JPH0419561A - 免疫アッセイ用ブロッキング剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の技術〕 本発明は、免疫アッセイ用ブロッキング剤、さらに詳し
くは長時間の常温保存が可能で、各種血清と非特異的吸
着を起こし難い免疫アッセイ用ブロッキング剤に関する
ものである。

〔従来の技術〕

近年、免疫測定法が広く用いられるようになり、人の臨
床検査や診断、動物の病気の診断または多くの分野の研
究に応用されている。この免疫測定法、たとえば酵素免
疫測定法やラジオイムノアッセイでは、固体支持体、例
えばポリスチレン等のマイクロプレートに抗原、抗体等
を固定しておき、この固体支持体を、分析対象としての
抗体、抗原等を含有する分析試料と接触せしめることに
より固体支持体に固定された抗原、抗体等と分析試料中
の抗体、抗原等とを特異的に結合せしめるが、この場合
固体支持体表面上に存在する遊離結合部位と分析試料中
の分析対象とが非特異的に結合し、これが測定誤差の原
因となる。このため、抗原や抗体をプレートに固定した
後ブロッキング剤で固体支持体をコーティングして前記
遊離部位をブロックすることにより非特異的吸着を防止
し、測定を行っている。この測定に使用される代表的な
ブロッキング剤として、従来から牛血清アルブミン、卵
アルブミン、ゼラチン、スキムミルク等が挙げら、れる
。しかしながらこれらのブロッキング剤は天然物である
ため腐敗しやすく、そのため低温保存が必要であったり
、ろ過滅菌等の滅菌が必要であり、長時間常温で保存す
るには適さない。また上記ブロッキング剤は、ある種の
分析試料、例えば鶏血清中の種々の抗体と非特異的に結
合するため、この様な試料の分析においてはブロッキン
グ剤と試料中の成分との非特異的結合が分析誤差の原因
となる。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明は、腐敗せず長期間の保存および滅菌操
作が簡単で、各種血清と非特異吸着を起こさない優れた
ブロッキング剤を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究の結
果、免疫アッセイ用ブロッキング剤としてポリビニール
アルコールを用いることにより、上北課題が達成される
ことを見いだし本発明を完成するに至ったのである。す
なわち、ポリビニールアルコールよりなる免疫アッセイ
用ブロッキング剤に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に関わるポリビニールアルコール（以下ｒＰＶＡ
Ｊと略す）としては、通常平均重合度が１００〜１００
００、好ましくは２００〜３０００である。またＰＶＡ
の鹸化度は通常５０％〜９９．９％、好ましくは、７０
％〜９９．９％である。また、このＰＶＡをブロッキン
グ剤として使うときの濃度としては、通常０．０１％〜
２０％、好ましくは、０．０５〜１０％である。

ただし、ＰＶＡの分子量が大きくなると水に対する溶解
性が悪くなり、溶解度が５％に満たないものがあるので
、これらの濃度の上限は飽和溶解度とする。このＰＶＡ
を使用する際、溶媒に溶解して用いられるが、その溶媒
としては、水、燐酸緩衝溶液、燐酸緩衝生理食塩水等が
あり、又これらの液に対する濃度の上限は飽和溶解度で
ある。

免疫測定法としては、酸素免疫測定法、ラジオイムノア
ッセイ法、蛍光免疫アッセイ法、発光免疫アッセイ法、
ラテックス凝集法等があげられる。

例えば酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、及び発光免疫
測定法では、プラスチックプレート、プラスチックビー
ズ等の固体支持体に対象となる抗原を吸着したのちブロ
ッキング剤を吸着させ、これに希釈剤で希釈した測定対
象の血清等を加え、固体支持体に固定された抗原に血清
中の抗体を結合させ、この抗体に結合する標識抗体を希
釈剤で希釈した液を加え、さらに基質を加え、吸光、蛍
光、発光を測定することにより測定がなされる。ラジオ
イムノアッセイ法では、プラスチックプレートやプラス
チックピースに対象となる抗原を吸着した後ブロッキン
グ剤を吸着させ、これに血清希釈剤で希釈した測定対象
の血清を加え抗原に抗体に結合させ、抗体に結合するラ
ジオアイソトープ標識抗体を希釈剤で希釈した液を加え
、結合したラジオアイソトープ量を測定する。ラテック
ス凝集法ではラテックス微粒子に抗原を吸着したのちブ
ロッキング剤を吸着させこれに希釈剤で希釈した測定対
象の血清を加え、凝集の変化を見ることにより診断する
。

