JP3714967B2 - ラクトフェリンの吸着防止方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、ラクトフェリンの測定に当たって正しくラクトフェリン量を測定するためのラクトフェリン溶液の調製方法に関し、詳細にはラクトフェリンの吸着を防止し、ラクトフェリン量を正しく測定するための方法に関する。
背景技術
ラクトフェリンは主として顆粒球によって合成される鉄結合性のタンパクであり、その強い鉄結合能のため、鉄要求性の病原性細菌に対して強い静菌作用を持つ生体防御因子のひとつである。このような性質のため、ラクトフェリンは通常は乳汁や唾液などの外分泌液中に多く存在し、病原性細菌の感染を防いでいる。しかし、何らかの理由によって生体内に炎症が起こると、炎症部位に顆粒球が遊走し活性化するため、多重のラクトフェリンが分泌される。そのため、ラクトフェリンの検出は炎症マーカーとして極めて重要であり、従って、ラクトフェリンの測定キットとして既にLactof-EIA［BIOXYTECHフランス］が市販されている。
ラクトフェリン量の測定には、特異性に優れる免疫学的測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法やＳＰＯＴ検出試薬が利用されることが多い。免疫学的測定方法では、標準物質や標識物質としてラクトフェリンを使用することが必須である。ところが、このラクトフェリンの使用には、その固有の性質のため、保存容器壁への吸着および反応容器壁への吸着という問題が内在する。即ち、予め調製した標準溶液において、その保存中に標準物質であるラクトフェリンが容器壁に吸着すると、結果として標準液のラクトフェリン量が低下し表示量を保証できなくなってしまう。他方、検体試料中のラクトフェリンについても、その測定の際に反応容器壁にラクトフェリンが吸着してしまい、見かけ上ラクトフェリン量が低くなり測定誤差を招来させることがある。このように、ラクトフェリンが容器壁に吸着する事実を無視してしまうと、種々の問題が生じる。
ラクトフェリンが保存容器あるいは反応容器に用いられる通常の材質、例えばガラス、プラスチックなどからなる容器の壁に対し、吸着を示す事実、およびその吸着を防止するための方法については知られていない。
このラクトフェリンの容器壁への吸着は、従来から行われている吸着防止のためのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどタンパクの添加では防止できないことを確認した。
本発明はこのような背景の下、ラクトフェリンを正しく測定するためのラクトフェリンの吸着防止方法に関し、ひいては炎症性疾患または癌などの随伴性炎症を引き起こし得る疾患を確実に検出する方法を提供する。
発明の開示
本発明は、保存容器または反応容器中のラクトフェリンを含有する溶液のｐＨを４以下にすること、あるいは該溶液の塩濃度を例えば塩化ナトリウムであれば１．０Ｍまたはそれ以上のイオン強度、塩化カリウムであれば０．５Ｍまたはそれ以上のイオン強度にすることを特徴とする、ラクトフェリンが保存容器または反応容器に吸着されることを防止する方法に関する。本発明はさらに、ｐＨ４以下、あるいは塩化ナトリウム濃度１．０Ｍ以上または塩化カリウム濃度０．５Ｍ以上の溶液であってラクトフェリンを含有する溶液、および該溶液を構成試薬とするラクトフェリン測定用キットに関する。
本発明においては、容器中のラクトフェリン含有溶液のｐＨを４以下にするために酸性の緩衝液を用いることができる。酸性の緩衝液としては、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液を用いるのが好ましく、グリシン緩衝液、塩酸緩衝液等も使用することができる。好ましくは、１０ｍＭクエン酸または酢酸緩衝液を用いてｐＨ調節を行う。
ラクトフェリンを含有する溶液の塩濃度を調節することも本発明の特徴であり、ここでは塩として塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）を例示しているが、他にＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6を用いることができる。
