HU201100B - Process for large-scale production of high purity human leukocyte alpha interferon with reduced endotoxin content and with improved therapeutic effect - Google Patents
Process for large-scale production of high purity human leukocyte alpha interferon with reduced endotoxin content and with improved therapeutic effect Download PDFInfo
- Publication number
- HU201100B HU201100B HU881050A HU105088A HU201100B HU 201100 B HU201100 B HU 201100B HU 881050 A HU881050 A HU 881050A HU 105088 A HU105088 A HU 105088A HU 201100 B HU201100 B HU 201100B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- interferon
- ifn
- cells
- ethanol
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 title claims description 14
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 title 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 title 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 title 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 15
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 5
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 2
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 claims 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims 1
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 7
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- BUKHSQBUKZIMLB-UHFFFAOYSA-L potassium;sodium;dichloride Chemical compound [Na+].[Cl-].[Cl-].[K+] BUKHSQBUKZIMLB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya új eljárás humán leukocita [/-interferon előállítására a vér fehérvérsejtdús frakciójának elválasztása, a vörősvértestek ammóniumkiorid-oldattal történő eltávolítása, a leukocitáknak foszfátsókkal pufferolt, az élettanilag szükséges aminosavakat, ásványi sókat és vitaminokat tartalmazó tápoldatban való szuszpendálása, a szuszpenzió humán leukocita oC-interferonnal történő előkezelése, az interferontermelés Sendai-virus hozzáadásával történő indukálása, az oC-interferontartalmú folyadéknak a sejtektől való elválasztása és a nyers humán oC-interferon tisztítása útján, oly módon, hogy a tisztítást szabályozott pórusméretű üvegen való adszorbeáltatásnak (controlled poré glass vagy CPG-kromatográfia) és alkoholos frakcionálásnak a kombinációjával végezzük.
A CPG-kromatográfia voltaképpen gél— permeációs kromatográfia, amely a vizes közegben duzzasztott üveggél pórusaiban végbemenő szelektív adszorpción alapuló szeparációs technika. Alkalmazása a találmány szerinti eljárásban előnyösen valósítható meg a .CPG' jelű (Sigma katalógusszám: 44710-12) üveg oszloptöltettel, melyet használat előtt az alkalmazott pufferben elöduzzasztunk.
A humán leukocita oC-interferon (oC-IFN) antivirális aktivitással rendelkező fehérjecsalád.
Az antivirális hatáson kivül számos biológiai hatással is rendelkezik: sejtproliferációt gátló hatású, aktiválja a természetes ölő sejteket, és egyéb módokon is befolyásolja az immunrendszer működését. Ezen tulajdonságok alapján az oí-IFN hatékonyan felhasználható terápiás készítményként is.
A terápiásán felhasználható oC-interferon gyártására alkalmas eljárásnak több különleges követelményt is ki kell elégítenie.
így csak szigorúan limitált mennyiségben tartalmazhat bakteriális endotoxínt, úgy hogy az eljárásnak még vírussal szennyezett alapanyagok felhasználása esetén is önmagában biztosítania kell a vírusmentességet és a biológiailag aktív altípusok minél szélesebb spektrumával kell rendelkeznie, továbbá a gazdaságosság érdekében a kihozatalnak is megfelelőnek kell lennie.
Megfelelő tisztaságú oí-IFN előállítására számos módszert alkalmaztak, igy például Sephadex G-100 vagy G-150 [Bodo, G.: Methods. Enzymol 78, 69 (1981)] illetve Ultragel AcA 54 [Whitman, J.E. et al: J. Interferon Rés. 1, 305 (1981)] kroniatográfiát, szulfo-propil-Sephadex-en végzett kromatográfiát [Bridgen, P.. et al., J. Bioi. Chem. 252, 6585 (1977)], Phenyl Sepharose-pn végzett kromatográfiát [Whitman, J.E. et al., J. Interferon Rés. 1, 305 (1981), Cu-kelát kromatográfiát [Berg.K., Scand.J.Immunoi. 11, 489 (1980)], CPG-kromatográfiát [Chanda,K.C. J.Interferon Rés. 2, 229, (1982)].
