FI80599C

FI80599C - Foerfarande foer rening av maenniskoleukocytinterferon.

Info

Publication number: FI80599C
Application number: FI862737A
Authority: FI
Inventors: Anatoly Mikhailovich Pivovarov; Leonid Pavlovich Korobitsyn; Vladimir Artemovich Pasechnik; Jury Petrovich Zerov; Svetlana Vladimirovn Shatinina; Alexandr Kolosovich Pashkovsky; Natalya Anatolievna Scheglova; Anatoly Platonovich Sharapov; Vladimir Alexeevich Udovchenko
Original assignee: Vnii Osobo Chistykh Bioprepara
Priority date: 1984-09-21
Filing date: 1986-06-26
Publication date: 1990-07-10
Also published as: EP0195084B1; HUT40575A; DE3482307D1; WO1986001723A1; EP0195084A4; JPS62500237A; EP0195084A1; HU193078B; FI862737A; FI862737A0; FI80599B; JPH0521120B2; HU193472B

Description

1 80599

Menetelmä ihmisen leukosyyttiperäisen interferonin puhdistamiseen

Keksinnön alue 5 Keksintö koskee biokemiallisia taitoja ja erityisem min ihmisen leukosyyttiperäisen interferonin puhdistusmenetelmiä .

Keksinnön tausta

Sinänsä tunnettu on menetelmä ihmisen leukosyytti-10 peräisen interferonin puhdistamiseen (kts. Cantell K.,

Hirvonen S., Interferon System, A Current Review to 1978, Ed. S. Baron, F. Dianzani, 1977, nro 35, sivu 138), joka käsittää proteiinien saostamista kaliumtiosyanaattiliuok-sen avulla, proteiinisaostuman erottamista ja halutun 15 tuotteen talteenottamista monivaiheisen uuton avulla etano lilla happamassa väliaineessa.

Tämä menetelmä mahdollistaa halutun tuotteen saannon, jonka spesifinen aktiivisuus yltää 10^ IU/mg proteiinia .

20 Yllämainitun spesifisen aktiivisuuden omaava halut tu tuote voidaan kuitenkin saavuttaa vain jos väliaineen pH on 0,01 tarkkuudella, josta syystä tämän menetelmän kaupallinen toteuttaminen tulee varsin kyseenalaiseksi.

Lisäksi menetelmä on työläs, koska se sisältää seit-25 semänvaiheisen etanoliuuton happamassa väliaineessa.

Sinänsä tunnettu on myös ihmisen leukosyyttiperäisen interferonin puhdistamiseen (kts. Anfinsen C.G., Proc. Natl. Acad. Sei., "The Process for Making Interferon", 1974, 71, 3139), joka käsittää alkuperäisten proteiinien 30 saostamista ammoniumsulfaatin avulla, proteiinisaostu man erottamista, erotetun saostuman liuottamista sekä halutun tuotteen geelisuodattamista.

Tämä menetelmä ei kuitenkaan mahdollista halutun tuotteen korkean saannon ja korkean puhtausasteen saavut-35 tamista, johtuen interferonin aggregoitumisesta raskaiden proteiinien kanssa geelisuodatuksen aikana.

2 80S99

Keksinnön selostus

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on aikaansaada ihmisen leukosyyttiperäisen interferonin puhdistusmenetelmään oikein valikoituja geelisuodatusolosuhteita siten, 5 että taataan halutun tuotteen korkeampi saanto ja suurempi puhtaus.

Tämä aikomus aikaansaadaan esillä olevan keksinnön mukaisessa ihmisen leukosyyttiperäisen interferonin puhdistusmenetelmässä, joka koostuu alkuperäisten proteiinien saos-10 tamisesta ammoniumsulfaatin avulla, proteiinisaostuman erottamisesta, erotetun saostuman liuottamisesta ja halutun tuotteen geelisuodatuksesta, siten että liuotetaan saostuma puskuriin, jonka pH on 2,5 - 9,0 ja joka sisältää aggre-goitumista estävän aineen, sekä lisätään pylvääseen samaa 15 puskuria 3-5 % pylvään tilavuutta vastaava määrä ennen geelisuodatusta.

Saostuman liuotusvaiheiden suorittaminen aggregoitu-mista estävän aineen läsnäollessa mahdollistaa proteiini-kompleksien hajoamisen, joka johtaa halutun tuotteen parem-20 paan puhtauteen ja korkeampaan saantoon.