本発明の方法はあらゆる免疫学的測定方法に適用可能であり、例えば酵素免疫法、放射免疫法、蛍光免疫法、発光免疫法、ラテックス凝集法など、通常使用される測定法に使用できる。
ｐＨ４以下、塩化ナトリウム濃度１．０Ｍ以上または塩化カリウム濃度０．５Ｍ以上の溶液であってラクトフェリンを含有する本発明の溶液は通常、ラクトフェリン不含の状態で希釈液としてラクトフェリン測定用キット中、バイアル内に容れておく。そして、この溶液は、検量線作成時の希釈液として、また検体の希釈液として使用され、ラクトフェリン含有溶液が調製される。
【図面の簡単な説明】
図１は、ガラスおよびポリプロピレンに対するラクトフェリンの吸着性を示すグラフである。図中、Micro tube、Assist tubeおよびFalcon tubeはポリプロピレン製チューブである。
図２は、ラクトフェリンの吸着阻害におけるｐＨ変動の効果を示すグラフである。
図３は、ラクトフェリンの吸着阻害におけるＮａＣｌ濃度変動の効果を示すグラフである。
図４は、ラクトフェリンの吸着阻害におけるＫＣｌ濃度変動の効果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下に参考例および実施例を記載して本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の限定を意図するものでない。以下の参考例および実施例におけるラクトフェリン量の測定は、特に明記しない限り、次のように行った：
１）マイクロプレートへの抗体の固相化
抗ヒトラクトフェリン抗体［DAKOPATTS，デンマーク］１０μｇ／ｍｌを含む０．０１Ｍ ＰＢＳ緩衝液２５０μｌをマイクロプレート［NUNC，デンマーク］の各ウエルに分注し、４℃で１２時間以上放置して、抗体固相プレートを作製する。
２）酵素標識抗体の調製
西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）を抗ヒトラクトフェリン抗体のＦａｂ’断片に１：１の割合で結合したＨＲＰ標識抗ヒトラクトフェリン抗体［DAKOPATTS，デンマーク］を３０ｎｇ／ｍｌになるように調製し使用する。
３）ラクトフェリン量の測定
工程（１）にて作製したマイクロプレートの各ウエルに、あらかじめ０．１％ウシ血清アルブミンおよび１．２５ＭＮａＣｌを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を分注し、次いで同緩衝液にて２０−７２０ｎｇ／ｍｌに希釈した標準ラクトフェリン［Cappel，スウェーデン］５０μｌを加え、混和した後、２５℃で１時間反応させる。次いで、０．０５％Tween２０を含む０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄する。その後、工程（２）にて調製したＨＲＰ標識抗ヒトラクトフェリン抗体を各ウエルに１００μｌずつ加え混和した後、２５℃で１時間反応させ、先と同様に洗浄する。さらにＴＭＢ発色試薬［BioRad，米国］１００μｌを加え、混和した後２５℃で１５分反応させ、１Ｍリン酸にて反応を停止させる。最後に、各ウエルの呈色をマイクロプレート用比色計を用いて４５０nmの波長光で比色し、検量線から各検体中のラクトフェリン量を算出する。
参考例
ラクトフェリンの吸着性の確認
ラクトフェリンの吸着性を確認するため、臨床検査に通常用いられる器材の材質に用いられている物質、ガラスおよびポリプロピレン（図中、Micro tube,Assist tube,Falcon tube）を用いて試験を行った。０．１％ウシ血清アルブミンを含有する０．０５Ｍ ＰＢＳ（生理食塩緩衝液、ｐＨ７．４）３ｍｌ中、標準ラクトフェリン［CAPPEL製］１．５μｇの溶液を、それぞれの材質の試験管（１０ｍｌ容量）に加える。ミキサーにより充分に攪拌し、そのうちの２．８ｍｌを同じ材質の別の試験管にそれぞれ移す。次いで、各試験管に残った溶液約０．２ｍｌを検体としてラクトフェリン量の測定を行う。同様にしてこの操作を１０回繰り返し、それぞれのラクトフェリン量の測定を行う。得られた結果を図１に示す。結果は、２回試験の平均値である。