Noha a fenti módszerek kombinációival homogén oí-IFN preparátum nyerhető, a kitermelés meglehetősen alacsony, és nem mindegyik eljárás alkalmas a technológiai méretek növelésére.
Nagy mennyiségű, terápiás minőségű ct-IFN előállítására a következő módszereket dolgozták ki eddig.
Cantell és munkatársai olyan tisztítási eljárást dolgoztak ki, amely egy sorozat pH-kontrollált precipitációs lépésből áll, s amelynek eredményeként 2x10® IU/mg fehérje specifikus aktivitású oí-IFN nyerhető 50%-os kitermeléssel. A nyers leukocita oí-IFN-t pH=3,5 mellett KSCN-dal kicsapják, majd savas etanolban oldják, a szennyező anyagokat a pH lépcsőzetes emelésével (5,3, majd 5,8) szelektíven kicsapják. Az etanolos oldatból az cC-IFN-t, a pH 8,0-ra történő emelésével viszik csapadékba, majd 0,1 mól foszfátpufferben visszaoldják. A puffer 0,5 mól KSCN-ot is tartalmaz. A szennyezéseket a pH 5,2-re történő csökkentésével precipitólják. A még oldatban lévő cC-IFN-t pH=3,0-nál csapják ki. Ezt követően 0,1 mól pH=8,0 foszfátpufferben a csapadékot feloldják és foszfátokkal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS) szemben dializálják [Cantell et al., Methods of Enzymol. 78, 499 (1981)].
A Wellcome Research Laboratories tisztitási eljárást dolgozott ki Namalva sejtekből származó DÍ-IFN-ra. Az így nyerhető átlagos specifikus aktivitás 6.107 IU/mg fehérje. [Reuveny, S. et al., Ann.Virol. 133, 191 (1982)].
A nyers limfoblasztoid oí-IFN-t 2,5% triklórecetsavval kicsapják, majd a csapadékot 94%-os etanollal extrahálják pH=3,5-nél. Az etanolos extraktumot a pH lépésenként! emelésével tisztítják. Az így nyert of-interferont poliklonális ellenanyag-affinitás kromatográfiával tisztítják tovább.
Egy kétlépéses kromatográfiás eljárást dolgoztak ki magas tisztaságú oí-IFN előállítására a New York Blood Center munkatársai [Horowitz.B. Methods of Enzymol. 119, 39 (1986)]. A nyers oC-IFN-t CPG-10/75 tölteten adszorbeáltatják, majd 50% etilénglikolt tartalmazó pufferrel eluálják. A eluátumot monoklonális ellenanyag-affinitás kromatográfiával (NK2-Sepharose, Celltech) tisztítják tovább. A kapott anyag specifikus aktivitása 3,6x10® IU/mg fehérje, a kitermelés 50%-os.
A találmány szerinti eljárás alkalmazásával olyan termék nyerhető, amely az interferon-preparátummal, illetve az előállítási eljárással szemben támasztott alábbi követelményeknek megfelel:
- a termék endotoxintartalma a nemzetközileg elfogadott határértéknél kisebb, nem több mint 5 IU/106 iU oí-IFN;
- az eljárás önmagában biztosítja a végtermék nagyfokú tisztaságét és vírusmentességét még akkor is, ha a kiindulási anyagok vírussal szennyezettek voltak - a ké3
HU 201100 Β szitmény fajlagos aktivitása mintegy 1-5xl07 IU/mg fehérje (vö. a Cantell-módszer szerinti 2x10® IU/mg fehérje értékkel);
- a termék a biológiailag aktív altípusok minél szélesebb spektrumával rendelkezzék, beleértve a savlabilis komponenseket is;
- az eljárás üzemi méretben gazdaságosan alkalmazható legyen.
