，該測試菌株對涉及結腸中水分吸收或分泌之轉運體之表現(尤其是CFTR蛋白及/或NHE3蛋白之表現)的影響係經由比較從已使用該測試菌株治療過之模式動物取得之生物樣本中測得之所欲蛋白質的表現量與從未使用該測試菌株治療過之模式動物(相同種類)取得之生物樣本(相同種類)中測得之所欲蛋白質的表現量來進行測定。此最後提及之動物稱為對照動物。
因此，例如當應用其中該生物樣本係來自模式動物之本發明方法時，係將指定量之經由培養該測試菌株所取得之細胞投予該模式動物。
該細胞量可一次投予。
或者，該細胞量可分成幾次投予，無論是在同一天、或在數天、或數週之內投予。
藉由培養該測試菌株所取得之細胞可藉由適合所使用 之模式動物的任何投服方法投服。例如，投服可藉由注射，尤其是藉由胃內注射含有合適之載劑及指定量之經由培養該測試菌株所取得之細胞的溶液或懸浮液進行。對照動物係投服僅包含載劑之相同體積的溶液。
再者，當應用其中該生物樣本為細胞株之本發明方法時，該測試菌株的影響係經由比較在已使用該測試菌株治療過之細胞株之細胞上測得之所欲蛋白質的表現量與在未使用該測試菌株治療之相同(細胞株之)細胞上測得之所欲蛋白質的表現量來進行測定。這些最後提及之細胞稱為對照細胞。
因此，例如當應用其中該生物樣本為細胞株之本發明方法時，細胞株之細胞係與指定量之含有合適載劑及指定量之經由培養該測試菌株所取得之細胞的溶液或懸浮液一起培育。該細胞株之對照細胞係被培育在同樣條件下，僅含有該載劑之相同體積的溶液中。
培養菌株(無論其為酵母菌株或細菌菌株)的方法為本技藝之人士所已知，且熟習本技藝之人士知道如何就各菌株之性質來優化該培養條件。
再者，熟習本技藝之人士知道如何決定該藉由培養取得之細胞在用來投予模式動物或用來與細胞株之細胞一起培育時的最佳數量。
例如，枯草芽孢桿菌細胞係經由將枯草芽孢桿菌菌株培養在培養基，尤其是，如Biotechnology,5th edition,R.Scriban,Edition Tec.& Doc.,1999,ISBN：2-7430-0309-X 一書中所描述之培養基中取得。
通常，藉由培養枯草芽孢桿菌之菌株來產製枯草芽孢桿菌細胞的方法包含以下步驟：-以枯草芽孢桿菌菌株之接種物接種培養基，-在有氧條件下培養以達到細胞增殖，-將生物質從其培養基中分離以取得枯草芽孢桿菌細胞。
由此取得之枯草芽孢桿菌細胞主要為繁殖體形式。
“主要為繁殖體”一詞意味至少70%之細胞為繁殖體，較佳為至少80%，且更佳為至少90%。
細菌之“繁殖體形式”係指被置於有利條件下之細菌形式。
有利條件之實例為在有利於細菌繁殖之溫度和pH值下的非限制性培養基。
非限制性培養基含有所有細胞繁殖必要的營養素。
產製枯草芽孢桿菌細胞之方法亦可包含介於在有氧條件下培養與分離生物物質的步驟之間的將細胞放置在不利條件下的中間步驟。因此，在生產方法結束時所取得之枯草芽孢桿菌細胞主要為孢子形式。
“主要為孢子形式”一詞意味著至少有70%之細胞為孢子形式，較佳為至少80%，更佳為至少90%。
細菌之“孢子形式”係指被置於不利條件下之細菌形式。因此，孢子形式為一種使細菌能夠抵抗艱困環境(諸如缺少營養素，即，限制性營養培養基、水分壓力、pH 值或溫度之變化很大、或通過消化道)之抵抗形式。
將細菌細胞置於不利條件下可藉由，例如以下方式達成：不更新該細菌之培養基、停止進料入該培養基中、使用限制性培養基、改變溫度、改變pH值或彼等之組合。
產製枯草芽孢桿菌細胞之方法亦可包含進一步乾燥該細胞的步驟，以取得乾燥形式之枯草芽孢桿菌細胞。
“乾燥形式之枯草芽孢桿菌細胞”一詞意指在產製枯草芽孢桿菌細胞之方法結束時所取得之生物物質中包含超過90%之乾燥物質，較佳為超過95%之乾燥物質。
該乾燥係藉由，例如冷凍乾燥、流化床乾燥或噴霧乾燥法進行。
