KR960013393B1 - 재조합 효모에서 발현된 알파 인터페론의 정제방법 - Google Patents

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Description

재조합 효모에서 발현된 알파 인터페론의 정제방법

제1도는 DEAD-셀룰로스 크로마토그래피한 것의 크로마토그램이고,

제2도는 CM-세파로즈 크로마토그래피한 것의 크로마토그램이며,

제3도는 산성 pH에서 겔 여과 크로마토그래피한 것의 크로마토그램이고,

제4도는 중섬 pH에서 겔 여과 크로마토그래피한 것의 크로마토그램이며,

제5도는 최종 정제된 알파 인터페론의 순도 결정을 위한 C18 역상고압 크로마토그래피한 결과이며,

제6도는 제조합 알파 인터페론이 pH 7.2에서 농도의 차이에 의하여 겔 여과-HPLC에서 용출되는 위치가 변하는 것을 보여주는 크로마토그램이다.

본 발명은 재조합 호모에서 발현된 알파 인터페론을 정제하는 방법에 관한 것이다.

인터페론은 1957년 이삭과 린덴만이 닭을 인플루엔자 A 바이러스로 감염시켰을 때, 바이러스의 번식을 억제하는 인자가 있다는 것을 발견하여 최초의 알려지게 되었다(Isaacs, K. 및 Lindenmann,J.,Proc. R. Soc.Long,B147, 258-267(1957).

그후, 수많은 연구결과에서 인터페론이 항바이러스 성질 뿐만 아니라 세포내 유전자의 발현, 구조 그리고 기능의 조절인자로 작용함이 알려졌으며, 인터페론은 또한 직접적인 항증식효과(antiproliferative effect)가 있는 것으로 밝혀졌는 바, 이를 이용하여 항암제로서의 가능성이 제시되었다.

근래에는, 유전공학의 발달에 힘입어 생리활성을 갖는 유전자 재조합 인간 일파 인터페론을 대량 생산할 수 있게 되었으며(Goedll, D.V.et al, Nature 287,411-416(1980)), 이러한 재조합 인간 알파 인터페론을 이용한 임상실험 결과 여러 고형암의 치료에 효과가 있는 것으로 판명되었다. 특히, 방광암(Bladder cancer)(Troti, F.M.et., al.,J. Clin.Oncol. 6, 476-483(1988)), 후천성 면역 결핍증(Acquired Immunodeficiency Syndrome)에 관련된 카포시육종(Rios,A. et al., J. Clin. Oncol.3, 506-512(1985)), 신장암(Vugrin, D. et al., Cancer Treat. Req. 69, 817-820(1985)) 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 C형 간엽 치료에도 효과가 있음이 알려지는 등(Davis. G. et al.,N.Engl. H.Med. 321, 1506-1510(1989))의약품 치료제로서의 적용범위가 날로 확대되고 있다.

재조합 알파 인터페론의 제조 및 정제 방법에 대해서는 많은 보고가 발표되었으며, 대부분의 방법들은 숙주세포내에서 알파-인터페론을 발현시킨 후 세포를 파괴한 다음 알파-인터페론을 얻는 것을 특징으로 하고 있다(대한민국 특허출원 제 80-3180호 ; 제 82-2286호 ; 제 86-327호). 하지만 이들 방법들은 세포파괴 후에 알파 인터페론을 인위적으로 재구성(refolding)시켜야하는 어려움이 따르며(대한민국 특허출원 제 90-13450호 ; 제 92-1155호), 또한 재구성 과정에서 중량체(oligomer) 및 부분산화형(partial oxidized type)등의 변형된 형태의 알파 인터페론이 생성되며 이들의 제거 과정에서 수율우 떨어지거나 완전히 제거하지 못한다는 단점이 있다. 또한 대장균에서 발현하였을 경우 N-말단의 메티오닐기는 50% 정도만이 제거된다는 보고가 있으며(R. Wetzel et al., J. Interferon Res. 1, 381-390(1981)), 숙주세포로 효모를 사용하였을 경우에는 N-말단의 메티오닐기가 완전히 제거되기는 하나 역시 정제하는데 어려움이 따른다.

따라서 최근에는 발현된 알파 인터페론이 숙주세포에서 배양약으로 분비되게하는 방법도 시도 되었는데 이들 방법에 의해 발효배지로 분비된 알파 인터페론은 다이설파이드 결합이 제대로 이루어져서 재구성 과정이 필요없게 되고 N-말단의 메티오닐기가 제거된 천영연과 동일한 재조합 단백질을 얻을 수 있다는 장점이 있다(David V. Goeddel et al., Science 219, 620(1983) ; L. Jeanne Perrt et al., N.A.R. 12, 8927(1984)).

