KR920009520B1 - 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제방법

제1도는 본 발명에 따른 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제과정에 있어서 음이온 교환수지를 이용하여 분리한 크로마토그램.

제2도는 본 발명에 따른 정제과정에 있어서 페닐-세파로즈를 이용하여 분리한 크로마토그램.

제3도는 본 발명에 따른 정제과정에 있어서 세파크릴 S-300을 이용하여 분리한 크로마토그램.

제4도는 본 발명에 따른 정제과정에 있어서 헤파린-세파로즈를 이용하여 세분화시킨 재조합 인체 종양 괴사인자(TNF-α)의 크로마토그램.

제5도는 상기의 정제과정을 거쳐 정제된 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)를 15% 소디움도데실설페이트 플리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)한 결과.

상기 도면에서, A는 효모에서 발현된 rTNF-α을 포함한 전체단백질(50μg)이며, B는 암모니움 설페이트 침전후의 rTNF-α(50μg)이고, C는 DEAE 음이온 교환 수지 통과후의 rTNF-α을 포함한 분획(30μg)이며, D는 페닐-세파로즈 후의 단백질(50μg))이며, E는 S-300 세파크릴 통과 후의 B분획의 rTNF-α(50μg)이며, F는 헤파린-세파로즈에서 세분화된 B분획의 rTNF-α(50μg)이며, G는 분자량이 알려진 표준단백질들의 결과이다.

본 발명은 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 효모에서 발현된 유전자 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)를 고순도와 고역가로 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.

1962년 O'Malley 등 다당류지질(lipopolysaccharide)의 주입으로 자극받은 쥐로부터 얻은 혈철을 종양을 갖고 있는 다른 쥐에 투여하자 출혈성 괴사[hemorrhagic necrosis)가 유발됨을 발견하였다(J. N. C. I., 29, pp 1169-1175(1962)]. 그 후, 1974년 Carswell 등도 Mycobacterium bovis 계통의 Bacillus Calmette- Guerin으로 감염시킨 생쥐, 쥐, 토끼 등에 엔도톡신을 처리한 후 얻어진 혈청이 숙주인 생쥐에는 영향을 미치지 않으면서 암세포만을 괴사시킴이 발견되었다[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, pp. 36663670(1975)].

이렇게 혈청내의 암세포를 괴사시키는 인자를 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor: TNF-α)라고 불리게 되었는데, 이들 TNF-α는 일반세포에는 영향을 미치지 않으면서 특정한 암세포만을 선택적으로 괴사시키는 것으로 밝혀졌다.

백혈구에서 생산되는 시토킨(cytokin)으로는 TNF-α 외에도 TNF-β가 있음이 발견되었다[J. Biol. Ghem., 259, pp 686(1984)]. TNF-α는 유사분열물질(mitogen)로 자극된 거식세포에서 분비되는 반면 TNF-β는 유사분열물질로 자극된 임파세포에서 분비된다.

1985년 Bharat Aggarwal 등은 HL-60 전골수 백혈병 세포주를 4β-포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 처리한 후 세포배양액으로부터 처음으로 인체 TNF-α를 분리정제하는데 성공하였다[J. Biol. Chem., 260, pp 2345-2354(1985)]. 정제방법으로 TNF가 함유된 세포배양액을 조절된 다공유리(controlled-pore glass)에 흡착시킨 후, DEAE-음이온 교환 수지와 모노-Q 컬럼 그리고 역상 고압 크로마토그래피 등을 차례로 이용하여 성취되었다. 정제된 TNF의 분자량은 약 17,000달톤이었으며, 등전점은 5.3이었다.

정제된 TNF-α의 아미노산 조성이 결정되었으며, 이를 이용하여 Wang등에 의하여 인체 TNF-α의 cDNA가 확정되었다[Science, 228, pp. 149-154,(1985)]. 그 결과 TNF-α는 233개의 아미노산으로 구성되어 있으며 생체내의 합성시에 76개의 시그널 시퀀스가 분리되면서 157개의 아미노산을 가진 성숙한 단백질로 생체내에 존재함이 밝혀졌다.