鑑別用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株
經由比較使用測試菌株處理之樣本中所測得之所欲蛋白質的表現量與對照樣本中所測得之所欲蛋白質的表現量可能決定該測試菌株是否能引起所欲蛋白質之表現減少或增加，或對該表現沒有效果。
如上述指出，已藉由本發明之選擇方法測定能引起至少一種涉及結腸中水分分泌之轉運體的表現減少及/或至少一種涉及結腸中水分吸收之轉運體的表現增加之菌株為可用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株。
本案發明人已證明這類益生菌菌株能夠引起存在於結腸中之過量水分被吸收，因而發現能應用在治療及/或預防腹瀉。
“涉及結腸中水分分泌之轉運體的表現減少”係指相對 於無該測試菌株存在時之表現，該轉運體之表現顯著減少。
此減少之“顯著”特性係藉由統計分析測定。
當對該轉運體之表現的影響係藉由免疫組織化學測量時，“該轉運體之表現減少”相當於對應該轉運體之表現的螢光強度/平方微米相對於無該測試菌株存在時之表現係顯著減少。
“涉及結腸中水分吸收之轉運體的表現增加”係指相對於無該測試菌株存在時之表現，該轉運體之表現係顯著增加。
此增加之“顯著”特性係藉由統計分析測定。
當對該轉運體之表現的影響係藉由免疫組織化學測量時，“該轉運體之表現增加”相當於對應該轉運體之表現的螢光強度/平方微米相對於無該測試菌株存在時之表現係顯著增加。
如熟習本技藝之人士將理解者，用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株可僅使用根據本發明之一種選擇方法鑑別。根據本發明之方法可使用單一類型之生物樣本(例如指定之模式動物)，或使用數種類型的生物樣本(例如一種細胞株，然後至少一種模式動物)進行。
或者，能作用於結腸中水分吸收之益生菌菌株的鑑別工作可使用根據本發明之選擇方法進行，再以熟習本技藝之人士所熟知之一系列測試和臨床試驗補充該選擇。
Ⅱ.益生菌菌株於治療及/或預防腹瀉之用途
本發明關於任何藉由本發明方法鑑別之能夠引起結腸中過量水分被吸收，以用於治療及/或預防腹瀉的益生菌菌株。本發明亦關於這類益生菌菌株於製造用於治療及/或預防腹瀉之醫藥產品的用途。
如上文所指出者，該益生菌菌株可為任何微生物之菌株，尤其是酵母菌株或細菌菌株，諸如上文中所提及者。
尤其是，本發明者已證明該於2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1為在結腸中作用以使過量水分被吸收，因而可用於治療及/或預防腹瀉的益生菌菌株。
此菌株已描述於文獻FR 2 837 835中，其揭露包含該用於在胃腸道黏膜層級免疫化之菌株的活佐劑。
本發明亦關於所有經由培養藉由本發明方法鑑別之用於治療及/或預防腹瀉的益生菌菌株所取得之酵母菌細胞或細菌細胞。
如上文所指出者，菌株之培養條件為本技藝所周知，或可由熟習本技藝之人士輕易測定。
尤其是，本發明關於經由培養該於2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1所取得之用於治療及/或預防腹瀉的細胞。
以下，該“經由培養該於2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1所取得之細胞”被稱為“CU1細胞”。
CU1細胞之產製可依上文中之描述進行。
該用於治療及/或預防腹瀉之CU1細胞為孢子形式及/或繁殖體形式之細胞。
於一較佳之實施態樣中，該CU1細胞主要為孢子形式。
於一較佳之實施態樣中，該用於治療及/或預防腹瀉之CU1細胞為乾燥形式。