この測定対象としては、組織、細胞、細菌、かび、マイ
コプラズマ、ウィルス、デオキシリボ核酸、タンパク質
、多糖、脂質、タンパク質に結合した各種ハブテン（抗
生物質、ホルモン等の低分子化合物）等を用いることが
出来る。血清としては、人、馬、牛、豚、羊、山羊、兎
、鶏、犬、猫、ラット、マウス等の血清が利用できる。

この中でもとりわけブロッキング剤との非特異反応の出
やすい鶏からの血清による病気の診断に有用であり、た
とえば鶏アデノウィルス、鶏痘ウィルス、伝染性ファブ
ルスキー嚢病ウィルス、伝染性気管支炎ウィルス、伝染
性喉頭気管炎ウィルス、鶏インフルエンザウィルス、マ
レック病ウィルス、エコつカッスル病ウィルス、パラミ
クソ病ウィルス、鶏レオウィルス、ロタウィルス、クラ
ミジア、ポルデテーラ、細胞内皮膜症ウィルス、鶏白血
病うレスパスツエラ、マイコプラズマ、サルモネラ、雛
白痢、コクシジウム、ロイコチトゾーンあげられる。人
では各種血清診断等またはその他動物の診断として牛の
病気では、イバラキ病、伝染性鼻気管炎、アデノウィル
ス感染症、流行熱、アカバネ病、牛ウィルス性下痢症、
牛痘、炭そ病、豚の病気では、豚コレラ、伝染性胃腸炎
、豚パルボウイルスに有用である。

このブロッキング剤の効果により、非特異的な蛋白等の
吸着を防ぐことが出来、より正確な診断が可能となるも
のである。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ＰＶＡを用いることにより、腐敗せず
、常温保存が可能で、オートクレーブ滅菌が出来、各種
血清と非特異的吸着を起こさない優れた免疫アッセイ用
ブロッキング剤を提供するものである。このＰＶＡを用
いることにより、血清診断、例えば鶏の病気の診断を正
確に出来るようになる。

〔実施例〕

次に、本発明に係わる実施例を挙げるが、本発明の趣旨
に反しない限り、これらの実施例に限定されるものでは
ない。

実施例１ 抗原の調製及び固定化 マイコブラズマガリセプチカムＣ３ＰＴを改変チャノッ
ク（ＣＨＡＮＯＣＨ）培地で３日間培養し、培養液を遠
心分離（１００ＯＯＲＰＭ）　した。沈澱物を生理食塩
水に懸濁しさらに遠心分離を行い洗浄した。この洗浄操
作を３回行った。沈澱物を、培養液濃度の１／１５濃度
になるように燐酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁して抗原を調
製した。この抗原を９６穴マイクロプレートの各ウェル
に５０１１１ずつ加え、室温で２時間放置した後に、液
を捨てＰＢＳで２回洗浄して、抗原を固定したプレート
を作製した。

他方、比較のため抗原を固定しないマイクロプレートも
用意した。

ブロッキング剤によるプレートのコーティングブロッキ
ング剤として、本発明のブロッキング剤、である第１表
に示す各種のＰＶＡを用いた。

ＰＶＡをＰＢＳ中の０６５％及び２．５％溶液とし、こ
れら２００ｄを前記のようにして作製した抗原を固定し
たプレート及び抗原を固定していないプレートのウェル
に加え、室温で３０分放置した後に、液を捨てＰＢＳで
２回洗浄した。こうしてブロッキング剤でコートされた
プレートを作製した。

血清の調製及び分析 鶏をマイコプラズマで免疫し、３週間後に採取した血液
から鶏免疫血清を調製した。他方、ふ化したでの雛から
採取した血液から非免疫血清を調製した。

前記ブロッキング剤でコーティングしたプレートの各ウ
ェルにＰＢＳで１／１００に希釈した上記の血清（免疫
血清又は非免疫血清）５０１１１を加え、３０分間放置
した。各ウェルから液を除き、ＰＢＳで３回洗浄した。