Interferoni on epästabiili pH-arvoja yli 9,0 ja alle 2,5 omaavissa väliaineissa.

Jos proteiinin liuottamisessa käytettyä puskuria lisätään pylvääseen ennen geelisuodatusta pienemmässä ti-25 lavuudessa kuin 3 % pylvään tilavuudessa tapahtuu geeli-suodatuksen aikana proteiinikompleksien osittainen väheneminen, joka johtaa alhaisempaan puhtausasteeseen ja halutun tuotteen hukkaan.

Jos puskuria lisätään pylvääseen enemmän kuin 5 % 30 pylvään tilavuudesta, aggregoitumista estävä aine tunkeutuu haluttuun tuotteeseen.

On suositeltavaa käyttää ureaa aggregoitumista estävänä aineena puskurissa 2,0 - 8,0 M konsentraatiossa.

n 3 80599

Urean konsentraation puskurissa ollessa alle 2,0 M tapahtuu proteiinikompleksien täydellinen hajoaminen, joka aiheuttaa halutun tuotteen alhaisempaa puhdistumisas-tetta ja sen alennettua saantoa.

5 Urean konsentraation puskurissa ollessa yli 8,0 muodostuu urean saostuma.

Esillä olevan keksinnön toisessa muodossa voidaan käyttää guanidiinikloriidia aggregoitumista estävänä aineena puskurissa 1,0 - 6,0 M konsentraatiossa.

10 Guanidiinikloriidin määrän puskurissa laskiessa alle 1,0 M ei tapahdu proteiinikompleksien täydellistä hajoamista, joka alentaa halutun tuotteen puhdistusastet-ta ja saantoa.

Guanidiinikloriidin määrän puskurissa noustessa 15 yli 6,0 M tapahtuu guanidiinikloriidin saostuminen.

Keksinnön suorittamisen paras muoto

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan seuraavalla tavalla.

Alkuperäiseen interferoniin lisätään ammoniumsul-20 faattia konsentraatioon, joka on vähintään 70 % saturoi vasta, leukosyyttiperäisen interferonin ja muiden proteiinien saostamiseksi. Saostuma erotetaan sentrifugoimalla. Talteenotettu proteiinijäännös liuotetaan 0,1 M puskuri-liuokseen, jonka pH on 2,5 - 9,0 ja joka sisältää aggre-25 goitumista estävää ainetta.

Ennen geelisuodatusta lisätään geeliä sisältävään pylvääseen samaa aggregoitumista estävää ainetta sisältävää puskuria 3-5 % pylvään tilavuuden määrästä.

Geelisuodatus suoritetaan geelissä jonka proteiini-30 erotusalue molekyylipainon perusteella on 5-70 kD.

Geelinä käytetään ultrageeli tai mikä tahansa muu geeli, joka on suhteellisen stabiili aggregoitumista estävän aineen suhteen, mahdollistaakseen 5-70 kD molekyyli-painon omaavien proteiinien tehokas erotus.

4 80599

Interferonin eluutio pylväästä suoritetaan 0,1 -0,2 M puskuriliuoksella, jonka pH on 2,5 - 9,0.

Aggregoitumista estävän aineen määrä puskuriliuoksessa ja geelitäytetyssä pylväässä valitaan käytettyjen 5 lähtöaineiden erityisominaisuuksien perusteella.

Esimerkki 1 8810 mlraan alkuperäistä interferonia (2000 IU/ml, 2 mg/ml proteiinia) lisätään 4405 g ammoniumsulfaattia. Muodostunut proteiinisaostuma erotetaan sentrifugoimalla.

10 Talteenotettu proteiinisaostuma liuotetaan 0,1 M fosfaat

tipuskuriin, jonka pH on 2,5 ja joka sisältää 8M ureaa liuoksessa. Ultrageelillä täytetty K 100/100 pylväs tasapainotetaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 2,5 ja siihen lisätään 240 ml (3 % pylvään tilavuudesta) 8 M

15 urealiuosta samassa puskurissa. Välittömästi tämän jälkeen pylvääseen lisätään interferoniliuos ja eluoidaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 2,5. Kerätyn aktiivisen fraktion tilavuus on 700 ml. Puhdistetulla tuotteella on spesifinen aktiivisuus 500.000 IU/mg proteiinia, tilavuus- 7 20 aktiivisuus 100.000 IU/ml ja kokonaisaktiivisuus 7x10 IU.