於本發明之一特別有利的實施態樣中，該用於治療及/或預防腹瀉之CU1細胞主要為孢子形式及乾燥形式。
本發明亦關於任何益生菌酵母細胞萃取物或益生菌細菌細胞萃取物，及來自益生菌菌株之培養的任何濾液，該萃取物或濾液能夠引起CFTR蛋白之表現減少及/或NHE3蛋白之表現增加，因此能夠引起結腸中之過量水分被吸收。
根據本發明之用於治療及/或預防腹瀉的方法包含投予患者有效量之酵母細胞或細菌細胞，該酵母細胞或細菌細胞係經由培養該藉由本文所描述之方法鑑別的益生菌菌株來取得。該可在一或多個劑量中投服之酵母細胞或細菌細胞的有效量可由醫師決定。根據患者的年齡、體重及一般狀況、腹瀉的性質和嚴重程度等，欲投服之確切量在患者彼此間可能有所不同。欲投服之確切量亦可根據所需之治療效果而有所不同(即，用於預防腹瀉或用於治療腹瀉)。
投服途徑(口服或經腸胃道外)，可根據該腹瀉之性 質及/或根據患者之年齡和一般狀況來選擇。
在預防腹瀉之情況中，該經由培養藉由本發明之方法鑑別的益生菌菌株所取得之酵母細胞或細菌細胞係在症狀出現之前投服。
在治療腹瀉之情況中，該經由培養藉由本發明之方法鑑別的益生菌菌株所取得之酵母細胞或細菌細胞係在症狀出現之後投服。
一般而言，任何形式之腹瀉(包括急性形式之腹瀉和慢性形式之腹瀉)可以使用根據本發明之益生菌菌株或經由培養該益生菌菌株所取得之細胞治療。
“急性腹瀉”意指其症狀持續不到兩週之腹瀉，而“慢性腹瀉”意指其症狀持續至少兩週，較佳為至少一個月之腹瀉。
急性腹瀉包括，例如病毒性腸胃炎、細菌性胃腸炎及食物中毒(例如沙門氏桿菌病(salmonelloses)、志賀氏菌病(shigelloses)、金黃色葡萄球菌感染、蠟狀芽胞桿菌感染、大腸桿菌感染)。
慢性腹瀉包括，例如吸收不良症候群、胃腸病(乳糜瀉、惠普爾氏病(Whipple's disease)、克隆氏病(Crohn's disease)等)、轉動腹瀉(即，由於腸道通過加速造成之腹瀉)、分泌性腹瀉(即，由於小腸及/或結腸中水分-電解質分泌加速造成之腹瀉)、滲透性腹瀉(即，由於胃腸道中存在吸收差且產生滲透作用之溶質而造成之腹瀉)。
可使用根據本發明之益生菌菌株或經由培養根據本發明之益生菌菌株所取得之細胞來治療的其他腹瀉包括由於焦慮或緊張之情緒造成的腹瀉、腹瀉是由於食物不耐受(例如牛奶中之乳糖、山梨糖醇、麩質等)造成的腹瀉、由於某些治療，諸如氧化鎂療法、放射療法、或化學療法造成的腹瀉、或由於某些形式之手術(諸如胃切除術或迴腸切除術)所造成的腹瀉、由於胃、小腸、結腸之過度負載或刺激所造成的腹瀉、由於停藥(諸如海洛因)所造成的腹瀉、由於某些藥物(諸如抗生素)所造成的腹瀉。
可使用根據本發明之益生菌菌株或經由培養根據本發明之益生菌菌株所取得之細胞來治療的其他腹瀉實例包括伴隨膽病發作或攝入之腹瀉、由於過度食用某些瀉藥食品所造成的腹瀉，及跑步者的腹瀉。
於某些有利之實施態樣中，該使用根據本發明之益生菌菌株或經由培養根據本發明之益生菌菌株所取得之細胞治療之腹瀉不是由投服抗生素，或更常為由投服醫藥產品所引起之腹瀉。
於其他有利之實施態樣中，該使用根據本發明之益生菌菌株或經由培養根據本發明之益生菌菌株所取得之細胞治療之腹瀉不是傳染性起源的腹瀉。
Ⅲ.組成物
本發明亦關於用於治療及/或預防腹瀉之組成物，該組成物包含至少一種根據本發明之益生菌菌株，或更具體 地說，經由培養這類菌株所取得之細胞。尤其是，該組成物包含有效量之經由培養於2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1細胞所取得的細胞。
根據本發明之組成物可為食品組成物、食品補充劑或醫藥組成物。
食品組成物係指任何類型之食物、飲料或糕點糖果。
食品組成物可為，例如飲料、穀物棒、口香糖、巧克力、牛奶製品，諸如發酵之乳製品、蔬菜來源之發酵產品。