山羊抗鶏１ｇＭ抗血清（ＩＣＮ社）を０．７％牛血清ア
ルブミンを含むＰＢＳで１／１０００に希釈し、各ウェ
ルに５０１１１加え、３０分放置した後に、液を除き、
ＰＢＳで３回洗浄した。西洋ワサビのペルオキシダーゼ
標識兎抗山羊ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗血清（キルケガード　
アンド　ベリーラボラトリーズ社）を０．７％牛血清ア
ルブミンを含むＰＢＳで１／１０００に希釈し、各ウェ
ルに５０１１１加え、３０分放置した後に、液を除き、
ツイーン２０を０．０２％含むＰＢＳで６回洗浄した。

ＡＢＴＳ　（２、２’−アジノービス（３−エチルベン
ズチアゾリン−６−スルフォン酸）アンモニウム塩〕水
溶液と過酸化水素水溶液を２５１１１ず、つ各ウェルに
加え室温で１時間放置した後、光度計にて４０５１ｍ吸
光度を測定した。この結果を第２表に示す。

比較例１ 実施例１に記載したのと同様の操作を行った。

但しブロッキング剤としてＰＶＡ０代りに牛血清アルブ
ミンのＰＢＳ中０．７％溶液及び乳タンノくり質のＰＢ
Ｓ中０．７％溶液を用いた。この結果を第２表に示す。

第２表 抗原を固定しないプレートに各種のブロッキング剤をコ
ートし、さらにこれを免疫血清と反応させた場合、ブロ
ッキング剤としてアルブミン及び乳タンパク質を使用し
た場合それぞれ０．６７及び０．９３という高い吸光度
を示し、他方本発明のブロッキング剤である試料２〜試
料７を使用した場合、約０．１以下という低い吸光度を
示した。これは、アルブミン又は乳タンパク質をコート
した場合には免疫血清中に含まれる種々の抗体がアルブ
ミン又は乳タンパク質に非特異的に結合した結果であり
、他方、試料２〜試料７を使用した場合には、これらが
免疫血清中存在する種々の抗体と非特異的に結合しなか
った結果であると考えられる。なお、試料１が高い吸光
度を示したのは、この試料が高い親水性を有するために
免疫血清中の種々の蛋白質と非特異的に結合したためと
考えられる。

以上の結果から、分子量が低く且つ鹸化度が高いために
親水性が特に高いものを除き、広範な種類のＰＶＡが本
発明において使用可能であることがわかる。

なお、雛から調製した非免疫血清を使用した場合、ブロ
ッキング剤としてアルブミン又は乳タンパク質を使用し
ても吸光度が低いのは、雛はまだ自らの抗体を産生じて
いないたｔ使用した非免疫血清中に非特異的に結合すべ
き抗体の含有量が少ないためと思われる。

第２表から明らかなように、従来の牛血清アルブミン又
は乳タンパク質をブロッキング剤として使用した場合、
鶏の免疫血清は抗原をコートしてないウェルにおいても
高い吸光度を示すため、この系を用いて抗体価を測定す
ることは不可能である。

実施例２ 本発明のブロッキング剤である種々のＰＶＡを第３表に
示す温度でＰＢＳに希釈し、密封して室温で放置し、そ
の外観の変化を観察した。この結果を次の第３表に示す
。

比較例２ 実施例２と同様の操作を行った。但し、被験物としてＰ
ＶＡの代りに牛血清アルブミンのＰＢＳ中０．７％溶液
を用いた。

結果を第３表に示す。

第 表 用いたＰＶＡは試料１を除き６力月経過しても外観上の
変化はみられなかった。

他方、 牛血溝ア ルブミンは約１カ月経過後に沈澱の形成が見られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ポリビニールアルコールを含有して成る免疫アッセ
   イ用ブロッキング剤。 ２、ポリビニールアルコールが重合度２００〜３０００
   、及び鹸化度７５〜９９．９％を有する請求項１に記載
   の免疫アッセイ用ブロッキング剤。 ３、ポリビニールアルコール濃度が０．０１〜２０％で
   ある請求項１に記載の免疫アッセイ用ブロッキング剤。