DE3906871C2

DE3906871C2 -

Info

Publication number: DE3906871C2
Application number: DE3906871A
Authority: DE
Inventors: Ferenc Dr. Peterfy; Zsolt Pallai; Laszlo Budapest Hu Bali
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-03-04
Filing date: 1989-03-03
Publication date: 1991-08-14
Also published as: HUT49894A; IT1228559B; ATA47989A; JPH01281097A; CN1036961A; HU201100B; AT391482B; IT1228560B; DE3906871A1; IT8919634A0; IT8919633A0; IN169468B

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leukozyten-Interferon. Die Ansprüche 2 bis 9 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Das menschliche Leukozyten-Interferon (IFN) ist eine Gruppe von antiviral wirkenden Eiweißen. Außer der anti viralen Wirkung hat Interferon noch zahlreiche andere biologische Wirkungen: es hemmt die Zellwucherung bezie hungsweise Zellproliferation, aktiviert die natürlichen Killer-Zellen und beeinflußt auch auf andere Weise die Funktion des Immunsystems. Aus diesen Gründen ist Inter feron therapeutisch einsetzbar.

Therapeutisch verwendbares Interferon beziehungsweise Verfahren zur Herstellung von therapeutisch verwendbarem Interferon müssen verschiedenen speziellen Anforderungen gerecht werden. Interferon darf bakterielle Endotoxine nur in streng begrenzter Menge enthalten, das Verfahren muß von vornherein virenfrei sein, das Produkt soll ein möglichst breites Spektrum der biologisch aktiven Unter typen enthalten und auch die Ausbeute muß entsprechend sein.

Zur Herstellung von Interferon entsprechender Reinheit werden zahlreiche Verfahren angewandt, zum Beispiel Chro matographie an Sephadex®G-100 oder G 150 (Bodo, G.: Methods Enzymol. 78 [1981], 69) beziehungsweise an Ultragel AcA 54 (Withman, J. E. und Mitarbeiter: J. Interferon Res. 1 [1981], 305), Chromatographie an Sulfopropyl-Se phadex® (Bridgen, P. J. und Mitarbeiter: J. Biol. Chem. 252 [1977], 6 585), Chromatographie an Phenyl-Sepharose® (Whitman, J. E. und Mitarbeiter: J. Interferon Res. 1 [1981], 305), Cu-Chelat-Chromatographie (Berg, J.: Scand. J. Immunol. 11 [1980] 489) und CPG-Chromatographie (Chan da, K. C., I. Interferon Res. 2 [1982], 229).

Durch Kombination dieser Verfahren kann zwar homoge nes Interferon hergestellt werden, die Ausbeuten sind je doch gering, und nicht jedes Verfahren ist zur Maßstabs vergrößerung bis zur technischen beziehungsweise industri ellen Dimension geeignet.

Zur Herstellung größerer Mengen von therapeutisch ver wendbarem Interferon sind die folgenden Verfahren bekannt.

Das Verfahren von Cantell und Mitarbeitern (Methods Enzymol. 78 [1981] 499) zur Reinigung von Interferon be steht aus einer Reihe von pH-kontrollierten Fällungsschrit ten, durch die Interferon in 50%iger Ausbeute mit einer spezifischen Aktivität von 2 · 10⁶ IE/mg erhalten wird. Das rohe Leukozyten-Interferon wird bei einem pH-Wert von 3,5 mit Kaliumrhodanid gefällt, dann in saurem Äthanol ge löst, und die begleitenden Verunreinigungen werden durch stufenweises Erhöhen des pH-Wertes (5,3, dann 5,8) selektiv gefällt. Aus der äthanolischen Lösung wird das Interferon durch Erhöhen des pH-Wertes auf 8,0 gefällt und dann in einem 0,1 m Phosphatpuffer erneut gelöst. Der Puffer ent hält auch 0,5 m Kaliumrhodanid. Die Verunreinigungen wer den durch Senken des pH-Wertes auf 5,2 gefällt. Das bei diesem pH-Wert noch in Lösung befindliche Interferon wird bei einem pH-Wert von 3,0 gefällt, der Niederschlag in einem 0,1 m Phosphatpuffer (pH-Wert: 8,0) gelöst und ge gen eine physiologische Kochsalzlösung dialysiert.