“食品補充劑”係指其目的係補充正常飲食之食品。食品補充劑構成營養素之濃縮來源，或具有營養或生理效果之其他物質(單獨或組合的)的濃縮來源。
食品補充劑係以劑型銷售，即，諸如膠囊、錠劑、片劑、丸劑及其他類似形式、粉劑之藥囊、液體安瓿、配備滴管之瓶子，及其他類似形式旨在以測量好之少量單位服用的液體或粉末製劑。
當旨在供人使用時，根據本發明之組成物為，例如適合每日使用包含1.108CFU至1.1011CFU(較佳為1.109CFU至1.1010CFU)之經由培養益生菌菌株所取得的細胞之組成物。
當旨在供獸醫使用時，根據本發明之組成物為，例如適合每日使用包含1.105CFU至1.1011CFU(較佳為1.106CFU至1.1010CFU)的經由培養益生菌菌株所取得 的細胞之組成物。
術語CFU表示菌落形成單位。
Ⅳ.醫藥組成物
由於其直接作用在涉及調控腸液之轉運體上，藉由本發明方法鑑別之益生菌菌株，或更具體地說，經由培養這類菌株所取得之酵母細胞或細菌細胞，可用來作為治療劑。
這些酵母或細菌細胞可以這類形式投服，或在至少一種生理上可接受之載劑或賦形劑的存在下，以製劑或醫藥組成物之形式投服。在本發明之背景下，“生理上可接受之載劑或賦形劑”意指在其投服濃度下，不會干擾該活性成分(在此為該酵母或細菌細胞)之生物活性的效力，且對患者或受試者没有過量毒性的任何基質或添加劑。生理學上可接受之載劑或賦形劑可為適合投予人及/或動物(尤其是哺乳動物)之載劑或賦形劑。
根據本發明之醫藥組成物可使用任何有效之劑量與投服途徑的組合以取得所需之治療效果。投服之確切量可根據患者的年齡、體重及一般狀況、腹瀉之性質和嚴重性等在患者彼此間有所變化。投服途徑(口服或腸胃道外)可根據腹瀉之性質及/或根據患者之年齡及/或健康選擇。
例如，本發明關於如上述定義之供每日使用經由培養該益生菌菌株所取得之細胞的醫藥組成物，當旨在供人使用時該醫藥組成物中之細胞含量為1.108CFU至1.1011 CFU(較佳為1.109CFU至1.1010CFU)。
本發明亦關於如上述定義之供每日使用經由培養該益生菌菌株所取得之細胞的醫藥組成物，當旨在供獸醫使用時該醫藥組成物中之細胞含量為1.105CFU至1.1011CFU(較佳為1.106CFU至1.1010CFU)。
根據本發明之醫藥組成物的調和物可根據投服途徑及所欲使用之組成物的劑量而有所不同。在與至少一種生理上可接受之載劑或賦形劑配製後，本發明之醫藥組成物可為任何用於投予哺乳動物(尤其是人)之適當形式，例如錠劑、片劑、糖衣丸劑、膠囊、糖漿、油膏、注射溶液、栓劑等。熟習本技藝之人士知道如何選擇最適合用於製備指定類型之調和物的載劑及賦形劑。因此，例如常用於注射製劑之調和物中的賦形劑有，諸如水、2,3-丁二醇、林格氏液、氯化鈉之等張溶液、合成之單或二甘油酯及油酸。液體組成物，包括乳劑、微乳劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑、酏劑等可在溶劑、增溶劑、乳化劑、油、脂肪酸，及其他添加劑，諸如懸浮劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、黏度調節劑、著色劑、等之存在下配製。用於經由口服途徑投服之固體組成物可在惰性賦形劑(諸如檸檬酸鈉)及可選擇之添加劑，諸如黏合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、潤滑劑等的存在下配製。
於某些實施態樣中，根據本發明之醫藥組成物係配製成用於立即釋出該活性成分，尤其是經由培養該益生菌菌株所取得之酵母細胞或細菌細胞。或者，醫藥組成物可被 配製成用於長期或靶向釋出活性成分，或用於保護該活性成分(例如抗胃酸和酶)。
