HU193472B

HU193472B - Process for purification of human leucocite interferon

Info

Publication number: HU193472B
Application number: HU85185A
Authority: HU
Inventors: Anatoly M Pivovarov; Vladimir A Pasechnik; Svetlana V Goncharova; Natalya A Scheglova; Vladimir A Udovchenko; Leonid P Korobitsyn; Jury P Zerov; Aleksandr K Pashkovsky; Anatoly P Sharapov
Original assignee: Vni Sky I Osobo Chistkykh Biop
Priority date: 1984-09-21
Filing date: 1984-09-21
Publication date: 1987-10-28
Also published as: FI862737A0; EP0195084A4; HU193078B; HUT40575A; JPS62500237A; FI862737A; EP0195084A1; FI80599C; DE3482307D1; JPH0521120B2; EP0195084B1; FI80599B; WO1986001723A1

Description

A találmány a biokémia területére vonatkozik és tárgya eljárás az emberi leukocita interferon tisztítására.

Az emberi leukocita interferon tisztítására ismeri egy eljárás (Cantell K.Hirvonen S., Interferon System, A’Current Review to 1978, Ed. S. Báron, F. Dianzani, I977, Nr. 35, S. 138), amelyben a fehérjét kálium-tiocianát oldattal kicsapják, a fehérjecsapadékot elválasztják és a végterméket savas közegben etanollal többfokozatú extrakcióval izolálják.

Ezzel az eljárással 10 ΙΕ/mg fehérje specifikus aktivitású végterméket állítanak elő.

Azonban az eljárás nagyipari méretekben történő alkalmazását rendkívül megnehezíti, hogy a végterméket a megadott specifikus aktivitással csak 0,01 pontosságú pH értékű közeg betartásával lehetséges előállítani.

Ezen kívül ez az eljárás rendkívül munkaigényes is, ugyanis savas közegben hétfokozatú etanolos extrakció szükséges.

Ismert másik eljárás az emberi leukocita interferon tisztítására is (C B. Anfinsen, Proc. Nat. Acad. Sci., „The process of making interferon”, 1974,71, 3139), amelyben a natív fehérjét ammónium-szulfáttal kicsapják, a fehérje csapadékot elválasztják, az elválasztott csapadékot feloldják és a végterméket gélszüréssel állítják elő.

Ezzel az eljárással azonban nem valósítható meg nagy kitermelés és nagy tisztaság, amely arra vezethető vissza, hogy az interferon a gél szűrés során a nehéz fehérjékkel aggregálódik.

A találmányunk célja, hogy olyan eljárást valósítsunk meg az emberi leukocita interferon tisztítására, amelyben a gélszürés feltételeit úgy választhatjuk meg, hogy a végtermék kitermelése és tisztasága is fokozódjék.

A feladatot úgy oldottuk meg, hogy az emberi leukocita interferon tisztítására szolgáló eljárásban a natív fehérjét ammónium-szulfáttal kicsaptuk, a fehérje csapadékot elválasztottuk, az elválasztott csapadékot feloldottuk és a végterméket gólszűréssel előállítottuk. A találmány szerinti eljárásban a csapadékot egy 2,5-9,0 pH-jú, 1,0-8,0 mól/l koncentrációjú dezaggregáló reagenst tartalmazó pufferban feloldottuk és gélszürés előtt ugyanennek a puffernak 35% kolonna térfogatnyi mennyiségét a kolonnára felvittük.

A végtermék kitermelését és tisztasági fokát növelhetjük, azáltal, hogy a csapadék feloldását és a végtermék gólszűrését dezaggregáló reagens jelenlétében folytatjuk le, amely a fehérjekomplexek szétzúzását segíti (Sbornik Statej, Sovremennije problemi biokhimii, Moszkva, 1961).

A 9,0 pH feletti és a 2,5 pH alatti közegekben az interferon nem stabil.