Nach dem Verfahren der Wellcome Research Laboratories zur Reinigung von aus Namalva-Zellen stammendem Interferon (Reuveny, S. und Mitarbeiter: Ann. Virol. 133 [1982], 191) ist eine durchschnittliche spezifische Aktivität von 6 · 10⁷ IE/mg Eiweiß erreichbar. Das rohe Lymphoblastoid- Interferon wird mit 2,5%iger Trichloressigsäure gefällt und der Niederschlag bei einem pH-Wert von 3,5 mit 94%igem Äthanol extrahiert. Der äthanolische Auszug wird durch stufenweises Erhöhen des pH-Wertes gereinigt. Das auf diese Weise gereinigte Interferon wird durch Affini tätschromatographie mit polyklonalen Antikörpern gerei nigt.

Von den Forschern des New York Blood Center wurde ein zweistufiges chromatographisches Verfahren zur Herstellung von hochreinem Interferon beschrieben (Horowitz, B.: Me thods Enzymol. 119 [1986], 39). Das rohe Interferon wird an einer Füllung aus CPG-10775 adsorbiert und dann mit einem 50% Äthylenglykol enthaltenden Puffer eluiert. Das Eluat wird durch Affinitätschromatographie mit monoklona len Antikörpern weiter gereinigt (NK2-Sepharose®, Cell tech). Die erhaltene Substanz hat eine spezifische Aktivi tät von 3,6 · 10⁸ IE/mg Eiweiß und die Ausbeute beträgt 50%.

Ferner ist aus der DDR-PS 2 66 002 ein Verfahren zur Herstellung von α-und γ-Interferon durch Trennung der Leukozytenfraktion des Blutes, Entfernung der Erythrozyten, Suspendieren der Leukozyten in einer geeigneten Nährlösung und Behandlung mit einem α-Interferon-Induktor und einem γ-Interferon- Induktor, bei welchem das α-Interferon und γ-Interferon in nacheinanderfolgenden Stufen in derselben Leukozytenkultur erzeugt werden, indem die nach Trennung der Leukozytenfraktion des Blutes, Entfernung der Erythrozyten und Suspendieren der Leukozyten in einer geeigneten Nährlösung erhaltene Suspension mit α- oder β-Interferon vorbehandelt wird, mit einem α-Interferon-Induktor in Berührung gebracht wird, die α-interferonhaltige Flüssigkeit von den Zellen abgetrennt wird, das α-Interferon, falls es gewünscht wird, gewonnen wird, die Zellen gewaschen und in einer geeigneten Nährlösung suspendiert werden, mit einem mitogenen Mittel behandelt werden, die γ-interferonhaltige Flüssigkeit von den Zellen abgetrennt wird und, falls es erwünscht ist, das γ-Interferon gewonnen und gegebenenfalls α-interferonfrei gemacht wird, bekannt. Dabei kann zum Entfernen der Erythrozyten eine wäßrige Ammoniumchloridlösung verwendet werden, als Nährlösung eine solche mit einem Zusatz von menschlichem Serum eingesetzt werden und zum Induzieren die Leukozyten in einer Konzentration von 10⁶ bis 10⁸, vorteilhaft 10⁷, Zellen/ml in der Nährlösung suspendiert werden. Zur Reinigung und Konzentrierung des rohen γ-Interferons wird die "Controlled pore glass"-Chromatographie allein angewandt. Die Reinheit des so erhaltenen Leukozyten- Interferons läßt aber noch zu wünschen übrig und auch die Ausbeute ist nicht optimal.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfah ren zur Herstellung von menschlichem Leukozyten-Inter feron, durch welches dieses in höchster Reinheit viren frei, mit hoher spezifischer Aktivität und mit einem brei ten Spektrum der Interferon-Untertypen sowie in sehr gu ter Ausbeute und damit wirtschaftlich erhalten werden kann, zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfin dung erreicht.

Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß mit einem Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leu kozyten-Interferon, bei welchem das Reinigen durch eine Kombination der "Controlled pore glass"-Chromatographie mit alkoholischer Fraktionierung vorgenommen wird, und weitere im folgenden angegebene Bedingungen eingehalten werden, ein Produkt erhalten wird, welches den oben ange gebenen Bedingungen völlig gerecht wird. Das erhaltene Präparat ist hochrein, enthält sehr wenig Endotoxin, in folge bestimmter Schritte der Verfahrenstechnik bezie hungsweise Technologie werden etwaig in das Präparat ge langte Viren inaktiviert und es enthält ein breites Spek trum der Interferon-Untertypen, unter anderen einen bedeu tenden Anteil an säurelabilen Komponenten. Die Ausbeute ist sehr gut, das heißt, das Verfahren ist wirtschaftlich.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leukozyten-Interferon durch Abtrennen der Leukozyten, Entfernen der Erythrozyten mit einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung, Suspendieren der Leukozyten in entsprechender Nährlösung mit einem Zusatz von menschlichem Serum, Vorbehandeln mit Interferon, Induzieren der in einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 · 10⁷ Zellen/ml in der Nährlösung suspendierten Leukozyten mit einem geeigneten Inducer, Abtrennen der interferonhaltigen Lösung von den Zellen und Reinigen des rohen Interferons unter Anwendung der "Controlled pore glass"-Chromatographie, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reinigen mittels einer Kombination der "Controlled pore glass"-Chromatographie mit alkoholischer Fraktionierung vorgenommen wird.

Die vorteilhaften Eigenschaften des Leukozyten-Inter feron-Produktes werden durch die einzelnen Schritte des Verfahrens gewährleistet.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zum Reinigen zusätzlich zur Kombination der "Controlled pore glass"-Chromatographie mit alkoholischer Fraktionierung die Membrantechnik angewandt.

Vorteilhaft wird zur "Controlled pore glass"-Chromato graphie als Füllung "Controlled pore glass" 10/75 verwendet.

Zweckmäßig werden auf 1 ml Füllung 50 bis 200 ml rohes Interferon aufgebracht.

Vorzugsweise werden bei der "Controlled pore glass"- Chromatographie zum Eluieren 0,1 bis 1,5 Mol eines pri mären, sekundären oder tertiären Amines oder quaternären Ammoniumhydroxydes enthaltende Lösungen verwendet.

Es ist auch bevorzugt, die alkoholische Fraktionierung bei Temperaturen von 0 bis -40°C durchzuführen. Zur alko holischen Fraktionierung wird als Alkohol zweckmäßig Äthanol verwendet. Dabei ist die Verwendung von wasserhal tigem Alkohol umfaßt. Vorzugsweise wird zur alkoholischen Fraktionierung eine 55- bis 75vol.-%ige Alkoholendkonzen tration eingestellt, das heißt das Eluat bis zur Errei chung einer Alkoholendkonzentration von 55 bis 75 Vol.-% mit dem Alkohol versetzt.

Ferner ist es bevorzugt, zum Entfernen der Erythro zyten als Ammoniumchloridlösung eine 0,75- bis 0,9gew.-%ige, insbesondere 0,83gew.-%ige, auf einen pH-Wert von 6 bis 7,5, insbesondere 7,2 bis 7,4, gepufferte Ammonium chloridlösung, vorteilhaft bei 0 bis 5°C, zu verwenden.

Weiterhin ist es bevorzugt, daß in der Nährlösung als menschliches Serum über "Controlled pore glass" gereinig tes gammaglobulinfreies menschliches Serum in einer Menge von 0,5 bis 2,5 mg/ml eingesetzt wird.

Vorzugsweise werden zum Induzieren die Leukozyten in einer Konzentration von 1 bis 1,3 · 10⁷ Zellen/ml in der Nährlösung suspendiert.

Nach einer zweckmäßigen Ausführungsform des erfindungs gemäßen Verfahrens wird wie folgt vorgegangen.

Aus menschlichem Blut stammende Leukozyten (weiße Blutkörperchen) werden durch Hämolyse mit Ammoniumchlorid von den anhaftenden Erythrozyten (roten Blutkörperchen) befreit. Dabei ist es bevorzugt, die Hämolyse bei 0 bis 5°C mit einer 0,83gew.-%igen, auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4 gepufferten wäßrigen Ammoniumchloridlösung in zwei Schritten vorzunehmen. Im ersten Schritt wird das Gewichtsverhältnis von Zellensuspension zu Ammoniumchlorid zu 1 : 3 und im zweiten Schritt zu 1 : 9 gewählt. Aus dem Hämolysemedium werden die Leukozyten mit einer Beschleu nigung von 1000 bis 2000 g abzentrifugiert. Die erhal tene Leukozytensuspension wird in einer Nährlösung wie Eagle MEM, RPMI oder MSKD, die auch menschliches gamma globulinfreies Serum in einer Menge von 0,5 bis 2,5 mg/ml enthält, suspendiert, wobei die Konzentration etwa 1 bis 1,3 · 10⁷ Zellen/ml beträgt.