E. coli에서 인체 TNF-α가 다량 발현됨으로써 처음으로 물리화학적 특성을 자세히 연구할 수가 있었고, Jones 등에 의하여 X-레이 크리스탈 로그래피 방법에 의한 3차 구조가 규명되었다[Nature, 338, pp. 225-228(1989)].

최근에는, 유전공학기법에 의해 다량의 인체 TNF-α가 생산됨으로써 새로운 항암제의 개발이라는 측면에서 상당한 기여를 할 수 있는 가능성이 대두되었으며, 더욱이 동물 및 시험관내 실험에서 TNF를 α-, β- 또는 γ-인터페론 등과 병용투여하였을 경우 항바이러스나 항증식효과 등에서 TNF-α나 인터페론을 단독적으로 사용하는 것보다 훨씬 높은 상승효과를 나타냄이 발견됨으로써[proc. Natl, Acad, Sci., USA, 80, pp. 5397-5401, (1983): Cancer Res., 49, pp. 5618-1622,(1989)], 타항암제와의 병용투여제제로써 TNF-α의 유용성이 확인되었다.

이에 본 발명은 효모에서 발현된 유전자 재조합 인체 TNF-α를 높은 생리활성을 가지며 임상에 적용가능하도록 고순도로 대량 정제시키는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 효모로 부터 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)를 정제하는 방법인 것으로, 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)가 발현되어 있는 효모를 페닐메틸설포닐플루오라이드가 함유된 완충용액에 현탁하여 분쇄시킨 후 침전물을 제거하고, 얻어진 용액에 암모니움 설페이트를 60% 농도가 되게 더 첨가한 후, 상등액을 제거하여 침전된 단백질을 얻은 다음, 1종 이상의 액상 크로마토그래피를 수행한 후, 헤파린-세파로즈 컬럼(Heparin-Sepharose column)을 이용하여 크로마토그래피함을 특징으로 하는 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)를 정제하는 방법인 것이다.

이와 같은 본 발명의 정제방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 재조합 안체 TNF-α가 발현되어 있는 효모를 완충용액[10mM Tris(Tris 히드록시메틸아미노메탄), 1mM PMSF(페닐메틸설포닐플루오라이드), pH 8.0]에 현탁시킨 후 0.5 내지 0.75mm 직경의 유리구슬로 다이노밀(Dynomil)에서 세포막을 분쇄시킨다. 여과 장치에 의해 유리구슬을 제거한 후 분쇄된 효모용액을 원심분리하여 불용성침전물을 제거한다.

이렇게 하여 얻어진 재조합 인체 TNF-α를 함유하는 상등액에 암모니움 설페이트 40%농도로 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 얻고, 그 용액에 암모니움 설페이트 60% 농도가 되게 더 첨가하여 침전되는 단백질들을 얻어낸다. 이 침전된 단백질들을 완충용액에 용해시킨 후 투석을 통하여 암모니움 설페이트를 제거한다.

그런 다음, 상기와 같이 얻어진 단백질 용액을 음이온 교환 크로마토 그래피하여 부분정제된 재조합 인체 TNF-α를 얻는다. 음이온 교환 수지로는 DEAE-셀룰로즈, DEAE-세파크릴 또는 q-세파로즈 등이 사용될 수 있다. 이로써, 음이온 교환 수지에 강하게 흡착하는 단백질, 핵산 및 발효 배지에서 유래된 색소로부터 재조합 인체 TNF-α를 어느 정도 분리시킬 수 있다.

이어서, 재조합 인체 TNF-α를 함유하는 분획을 수집하여 여기에 NaCl이 함유된 완충용액으로 미리 평형화시킨 소수성 컬럼을 통과시켜 크로마토그래피한다. 이때, 재조합 인체 TNF-α를 칼럼에 흡착시키지 않고 용출되게 함으로써 재조합 인체 TNF-α보다 소수성이 강한 오염 단백질로부터 분리시킨다. 젤로서는 페닐-세파로즈 또는 옥틸-세파로즈 등을 사용할 수 있다.

상기 과정에서 얻은 재조합 인체 TNF-α용액에 암모니움 설페이트를 65% 농도가 되도록 첨가하여 재조합 인체 TNF-α를 침전시킨 후 원심분리하여 재조합 인체 TNF-α침전물을 얻은 다음 최소량의 완충용액으로 용해시킨 재조합 인체 VDYDDOR을 젤-여과 크로마토그래피한다. 이때, 젤로는 S-200 세파크릴이나 S-300 세파크릴 또는 G-75 세파덱스 등을 사용할 수 있다. 이 단계에서, 소듐 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)하여 젤에서 용출된 재조합 인체 TNF-α 분획들의 순도를 측정한 결과 95%이상의 높은 순도를 나타내었다.

그런 다음, 상기 과정에서 얻은 재조합 인체 TNF-α를 투석하여 염을 제거한 후에 다시 헤파린-세파로즈를 이용한 친화성 크로마토그래피를 수행한다. 특히, 헤파린-세파로즈를 이용한 친화성 컬럼을 사용하면, SDS-PAGE에서 단일 밴드로 나타나는 종양괴사인자라 할지라도 비활성의 차이를 보여주는 더 세분화된 분획들로 분리됨으로써 가장 높은 활성의 인체 TNF-α를 얻을 수 있는 잇점이 있다.

본 발명에서 전술한 액상 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피를 선행하고 이어서 소수성 크로마토그래피, 젤 크로마토그래피의 순으로 수행하는데, 음이온 교환 크로마토그래피의 경우, 젤 내부에 있는 공간의 크기를 조절할 수 있어 단백질의 크기에 따라 젤을 선택할 수 있으며 소수성 수지에 비하여 가격면에서도 경제적이고 불순물에 오염된 후 세척 및 재생이 용이하므로 가장 먼저 수행하는 것이 바람직하고, 소수성 크로마토그래피의 경우는 음이온 크로마토그래피 다음에 이어서 수행함으로써 전 단계에서 용출된 용액에 소금이 함유되어 있기 때문에 전처리과정 없이 바로 로딩할 수 있을 뿐 아니라 음이온 수지에 의하여 불순단백질 핵산 및 발효배지에서 유래된 색소로부터 TNF-α가 어느 정도 순수하게 분리되었기 때문에 고가인 소수성 수지의 수명을 길게하는 잇점이 있다. 다음 단계로 수행하는 젤-크로마토그래피는 저분자량의 불순 단백질과 재조합 TNF-α를 분리시키는 초고속 원심분리기의 역할을 대체할 수 있는 것으로서, 액상 크로마토그래피의 최종단계에 수행하는 것이 재조합 TNF-α정제순도를 95%이상 높일 수 있으므로 바람직하다.

이상과 같은 본 발명의 정제방법은 발현숙주에 관계없이 일반적인 효모나 박테리아로부터 발현된 유전자 재조합 인체 TNF-α의 정제에 모두 응용될 수 있으며, 특히 본 출원인에 의해 재단법인 한국종균협회에 1990년 5월 8일에 기탁번호 제10692호로 기탁된 Saccharomyces cerevisiae LUCK-TNF-2Y로 부터 재조합 인체 TNF-α를 정제하는데 바람직하다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 다음의 실시예에서 재조합 인체 TNF-α가 발현된 효모균주로는 Saccharomyces cerevisiae LUCK-TNF-2Y를 사용하였다.

[실시예 1]

재조합 인체 TNF-α가 발현된 효모 150g을 300ml의 완충용액[10mM Tris, 1mM PMSF, pH 8.0]에 현탁시켜서 0.6mm의 유리구슬로 다이노밀에서 15분간 분쇄시킨 후, 여과장치를 통하여 유리구슬을 제거하였다. 약 100ml의 완충용액으로 유리구슬을 완전히 씻어낸 후 이두용액을 합쳤다. 이 용액을 15,000xg에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후 상등액만을 취하였다.

이 상등액에 암모니움 설페이트 분말을 최종 농도가 40%가 되게 첨가하고, 4℃에서 6시간 내지 10시간 동안 평형시켰다. 그 후 15,000xg에서 1시간 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 얻었다. 이 상등액에 암모니움 설페이트 분말을 최종농도가 60%가 되게 더 첨가하고 약 2 내지 6시간 정도 평형화시킨 후, 15,000xg에서 1시간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이때 약 40g의 침전물을 얻었다.

이 침전물을 100ml의 10mM Tris-HC1, pH 8.0로 용해시킨 후, 동일 완충용액에서 4℃에서 투석하였다. 이 과정에서 전체부피가 약 200ml로 증가되었다.

[실시예 2]

DEAE-셀룰로즈 컬럼(용적 부피; 250ml)을 10mM Tris-HC1, pH 8.0으로 평형화시킨 후 상기 실시예 1에서 얻은 단백질 용액 200ml을 4℃에서 칼럼을 투여하였다.

DEAE-음이온 교환수지에 흡착되지 않은 단백질 및 기타 물질을 상기완충용액으로 충분히 씻어낸 후 상기 완충용액에서 NaCl농도가 각각 OM과 0.2M이 되도록 만든 용액 1ℓ로 선형구배시키며, 이때의 용출속도는 7.6cm/시간으로 하였다. DEAE-음이온 교환 수지에서 용출된 각 분획의 단백질을 280nm의 파장에서 검출한 결과를 제1도에 나타내었다.

재조합 인체 TNF-α에 해당하는 분자량을 갖는 컬럼 분획들을 수집한후(제1도에서 검은 막대 부분), NaCl을 첨가하여 최종농도를 2M로 맞추었다.

[실시예 3]

상기 실시예 2에 의하여 얻어진 재조합 인체 TNF-α용액(500ml)을 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 2M NaCl 용액으로 평형화시킨 페닐-세파로즈(Pharmacia사 제품) 크로마토그래피 컬럼(용적 부피: 200ml)에 35.6cm/시간의 속도로 투여하였다. 이때 재조합 인체 TNF-α는 젤 메디아에 흡착되지 않고 컬럼에서 용출되었으며 재조합 인체 TNF-α보다 소수성이 강한 단백질들만이 젤에 흡착되었다.

이 흡착된 오염 단백질들은 염기의 농도를 낮추어 컬럼에서 용출시켰다. 이 과정을 280nm의 파장에서 검출하여 제2도에 나타내었다. 15% SDS-PAGE상에서 재조합 인체 TNF-α의 순도가 높은 분획들을 수집하고(제2도에서 검은 막대 부분), 여기에 암모니움 설페이트의 최종농도가 65%되게 가한 후, 원심분리하여 얻어진 침전물들을 100ml의 20mM Tris, pH 8.0에 용해시켰다.

[실시예 4]

상기 실시예 3에서 얻은 rTNF-α용액(100ml)을 20mM Tris-HCl, 02MNaCl, pH 8.0으로 평형화시킨 세파크릴 S-300(부피 8l)에 투여하여 3cm/시간의 용출속도로 단백질을 분리시켰다. 제3도는 이 결과를 나타낸 것이다. 제3도에서 A와 B 분획 모두 rTNF-α가 나타났으며, 모두 거의 비슷한 생리활성을 나타내었다. B분획의 단백질 양이 A보다 많고 또한 순도도 월등히 높았으므로 B분획들을 모아서 10mM Tris-HCl, pH 8.0에서 투석하여 염기를 제거하였다. 이때 단백질 용액의 부피는 약 500ml였다. 이 용액을 YM10 아미콘 필터로 농축하여 최종 부피가 200ml가 되도록 하였다.