Találmányunk tárgya magas titerű nyers oC-IFN előállítása és ennek tisztítása controlled poré glass kromatográfla, etilalkoholos frakcionálás és membrántechnika kombinációjával. Az eljárás egyes lépései együttesen biztosítják a termék (oC-IFN) előnyös tulajdonságait, ezért módszerünk az önmagában ismert műveleti lépések előnyös, új kombinációját valósítja meg.
Eljárásunk során a humán vérből származó fehérsejteket a szennyező vörösvértestektól ammóniumkloridos hemolízissel tisztítjuk meg. Előnyösen járhatunk el úgy, ha a hemolízist 0-5 °C hőmérsékletű pH=7,2-7,4 értékre pufferolt 0,83%-os ammóniumklorid-oldattal végezzük két lépésben. Az első lépésben a sejtszuszpenzió/ammóniumklorid arány 1:3, a második lépésben 1:9. A hemolizáló közegből a fehérvérsejteket 1000-2000 -vei történő centrifugálással ülepítjük ki. Az igy nyert fehérvérsejt-szuszpenziót alkalmas tépoldatban szuszpendáljuk. Ilyen alkalmas tápoldatok a szakember számára jólismert módon azok az élettanilag szükséges sókat, aminosavakat és vitaminokat tartalmazó, közvetlenül felhasználható, pl. liofilizált tápoldatkészítmények, amelyeknek gyári jelzése pl. .Eagle MÉM (Serva), .RPMI vagy a magyar szakirodalomból (Béládi Ilona és munkatársai; 182.209 lajstromszámú magyar szabadalom) ismert .MSKD’ jelű tápoldat. A szuszpenzió koncentrációja 1-1,3x10’ sejt/ml. A tápoldat 0,5-2,5 mg/ml gammaglobulin-mentes humán szérumot is tartalmaz.
Előkezelés (priming) céljából 37 °C-on 100-200 IU/ml humán oC-IFN-nal inkubáljuk a sejtkultúrát 1,5-3 órán keresztül. Ezt követően 100-200 hemagglutinációs (HA) egység/ml Sendai-vírussal indukáljuk az oC-IFN termelést. A fehérvérsejteket centrifugálással választjuk el a tápoldattól; s a termék a nyers oC-IFN.
A nyers c<-IFN-t a lebegő szennyezésektől, sejttörmelékektól membránszüréssel tisztítjuk meg, majd CPG 10/75 töltetet tartalmazó oszlopon nyomjuk keresztül. A töltetet előbb PBS-sel átmossuk. Az oC-IFN-t 0,05-0,1 mól Tris.HCl + 1,5 mól NaCl-t tartalmazó 8,0 pH-jú oldattal eluáljuk.
Az oC-IFN tartalmú eluátumot -20 °C-on 55-75%-ob vizes etanollal frakcionálva tisztítjuk. A kicsapódott szennyező fehérjéket centrifugálással távolítjuk el. Az etanolos, oC-IFN tartalmú felülúszót ultraszűrővel a fordított ozmózis elve alapján 10-20-szorosára töményítjük, majd az etanolt diafiltrálással vagy dialízissel alkalmas pufféra cseréljük le. (Alkalmas pufferként utalunk az előzőek5 ben példaképpen megemlített pufferokra.) Eljárhatunk úgy is, hogy az cC-IFN-t az etanolos felülúszóból CPG-kromatográfia segítségével ismét adszorbeáltatjuk. Az igy nyert nagy tisztaságú oC-IFN oldat közvetlenül liofi— lezhető.
A vírusmentességet mind a CPG-kromatográfia, mind az 55-75 tf%-os etilalkoholos kezelés önmagában biztosítja. Az esetlegesen előforduló endotoxin is az alkoholos kezelés15 nél távolítható el, mivel az endotoxin a csapadékba kerül.
Minthogy az eljárás nem tartalmaz alacsony pH-η végrehajtott lépést, a savlabilis oC-IFN-altipusok sem veszítenek aktivitásuk20 ból.
