KR910006603B1 - 인체 γ-인터페론 단량체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

인체 γ-인터페론 단량체의 제조방법
제1도는 rIFN-γ의 일예로서 폴리펩티드(I)의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
제2도는 참고예2(i)에 기재된 플라스미드 pHIThp1101-d2의 형성도식을 나타낸 것이다.
본 발명은 인체γ-인터페론 단량체의 제조방법에 관한 것이다.
인터페론(이후 IFNs으로 약청하기도 함)은 고등 세포를 비루스, 핵산 등으로 자극 시킴으로써 제조된 단백질이며, 항비루스, 항종양 및 기타의 활성을 갖는다.
오늘날, 인터페론을 일반적으로 그 특징에 따라 α,β 및 γ형의 3종류로 분류한다.
α형 인터페론(이후 IFN-α로 약칭함) 및 β형 인터페론(이후 IFN-β로 약칭함)에 대한 연구는 상당히 진행되었으며 그의 개량된 정제방법이 개발되었고, 그의 특성도 상당히 알려졌다.
γ형 인터페론(이후 IFN-γ로 약칭함)은 림파구의 아세포 형질전환 또는 림포킨 생성이 일어날 수 있는 조건하에 면역적합 세포에 의해 제조되므로 면역 인터페론이라고도 명명한다.
IFN-γ는 IFN-α 및 IFN-β와 비교해서 높은 항증식 및 항종양 활성을 나타내며, 따라서 임상적 응용면에서 더욱 기대되고 있다.
그러나 그의 제조를 위한 신선한 림파구의 필요 등과 같은 각종 제약으로 인해 효과적인 생산계가 아직 설립되고 있지 않다.
다른 실험계에서 다른 세포종이 다른 IFN-γ분자종을 제조할 수 있다는 것이 제안되었으며, 그의 구조 및 특성은 아직 여러면에서 밝혀지지 않고 있다.
본 발명자들은 유전공학 기술을 이용하여 제조된 인체 IFN-γ를 정제하기 위한 기술을 발전시키기 위해 연구를 계속하였다.
이 연구과정에서, 본 발명자들은 IFN-γ가 강한 중합능력을 가지며, 그 결과 인체 IFN-γ단량체의 수율이 매우 적다는 것을 발견하였다.
인체 IFN-γ를 물리 및 화학적 관점에서 다룬 몇가지 논문이 있으며 거기에 이 인터페론이 중합형이라는 것이 공지되어 있다.
그러나, 중합체형을 단량체형으로 전환시키는 방법 또는 단량체형이 중합체형으로 전환되는 것을 방지하는 방법은 전혀 알려져 있지 않다.
더한 연구의 결과, 본 발명자들은 인체 IFN-γ단량체의 제조방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 조인체 IFN-γ를 환원 황 화합물 및 단백질 변성제 공존하에 겔 여과함을 특징으로 하는 인체 IFN-γ단량체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법에 의해 정제될 상기 조인체 IFN-γ는 어떤 인체 IFN-γ-함유물질일 수도 있다.
예를 들면 천연인체 IFN-γ를 농축함으로써 수득된 조생성물, 즉 천연 IFN-γ(nIFN-γ) 및 유전자 조작 기술에 의해 얻어진 인체 IFN-γ-생성 미생물을 배양함으로써 제조된 인체 IFN-γ-함유물질[참고 : 유럽 특허공보 0 089 676; 핵산연구, 10, 2,487-2,501(1982) : 내쳐, 295, 503-508(1982) : 핵산연구, 10, 3605-3615(1982)], 즉 재조합 IFN-γ(rIFN-γ)를 사용할 수 있다.
더 구체적으로 상술한 rIFN-γ는 제1도의 서열을 갖는 146아미노산의 폴리펩티드(I) 및 폴리펩티드의 (I)의 N말단 부분의 2이하의 아미노산이 결핍된 N말단부분 결핍종 및 폴리펩티드(I)의 131번째 아미노산 잔기의 뒷부분이 절단된 C 말단 부분 결핍종, 예를 들면 131번째와 132번째 아미노산 잔기 사이가 결합 되어 C말단에 Lys를 갖는 단백질과 같은 각종 단편이 있다.