繰り返し数が大きくなるに従ってラクトフェリン濃度の測定値が小さくなる場合はその材質に対してラクトフェリンが吸着することを示す。図１は、いずれの材質に対してもラクトフェリンが強い吸着を示し、検体採取から測定までは充分な注意が必要であることを示している。
実施例１
ラクトフェリンの吸着阻害
１０ｍＭクエン酸と１０ｍＭクエン酸ナトリウムを適宜混合し、ｐＨ３、４、５、６にした溶液を用いて３６０ｎｇ／ｍｌの標準ラクトフェリン溶液をそれぞれ調製する。次いで、ガラス製の容器を用い、参考例１と同様にして繰り返し試驗を行う。得られた結果を図２に示す。結果は２回試験の平均である。なお、参考のため、リン酸を用いてｐＨ６〜７に調整した溶液についても同様の試験を行った。
実施例２
ラクトフェリンの吸着阻害
０ＭＮａＣｌと２ＭＮａＣｌを適宜混合し、ＮａＣｌ濃度０から２Ｍにした溶液を用いて３６０ｎｇ／ｍｌの標準ラクトフェリン溶液をそれぞれ作成する。次いで、ガラス製の容器を用い、参考例１と同様にして繰り返し試驗を行う。得られた結果を図３に示す。結果は２回試験の平均である。
実施例３
ラクトフェリンの吸着阻害
０ＭＫＣｌと２ＭＫＣｌを適宜混合し、ＫＣｌ濃度０から２Ｍにした溶液を用いて３６０ｎｇ／ｍｌの標準ラクトフェリン溶液をそれぞれ作成する。次いで、ガラス製の容器を用い、参考例１と同様にして繰り返し試験を行う。得られた結果を図４に示す。結果は２回試験の平均である。
まとめ
図２〜４は、ラクトフェリンの吸着阻害にｐＨを低下させること、あるいは塩濃度を上げることが有効であることを示している。測定系であるＥＬＩＳＡの場合、その測定誤差は約±１０％〜２０％である。従って、図２、３および４はそれぞれ、ラクトフェリンの吸着阻害のためには、少なくともｐＨ４以下、またＮａＣｌ１．０Ｍ以上、ＫＣｌ０．５Ｍ以上の条件に反応系をおく必要のあることを示している。
本発明は、ラクトフェリンの測定に当たって正しくラクトフェリン量を測定するためのラクトフェリン溶液の調製方法に関し、詳細にはラクトフェリンの吸着を防止し、ラクトフェリン量を正しく測定するための方法に関する。
背景技術
ラクトフェリンは主として顆粒球によって合成される鉄結合性のタンパクであり、その強い鉄結合能のため、鉄要求性の病原性細菌に対して強い静菌作用を持つ生体防御因子のひとつである。このような性質のため、ラクトフェリンは通常は乳汁や唾液などの外分泌液中に多く存在し、病原性細菌の感染を防いでいる。しかし、何らかの理由によって生体内に炎症が起こると、炎症部位に顆粒球が遊走し活性化するため、多重のラクトフェリンが分泌される。そのため、ラクトフェリンの検出は炎症マーカーとして極めて重要であり、従って、ラクトフェリンの測定キットとして既にLactof-EIA［BIOXYTECHフランス］が市販されている。
ラクトフェリン量の測定には、特異性に優れる免疫学的測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法やＳＰＯＴ検出試薬が利用されることが多い。免疫学的測定方法では、標準物質や標識物質としてラクトフェリンを使用することが必須である。ところが、このラクトフェリンの使用には、その固有の性質のため、保存容器壁への吸着および反応容器壁への吸着という問題が内在する。即ち、予め調製した標準溶液において、その保存中に標準物質であるラクトフェリンが容器壁に吸着すると、結果として標準液のラクトフェリン量が低下し表示量を保証できなくなってしまう。他方、検体試料中のラクトフェリンについても、その測定の際に反応容器壁にラクトフェリンが吸着してしまい、見かけ上ラクトフェリン量が低くなり測定誤差を招来させることがある。このように、ラクトフェリンが容器壁に吸着する事実を無視してしまうと、種々の問題が生じる。
ラクトフェリンが保存容器あるいは反応容器に用いられる通常の材質、例えばガラス、プラスチックなどからなる容器の壁に対し、吸着を示す事実、およびその吸着を防止するための方法については知られていない。
このラクトフェリンの容器壁への吸着は、従来から行われている吸着防止のためのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどタンパクの添加では防止できないことを確認した。