1. példa
Humán vérből származó fehérvérsejtben dús vérfrakciót (buffy coat-ot) jeges hűtés mellett 10 percen keresztül háromszoros mennyiségű, 0- +4 °C-os, 0,83 tömeg%-os, pH=7,3-ra pufferolt ammóniumklorid-oldattal keverünk össze. A fehérvérsejtek kiülepitése céljából 10 perc elteltével +4 °C-on 1500 g-val centrifugálást végzünk. A fehérvérsejteket ezután PBS-(=phosphate óuffered saline)-oldatban szuszpendáljuk és a sejtszusz35 penzió kilencszeresét kitevő térfogatú, 0 -+4 °C-os, 0,83%-os ammóniumklorid-oldattal ismételten kezeljük.
A PBS-oldat összetétele az alábbi:
oldott anyag
NaCl KC1
Na2HPO4.12H2O
NaH2PO4.H2Ü
A PBS-oldat pH-ja: 7,2-7,4.
koncén tracio [mg/1] 8800 220 3500 224
Tíz perc elteltével az előbbivel azonos módon centrifugálással kiülepitjük a sejteket, majd 1,0x10’ sejt/ml koncentrációban Eagle MÉM tápoldatban szuszpendáljuk. A tépfolyadék adalékként 0,9 mg/ml gammaglobulin-mentes humán szérumot is tartalmaz. A sejtkultúrát 37 °C-os termosztátban 150 IU/ml humán oC-IFN hozzáadásával két órán át keverjük, majd 100 HA egység/ml Sendai-virussal indukáljuk az cC-IFN-termelődést és a sejteket további 15-20 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Eztán a sejteket centrifugálással választjuk el az cC-IFN tartalmú tápfolyadéktól, amely a nyers oC-IFN.
A PBS-sel egyensúlyba hozott CPG 10/75 töltetet tartalmazó oszlopra nyomjuk a nyers
HU 201100 Β ot-IFN-oldatot 100 ml/ml CPG mennyiségben. (Az oszloptöltet megjelenési formája üvegpor, amely vízben duzzad és gélesedik, ezért mennyisége ml-ben is megadható.) Foszfátpuffért tartalmazó sóoldattal (PBS) az oszlopon meg nem kötött fehérjéket kimossuk. Majd az ot-IFN-t 0,6 mól Tris.HCl puffért és 1,5 mól NaCl-ot tartalmazó, 8,6 pH-jú oldattal eluáljuk az oszlopról. Az eluátumot -20 °C-ra lehűtjük, -20 °C-os etanollal óvatosan elegyítjük úgy, hogy a végső alkoholkoncentráció 75 tf% legyen. Az etanolos elegyet 24 órán át -20 °C-on tároljuk, majd lecentrifugáljuk.
A csapadékot eldobjuk, a felülúszót pedig -20 °C-on ultraszürővel betöményitjük. Az etanolt diafiltrálással távolítjuk el, miközben a közeget vizes pufferoldatra (PBS) cseréljük le. Az így kapott anyagot ampullákba osztjuk szét és liofílizáljuk.
2. példa
A nyers oC-IFN előállítása, majd az ezt kővető CPG-kromatográfia megegyezik az 1. példában leírtakkal, azzal a különbséggel, hogy .agammá‘-ból 1,5 mg/ml-t használunk.
A 75%-os etanolos c<-IFN-oldatból az interferont kicsapással választjuk oly módon, hogy az előbbi alkoholos IFN-oldatot 30 tf% etanolt tartalmazó, 0,05 mólos, pH=5,0 citrátpufferral szemben dializáljuk -20 °C-on. A kicsapódott interferon-fehérjét centrifugálással kiülepítjük és megfelelő mennyiségű PBS-ben felvesszük. Az igy kapott terméket is közvetlenül liofílizáljuk.
3. példa
A 2. példában leírt módon járunk el, azonban a 75%-os etanolos oC-IFN-oldatot ultraszűrővel 8-10 mg/ml fehérjekoncentráció eléréséig betöményítjük, majd 20% etanolt tartalmazó, 0,05 mólos, pH=5,0 citrátpufferral szemben dializáljuk. A továbbiakban a kicsapódott fehérjét a 2. példában leírt módon kezeljük.