因此，使用能夠抵抗pH值及/或胃酶之作用的塗層、對pH值及/或酶之作用敏感的塗層、或黏附在胃或腸壁之生物黏附塗層、或經由使用包封系統是可行的。
再者，根據本發明之醫藥組成物可含有至少一種額外之活性藥物成分(即，經由培養益生菌菌株所取得之酵母細胞或細菌細胞除外)。
“活性藥物成分”意指投服時可對患者或被投予之個體的健康或一般狀況具有療效或有益效果的任何化合物或物質。
因此，活性藥物成分可有效對抗欲藉由投服醫藥組成物來防止或治療之腹瀉；可有效對抗與腹瀉相關之病況或症狀(例如發燒、嘔吐或腹部痙攣)；或可增加該醫藥組成物之活性成分的可利用性及/或活性。
可存在於本發明之組成物中的活性藥物成分之實例包括，但不限於抗炎劑、抗生素、解熱劑、止吐劑、抗組織胺藥、維生素、抗痙攣藥等。
於一有利之實施態樣中，另一活性藥物成分不是枯草芽孢桿菌菌株或經由培養這類菌株所取得之細胞，較佳地，不為細菌菌株或經由培養這類菌株所取得之細胞，更佳地，不為益生菌菌株或經由培養這類菌株所取得之細胞。
根據本發明之醫藥組成物的實例為包含經由培養益生 菌菌株所取得之酵母細胞或細菌細胞作為唯一之活性藥物成分的組成物。
於一較佳之實施態樣中，根據本發明之組成物含有經由培養2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1所取得之細胞，不包括任何其他細菌菌株。
於另一較佳之實施態樣中，根據本發明之組成物含有經由培養2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1所取得之細胞，不包括任何其他細菌菌株或酵母菌株。
再於另一較佳之實施態樣中，根據本發明之組成物含有經由培養2001年10月25日寄存在CNCM，登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1所取得之細胞作為唯一之藥學活性成分。
除非另外為其定義，本說明書中所使用之所有技術和科學術語與本發明所屬之領域中的一般專業人士所通常理解者具有相同的含義。此外，本文所提及之所有出版物、專利申請案、所有專利及所有其他參考文獻均以引用方式被納入本文。
第1圖. 以枯草芽孢桿菌株CU1治療時對結腸CFTR蛋白之表現的影響。圖中顯示對照組(以白色表示)及以CU1(以黑色表示)治療後之螢光強度/平方微米。 *p<0.005
第2圖. 以枯草芽孢桿菌株CU1治療時對結腸NHE3蛋白之表現的影響。圖中顯示對照組(以白色表示)及以CU1(以黑色表示)治療後之螢光強度/平方微米。*p<0.005
第3圖. 以植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)株治療時對結腸CFTR蛋白之表現沒有效果。圖中顯示對照組(以白色表示)及以LR(以黑色表示)治療後之螢光強度/平方微米。*p<0.005
第4圖. 以植物乳桿菌株治療時對結腸NHE3蛋白之表現沒有效果。圖中顯示對照組(以白色表示)及以LR(以黑色表示)治療後之螢光強度/平方微米。*p<0.005
第5圖. 靜脈內投予小鼠LPS(15毫克/公斤)或靜脈內投予小鼠生理鹽水後在60分鐘內(以黑色表示)及60分鐘至120分鐘之間(以白色表示)糞便內所排泄之水分(以毫克計)(平均值±SEM，n=10-20)。T-：接受生理鹽水注射，未以CU1治療之小鼠；T+：接受LPS注射，未以CU1治療之小鼠；T-/CU1：接受生理鹽水注射之以CU1治療的小鼠；T+/CU1：接受LPS注射之以CU1治療的小鼠。*相對於T-，P<0.05；†相對於T+，P<0.05