Zum Zwecke der Vorbehandlung wird die Zell kultur bei 37°C in Gegenwart von 100 bis 200 IE/ml mensch lichem Interferon 1,5 bis 3 Stunden lang bebrütet. An schließend wird die Interferon-Erzeugung durch Zusatz von 100 bis 200 HA-Einheiten/ml Sendei-Virus induziert. 1 bis 3 Stunden nach der Induktion werden die Bedingungen der Bebrütung (pH-Wert, Salzkonzentration, Temperatur, Zusatz von Wasserstoffperoxyd [H₂O₂]) in ge eigneter Weise geändert. Nach weiteren 15 bis 25 Stunden langem Bebrüten werden die Leukozyten durch Zentrifugie ren von der das rohe Interferon darstellenden Nährlösung abgetrennt.

Das Roh-Interferon wird durch Filtrieren von Schweb stoffen und Zelltrümmern befreit und dann durch eine das "Controlled pore glass" CPG 10/75 enthaltende Säule ge drückt, die vorher mit einer salzhaltigen Phosphatpuffer lösung (phosphate buffer saline [PBS]) durchgewaschen wor den war. Die Phosphatpufferlösung hat die folgende Zusam mensetzung:


mg/l
NaCl	8 800
KCl	220
Na₂HPO₄ · 12 H₂O	3 500
NaH₂PO₄ · H₂O	224
pH-Wert:	7,2 bis 7,4.

Das Interferon wird mit einem Puffergradienten (0,05 bis 0,1 m Tris HCl + 1,5 m NaCl, pH-Wert = 8,0) eluiert. Der Tris-Puffer enthält tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan, welches das Interferon nicht inaktiviert, jedoch die Tren nung verbessert. Es können auch andere Amine verwendet wer den.

Das Interferon-Eluat wird bei -20°C bis 55- bis 75 vol.-%igem Äthanol behandelt. Die gefällten Eiweiße wer den durch Zentrifugieren entfernt. Die das Interferon ent haltende überstehende äthanolische Flüssigkeit wird mit tels eines Ultrafilters auf das 10- bis 20fache aufkonzen triert, dann wird das Äthanol durch Diafiltration oder Dialyse gegen einen geeigneten Puffer ausgetauscht (Membrantechnik). Es ist auch möglich, das Interferon aus der alkoholischen Lösung erneut zu adsorbieren. Die nach der Diafiltration bezie hungsweise Dialyse erhaltene Interferon-Lösung ist hoch rein und kann sofort lyophilisiert werden.

Die Virenfreiheit ist durch die Kombination der genann ten Chromatographie mit der Behandlung mit 55- bis 75vol.-%igem Alkohol gewährleistet. Etwaig enthaltene Endotoxine werden ebenfalls durch die alkoholische Behandlung beseitigt, weil sie in den Niederschlag eingehen.

Da das Verfahren keine bei niedrigem pH-Wert vorgenom menen Schritte enthält, verlieren auch die säurelabilen Interferon-Untertypen nichts von ihrer Aktivität.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine aus menschlichem Blut stammende leukozytenreiche Blutfraktion (buffy coat) wird unter Eiskühlung mit dem dreifachen Volumen einer auf 0 bis +4°C gekühlten, 0,83 gew.-%igen Ammoniumchloridlösung 10 Minuten lang behan delt. Danach wird bei +4°C mit einer Beschleunigung von 1500 g zentrifugiert, wobei sich die Leukozyten absetzen. Die Leukozyten werden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und erneut mit 0 bis +4°C warmer, 0,83 gew.-%iger Ammoniumchloridlösung behandelt, dieses Mal jedoch mit dem neunfachen Volumen. Nach 10 Minuten wird unter den beschriebenen Bedingungen erneut zentrifugiert. Danach werden die Leukozyten in einer Konzentration von 1,0 · 10⁷ Zellen/ml in einer Nährlösung Eagle MEM suspen diert. Der Nährlösung wird in einer Menge von 1 mg/ml gammaglobulinfreies menschliches Serum zugesetzt. Die Zell kultur wird mit 150 IE/ml menschlichem Interferon versetzt und in einem Thermostaten bei 37°C 2 Stunden lang gerührt. Anschließend wird mit 100 HA-Einheiten (Hämagglutinin-Ein heiten) Sendei-Viren pro ml die Interferonproduktion indu ziert, und die Zellen werden weitere 15 bis 20 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Dann werden die Zellen von der das rohe IFN darstellenden IFN-haltigen Nährlösung durch Zen trifugieren abgetrennt.