本発明はこのような背景の下、ラクトフェリンを正しく測定するためのラクトフェリンの吸着防止方法に関し、ひいては炎症性疾患または癌などの随伴性炎症を引き起こし得る疾患を確実に検出する方法を提供する。
発明の開示
本発明は、保存容器または反応容器中のラクトフェリンを含有する溶液のｐＨを４以下にすること、あるいは該溶液の塩濃度を例えば塩化ナトリウムであれば１．０Ｍまたはそれ以上のイオン強度、塩化カリウムであれば０．５Ｍまたはそれ以上のイオン強度にすることを特徴とする、ラクトフェリンが保存容器または反応容器に吸着されることを防止する方法に関する。本発明はさらに、ｐＨ４以下、あるいは塩化ナトリウム濃度１．０Ｍ以上または塩化カリウム濃度０．５Ｍ以上の溶液であってラクトフェリンを含有する溶液、および該溶液を構成試薬とするラクトフェリン測定用キットに関する。
本発明においては、容器中のラクトフェリン含有溶液のｐＨを４以下にするために酸性の緩衝液を用いることができる。酸性の緩衝液としては、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液を用いるのが好ましく、グリシン緩衝液、塩酸緩衝液等も使用することができる。好ましくは、１０ｍＭクエン酸または酢酸緩衝液を用いてｐＨ調節を行う。
ラクトフェリンを含有する溶液の塩濃度を調節することも本発明の特徴であり、ここでは塩として塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）を例示しているが、他にＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6を用いることができる。
本発明の方法はあらゆる免疫学的測定方法に適用可能であり、例えば酵素免疫法、放射免疫法、蛍光免疫法、発光免疫法、ラテックス凝集法など、通常使用される測定法に使用できる。
ｐＨ４以下、塩化ナトリウム濃度１．０Ｍ以上または塩化カリウム濃度０．５Ｍ以上の溶液であってラクトフェリンを含有する本発明の溶液は通常、ラクトフェリン不含の状態で希釈液としてラクトフェリン測定用キット中、バイアル内に容れておく。そして、この溶液は、検量線作成時の希釈液として、また検体の希釈液として使用され、ラクトフェリン含有溶液が調製される。
【図面の簡単な説明】
図１は、ガラスおよびポリプロピレンに対するラクトフェリンの吸着性を示すグラフである。図中、Micro tube、Assist tubeおよびFalcon tubeはポリプロピレン製チューブである。
図２は、ラクトフェリンの吸着阻害におけるｐＨ変動の効果を示すグラフである。
図３は、ラクトフェリンの吸着阻害におけるＮａＣｌ濃度変動の効果を示すグラフである。
図４は、ラクトフェリンの吸着阻害におけるＫＣｌ濃度変動の効果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下に参考例および実施例を記載して本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の限定を意図するものでない。以下の参考例および実施例におけるラクトフェリン量の測定は、特に明記しない限り、次のように行った：
１）マイクロプレートへの抗体の固相化
抗ヒトラクトフェリン抗体［DAKOPATTS，デンマーク］１０μｇ／ｍｌを含む０．０１Ｍ ＰＢＳ緩衝液２５０μｌをマイクロプレート［NUNC，デンマーク］の各ウエルに分注し、４℃で１２時間以上放置して、抗体固相プレートを作製する。
２）酵素標識抗体の調製
西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）を抗ヒトラクトフェリン抗体のＦａｂ’断片に１：１の割合で結合したＨＲＰ標識抗ヒトラクトフェリン抗体［DAKOPATTS，デンマーク］を３０ｎｇ／ｍｌになるように調製し使用する。
３）ラクトフェリン量の測定