第6圖. 胃內投予小鼠蓖麻油(200微升)或胃內投予小鼠生理鹽水後在60分鐘內(以黑色表示)、在60分鐘至120分鐘之間(以灰色表示)，及在120分鐘至180 分鐘之間(以白色表示)糞便內所排泄之水分(以毫克計)(平均值±SEM，n=10-19)。T-：接受生理鹽水注射，未以CU1治療之小鼠；T+：接受蓖麻油注射之未以CU1治療的小鼠；T-/CU1：接受生理鹽水注射之以CU1治療的小鼠；T+/CU1：接受蓖麻油注射之以CU1治療的小鼠。*相對於T-，P<0.05；†相對於T+，P<0.05
下列實例描述本發明之一些實施態樣。然而，需理解的是，這些實例之呈現僅用於說明，而不欲以任何方式限制本發明之範圍。
實例1：選擇欲用於預防及/或治療腹瀉之益生菌菌株
材料及方法
測試之益生菌菌株
測試之菌株如下：植物乳桿菌屬菌株及枯草芽孢桿菌株CU1。
所使用之枯草芽孢桿菌CU1(以下稱為CU1)之細胞為孢子形式及乾燥形式。
所使用之植物乳桿菌(以下稱為LR)之細胞為凍乾之繁殖體形式。
測量益生菌菌株對CFTR及NHE3之表現的效果。
四隻小鼠各以109CFU/天之CU1治療2週。
四隻小鼠各以109CFU/天之LR治療2週。
使用四隻未以CU1治療之小鼠作為對照組。
依下述，藉由免疫組織化學測量從以CU1治療之小鼠及對照組小鼠取得之結腸細胞上的CFTR和NHE3之表現。
將小鼠處死後不久，即刻以0.9%NaCl溶液洗滌近端結腸之樣本(1厘米長)，在4%甲醛之緩衝溶液中固定(6小時)並浸沒在4℃，30%蔗糖溶液中24小時。
將樣本固定在Tissue Tek培養基(Euromedex，法國Souffelweyersheim)中，並將其在-45℃，異戊烷中冷凍。以丙酮進行冷凍切片後固定(10分鐘，-20℃)並在磷酸鹽緩衝之生理鹽水(PBS)-乳溶液中水合。在封阻溶液(帶有含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)之0.25%Triton X-100的PBS)中溫育後，將切片與兔子抗小鼠CFTR(1/100)、抗小鼠NHE3(1/200)或抗小鼠TLR4(1/100)多株抗體(Abcam公司，英國劍橋)在4℃下培育一整夜。然後，將切片與經FITC標記之驢抗兔抗體(1/2000，Uptima，法國蒙呂松)在室溫下培育1小時。然後，將切片封固在“Vectashield HardSet封固劑”(Abcys，法國Les Ulis鎮)中，並在Nikon 90i螢光顯微鏡(Nikon，法國Champigny-sur-Marne)下檢查。以Nis-Elements Ar軟體(Nikon)測量該免疫標記之螢光強度/平方微米。在來自一組4隻之小鼠的5個切片上進行分析。
結果
在測試之益生菌菌株中，僅該枯草芽孢桿菌菌株CU1被發現對涉及水分通過結腸黏膜之運動的二種轉運體CFTR和NHE3之表現具有影響。事實上，如第1圖中所示，以枯草芽孢桿菌菌株CU1治療小鼠兩週導致健康小鼠之結腸中的結腸細胞頂極上之CFTR的表現明顯減少。如第2圖所示，以枯草芽孢桿菌菌株CU1治療小鼠兩週導致健康小鼠之結腸中的結腸細胞頂極上之NHE3的表現明顯增加。
相反地，如第3和4圖所示，以植物乳桿菌株治療並未明顯改變CFTR或NHE3之表現。
實例2：益生菌菌株CU1於預防及/或治療腹瀉之用途
材料及方法
由LPS引起之腹瀉模式
經由胃內途徑將109CFU/天/動物之欲評估的益生菌菌株投予雄性DBA/2小鼠14天。