Claims (5)
1. Eljárás humán leukocita oC-interferon előállítására a vér fehérvérsejtdús frakciójának elválasztása, a vörösvértestek ammóniumklorid-oldattal történő eltávolítása, a leukocitáknak foszfátsókkal pufferolt, az élettanilag szükséges aminosavakat, ásványi sókat és vitaminokat tartalmazó tápoldatban való szuszpendálésa, a szuszpenzió humán leukocita oC-interferonnal történő előkezelése, az interferontermelés Sendai-vírus hozzáadásával történő indukélása, az oC-interferontartalmú folyadéknak a sejtektől való elválasztása és a nyers humán oC-interferon tisztítása útján, azzal jellemezve, hogy a vörösvértestek eltávolítására 6,0-7,5 pH-értékre pufferolt ammóniumklorid-oldatot használunk, a tápoldatot gammaglobulin-mentes humán vérszérum 0,5-2,5 mg/ml-nyi mennyiségével egészítjük ki, a fehérvérsejteket az indukcióhoz 0,5 . 10’ - 1,5 . 107 sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk a tápoldatban és a termék tisztítását adszorpciós kromatográfia és etanolos frakcionálás kombinációjával végezzük, oly módon, hogy az adszorpciós kromatográfiát szabályozott, átlagosan 70-80 A pórusméretű, 80-400 mesh szemcseméretű üveg állófázison hajtjuk végre.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adszorpciós kromatográfiás tisztításhoz állófázisként előduzzasztott üveg oszloptöltetet alkalmazunk.
3. Az 1-2. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oszloptöltet 1 ml-ére számítva 50-200 ml nyers oC-interferont viszünk fel.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oszlopról eluálódó folyadékot vizes etanollal oly módon elegyítjük, hogy az eluátumban az etanol végkoncentrációja 55 tf%-75 tf% legyen.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az etanolos kezelést 0° és -40 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU881050A HU201100B (en) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | Process for large-scale production of high purity human leukocyte alpha interferon with reduced endotoxin content and with improved therapeutic effect |
| IN179/MAS/89A IN169468B (hu) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | |
| IN178/MAS/89A IN169467B (hu) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | |
| JP1050210A JPH01281097A (ja) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | ヒトインターフェロンの製造方法 |
| DE3906871A DE3906871A1 (de) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | Verfahren zur herstellung von menschlichem leukozyten-interferon |
| AT0047989A AT391482B (de) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | Verfahren zur industriellen herstellung von hochreinem menschlichem leukozyteninterferon |
| IT8919634A IT1228560B (it) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | Procedimento per la preparazione su scala industriale di interferon di leucocita umano ad alta purezza e terapeuticamente utile. |
| IT8919633A IT1228559B (it) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | Procedimento per la preparazione di enzima mieloperossidasi. |
| CN89102018.7A CN1036961A (zh) | 1988-03-04 | 1989-03-04 | 高纯度治疗上有用的人类白细胞干扰素的工业规模制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU881050A HU201100B (en) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | Process for large-scale production of high purity human leukocyte alpha interferon with reduced endotoxin content and with improved therapeutic effect |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT49894A HUT49894A (en) | 1989-11-28 |
| HU201100B true HU201100B (en) | 1990-09-28 |
Family
ID=10952636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU881050A HU201100B (en) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | Process for large-scale production of high purity human leukocyte alpha interferon with reduced endotoxin content and with improved therapeutic effect |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01281097A (hu) |
| CN (1) | CN1036961A (hu) |
| AT (1) | AT391482B (hu) |
| DE (1) | DE3906871A1 (hu) |
| HU (1) | HU201100B (hu) |
| IN (1) | IN169468B (hu) |