이에 부응하여 본 출원인도 인간 알파 인터페론이 대량 발현, 분비될 수 있도록 고안된 효모 발현벡터 PyLBC A/G α f α-IFN를 특허출원한 바 있고(대한민국 특허출원 제 92-16766호), 그를 함유하는 효모를 한국과학기술연구원 유전자은행에 1992년 7월 2일자로 기탁번호 KCTC 0051BP로 기탁하였다.

본 발명자들이 상기 벡터에 의해 형질 전환된 효모 균주의 세포 배양액에서 인가 알파 인터페론을 정제하기 위하여 연구를 하던 중 중성 pH에서의 겔 여과 크로마토그래피시 용출되는 알파 인터페론의 위치는 단백질의 농도에 크게 좌우되는 것을 알게 되었고, 이를 이용하여 인체에 투여하기에 적합한 고순도, 고역가의 인간알파 인터페론을 정제할 수 있는 방법을 발명하게 되었다.

본 발명자들은, 알파 인터페론이 pH가 낮은 용액(pH 4-5)에서는 예상되는 용액내의 분자량이 약 19,000달톤 정도이나, pH 중성 부근 혹은 그 이상에서는 중합체를 이루어 겔 여과 크로마토그래피 상에서 분자량이 변하는 것을 발견하였으며, 나아가서 pH 중성 부근에서 겔 여과 크로마토그래피를 할 때 컬럼 상에서 용출되는 알파 인터페론의 위치는 단백질의 농도에 크게 좌우되는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 실험 결과를 응용하여 상당히 농축된 제조합 알파 인터페론을 pH 중성 부근에서 겔 여과 크로마토그래피하면 SDS-PAGE 상에서 인터페론과 분자량이 거의 유사하던 오염 단백질들이 효과적으로 제거될 뿐만 아니라, 최종 원액의 투석과정 등을 통해 pH를 중성으로 전환시키는 불 필요한 단계를 생략할 수 도 있다는 잇점이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 재조합 효모로 부터 생산된 알파 인터페론을 정제하는데 있어서, 산성 pH에서의 겔 여과 크로마토그래피에 의해 알파 인터페론과 분자량이 거의 유사한 오염 단백질만이 남아 있는 상태로 조정제된 알파 인터페론을 중성 pH에서 겔 여과 크로마토그래피하는 것을 특징으로 한다.

이와같은 본 발명의 정제방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

재조합 인간 알파 인터페론이 발현되어 세포밖으로 분비된 발효배지를 원심분리하여 효모 세포를 제거한 후 상등액을 한외여과 막으로 농축하고 pH 8.3인 완충 용액으로 충분히 다이아필트레이션하여 발표 배지에 있는 색소와 염(Salt)을 제거한다.

이렇게 하여 얻어진 농축액을 음이온 교환 크로마토그래피를 한다. 이때 재조합 인간 알파 인터페론을 일단 음이온 교환수지에 붙인 후 염(NaCl)이 첨가된 완충용액으로 용출시킴으로써 단백질 용액에 남아 있는 색소와 오염 단백질을 동시에 제거할 수 있다. 음이온 교환 수지로는 DEAE-셀룰로즈 또는 DEAE-세파로즈 등이 사용되어질 수 있고 완충용액으로서는 트리스-HCl 완충용액이 사용될 수 있다.

용출된 용액을 pH 4.5인 Na-아세테이트 완충용액에서 투석한 후 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 더욱 정제한다. 이때 수지로서는 CM-세파로즈가 사용될 수 있으며 재조합 인간 알파 인터페론은 염(NaCl)의 농도를 높여 용출시킨다. 이때 분자량이 큰 불순 물질들이 낮은 염 농도에서 컬럼으로부터 용출되며, 이어서 알파 인터페론이 함유된 용액이 용출된다. 이 과정은, 특히 음이온 교환 크로마토그래피 수행후에도 잔존하는 발효 배지 물질들을 pH를 낮추어 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 컬럼에 흡착시키지 않고 통과 시켜서 제거할 수 있으며 보다 정제된 알파 인터페론을 동시에 얻을 수 있다는 잇점이 있다.

그런 다음, 상기 양이온 교환수지 칼럼을 통과시켜 얻어진 재조합 알파 인터페론 분획을 농축시킨 후 pH4.0 내지 5.0의 NH₄-아세테이트 완충용액에서 겔 여과 크로마토그래피를 하여 재조합 알파 인터페론을 더욱 정제한다. 이때 겔로는 S-300이 바람직하나 S-200이나 G-50도 사용될 수 있다. 여기서 정제된 알파 인터페론은 거의 순수하며 단지 SDE-PAGE 상에 인터페론과 분자량이 거의 같은 오염 물질만이 소량 보이게 된다.

상기 겔 여과 크로마토그래피를 통해 보다 정제된 재조합 알파 인터페론 분획들을 모아 농축시킨 후, 최종적으로 pH 6.5 내지 pH 8.0의 인산완충용약(Na-인산)에서 겔 여과 크로마토그래피를 한다. 이때 겔로는 S-100이 사용될 수 있고, 알파 인터페론의 농도는 2.0mg/ml 이상으로 하는 것이 좋다. pH 중성 부근에서의 겔 여과 크로마토그래피는 알파 인터페론과 분자량이 거의 같은 오염 단백질들을 제거하는데 효과적이다.

이상과 같은 본 발명의 정제 방법에 따르면 효모의 배양액으로 부터 고역가의 인간 알파 인터페론을 99%이상의 고순도로 정제할 수 있다.

이상의 연구 및 하기 실시예에서는 앞에서 언급한 바 있는 기탁번호 KCTC 00515BP의 재조합 효모 균주, S. cerevisiae pYLBC A/G α f α-INF를 이용하여 진행된 것으로 분비형 알파 인터페론을 정제 대상으로 하고 있으나, 본 발명의 특징적인 부분인 중성 pH에서의 겔 여과 크로마토그래피는 알파 인터페론과 동일한 분자량의 오염 단백질만이 남아있는 수준으로 거의 정제된 상태의 알파 인터페론에 적용되므로, 본 발명의 정제 방법은 분비형의 인간 알파 인터페론에 국한되지 않고 다른 알파 인터페론의 경우에도 통상적으로 적용되어 질 수 있다.

이하 본 발명의 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다.

실시예 1 :

재조합 인간 알파 인터페론의 정제 과정

원심분리에 의하여 효모세포가 제거된 발효액 3L에 완충용액(20mM 트리스 HCl pH 8.3)을 첨가한 후 분자량 한계점(molecular weight cut off)이 10,000인 나선형 한외여과기(S1Y10, Amicon사, 미국)를 사용하여 450ml로 농축하였다.

농축된 용액을 같은 완충용액으로 평형화된 DEAE-셀룰로즈 컬럼(Whatmann사, 영국)에 5ml/분의 속도로 투여한 후 같은 완충용액을 계속 흘러 보내주어 겔에 붙지 않은 단백질들을 모두 제거하였다. 50mM NaCl이 포함된 완충용액(20mM 트리스 HCl, 50mM NaCl, pH8.3)을 상기의 속도로 컬럼 부피의 3배를 흘려 보내주어 오염 단백질을 제거한 후 100Mm NaCl을 함유한 완충용액(20mM 트리스 HCl, 100mM NaCl, pH8.3)으로 알파 인터페론을 용출시켰다.

280nm에서 기록된 이 과정의 크로마토그램을 제1도에 나타내었다. 모아진 각 분획을 SDS-PAGE를 한 다음 쿠마시 블루염색을 하여 알파 인터페론의 순도가 비교적 높은 것들을 모아 완충용액(50mM Na-아세테이트, pH4.5)에 충분히 투석시켰다.

투석이 끝난 용액을 같은 완충용액으로 평형화된 CM-세파로즈 칼럼(Pharmacia 사, 스웨덴)에 5ml/분의 속도로 투여한 다음 레코더의 피크가 다 내려갈 때까지 계속 흘려 보내 주었다. 같은 완충용액에 150 mM NaCl이 포함된 용액을 같은 속도로 흘려 보내 주어 겔에 약하게 붙은 단백질을 제거한 후 175mM NaCl이 포함된 용액을 상기의 속도로 흘려 보내 알파 인터페론을 용출시켰다.

이때의 크로마토그램이 제2도에 나타나 있으며, 여기서 얻어진 각 분획을 SDS-PAGE한 다음 쿠마시 블루염색을 하여 알파 인터페론의 순도가 90% 이상인 분획만을 모아 한외여과막 YM-10(Amicon 사, 미국)으로 농축하였다.

농축된 단백질 용액을 겔 여과 완충용액 1(25mM NH4-아세테이트, 0.12M NaCl pH 5.0)로 평형화된 S-300 컬럼(Pharmacia사, 스웨텐)에 1ml/분의 속도로 투여한 다음 같은 속도로 완충용액을 계속 흘려보내주어 오염 단백질과 알파 인터페론을 분리하였다. 이때의 크로마토그램이 제3도에 나타나 있으며 모아진 각 분획을 SDS-PAGE한 다음 구마시 블루염색을 하여 알파 인터페론의 순도가 95% 이상인 것을 모아 한외여과막 YM-10(Amicon사, 미국)으로 다시 농축하였다.

농축된 단백질 용액을 겔 여과 완충용액 2(10mN Na-인산 0.14M NaCl pH 7.1)로 평형화된 S-100컬럼에 1ml/분의 속도로 통과시켜 겔 여과 크로마토그래피를 하였다. 이때의 크로마토그램은 제4도에 나타나 있으며, 모아진 각 분획을 SDS-PAGE를 한 다음 쿠마시 블루염색을 하여 오염단백질은 보이지 않고 알파 인터페론만 보이는 분획을 모으고, 이를 다시 SDS-PAGE를 하여 은염색(Silver Staining)한 결과 순도는 99% 이상이 됨을 확인하였다.

또한, 정제된 알파 인터페론을 0.05% 트리풀루오로아세트산/H₂O로 평형화된 C18 역상 고압 크로마토그래피 컬럼(Boudapak Waters사 미국)에 투입한 후 80% 아세토니트릴/0.05% 트리플루오로아세트산으로 1ml/분의 속도로 32분간 걸쳐 크로마토그래피 하였을 때의 결과는 제5도에 나타나 있으며, 이때의 순도는 99%이상 이었다.

실시예 2 :

정재된 재조합 인간 알파 인터페론의 N-말단 확인

상기 실시예에서 정제된 재조합 인간 알파 인터페론 300pmole을 아미노산 서열 자동 분석기(Applied Biosystems, Model 471A, 미국)에 투입한 다음 반복 계수(repetative yield)를 90.7%로 유지시키며 N-말단의 아미노산 서열을 분석한 결과 천연형 인간 알파 인터페론과 동일하였다.

실시예 3 :

정재된 재조합 인간 알파 인터페론의 역가 결정

상기의 방법에 의해 최종 정제된 재조합 알파 인터페론의 역가를 측정하기 위하여 항바이러스 활성을 측정하여 역가를 결정하였다. T/75 플라스크에서 배양한 숫송아지 신장 세포 부유액(MDBK, 3.5×105 세포/ml)을 96공 플레이트에 100μl씩 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 18 내지 24시간 동안 배양하였다. 인산완충용액(pH 7.0)으로 전체 공을 세척한 후 1×10⁵내지 4×10⁵pfu/ml의 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 100μl 씩 접종하여 37℃ CO₂배양기에서 18 내지 24시간 배양하여 세포단층을 만든 후 검액인 재조합 인간 알파 인터페론을 2배 연속 희석하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 48시간 방치하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 인간 알파 인터페론의 단백질 농도는 TCA(trichloro acetic acid)침전 후 로우리(Lowry)방법을 이용하여 측정하였다.

미국 국립 보건원(NIH)에서 분양받은 알파 인터페론 표준품을 이용하여 측정한 결과 2.0×10⁶IU/mg이상의 비활성을 나타내었다.알파 인터페론 표준품의 역가가 2.0×10⁶IU/mg인 점을 감안할 때, 상기 실시예에서 정제한 재조합 인간 알파 인터페론이 단백질의 구조 및 순도면에서 문제가 없음을 시사한다.

참조예 :

알파 인터페론의 pH 변화에 따른 분자량 측정

상기 실시예 1에 의하여 정제된 알파 인터페론의 완충용액(10mm Na-인산, 0.14M NaCl, pH 7.2)을 인터페론의 농도를 달리하여 준비하였다. 인터페론의 농도는 각각 2.7mg/ml, 0.68mg/ml, 그리고 0.27mg/ml이었다. 각각의 용액을 겔여과-HPLC컬럼(Protein-PAK 125, Waters사, 미국)에 용매의 속도 0.5ml/분으로 투입하여서 컬럼에서 용출되는 알파 인터페론의 시간을 측정, 기록하였다. 용출되는 알파 인터페론의 용액 내에서의 분자량은 표준 단백질들을 이용하여 결정하였으며, 사용된 표준 단백질로는 우혈청 알부민(M.W. 66.200), 오브알부민(M.W. 42,700), 그리고 소이빈 트립신 인히비터(M.W. 21,500)등을 사용하였다.

실험 결과는 제6도에 나타나 있으며, 이에 의해 알파 인터페론의 농도가2.7mg /ml 일때는 분자량이 약 42,700, 0.68mg/ml 일 때는 23,500, 그리고 0.27mg/ml 일 때는 분자량 19,000임을 보여 주었다. 따라서, 본 실험으로 알파 인터페론의 농도가 적어도 2mg/ml 이상이 되면, 본 발명의 마지막 겔여과 컬럼에서 알파 인터페론이 중합체 (dimer)의 위치에서 용출되어 1차 겔여과 크로마토그래피에서 분리되지 않은 알파 인터페론과 분자량이 거의 같은 오염 물질들을 분리할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

Claims (2)

1. 재조합 효모에서 발현된 알파 인터페론을 정제함에 있어서, 조정제된 알파 인터페론을 pH 4.0 내지 5.0에서 겔여과 크로마토그래피한 후 pH 6.5 내지 8.0에서 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파 인터페론의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 pH 6.5 내지 8.0에서의 겔 여과 크로마토그래피시 알파 인터페론의 농도가 2.0mg/ml 이상임을 특징으로 하는 방법.