실제적인 관점에서 상술한 IFN-γ-생성 미생물 세포를 추출하여 배양함으로써 수득된 IFN-γ-활성 분획 또는 상기 추출물을 황산암모늄으로 분획화, 항체 컬럼에 용출 또는 이온교환 용출함으로써 수득된 활성분획이 사용된다.
그러나 대량의 오염 단백질은 대량의 환원 황 화합물을 필요로하여 비경제적이기 때문에 항체 컬럼 또는 이온 교환 컬럼 용출물을 사용하는 것이 더 바람직하다.
이런 조생성물중에서, IFN-γ는 중합체형으로 존재할 수 있다.
환원 황 화합물은 시스테인, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 글루타티온(환원형), 티오에탄올아민, 모노티오글리세롤, 디티오트레이톨, 1∼7탄소원자를 갖는 티오알칸류 및 포름알데히드 소듐 술폭실레이트 디히드레이트와 같은 유기황 화합물 및 메타비설파이트(소듐염, 포타슘염)와 같은 무기황-함유화합물이 있다.
단백질 변성제는 구아니딘염(히드로클로라이드, 설페이트), 우레아 및 티오시아네이트(소듐염, 포타슘염)이 있다.
상기 겔 여과에 사용되는 겔은 예를 들면 상업적으로 이용되는 겔중에서 임의로 선택될 수 있으며, 텍스트란, 폴리아크릴아미드 및 아가로즈와 같은 마립 겔이 바람직하다.
유전자 조작기술에 의해 제조된 조 인체 IFN-γ를 처리하는데 있어, 예를 들면 약 1,000∼8,000범위의 분자량을 분획할 수 있는 겔을 사용하는 것이 그로부터 오염 단백질을 분리하는 효율의 면에서 바람직하다.
구체적으로 파마시아사제의 세파덱스G50 및 G75(에피클로로히드린과의 교차결합 덱스트란 겔) 및 세파크릴 S-200(N, N′- 비스아크릴아미드와의 교차결합 겔), 바이오레드사 제 비오겔 P-10, P-30 및 P-60(폴리아크릴아미드 겔), 및 파마시아사 제 세파로즈 6B(아가로즈겔)는 특히 바람직한 예이다.
겔은 일반적으로 처리될 시료량의 5∼100배(중량%), 바람직하게는 10∼30배(중량%)사용한다.
겔 여과는 공지의 컬럼 방법에 의해 적당히 수행된다.
그러므로 조 인체 IFN-γ를 완충액에 용해시키고 이 수용액을 전개 용매로 평형된 겔 컬럼에 처리한다.
용출은 전개 용매로 수행한다.
바람직한 용출속도는 시료의 순도 및 겔의 종류 및 양에 따라 변화하며, 일반적으로는 0.1∼10SV (공간속도), 더 바람직하게는 0.5∼3이다.
용출물은 공지의 방법으로 분획화한다.
인체 IFN-γ-함유 분획은 공지의 방법, 예를 들면 O.D 280mm 흡수데이터를 기준으로 한 용출 커브를 검사함으로써 쉽게 검출할 수 있다.
환원 황 화합물 및 단백질 변성제는 상기 겔 여과 방법의 어떤 단계에서 인체 IFN-γ와 공존할 수 있다.
환원 황 화합물 및 단백질 변성제는 겔 여과될 인체 IFN-γ수용액 및 전개 용매에 가하는 것이 바람직하다.
단백질 변성제가 추출 또는 항체컬럼 처리와 같은 전처리단계에 사용되는 경우, 겔 컬럼에 처리될 수용액은 상기 변성제를 더 가하지 않고도 사용될 수 있다.
처리될 수용액 및 전개용매는 pH 5.0∼8.0, 특히 중성근처의 pH가 바람직하며 1∼100mM, 특ㅎ; 5∼20mM 농도의 환원 황 화합물 및 0.1∼7M, 특히 1∼2M 농도의 단백질 변성제를 함유하는 것이 바람직하다.
상술한 수용액 및 전개용매용 완충액으로 트리 히드로클로라이드, 아세테이트, 포스페이트 및 보레이트 완충액이 예시되며, 포스페이트 완충액이 바람직하다.
정제된 인체 IFN-γ를 함유하는 용출물에 함유된 환원 황 화합물 및 단백질 변성제는 필요하다면 제거될 수 있다.
저분자량 화합물과 고분자량 화합물인 인체 IFN-γ를 분리하기 위해 겔 여과를 수행하는 것이 바람직하다.
이 겔 여과는 저분자량 화합물을 제거하는데 적당한 겔, 예를 들면 세파덱스 25를 사용하여 상술한 단량체화 하는 겔 여과와 같은 방법으로 수행될 수 있다.
환원 황 화합물을 제거하는 경우, 용출물을 공지의 방법으로 한외 여과할 수 있다.
인체 IFN-γ로부터 저분자량 화합물을 분리하는 과정에서, 인체 IFN-γ를 안정화 시키기 위해 예를 들면 인체 혈청 알부민을 가할 수 있다.
이렇게 정제된 인체 IFN-γ단량체는 필요하다면 분말형으로 동결건조될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 인체IFN-γ단량체는 공지의 IFN-γ생성물의 경우와 같은 목적 및 같은 용도를 위해 사용될 수 있다.
이 인체 IFN-γ단량체는 공지의 생성물과 비교할 때 오염단백질 및 피로겐에 불충분하기 때문에 주사용제제를 제조하기 위한 벌크 물질로서 더욱 안전하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 인체 IFN-γ단량체는 항비루스, 항종양, 항증식 및 면역강화 활성을 나타내며, 공지의 IFN-γ와 같은 방법으로 투여될 수 있다.
항비루스 활성 U/ml(단위/ml)로 기제한 IFN 활성은 하기의 방법으로 결정한다.
단위가 설정된 국제표준 IFN-α 및 백혈구 유도 조 IFN-γ는 VSV(소포성구염 비루스)에 의해 인체 복수 유도 FL세포주에 일어나는 세포변성에 대한 방해효과를 평가하기 위한 시험에서 분석되며, 림프구 유도 IFN-γ의 역가는 발견된 역가와 비교함으로써 결정되고, 이 IFN-γ는 실험실 표준 IFN-γ로서 사용된다.
물질에서 IFN-γ의 역가를 계산할 때 이 실험실 표준 IFN-γ는 항상 WISH-VSV계 상술한 분석과 평행하여 사용되며, 역가 계산은 역가비를 기준으로 수행한다.
본 명세서 및 특허청구의 범위에 있어서, mM 및 M은 각각 밀리몰 농도 및 몰농도를 나타낸다.
하기의 실시예 및 참고예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하는 것이며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예에 기재된 항체컬럼 Ab(Mo γ-2-11.1)은 국제출원 PCT/JP 83/00174(1983. 5. 31 출원)에서도 출원된 유럽 특허공보 0 103 898에 기재된 방법에 의해 제조된다.
[실시예 1]
(ⅰ)참고예 1에서 수득된 동결 세포 100g에 7M 구아니딘 히드로클로라이드 및 2mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드를 함유한 100mM 트리스 히드로클로라이드 완충액(pH 7.0)300ml를 가한다.
혼합물을 4℃에서 1시간 동안 교반하고 원심분리(17,000prm/30분)한다.
깨끗하고 투명한 상층액을 137mM 염화나트륨, 2.7mM 염화칼륨, 8mM 인산수소이나트륨 및 1.47mM인산이수소칼륨을 함유한 완충액(이후 “PBS”로 약칭함)으로 70배 희석한다.
생성된 침전물을 샤플즈 원심분리(10,000rpm)를 사용하여 제거하고, 수득된 상층액(22ℓ)을 페리콘 막 여과기(밀리포어 사 : 분자량 절단 : 10,000)를 사용하여 1.5ℓ부피로 농축한다.
농축물을 4℃에서 밤새 방치하고, 생성 침전물은 더 원심분리(10,000rpm/30분)하여 제거한다.
미리 충전된 항체컬럼[Ab(Mo γ2-11.1) : 5×3cm]에 수득된 상층액을 1,000ml/시의 유속으로 부하시킨다.
컬럼을 통해 세척 용액, 즉 PBS 500ml, 1M 염화나트륨 및 0.1% 트윈 20을 함유한 10mM 인산완충액(pH 7.0)1,000ml, PBS 500ml 및 0.5M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유한 인산완충액 (pH 7.0)20mM로 용출을 수행하여 항비루스성 활성 용출 분획 62ml를 수득한다.
(ⅱ)1mM 에틸렌 디아민테트라아세테이트, 150mM 염화나트륨, 10mM 시스테인 히드로클로라이드 및 2M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유한 25mM 아세테이트 완충액(pH5.0)으로 미리 평형된 세파 크릴S-200(파마시아)의 컬럼(5.0×60.0cm)을 실시예 1-(ⅰ)에서 수득된 IFN-γ용출 물 62ml로 부하시키고, 같은 완충액으로 용출시켜 단량체 용출물 분획 83ml를 수득한다.
이렇게 수득된 분획은 소듐 도데실설페이트를 사용한 평판 전기영동(이후 SDS-PAGE로 약칭함)에서 단량체 형태(외관 분자량:약 18,000)로 한점에 나타난다.
이것을 분자 시이브 처리하면 1.5×107U/mg 단백질의 비활성을 갖는 IFN-γ 3.7mg이 수득된다.
대조군에서 10mM 시스테인 히드fh클로라이드가 없는 겔 여과용 전개 용매를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1-(ⅱ)와 같은 방법으로 실시예 1-(ⅰ)에tj 수득된 IFN-γ를 처리하면, 전체 용출액의 약 90%가 이량체 및 다량체 분획이며 단량체 분획은 단지 약 10% 이다.
그러므로 이 결과는 단량체 형태로 전환시키기 위한 시스테인히드로클로라이드 및 구아니딘 히드로클로라이드의 공존 효과를 나xk내는 것이다.
(ⅲ) 10mM 시스테인 히드로클로라이드, 150mM 염화나트륨 및 0.01%트윈 20을 함유한 25mM 아세테이트 완충액(pH6.0)으로 미리 평형된 세파덱스 G-25컬럼(5.0×60.0cm)을 실시예 1-(ⅱ)에서 수득된 IFN-γ-함유 용출액 83ml로 부하시키고, 같은 완충액으로 용출시킨다.
이렇게 수득된 구아니딘 히드로클 로라이드가 없는 IFN-γ-함유 용출분획(90ml:2.7mg)은 1.7×107U/mg 단백질의 비활성을 갖는다.
(ⅳ)실시예 1-(ⅲ)에서 수득된 IFN-γ-함유 용출액 90ml에 450mg의 인체 혈청 알부민을 가한다.
용해시킨후 이 용액을 디아플로 PM-10막(아이콘의 한외여과 막)을 사용하여 한외 여과함으로써 60ml로 농축한다.
150mM 염화나트륨을 함유한 인산완충액(pH7.0) 25mM로 미리 평형된 세파덱스 G-75컬럼(5×60cm)을 농축물로 부하시키고, 같은 완충액으로 전개 및 용출시켜 IFN-γ-함유 분획을 스득한다. 이 과정을 실시예 1-(iii)에서 수득된 IFN-γ-함유 용출물로부터 남아있는 시스테인 부분을 제거하는 것이며 대신에 인체 혈청 알부민을 함유하며 1.5×107U/mg 단백질의 비활성을 갖는 IFN-γ용액 33ml(2.2mg)이 수득된다.
[실시예 2]
실시예 1-(ⅰ)과 같은 방법으로 수득된 항체 컬럼 용출물에 10mM 농도가 되도록 글루타티온(환원형)을 가하여 3.0×106U/mg 단백질의 비활성을 갖는 단량체가 풍부한 조 IFN-γ용액(63ml : 11mg)을 수득한다.
시스테인 대신에 10mM 글루타티온 (환원형)을 함유한 겔 여과용 완충액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1-(ⅱ)와 같은 방법으로 상기의 조 IFN-γ용액을 처리한다.
이렇게 수거된 단량체 용출 분획(85ml)은 SDS-PAGE(외관 분자량 :약 18,000)에서 단량체 형태로 한점에서 나타낸다.
425mg의 인체 혈청알부민을 용출물(85ml)에 가하고 겔 여과하여 구아니딘 히드로클로라이드가 없고 1.8×107U/mg 단백질의 비활성을 갖는 IFN-γ용액(90ml)를 수득한다.
[실시예 3]
(ⅰ) 참고예 2(ⅱ)에서 수득된 동결 세포(5.9g)을 7M 구아니딘·HCl 및 2mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드를 함유한 0.1M 트리스·HCL 완충액(pH7.0)18ml에 현탁시킨다.
혼합물 4℃에서 1시간 동안 교반하고, 10,000×g에서 30분간 원심분리 한다.