| IT (2) | IT1228559B (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2888443B2 (ja) * | 1989-12-07 | 1999-05-10 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法 |
| CN104622777A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-05-20 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种白细胞提取物及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7907791A (nl) * | 1979-10-23 | 1981-04-27 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| US4382027A (en) * | 1981-08-18 | 1983-05-03 | Meloy Laboratories, Inc. | Purification of human immune interferon |
| JPS5889196A (ja) * | 1981-11-24 | 1983-05-27 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | インタ−フエロンの精製法 |
| HU184972B (en) * | 1981-12-01 | 1984-11-28 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | Process for preparing human gamma interferone |
| HU192254B (en) * | 1983-12-13 | 1987-05-28 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | Process for producing human leucocite and human gamma interferons in consecutive steps |
-
1988
- 1988-03-04 HU HU881050A patent/HU201100B/hu not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-03-03 IT IT8919633A patent/IT1228559B/it active
- 1989-03-03 AT AT0047989A patent/AT391482B/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-03 JP JP1050210A patent/JPH01281097A/ja active Pending
- 1989-03-03 DE DE3906871A patent/DE3906871A1/de active Granted
- 1989-03-03 IN IN179/MAS/89A patent/IN169468B/en unknown
- 1989-03-03 IT IT8919634A patent/IT1228560B/it active
- 1989-03-04 CN CN89102018.7A patent/CN1036961A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT8919633A0 (it) | 1989-03-03 |
| DE3906871C2 (hu) | 1991-08-14 |
| IT8919634A0 (it) | 1989-03-03 |
| IN169468B (hu) | 1991-10-19 |
| HUT49894A (en) | 1989-11-28 |
| JPH01281097A (ja) | 1989-11-13 |
| AT391482B (de) | 1990-10-10 |
| IT1228560B (it) | 1991-06-21 |
| DE3906871A1 (de) | 1989-09-21 |
| ATA47989A (de) | 1990-04-15 |
| CN1036961A (zh) | 1989-11-08 |
| IT1228559B (it) | 1991-06-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5177194A (en) | Process for purifying immune serum globulins | |
| US7125552B2 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates | |
| GB2037296A (en) | Purified proteins, especially interferon and process therefor | |
| EP0110302A2 (en) | Method for producing monomeric interferons | |
| JPS6136228A (ja) | 肝炎表面抗原の精製方法 | |
| NZ203364A (en) | Method for purifying human immune interferon;homogeneous human immune interferon | |
| US4617378A (en) | Purification of biologically active human immune interferon | |
| EP0138167A1 (en) | Method for purification of HBs antigen | |
| JPS6338330B2 (hu) | ||
| JPH0428279B2 (hu) | ||
| CA1340281C (en) | Process for preparing and purifying alpha-interferon | |
| HU201100B (en) | Process for large-scale production of high purity human leukocyte alpha interferon with reduced endotoxin content and with improved therapeutic effect | |
| US5391713A (en) | Interferon purification process | |
| US4526782A (en) | Process for recovering interferon | |
| US4723000A (en) | Human interferon gamma and interleukin-2 | |
| KR840001516B1 (ko) | 인체 섬유아세포 인터페론의 제조방법 | |
| EP0478659B1 (en) | Interferon purification process | |
| GRAHAM et al. | Separation and partial characterization of erythropoietin from human urine | |
| MXPA06006357A (es) | Proceso para purificar interferon beta. | |
| KR960013393B1 (ko) | 재조합 효모에서 발현된 알파 인터페론의 정제방법 | |
| KR920009503B1 (ko) | 재조합 인 알파-인터페론의 정제방법 | |
| Herring et al. | Rapid purification of leukocyte interferons by high-performance liquid chromatography | |
| FI80599C (fi) | Foerfarande foer rening av maenniskoleukocytinterferon. | |
| KAPLAN | PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF RAT FIBROBLAST DERIVED INTERFERON | |
| JPS61207334A (ja) | 腫瘍細胞障害性物質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HC9A | Change of name, address |
Owner name: EGIS GYOGYSZERGYAR NYRT., HU Free format text: FORMER OWNER(S): EGIS GYOGYSZERGYAR, HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |