CN111072770B - 卵转铁蛋白抗菌肽及其制备方法 - Google Patents

卵转铁蛋白抗菌肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种卵转铁蛋白抗菌肽及其制备方法。该方法将卵转铁蛋白热处理后胃蛋白酶水解，分离，纯化鉴定得到3条高活性抗菌肽。本发明通过加热的方法对蛋白做预处理，为胃蛋白酶水解得到高活性小分子抗菌肽奠定了良好的底物基础；同时采用弱阳离子色谱柱和反向液相色谱柱分离纯化，有利于获得抗菌活性高的肽序列，可应用于食品工业和医学领域。

Description

卵转铁蛋白抗菌肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物活性肽提取技术领域，具体而言，涉及一种卵转铁蛋白抗菌肽及其制备方法。
背景技术
鸡蛋是生物活性蛋白的重要来源，它含有卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵粘蛋白、卵球蛋白和溶菌酶等。卵转铁蛋白的分子量为76kDa，具有686个氨基酸残基和铁结合糖蛋白，占蛋清蛋白的12％。它由两个大小相似的球状小叶(N和C小叶)组成，每个小叶分为两个域(N中的域N1和N2-叶和C-叶中的C1和C2域)。近年来，已经报道了卵转铁蛋白各种生理益处，如抗菌、免疫调节、抗癌、抗病毒和抗氧化特性以及血管紧张素转化酶抑制活性。卵转铁蛋白在消化或加工过程中被降解为肽，这些生物活性肽对人类健康有积极的影响。
近年来，许多研究集中于从卵转铁蛋白分离和鉴定肽及其生物学活性。例如：卵转铁蛋白被嗜热菌蛋白酶和胃蛋白酶水解，最有效的抗氧化肽序列被鉴定出来，这些肽比整个蛋白质有更高的氧自由基吸收能力。此外，还证明了带有儿茶素的卵转铁蛋白肽增强了氧自由基吸收能力。卵转铁蛋白水解物作为体外抗氧化剂时显示出抗氧化应激的保护作用和明显的超氧阴离子清除活性。除抗氧化活性外，其他生物活性也被描述为存在于卵转铁蛋白水解产物中。从卵转铁蛋白水解物中鉴定出的两种三肽，均能减弱TNF-α诱导的炎症反应。此外，两步酶解卵转铁蛋白，发现了血管紧张素抑制肽，通过口服这种肽，高血压动物的血压显着降低。卵转铁蛋白抗马立克氏病毒活性也与肽有关，可用于阻断鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒的感染。还有研究发现，卵转铁蛋白的酶水解产物显示出比天然蛋白更强的抗癌活性。
卵转铁蛋白肽的功能特性众多，但是在众多的功能特性中，抗菌活性是最为重要的。随着细菌耐药性增强以及抗生素滥用加速了细菌耐药性，导致对新型高效抗生素的需求增加。抗菌肽被认为是具有广谱抗菌效果的小分子，因此抗菌肽有可能作为抗生素的替代品被应用于医药领域。
郑健等人研究了以卵转铁蛋白为原料，利用胃蛋白酶酶解技术制备抗菌活性肽(郑健,张铁华,张春红,张卓丹,陈玉江.卵转铁蛋白制备抗菌活性肽的研究.第九届中国蛋品科技大会论文集，2010年)，其实验结果表明，胃蛋白酶酶解卵转铁蛋白制备抗菌肽在温度为40℃，pH值为2.0，底物浓度为4％，酶的加入量为1％，水解时间为2h时，抑菌率达到90.36％；通过正交试验得出底物浓度及酶与底物浓度比对抑菌率的影响显著性水平达到0.05。并对在最优条件下得到的抗菌活性肽进行HPLC分析，确定分子量范围主要在5000-9000Da之间。然而，该方法并没有对其获得的抗菌活性高的水解物进行测序鉴定，并且其得到的抗菌活性肽的分子量较大。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种卵转铁蛋白抗菌肽及其制备方法，从而得到一种天然的具有很好抑菌效果的抗菌肽。
为实现上述技术目的，本发明人结合多年来对卵转铁蛋白的研究经验，并通过大量试验反复探索，最终获得了如下技术方案：
一种抗菌肽，该抗菌肽的氨基酸序列如序列表中如SEQ ID NO.1所示、SEQ IDNO.2或如SEQ ID NO.3所示。需要说明的是，所述的抗菌肽可以由卵转铁蛋白作为底物酶解获得，也可以采用基因工程技术重组表达获得。
一种上述抗菌肽的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)卵转铁蛋白的预处理
将卵转铁蛋白配制成1％～5％的溶液，在60～80℃的水浴中加热10～30min，并不断搅拌，然后冷却到35～40℃；