Das Rohinterferon hat eine spezifische Aktivität von 200 000 IE/mg Protein.

Das Roh-IFN wird auf eine mit der oben angegebenen Phosphatpufferlösung vorbehandelte, mit CPG 10/75 gefüllte Säule aufgegeben, wobei man 1 Volumteil CPG auf 100 Volum teile Lösung verwendet. Nach der Adsorption werden die restlichen Eiweiße mit physiologischer Kochsalzlösung von der Säule gewaschen. Dann wird das Interferon mit 1,5 m NaCl enthaltendem Tris-Puffer eluiert. Das Eluat hat eine spezifische Aktivität von 10 000 000 IE/mg Protein. Das Eluat wird bei -20°C mit auf -20°C abgekühltem Äthanol vermischt, bis eine Alkoholendkonzentration von 75 Vol.-% eingestellt ist. Das äthanolische Gemisch wird 24 Stunden lang bei -20°C gelagert und dann zentrifugiert. Der Nie derschlag wird verworfen, die überstehende Flüssigkeit wird bei -20°C mittels eines Ultrafilters aufkonzentriert. Der Al kohol wird in einem anschließenden Diafiltrationsschritt gegen einen beliebigen Puffer ausgetauscht. Die erhaltene Flüssigkeit wird in Ampullen gefüllt und lyophilisiert.

Beispiel 2

Die Herstellung des rohen IFN und seine CPG-chromato graphische Reinigung erfolgen auf die im Beispiel 1 be schriebene Weise. Aus der resultierenden 75vol.-%igen alkoholischen Lösung kann das Interferon jedoch auch durch Ausfällen abgetrennt werden. Dazu wird die alkoholi sche Lösung gegen einen 30 Vol.-% Alkohol enthaltenden 0,05 m Citratpuffer (-10°C, pH-Wert 5) dialysiert. Das ausge fallene Eiweiß wird abzentrifugiert und in die entspre chende Menge physiologische Kochsalzlösung aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird unmittelbar filtriert.

Beispiel 3

Man arbeitet auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise, konzentriert jedoch die 75vol.-%ige alkoholische Lösung mit einem Ultrafilter und dialysiert mit nur 20 Vol.-% Alkohol enthaltendem Citratpuffer. Anschließend wird ge mäß Beispiel 2 gearbeitet.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leukozyten- Interferon durch Abtrennen der Leukozyten, Entfernen der Erythrozyten mit einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung, Suspendieren der Leukozyten in entsprechender Nährlösung mit einem Zusatz von menschlischem Serum, Vor behandeln mit Interferon, Induzieren der in einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 · 10⁷ Zellen/ml in der Nährlösung suspendierten Leukozyten mit einem geeigneten Inducer, Abtrennen der interferonhaltigen Lösung von den Zellen und Reinigen des rohen Interferons unter Anwendung der "Controlled pore glass"-Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reinigen mittels einer Kombination der "Controlled pore glass"-Chromatographie mit alkoholischer Fraktionierung vornimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Reinigen zusätzlich zur Kombination der "Controlled pore glass"-Chromatographie mit alkoholischer Fraktionierung die Membrantechnik anwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß man zur "Controlled pore glass"-Chromatographie als Füllung "Controlled pore glass" 10/75 verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man auf 1 ml Füllung 50 bis 200 ml rohes Interferon aufbringt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der "Controlled pore glass"-Chromatographie zum Eluieren 0,1 bis 1,5 Mol eines primären, sekundären oder tertiären Amines oder quaternären Ammoniumhydroxydes enthaltende Lösungen verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeich net, daß man die alkoholische Fraktionierung bei Temperaturen von 0 bis -40°C durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeich net, daß man zur alkoholischen Fraktionierung einen 55- bis 75vol.-%ige Alkoholendkonzentration einstellt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeich net, daß man zum Entfernen der Erythrozyten als Ammoniumchloridlösung eine 0,83gew.-%ige, auf einen pH-Wert von 6 bis 7,5 gepufferte Ammoniumchloridlösung verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeich net, daß man in der Nährlösung als menschliches Serum über "Controlled pore glass" gereinigtes gammaglobulinfreies menschliches Serum in einer Menge von 0,5 bis 2,5 mg/ml einsetzt.