Esimerkki 2 8585 ml:aan alkuperäistä interferonia (3000 IU/ml, 2 mg/ml proteiinia) lisätään 4292 g ammoniumsulfaattia. Muodostunut proteiinisaostuma erotetaan sentrifugoimalla.

25 Talteenotettu proteiinisaostuma liuotetaan 0,1 M fosfaat tipuskuriin, jonka pH on 6,0 ja joka sisältää 6 M ureaa. Ultrageelillä täytetty K 100/100 pylväs tasapainotetaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 6,0 ja siihen lisätään 400 ml (5 % pylvään tilavuudesta) 6 M urealiuos- 30 ta samassa puskurissa. Välittömästi tämän jälkeen pylvää seen lisätään interferoniliuos ja eluoidaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 6,0. Kerätyn aktiivisen fraktion tilavuus on 1360 ml. Puhdistetulla tuotteella on spesifinen aktiivisuus 300.000 IU/mg proteiinia, tilavuus- 7 35 aktiivisuus 75.000 IU/ml ja kokonaisaktiivisuus 9,7x10 IU.

Il 5 80599

Esimerkki 3 8270 ml:aan alkuperäistä interferonia (2480 IU/ml, 1 mg/ml proteiinia) lisätään 4135 g ammoniumsulfaattia. Muodostunut proteiinisaostuma erotetaan sentrifugoimalla.

5 Talteenotettu proteiinisaostuma liuotetaan 0,1 M fosfaatti-puskuriin, jonka pH on 9,0 ja joka sisältää 4 M ureaa. Ult-rageelillä täytetty K 100/100 pylväs tasapainotetaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 9,0 ja siihen lisätään 320 ml (4 % pylvään tilavuudesta) 4 M urealiuosta samassa 10 puskurissa. Välittömästi tämän jälkeen pylvääseen lisätään interferoniliuos ja eluoidaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 9,0. Kerätyn aktiivisen fraktion tilavuus on 900 ml. Puhdistetulla tuotteella on spesifinen aktiivisuus 50.000 IU/mg proteiinia, tilavuusaktiivisuus 20.000 IU/ml 7 15 ja kokonaisaktiivisuus 1,8x10 IU.

Esimerkki 4 8980 ml:aan alkuperäistä interferonia (4960 IU/ml, 3 mg/ml proteiinia) lisätään 4490 g ammoniumsulfaattia. Muodostunut proteiinisaostuma erotetaan sentrifugoimalla.

20 Talteenotettu proteiinisaostuma liuotetaan 0,1 M fosfaattipuskuriin, jonka pH on 7,0 ja joka sisältää 2,0 M ureaa. Ultrageelillä täytetty K 100/100 pylväs tasapainotetaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 7,0 ja siihen lisätään 300 ml (3,75 % pylvään tilavuudesta) 2 M urea- 25 liuosta samassa puskurissa. Välittömästi tämän jälkeen pylvääseen lisätään interferoniliuos ja eluoidaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 7,0. Kerätyn aktiivisen fraktion tilavuus on 1280 ml. Puhdistetulla tuotteella on spesifinen aktiivisuus 400.000 IU/mg proteiinia, tilavuus- 7 30 aktiivisuus 70.000 IU/ml ja kokonaisaktiivisuus 9,4x10 IU.

Esimerkki 5 750 ml:aan alkuperäistä interferonia (3500 IU/ml, 3,3 mg/ml proteiinia) lisätään 308 g ammoniumsulfaattia. Muodostunut proteiinisaostuma erotetaan sentrifugoimalla.

35 Talteenotettu proteiinisaostuma liuotetaan 0,1 M fosfaat- 6 80599 tipuskuriin, joka sisältää 1 M guanidiinikloriidia. Ultra-geelillä täytetty K 50/100 pylväs tasapainotetaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 7,0 ja siihen lisätään 80 ml (4 % pylvään tilavuudesta) 1M guanidiinikloriidia 5 samassa puskurissa. Välittömästi tämän jälkeen pylvääseen lisätään interferoniliuos ja eluoidaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 7,0. Kerätyn aktiivisen fraktion tilavuus on 200 ml. Puhdistetulla tuotteella on spesifinen aktiivisuus 30.000 IU/mg proteiinia, tilavuusaktiivisuus 10 15.000 IU/ml ja kokonaisaktiivisuus 6x10 IU.