(2)胃蛋白酶酶解
将预处理得到的蛋白溶液调节pH为1.9～2.1，加入的胃蛋白酶，在35～40℃下酶解100～200min制得蛋白酶解物，离心后取上清液冷冻干燥，备用；
(3)弱阳离子柱分离纯化
将冷冻干燥的卵转铁蛋白酶解物溶解在醋酸缓冲液中，然后添加到
Figure BDA0002327609670000021
150系统的HiTrap CM FF离子交换色谱柱上，用4～6倍柱体积的醋酸缓冲液平衡该柱，然后进行线性洗脱，其中A液为乙酸缓冲液，B液为含1M氯化钠的乙酸缓冲液，收集各组分的洗脱液，冷冻干燥，备用；
(4)反向液相分离纯化
使用反相高效液相色谱系统，色谱柱为ZORBAX C18，4.6mm×250mm，5μm，将步骤(3)冻干的各组分分别溶解在Milli-Q水中，制成0.9-1.1mg/mL的溶液，注入色谱柱，梯度洗脱得到纯化的抗菌肽；所述梯度洗脱中按体积比计流动相的梯度设置如下：
Figure BDA0002327609670000031
所述的流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％TFA的乙腈溶液。
进一步优选地，如上所述抗菌肽的制备方法，其中步骤(1)中卵转铁蛋白配制成2％的溶液。
进一步优选地，如上所述抗菌肽的制备方法，其中步骤(2)中胃蛋白酶的加入量为卵转铁蛋白用量的1％～4％。
进一步优选地，如上所述抗菌肽的制备方法，其中步骤(2)酶解结束后采用8000-12000g的转速离心18-22min。
进一步优选地，如上所述抗菌肽的制备方法，其中步骤(3)中所述的醋酸缓冲液为pH4.0、20mM醋酸缓冲液。
进一步优选地，如上所述抗菌肽的制备方法，其中步骤(3)中洗脱时流速为1mL/min。
进一步优选地，如上所述抗菌肽的制备方法，其中步骤(4)中反相高效液相色谱系统的检测波长为280nm。
与现有技术相比，本发明的抗菌肽及其制备方法具有如下优点和进步性：
(1)本发明通过加热的方法对蛋白做预处理，为胃蛋白酶水解得到高活性小分子抗菌肽奠定了良好的底物基础。
(2)本发明采用弱阳离子色谱柱和反向液相色谱柱分离纯化，有利于获得抗菌活性高的肽序列，可应用于食品工业和医学领域。
附图说明
图1为水解产物对金黄色葡萄球菌抑菌圈。其中，1为阴性对照水；2、3分别为实施例1、实施列2的酶解混合物抑菌圈。
图2为离子交换色谱柱的分离纯化图以及每个组分的抑菌率。其中，A为离子交换色谱柱的分离纯化图；B为每个组分的抑菌率。
图3为液相色谱柱的分离纯化图以及每个组分的抑菌率。其中，A为液相色谱柱的分离纯化图；B为每个组分的抑菌率。
图4为本发明实施例1分离纯化所得抗菌肽的二级质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明实施例的制备方法仅仅是用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不是对本发明保护范围的限制，在总体构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1
(1)卵转铁蛋白的预处理
将卵转铁蛋白配制成2％的溶液，在80℃的水浴中加热20min并不断搅拌，然后冷却到35℃。
(2)胃蛋白酶酶解蛋白溶液
将蛋白溶液的pH值调节为2，加入1％的胃蛋白酶，在37℃下酶解100min制得蛋白水解物，10000g离心20min后取上清液在冷冻干燥机中冻干。
(3)弱阳离子柱分离纯化
将冷冻干燥的卵转铁蛋白水解物溶解在10mM乙酸缓冲液中，缓冲液的pH为3。样品溶液添加到
Figure BDA0002327609670000041
150系统的HiTrap CM FF离子交换色谱柱上。用5倍柱体积的乙酸缓冲液平衡柱子，然后进行线性洗脱，其中A液为乙酸缓冲液，B液为含1M氯化钠的乙酸缓冲液，以1.0mL/min的流速洗脱样品，并将不同组分的洗脱液冷冻干燥并在-20℃中储存。
(4)反向液相分离纯化
使用反相高效液相色谱系统，在ZORBAX C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。将冻干的样品溶解在Milli-Q水中，制成1mg/mL的溶液，并洗脱以1mL/min的流速注入色谱柱，洗脱液A为0.1％三氟乙酸的水溶液，洗脱液B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。流动梯度如下：0-5min,5％B；5-25min,5％-95％B；25-30min,5％B。
(6)鉴定肽序列
用LC-MS/MS鉴定抗菌肽序列。在C18色谱柱上，以300nL流速的0.1％FA(A)和0.1％FA的溶剂在80％ACN(B)中分离肽。流动梯度如下：0-5min，5％B；5-45分钟，5-50％B；45-55分钟，50％-90％B；55-65分钟，90％-5％B。洗脱液直接注入MS系统，MS分析使用以下参数进行操作：扫描范围100到2000m/z，全扫描分辨率7万；源温度100℃；自动增益控制(AGC)目标3e6；MS/MS扫描分辨率：17500；AGC，1e5。原始的MS/MS数据文件，并通过MM文件转换软件进行转换，以获得MGF文件，然后使用MASCOT检索Uniprot数据库到获得肽序列。
(7)抑菌活性的测定
通过液体生长抑制测定法测量肽的抗菌活性。使用以下公式计算每个样品的抑制百分比：抗菌活性(％)＝(A0-A)/A0×100，其中A是样品在600nm的吸光度，A0是对照在600nm的吸光度。金黄色葡萄球菌是肽纯化中使用的测试菌株。
纸片扩散法，用纸片扩散法测定抗菌肽的抗菌活性。将细菌涂布在琼脂培养基表面，然后将直径6mm的纸片放在培养基上面，在纸片上滴加10μL抗菌肽。然后在37℃下培养24h。用水作为阴性对照。
(8)统计分析。
每个实验至少重复三遍。结果表示为平均值±标准偏差。使用SPSS 23.0进行统计分析。显著差异是P值<0.05。分析肽的净电荷和疏水性。
表1为实施例1所得抗菌肽序列抑菌率及其理化性质
Figure BDA0002327609670000051
Figure BDA0002327609670000061
实施例2
(1)卵转铁蛋白的预处理
将卵转铁蛋白配制成2％的溶液，在80℃的水浴中加热20min并不断搅拌，然后冷却到35℃。
(2)胃蛋白酶酶解蛋白溶液
将蛋白溶液的pH值调节为2，加入1％的胃蛋白酶，37℃酶解100min制得蛋白水解物，10000g离心20min后，取上清液在冷冻干燥机中冻干。
(3)弱阳离子柱分离纯化
将冷冻干燥的卵转铁蛋白水解物溶解在10mM乙酸缓冲液中，缓冲液的pH为3。样品溶液添加到
Figure BDA0002327609670000062
150系统的HiTrap CM FF离子交换色谱柱上。用5倍柱体积的乙酸缓冲液平衡柱子，然后进行线性洗脱，其中A液为乙酸缓冲液，B液为含1M氯化钠的乙酸缓冲液，以1.0mL/min的流速洗脱样品，并将不同组分的洗脱液冷冻干燥并在-20℃中储存。
(4)反向液相分离纯化
使用反相高效液相色谱系统，在ZORBAX C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。将冻干的样品溶解在Milli-Q水中，制成1mg/mL的溶液，并洗脱以1mL/min的流速注入色谱柱，洗脱液A为0.1％三氟乙酸的水溶液，洗脱液B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。流动梯度如下：流动梯度如下：0-5分钟,5％B；5-25分钟,5％-95％B；25-30分钟,5％B。
(6)鉴定肽序列
用LC-MS/MS鉴定抗菌肽序列。在C18色谱柱上，以300nL流速的0.1％FA(A)和0.1％FA的溶剂在80％ACN(B)中分离肽。流动梯度如下：0-5分钟，5％B。5-45分钟，5-50％B；45-55分钟，50％-90％B；55-65分钟，90％-5％B。洗脱液直接注入MS系统，MS分析使用以下参数进行操作：扫描范围100到2000m/z，全扫描分辨率7万；源温度100℃；自动增益控制(AGC)目标3e6；MS/MS扫描分辨率：17500；AGC，1e5。原始的MS/MS数据文件，并通过MM文件转换软件进行转换，以获得MGF文件，然后使用MASCOT检索Uniprot数据库到获得肽序列。
(7)抑菌活性的测定
通过液体生长抑制测定法测量肽的抗菌活性。使用以下公式计算每个样品的抑制百分比：抗菌活性(％)＝(A0-A)/A0×100，其中A是样品在600nm的吸光度，A0是对照在600nm的吸光度。金黄色葡萄球菌是肽纯化中使用的测试菌株。