[실시예 5]

상기 실시예 4에서 얻어진 용액을 헤파린-세파로즈(Pharmacia사 제품) 크로마토그래피(용적부피: 150ml)하였다. 이때, 평형 용액으로는 10mM Tris-HCl, pH 8을 사용하였다. 재조합 인체 TNF-α를 투여하고, 평형용액으로 충분히 세척한 후, NaCl의 농도구배가 OM에서 0.2M이 되게 각기 600ml의 용액으로 선형구배하여 용출시켰다. 그결과를 제4도에 나타내었는바, 재조합 인체 TNF-α는 더 세분화되었다.

제4도의 A, B 및 C 분획을 15% SDS-PAGE하였을 경우, A, B 및 C 분획 모두가 재조합 인체 TNF-α의 분자량과 동일한 위치에 단일 단백질 밴드를 보여주었다. 그리고, A, B 및 C분획 모두 거의 동일한 정도의 순도를 보여주었다.

그러나 세포병변에 의한 단백질의 비활성면에서는 각각의 피크에서 나온 재조합 인체 TNF-α가 약간의 차이를 보여주었다. A, B 및 C의 분획중 B분획에서 얻은 재조합 인체 TNF-α가 가장 생리활성이 높았으며, A는 B분획보다 약 2.5배 가량 낮은 비활성을 보여주었다. 대체적으로 이들 어느 분획도 고역가의 생리활성을 유지하고 있는 재조합 인체 TNF-α임이 확인되었으나 그 구성상의 미세한 차이에 의하여 헤파린-세파로즈 컬럼에서 더 세분화된 것으로 사료된다.

재조합 인체 TNF-α의 비활성 측정

10% 우태자혈청이 첨가된 MEM 배지로 T75플라스크에서 배양한 HeLa 및 L929를 세포부유액(1.5×10⁵세포/ml)을 96공 플레이트 100μl씩 적가하고, 30℃를 유지하는 5% CO₂인큐베이터에서 18내지 24시간 배양하여 세포단층을 만든후, MEM으로 2배 또는 4배 연속 희석한 재조합 인체 TNF-α 100μl씩을 37℃를 유지하는 5% CO₂배양기에서 24시간 방치하여 결과를 확인한 다음 크리스탈 바이오렛으로 염색하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 TNF-α희석시 액티노마이신 D가 1μg/ml 들어 있는 MEM으로 희석하며 상대적인 역가 검증을 위해 Genzyme 사이에 구입한 TNF-M(4×10⁷units/mg)을 이용하였다. 세포가 50% 죽는 지점을 종점으로 하여 TNF의 세포 병변 효과를 측정하였다. 비활성의 결정을 위한 단백질의 농도는 Pierce 사에서 구입한 BCA 방법을 이용하였다.

제4도에서 헤파린-세파로즈 컬럼을 이용하여 얻은 A, B 및 C분획의 재조합 인체 TNF-α의 활성은 다음 표 1과 같다.

[표 1]

Claims (5)

1. 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)가 발현된 재조합 숙주세포를 전처리과정을 거쳐 크로마토그래피하여 정제함에 있어서, 전처리과정에서 얻어진 조 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)를 순차적으로, 먼저 음이온교환 크로마토그래피를 수행하고 이어서 소수성 크로마토그래피, 젤 크로마토그래피한 후, 헤파린-세파로즈 컬럼을 이용하여 크로마토그래피함을 특징으로 하는 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE-셀룰로즈, Q-세파로즈 또는 DEAE-세파크릴 수지를 이용하여서 되는 것임을 특징으로 하는 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 젤 여과 크로마토그래피는 S-200 세파크릴, S-300 세파크릴 또는 G-75 세파덱스 수지를 이용하여서 되는 것임을 특징으로 하는 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 소수성 크로마토그래피는 페닐-세파로즈 또는 옥틸-세파로즈 수지를 이용하는 것임을 특징으로 하는 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제방법.
5. 제1항에 있어서, 제조합 숙주세포는 대장균 또는 효모임을 특징으로 하는 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)의 정제방법.

Images