Abban az esetben, ha gélszürés előtt a fehérje feloldására szolgáló puffért a kolonna térfogat 3% alatti mennyiségében visszük fel a kolonnára, akkor a gélszűrés során a fehérjekomplex részleges redukciója történik, amely a végtermék veszteségét és a végtermék tiszta2 sági fokának csökkenését okozza.

Ha a kolonnára felvitt puffer mennyisége a kolonnatérfogat 5°/o-a felett van, akkor a dezaggregáló reagens a végtermékben kimutatható.

Célszerű dezaggregáló reagensként karbamidot alkalmazni, amelynek a pufferben mért koncentrációja 2-8 mól/l.

Ha a pufferban a karbamidtartalom 2,0 mól/l alatt van, akkor nem megy végbe teljes mértékben a fehérjekomplex szétzúzása, amely a végtermék kitermelésének és tisztaságának csökkenését okozza.

Ha a pufferban a karbamid tartalom 8,0 mól/l felett van, akkor a karbamid kicsapódik.

A találmány szerinti eljárás egy másik kivitelezési formájában dezaggregáló szerként guanidin-kloridot alkalmazunk, amelynek a pufferban mért koncentrációja 1,0-6,0 mól/l.

Ha a pufferban a guanidin-klorid tartalom 1,0 mól/l alatt van, akkor nem megy végbe teljes mértékben a fehérjekomplex szétzúzása, amely a végtermék kitermelésének és tisztaságának csökkenését okozza.

Ha a pufferban a guanidin-klorid tartalom 6,0 mól/l felett van, akkor a guanidin-klorid kicsapódik.

A találmány szerinti eljárást a következő módon folytatjuk le:

A telítésnek legalább 70%-áig ammónium-szulfátot adunk a natív interferonhoz, miközben a leukocita interferon és egyéb fehérjék kicsapódnak. A csapadékot centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot dezaggregálószert tartalmazó 2,5 9,0 pH érté kü, 0,1 mól/l-es pufferoldatban feloldjuk.

Az így előállított fehérjeoldat gélszűrése előtt ugyanennek a dezaggregáló reagenst tartalmazó puffernek 3-5% kolonna térfogatnyi mennyiségét a gélkolonnára juttatjuk.

A gélszűréssel az 5-70 kD molekula tömegű fehérjék elválasztását valósítjuk meg.

Célként ultragélt vagy egyéb gélfajtát alkalmazunk, miközben arra ügyelünk, hogy a dezaggregáló szer hatásával szemben a gél viszonylag stabil legyen és lehetőséget nyújtson az 5-70 kD molekulatömegű fehérjék effektív elválasztására.

Az interferont a kolonnáról egy 2,5-9,0 pHjú 0,1-0,2 molaritású puffer oldattal eluáljuk.

A pufferoldatnak és a gélkolonnának a dezaggregáló reagenstartalmát az alkalmazandó nyersanyag sajátosságainak megfelelően választjuk meg.

1. példa

8810 ml natív interferonhoz (2000 lE/ml, 2 mg/ml fehérje) hozzáadunk 4405 g ammónium-szulfátot. A kicsapódó fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot 2,5 pH-jú , 0,1 mól/l-es foszfát-pufferben feloldjuk, az oldat 8,0 mól/l karbamidot tartalmaz. Az ultragéllel feltöltött kolonnát (K 100/100) egyensúlyba hozzuk egy 2,5 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát-pufferral, a kolonnára felvisszük ugyanebben a pufferban készített mól/l-es karbamid oldat 240 ml-ét (3% kolonnatérfogat). Ezután a kolonnára visszük az interferon oldatot és 2,5 pH-jú, 0,1 mól/l-es foszfát-pufferral eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakciók térfogata 700 ml. A tisztított készítmény specifikus aktivitása 500.000 ΙΕ/mg fehérje, tórfogatakjivitása 100.000 ΙΕ/ml és összaktivitása 7 · 10⁷ IE.