纸片扩散法，用纸片扩散法测定抗菌肽的抗菌活性。将细菌涂布在琼脂培养基表面，然后将直径6mm的纸片放在培养基上面，在纸片上滴加10μL抗菌肽。然后在37℃下培养24h。用水作为阴性对照。
(8)统计分析。
每个实验至少重复三遍。结果表示为平均值±标准偏差。使用SPSS 23.0进行统计分析。显著差异是P值<0.05。分析肽的净电荷和疏水性。
表2为实施例2所得抗菌肽序列抑菌率及其理化性质
Figure BDA0002327609670000071
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 卵转铁蛋白抗菌肽及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Phe Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Lys Pro Ile Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Leu Phe Gly Pro Pro Gly Lys Lys Asp Pro Val Leu Lys Asp Leu
1 5 10 15
Leu
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Gln Val Phe Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Lys Pro
1 5 10 15
Ile Ala Ala

Claims (8)

1.一种抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，其由卵转铁蛋白作为底物酶解获得。
3.一种根据权利要求1所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）卵转铁蛋白的预处理
将卵转铁蛋白配制成1%~5%的溶液，在60~80℃的水浴中加热10~30 min，并不断搅拌，然后冷却到35~40℃；
（2）胃蛋白酶酶解
将预处理得到的蛋白溶液调节pH为1.9~2.1，加入的胃蛋白酶，在35~40℃下酶解100~200min制得蛋白酶解物，离心后取上清液冷冻干燥，备用；
（3）弱阳离子柱分离纯化
将冷冻干燥的卵转铁蛋白酶解物溶解在乙酸缓冲液中，然后添加到ÄKTAPure 150系统的HiTrap CM FF离子交换色谱柱上，用4~6倍柱体积的乙酸缓冲液平衡该柱，然后进行线性洗脱，其中A液为乙酸缓冲液，B液为含1M氯化钠的乙酸缓冲液，收集各组分的洗脱液，冷冻干燥，备用；
（4）反向液相分离纯化
使用反相高效液相色谱系统，色谱柱为ZORBAX C18，4.6mm×250mm，5μm，将步骤（3）冻干的各组分分别溶解在Milli-Q水中，制成0.9-1.1mg/ mL的溶液，注入色谱柱，梯度洗脱得到纯化的抗菌肽；所述梯度洗脱中按体积比计流动相的梯度设置如下：
时间（min） 流动相A 流动相B 0～5 95% 5% 5～25 95%～5% 5%～95% 25～30 95% 5%
所述的流动相A为0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1%TFA的乙腈溶液。
4.根据权利要求3所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中卵转铁蛋白配制成2%的溶液。
5.根据权利要求3所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中胃蛋白酶的加入量为卵转铁蛋白用量的1%~4%。
6.根据权利要求3所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）酶解结束后采用8000-12000g的转速离心18-22min。
7.根据权利要求3所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（3）中洗脱时流速为1 mL/ min。
8.根据权利要求3所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）中反相高效液相色谱系统的检测波长为280nm。
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