생성된 상층액(20ml)을 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4및 1.5mM KH2904를 함유한 완충액(pH 7.4)(PBS로 약칭함) 260ml로 희석하고, 단 클론성 항체(Mo γ2-11.1)컬럼 (베드 부피 12ml)에 1ml/분의 유속으로 도입한다.
컬럼을 0.5M 구아니딘·HCl을 함유한 20mM 인산나트륨 완충액 (pH7.0) 60ml로 세척하고, 폴리펩티드를 2M 구아니딘·HCl을 함유한 20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0)36ml로 용출시켜 항비루스 활성을 갖는 분획 20ml를 수득한다.
이 분획(20ml)를 2M 구아니딘·HCl, 0.15M NaCl, 1mM 에틸렌디아민테트라아세테이트 및 10mM 시스테인을 함유한 25mM 암모늄 아세테이트 완충액 (pH6.0)으로 평형된 세파크릴 S-200(파마시아파인 케미칼즈)컬럼 (2.6×94cm:베드 부피 500ml)에 도입하고, 같은 완충액으로 용출시켜 항루비스 활성을 갖는 분획 37ml를 수득한다.
수득된 폴리펩티드의 양은 5.9mg이며 비활성은 1.0×107U/mg이다.
라엠리의 방법[내쳐, 227, 680-685(1970)]에 따른 소듐 도데실설페이,-폴리아크릴 아미드겔 전기영동에 의해 폴리펩티드를 분석하면 폴리펩티드의 이동성은 약 18,000을 나타낸다.
비 환원 조건하에서는 낮은 분자량에 해당하는 위치에 단지 희미한 단백질 밴드가 관찰된다.
[참고예 1]
유럽 특허공보 0 089 676의 실시예 8에 기재된 것 같과 같은 인체 IFN-γ 형질 발현 유전자를 운반하는 RR1 종(pRk248cItsS, pRC231/IFI-900)를 세포 농도가 3~4×108세포/ml에 도달할 때까지 M9-글루코즈 배지에서 30℃로 배양한다. 글루코즈 및 카사미노산을 각각 1.0 및 0.5%의 농도로 가한다. 42℃에서 1시간 동안 감응시킨 후, 배양액을 원심분리하고, 수득된 세포를 동결시켜 저장한다. 여기에 함유딘 rIFN-γ는 제1도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
[참고예 2]
(ⅰ)IFN-γ혈청 발현 플라스미드 pHITtrp1101(유럽 특허공보 0 110 044의 실시예 2(ⅲ)참고)를 제한효소 AvaII 및 Pst I 로 절단하고, IFN-γ의 구조 유전자를 함유하는 AvaII-Pst I 1kbDNA 단편을 분리한다.
이렇게 수득된 DNA단편의 AvaII의 결합 말단에 트리에스테르법에 의해 화학적으로 합성된 단백질 합성 출발 코돈
CGATAATGTGCCAG
TATTACACGGTCCTG
을 함유한 올리고뉴클레오티드 어댑터를 T4 DNA리 가게를 사용하여 연결시킨다.
플리스미드 ptrp 771(상술한 공보의 실시예 2(ⅱ)참고)를 제한 효소 Cla I 및 Pst I으로 절단함으로써 수득된 DNA단편의 trp프로모터의 아래쪽에 상술한 어댑터와 연결된 IFN-γ구조 유전자를 삽입하여 형질발현 플라스미드 pHITtrp1101-d2를 형성한다(제2도).
이렇게 수득된 플라스미드 pHITtrp1101-d2를 사용하여 코헨 등의 방법[Pγoc.Natl.Acad.Sci.USA.,69,2110(1972)]에 의해 에스케리키아 콜리 294를 형질 전한시켜 일본국 재단법인발효 연구소에 IFO-14350으로 기탁된 형질전환체 에스케리카아 콜리 294/pHITtrp1101-d2를 수득한다.
(ⅱ) 이. 콜리 294/pHITtrp1101-d2를 8㎍/ml 테트라시클린, 0.4% 카사미노산 및 1%글루코즈를 함유한 M9 배지에서 37℃로 배양한다.
성장이 KU220까지 도달했을 때, 3β-인돌릴 아크릴산(IAA)를 25㎍/ml 농도로 가하고, 혼합물을 4시간 동안 더 배양한다.
배양후 세포를 원심분리에 의해 수거한다.
여기서 함유된 rIFN-γ는 제1도에서 3∼146번의 아미노산 서열을 갖는다.