工程（１）にて作製したマイクロプレートの各ウエルに、あらかじめ０．１％ウシ血清アルブミンおよび１．２５ＭＮａＣｌを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を分注し、次いで同緩衝液にて２０−７２０ｎｇ／ｍｌに希釈した標準ラクトフェリン［Cappel，スウェーデン］５０μｌを加え、混和した後、２５℃で１時間反応させる。次いで、０．０５％Tween２０を含む０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄する。その後、工程（２）にて調製したＨＲＰ標識抗ヒトラクトフェリン抗体を各ウエルに１００μｌずつ加え混和した後、２５℃で１時間反応させ、先と同様に洗浄する。さらにＴＭＢ発色試薬［BioRad，米国］１００μｌを加え、混和した後２５℃で１５分反応させ、１Ｍリン酸にて反応を停止させる。最後に、各ウエルの呈色をマイクロプレート用比色計を用いて４５０nmの波長光で比色し、検量線から各検体中のラクトフェリン量を算出する。
参考例
ラクトフェリンの吸着性の確認
ラクトフェリンの吸着性を確認するため、臨床検査に通常用いられる器材の材質に用いられている物質、ガラスおよびポリプロピレン（図中、Micro tube,Assist tube,Falcon tube）を用いて試験を行った。０．１％ウシ血清アルブミンを含有する０．０５Ｍ ＰＢＳ（生理食塩緩衝液、ｐＨ７．４）３ｍｌ中、標準ラクトフェリン［CAPPEL製］１．５μｇの溶液を、それぞれの材質の試験管（１０ｍｌ容量）に加える。ミキサーにより充分に攪拌し、そのうちの２．８ｍｌを同じ材質の別の試験管にそれぞれ移す。次いで、各試験管に残った溶液約０．２ｍｌを検体としてラクトフェリン量の測定を行う。同様にしてこの操作を１０回繰り返し、それぞれのラクトフェリン量の測定を行う。得られた結果を図１に示す。結果は、２回試験の平均値である。
繰り返し数が大きくなるに従ってラクトフェリン濃度の測定値が小さくなる場合はその材質に対してラクトフェリンが吸着することを示す。図１は、いずれの材質に対してもラクトフェリンが強い吸着を示し、検体採取から測定までは充分な注意が必要であることを示している。
実施例１
ラクトフェリンの吸着阻害
１０ｍＭクエン酸と１０ｍＭクエン酸ナトリウムを適宜混合し、ｐＨ３、４、５、６にした溶液を用いて３６０ｎｇ／ｍｌの標準ラクトフェリン溶液をそれぞれ調製する。次いで、ガラス製の容器を用い、参考例１と同様にして繰り返し試驗を行う。得られた結果を図２に示す。結果は２回試験の平均である。なお、参考のため、リン酸を用いてｐＨ６〜７に調整した溶液についても同様の試験を行った。
実施例２
ラクトフェリンの吸着阻害
０ＭＮａＣｌと２ＭＮａＣｌを適宜混合し、ＮａＣｌ濃度０から２Ｍにした溶液を用いて３６０ｎｇ／ｍｌの標準ラクトフェリン溶液をそれぞれ作成する。次いで、ガラス製の容器を用い、参考例１と同様にして繰り返し試驗を行う。得られた結果を図３に示す。結果は２回試験の平均である。
実施例３
ラクトフェリンの吸着阻害
０ＭＫＣｌと２ＭＫＣｌを適宜混合し、ＫＣｌ濃度０から２Ｍにした溶液を用いて３６０ｎｇ／ｍｌの標準ラクトフェリン溶液をそれぞれ作成する。次いで、ガラス製の容器を用い、参考例１と同様にして繰り返し試験を行う。得られた結果を図４に示す。結果は２回試験の平均である。
まとめ
図２〜４は、ラクトフェリンの吸着阻害にｐＨを低下させること、あるいは塩濃度を上げることが有効であることを示している。測定系であるＥＬＩＳＡの場合、その測定誤差は約±１０％〜２０％である。従って、図２、３および４はそれぞれ、ラクトフェリンの吸着阻害のためには、少なくともｐＨ４以下、またＮａＣｌ１．０Ｍ以上、ＫＣｌ０．５Ｍ以上の条件に反応系をおく必要のあることを示している。
Claims (5)
- 保存容器または反応容器中のラクトフェリンを含有する溶液のｐＨを４以下にすることを特徴とする、ラクトフェリンが保存容器または反応容器に吸着されることを防止する方法。
- ｐＨを３〜４に維持できる酸性の緩衝液を用いる請求項１記載の方法。
- 緩衝液がクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液またはグリシン緩衝液である請求項２記載の方法。
- ｐＨ４以下の溶液であってラクトフェリンを含有する溶液を構成試薬とするラクトフェリン測定用キット。
- ｐＨ４以下の溶液を含むラクトフェリン測定用キット。
Applications Claiming Priority (2)
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