2. példa

8585 ml natív interferonhoz (3000 lE/ml, 2 mg/ml fehérje) hozzáadunk 4292 g ammónium-szulfátot. A kicsapódó fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot 6,0 pH-jú, 0,1 mól/l-es foszfát-pufferban feloldjuk, az oldat 6 mól/l karbamidot tartalmaz. Az ultragéllel töltött kolonnát (K 100/100) egyensúlyba hozzuk 6,0 pH -jú 0,1 mól/l -es foszfát puferral és a kolonnára visszük ugyanebben a pufferban készített 6 mól/l -es karbamid 400 ml-ét (5% kolonnatérfogat). Ezután a kolonnára juttatjuk az interferon oldatot és 6,0 pH-jú 0,1 mól/les foszfát puferral eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakció térfogata 1360 ml. A tisztított készítmény specifikus aktivitása 300.000 ΙΕ/mg fehérje, térfogataktivitása 75.000 ΙΕ/ml és összaktivitása 9,7 * 10 IE.

3. példa

8270 ml natív interferonhoz (2480 lE/ml, 1 mg/ml fehérje) hozzáadunk 4135 g ammónium-szulfátot. A kicsapódott fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot feloldjuk 9,0 pH-jú, 0,1 mól/l-es foszfát pufferban, az oldat 4 mól/l karbamidot tartalmaz. Az ultragéllel töltött kolonnát (K. 100/100) egyensúlyba hozzuk egy 9,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát puferral, és a kolonnára juttatjuk ugyanebben a pufferban készített 4 mól/l- es karbamid oldat 320 ml-ét (4% kolonna térfogat). Ezután az interferon oldatot kolonnára visszük és 9,0 pH-jú 0,1 mólos foszfát pufferral eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakció térfogata 900 ml. A tisztított készítmény specifikus aktivitása 50.000 ΙΕ/mg fehérje, térfogatal^tivitása 20.000 ΙΕ/ml, és összaktivitása 1,8 » 10' IE.

4. példa

8980 ml aktív interferonhoz (4960 IR/ml, 3 mg/ml fehérje) hozzáadunk 4490 mg ammónium-szulfátot. A kicsapódott fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérjecsapadékot 7,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferban feloldjuk, az oldat pufferban 2 mól/l karbamid van. Az ultragéllel töltött kolonnát (K 100/100) egyensúlyba hozzuk egy 7,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferral és a kolonnára felvisszük ugyanebben a pufferban készített 10 mól/l-es karbamidoldat 300 ml-ét (3,75% kolonna térfogat). Ezután a kolonnára juttatjuk az interferon oldatot és 7,0 pH-jú 0,1 mólos foszfát pufferral eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakció térfogata 1280 ml. A tisztított készítmény specifikus aktivitása 400.000 ΙΕ/mg fehérje, térfogataktjvitása 70.000 ΙΕ/ml és összaktivitása 9,4 « 10 IE.

5. példa

750 ml interferonhoz (3500 lE/ml, 3,3 mg/ml fehérje) hozzáadunk 308 g ammónium-szulfátot. A kicsapódott fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot feloldjuk 7,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferban, az oldat 1 mól/l guanidin-kloridot tartalmaz. A géllel töltött kolonnát (K 50/100) egyensúlyba hozzuk egy 7,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát puf ferrel és a kolonnára felvisszük ugyanebben a pufferban készített 1 mól/l guanidin-klorid oldat 80 ml-ét (4% kolonna térfogat). Ezután a kolonnára juttatjuk az interferon oldatot és 7,0 pH-jú mól/l-es foszfát pufferral eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakció térfogata 200 ml. A tisztított készítmény specifikus aktivitása 30.000 ΙΕ/mg fehérje, térfogataktivitása 15.000 ΙΕ/ml és összaktivitása 6 * 10⁶ IE.