Claims (15)

  1. 조 인체 γ-인터페론을 환원 황 화합물 및 단백질 변성체의 공존하에 겔 여과함을 특징으로 하는 인체 γ-인터페론 단량체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서 환원 황 화합물이 유기 황 화합물인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 유기 황 화합물이 시스테인, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 글루타티온(환원형), 티오에탄올아민, 모노티오글리세롤, 디티오트레이톨, 1∼7탄소원자를 갖는 티오알칸 및 포름알데히드 소듐 술폭실레이트 디히드레이트의 군에서 선택된 화합물인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 유기 황 화합물이 글루타티온(환원형)인 방법.
  5. 제1항에 있어서 단백질 변성제가 구아니딘염, 우레아 및 티오시아네이트의 군에서 선택된 것인 방법
  6. 제5항에 있어서 단백질 변성제가 구아니딘염인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 인체 γ-인터페론이 재조합 인체 γ-인터페론인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 조 인체 γ-인터페론이 인체 γ-인터페론을 함유한 추출물을 항체 컬럼에 통과시킨 용출물인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 겔이 덱스트란, 폴리아크릴아미드 및 아가로즈의 군에서 선택된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서 겔이 덱스트란인 방법
  11. 제1항에 있어서, 겔 여과가 환원 황 화합물 및 단백질 변성제를 함유한 완충용액에 용해된 조 인체 γ-인터페론을 과립겔로 페킹된 컬럼에 부하시키고, 같은 완충 용액으로 γ-인터페론을 용출시킴으로써 수행되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 완충 용액이 각각 1∼100mM 및 0.1∼7M 농도의 환원 황 화합물 및 단백질 변성제를 함유하는 방법.
  13. 제11항에 있어서 완충 용액이 pH 5.0∼8.0인 방법.
  14. 제11항에 있어서 용출이 0.1∼10의 공간속도로 수행되는 방법.
  15. 제1항에 있어서 생성된 인체 γ-인터페론 단량체 용액을 저분자량 화합물을 제거하기에 적당한 겔을 사용하여 더 겔 여과함으로써 환원 황 화합물 및 단백질 변성제가 없는 인체 γ-인터페론 단량체를 수득하는 방법.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
IL74094A0 (en) * 1984-01-23 1985-04-30 Takeda Chemical Industries Ltd Highly solubilised protein and production thereof
GB8414354D0 (en) * 1984-06-05 1984-07-11 Biogen Nv Purifying protein
GB8508340D0 (en) * 1985-03-29 1985-05-09 Creighton T E Production of protein
US4873312A (en) * 1985-04-25 1989-10-10 Amgen Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby
US4766205A (en) * 1985-11-13 1988-08-23 Beatrice Companies, Inc. Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms
US4950470A (en) * 1986-10-06 1990-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions employing interferon-gamma
WO1992004382A1 (en) * 1990-09-05 1992-03-19 Bunge (Australia) Pty. Ltd. Solubilization of proteins in active forms
AU648214B2 (en) * 1991-12-31 1994-04-14 Lucky Limited Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc.
US5434249A (en) * 1992-05-27 1995-07-18 Viragen Inc. Method for modulating specific activity of inteferon alpha
JP3452779B2 (ja) * 1997-11-28 2003-09-29 株式会社東海理化電機製作所 回転量制限装置及びウエビング巻取装置

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7404589A (nl) * 1974-04-03 1975-10-07 Stichting Rega V Z W Werkwijze voor het stabiliseren van interferon.
US4100150A (en) * 1975-11-04 1978-07-11 G. D. Searle & Co. Stabilization of interferon against mechanical stress using thioctic acid
US4278661A (en) * 1979-10-12 1981-07-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Purification of interferon
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
EP0080879B1 (en) * 1981-11-28 1986-10-01 Sunstar Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing interferon in stable state
CA1210714A (en) * 1982-03-23 1986-09-02 Alan Sloma .alpha.-INTERFERON GX-1
US4432895A (en) * 1982-11-24 1984-02-21 Hoffmann-La Roche Inc. Monomeric interferons
US4476049A (en) * 1983-09-20 1984-10-09 Hoffmann-La Roche Inc. Method for the extraction of immune interferon

Also Published As

Publication number Publication date
PH20251A (en) 1986-11-10
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ATE49981T1 (de) 1990-02-15

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