Esimerkki 6 760 ml:aan alkuperäistä interferonia (3500 IU/ml, 3,3 mg/ml proteiinia) lisätään 310 g ammoniumsulfaattia. Muodostunut proteiinisaostuma erotetaan sentrifugoimalla. 15 Talteenotettu proteiinisaostuma liuotetaan 0,1 M fosfaat tipuskuriin, jonka pH on 7,0 ja joka sisältää 6 M guanidiinikloriidia. Ultrageelillä täytetty K 50/100 pylväs tasapainotetaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 7.0 ja siihen lisätään 60 ml (3 % pylvään tilavuudesta) 20 6 M guanidiinikloriidia samassa puskurissa. Välittömästi tämän jälkeen pylvääseen lisätään interferoniliuos ja eluoidaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 7,0. Kerätyn aktiivisen fraktion tilavuus on 220 ml. Puhdistetulla tuotteella on spesifinen aktiivisuus 35.000 IU/mg 25 proteiinia, tilavuusaktiivisuus 15.000 IU/ml ja kokonaisaktiivisuus 6,2x10^ IU.

Esimerkki 7 935 ml:aan alkuperäistä interferonia (2000 IU/ml, 2.0 mg/ml proteiinia) lisätään 466 g ammoniumsulfaattia.

30 Muodostunut proteiinisaostuma erotetaan sentrifugoimalla.

Talteenotettu proteiinisaostuma liuotetaan 0,1 M fosfaattipuskuriin, jonka pH on 3 ja joka sisältää 3 M guanidiinikloriidia. Ultrageelillä täytetty K 50/100 pylväs tasapainotetaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 3,0 35 ja siihen lisätään 60 ml (3 % pylvään tilavuudesta) 3 M

II

7 80599 guanidiinikloriidia samassa puskurissa. Välittömästi tämän jälkeen pylvääseen lisätään interferoniliuos ja eluoidaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 3,0. Kerätyn aktiivisen fraktion tilavuus on 240 ml. Puhdistetulla tuotteel-5 la on spesifinen aktiivisuus 96.000 IU/mg proteiinia, ti-lavuusaktiivisuus 32.000 IU/ml ja kokonaisaktiivisuus 7,7x106 IU.

Esimerkki 8 1230 ml:aan alkuperäistä interferonia (7000 IU/ml, 10 3,5 mg/ml proteiinia) lisätään 613 g ammoniumsulfaattia.

Muodostunut proteiinisaostuma erotetaan sentrifugoimalla. Talteenotettu proteiinisaostuma liuotetaan 0,1 M fosfaatti-puskuriin, jonka pH on 8,0 ja joka sisältää 4 M guanidiinikloriidia. Ultrageelillä täytetty K 50/100 pylväs tasa-15 painotetaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 8,0 ja siihen lisätään 60 ml (3 % pylvään tilavuudesta) 4 M guanidiinikloriidia samassa puskurissa. Välittömästi tämän jälkeen pylvääseen lisätään interferoniliuos ja eluoidaan 0,1 M fosfaattipuskurilla, jonka pH on 8,0. Kerätyn 20 aktiivisen fraktion tilavuus on 250 ml. Puhdistetulla tuotteella on spesifinen aktiivisuus 20.000 IU/mg proteiinia, tilavuusaktiivisuus 10.000 IU/ml ja kokonaisaktiivisuus 5x106 IU.

Teollinen soveltuvuus 25 Esillä oleva keksintö voidaan mitä menestykselli simmin käyttää lääketeollisuudessa minkä tahansa menetelmän mukaisesti luovuttajan tai ruumiin veren leukosyyteistä saadun ihmisen leukosyyttiperäisen interferonin puhdistamiseen.

Claims

8 80599

1. Menetelmä ihmisen leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi seostamalla natiivi proteiinit ammoniumsul- 5 faatilla, erottamalla proteiini saostuma, liuottamalla erotettu saostuma ja geelisuodattamalla haluttu tuote, tunnettu siitä, että saostuma liuotetaan puskuri-liuokseen, jonka pH-arvo on 2,5 - 9,0 ja joka sisältää aggregoitumista estävää ainetta, ja että ennen geelisuo-10 datusta pylvääseen lisätään samaa puskuria määränä 3-5 % laskettuna pylvään tilavuudesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuriliuoksessa käytetään aggregoitumista estävänä aineena karbamidia pitoisuutena 15 2,0 - 8,0 mol/1.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuriliuoksessa käytetään aggregoitumista estävänä aineena pitoisuutena 1,0 - 6,0 mol/1 guanadiinikloridia. li 9 80599