然後，以200微升經由靜脈內途徑投予之水治療對照組中之小鼠(12隻小鼠)，而測試組中之小鼠(12隻小鼠)則經由靜脈內途徑接受投予劑量為15毫克/公斤的腸炎沙門氏菌(Salmonella enteriditis)脂多醣(LPS)(Sigma公司，法國Saint Quentin Fallavier)，以誘導腹瀉。注射LPS後，將小鼠放置在單獨的籠子中，地板上覆蓋鋁片以允許每隔30分鐘收集糞便，共120分鐘。將收 集之糞便物質稱重，並在100℃加熱24小時，再次稱重。糞便物質之濕質量(加熱前)與乾質量之間的差值相當於排泄的水分。相對於投服LPS後之全部排泄的水分來評估腹瀉。
由蓖麻油引起之腹瀉模式
經由胃內途徑將109CFU/天/動物之欲評估的益生菌菌株投予雄性NMRI小鼠14天。
以200微升經由胃內途徑投予之水治療對照組中之小鼠(12隻小鼠)，並經由胃內途徑投予測試組中之雄性NMRI小鼠(12隻小鼠)200微升的蓖麻油(Sigma公司)，以引起腹瀉。投服蓖麻油後，將小鼠放置在單獨的籠子中，地板上覆蓋鋁片以允許每隔30分鐘收集糞便，共180分鐘。將收集之糞便物質稱重，並在100℃加熱24小時，再次稱重。糞便物質之濕質量(加熱前)與乾質量之間的差值相當於排泄的水分。相對於投服蓖麻油後之全部排泄的水分來評估腹瀉。
由抗生素引起之腹瀉模式
使用數量減少之抗生素設立由抗生素引起之腹瀉動物模式(根據Chen et al.,2008,Gastroenterology,135(6)：1984-92之工作)。投服抗生素會引起菌群生態失調(不平衡)和免疫反應，以及小鼠腸道黏液產製細胞之數量改變。抗生素治療能顯著誘導出現困難梭狀芽孢桿菌。
在此模式中，以109CFU/天/動物之比率投予一組5 隻之小鼠共14天及18天，以測試使用CU1菌株進行之預防性治療。投服CU1菌株7天後，將5種抗生素之混合物在飲用水中投服3天，然後，在第二天，以抗生素治療之小鼠接受腹膜內注射克林黴素(clindamycin)。在實驗開始後之第14及18天觀察治療效果。以CU1菌株治療之小鼠在整個測試中均接受該菌株。
結果
在各種小鼠之腹瀉模式中測試枯草芽孢桿菌菌株CU1。
枯草芽孢桿菌菌株CU1之止瀉性能
如第4及5圖中所示，明顯地，菌株CU1被發現顯著防止由LPS引起之腹瀉(第5圖)及由蓖麻油引起之腹瀉(第6圖)。
事實上，投服CU1細胞顯著減少在投服LPS後之第一個小時內糞便中所排泄的水分(在4個測試中減少的百分比為35%、38%、36%及40%)。
在由蓖麻油所引起之腹瀉模式中，投服CU1細胞顯著減少在第二個小時內糞便中所排泄的水(在3個測試中減少的百分比為63%、46%、44%)。
菌株CU1亦對由投服抗生素所引起之腹瀉具有預防效果。此效果可在以CU1細胞進行預防性治療後觀察到：然後，該小鼠顯示出腸道菌群正常化，且改善在腸黏膜之黏液產製細胞和巨噬細胞層級中由抗生素引起之變 化。
與洛哌丁胺之效果相比較
以菌株CU1預防性治療15天被發現其減少由LPS或蓖麻油引起之腹瀉的效果與啟動腹瀉前1小時經口服途徑投服之單劑量(1毫克/公斤)洛哌丁胺(參考之止瀉分子)相同。洛哌丁胺可減少50%投服LPS後在糞便中排泄之水分(CU1為40%)及60%投服蓖麻油後在糞便中排泄之水分(CU1為60%)。
結論
在體內，該枯草芽孢桿菌菌株CU1可改善結腸在過量流體狀況中的吸收能力。
另外的研究表明枯草芽孢桿菌菌株CU1：-在蓖麻油模式和LPS模式中對小腸之分泌/吸收能力沒有影響，-取消結腸壁層級之由LPS引起的旁細胞滲透性增加，但由蓖麻油所引起者則不，-減低結腸壁層級之由蓖麻油引起的短路電流，這表明在由蓖麻油引起之瀉藥腹瀉的情況中結腸吸收水分的能力加強(但在基線情況中則不)。
因此，枯草芽孢桿菌菌株CU1及經由培養此菌株所取得之細胞可用於治療及/或預防任何類型之腹瀉。

Claims (15)

  1. 一種選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，該方法包含以下步驟：-測量至少一種測試菌株對CFTR(囊性纖維化跨膜轉導調節因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator))蛋白的表現之影響，及-選擇至少一種引起CFTR蛋白的表現減少之菌株。
  2. 如申請專利範圍第1項之選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，該方法進一步包含以下步驟：-測量至少一種測試菌株對NHE3(鈉氫交換體3(sodium hydrogen exchanger 3))蛋白的表現的影響，及-選擇至少一種引起NHE3蛋白之表現增加的菌株。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，其中該測試菌株為酵母菌株或細菌菌株。
  4. 如申請專利範圍第3項之選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，其中該細菌菌株為芽孢桿菌菌株。
  5. 如申請專利範圍第4項之選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，其中該菌株為枯草芽孢桿菌菌株。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之選擇用於治療及/或預防腹瀉之益生菌菌株的方法，其中該蛋白的表現係藉由 以下技術測量：電泳、西方印漬、免疫分析法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法、質譜分析法、RT-PCR或北方印漬。
  7. 一種益生菌菌株用於製造供治療及/或預防腹瀉的藥物之用途，其中該益生菌菌株為2001年10月25日寄存在CNCM(國家微生物菌種保藏中心，Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)、登錄編號為I-2745之枯草芽孢桿菌菌株CU1。
  8. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該腹瀉為急性腹瀉或慢性腹瀉。
  9. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該腹瀉為傳染性起源之腹瀉或非傳染性起源之腹瀉。
  10. 一種藉由培養枯草芽孢桿菌CU1菌株所取得之細菌細胞用於製造供治療及/或預防腹瀉的藥物之用途，其中該枯草芽孢桿菌CU1菌株係2001年10月25日寄存在CNCM、登錄編號為I-2745。
  11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該腹瀉為急性腹瀉或慢性腹瀉。
  12. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該腹瀉為傳染性起源之腹瀉或非傳染性起源之腹瀉。
  13. 一種組成物用於製造供治療及/或預防腹瀉的藥物之用途，其中該組成物包含藉由培養枯草芽孢桿菌CU1菌株所取得之細菌細胞，該枯草芽孢桿菌CU1菌株係2001年10月25日寄存在CNCM、登錄編號為I-2745。
  14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該腹瀉為急性腹瀉或慢性腹瀉。
  15. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該腹瀉為傳染性起源之腹瀉或非傳染性起源之腹瀉。
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