6. példa

760 ml natív interferonhoz (3500 IR/ml, 3,3 mg/ml fehérje) hozzáadunk 310 g ammónium-szulfátot. A kicsapódott fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot feloldjuk, 7,0 pH-jú 0,1 mól/l foszfát pufferban, az oldat 6 mól/l guanidin-kloridot tartalmaz. Ultragéllel töltött kolonnát (K 50/100) egyensúlyba hozunk egy 7,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferral és a kolonnára visszük ugyanebben az oldatban készített 6 mól/l-es guanidin-klorid 60 ml oldatát (3% kolonna térfogat). Ezután a kolonnára juttattuk az interferon oldatot és 7,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferral eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakció térfogata 220 ml. A tisztított készítmény specifikus aktivitása 35.000 ΙΕ/mg fehérje, térfogataktivitása 15.000 ΙΕ/ml és ossz aktivitása 6,2 * 10⁶ IE.

7. példa

935 ml natív interferonhoz (2000 lE/ml, 2,0 mg/ml fehérje) hozzáadunk 466 g ammónium-szulfátot A kicsapódott fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot feloldjuk 3,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferban, az oldat 3 mól/l guanidin-kloridot tartalmaz. Ultragéllel töltött kolonnát (K 50/100) egyensúlyba hozunk 3,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferral és a kolonnára felviszünk ugyanebben a pufferban készített 3 mól/l-es guanidin-klorid oldat 60 ml-ét (3% kolonna térfogat). Ezután a kolonnára juttatjuk az interferon oldatot és 0,1 mól/l-es 3,0 pH értékű foszfát pufferral eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakció térfogata 240 ml. A tisztított készítmény specifikus aktivitása 96.000 IE/ mg fehérje, térfogataktivitása 32.000 ΙΕ/ml és ossz aktivitása 7,7 * 10⁶ IE.

8. példa

1230 ml natív interferonhoz (7000 lE/ml, 3,5 mg/ml fehérje) hozzáadunk 613 mg ammónium-szulfátot. A kicsapódott fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot feloldjuk 8,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferban, az oldat 4 mól/l guanidin-kloridot tartalmaz. Az ultragéllel töltött kolonnát (K 50/100) egyensúlyba hozzuk 8,0 pH értékű 0,1 mól/l-es foszfát pufferral és a kolonnára visszük ugyanebben a pufferban készített 3

-3193472 mólos guanidin-klorid 60 ml oldatát (3% kolonna térfogat). Ezután a kolonnára juttatjuk az interferon oldatot és 8,0 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát pufferral eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakció térfogata 250 ml. A tisztított készítmény specifikus aktivitása 20.000 ΙΕ/mg fehérje, térfogataktivitása 10.000 IE/ml és ossz .aktivitása · 10⁶ IE.

Ipari alkalmazhatóság A találmány szerinti eljárást a legsikeresebben az emberi leukocita interferon gyógyszer ipari tisztítására alkalmazhatjuk. Az emberi leukocita interferont mind véradóvér, mind pedig hullavér leukocitájából tetszés szerinti eljárással előállíthatjuk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás emberi leukocita interferon tiszti tására, amelyben a natív fehérjét ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a fehérje csapadékot elválasztjuk, az elválasztott csapadékot feloldjuk és a végterméket gélszúréssel előállítjuk, azzal jellemezve, hogy a csapadékot 1,0-0,8 mól/l koncentrációjú dezaggregáló reagenst tartalmazó, 2,5-9,0 pH-jú pufferban oldjuk fel, és gélszűrés előtt ugyanennek a puffernak 3-5% kolonnatérfogatnyi mennyiségét a kolonnára juttatjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pufferban 2,0-8,0 mól/l koncentrációban dezaggregáló reagensként karbamidot alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pufferban 1,0-6,0 mól/l koncentrációban dezaggregáló reagensként guanidin-kloridot alkalmazunk.