KR950004015B1

KR950004015B1 - 재조합 종양괴사인자(TNF-α)의 개선된 정제방법

Info

Publication number: KR950004015B1
Application number: KR1019920000993A
Authority: KR
Inventors: 배태옥; 박순재; 윤상주
Original assignee: 주식회사럭키; 최근선
Priority date: 1992-01-24
Filing date: 1992-01-24
Publication date: 1995-04-22
Also published as: KR930016539A

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 종양괴사인자(TNF-α)의 개선된 정제방법

제1도는 본 발명에 따른 재조합 인체 종양괴사인자의 정제과정에 있어서 음이온 교환수지를 이용하여 분리한 크로마토그래피의 패턴이다.

제2도는 본 발명에 따른 정제과정에 있어서 셀루파인 설페이트를 이용하여 분리한 크로마토그래피의 패턴이다.

제3도는 본 발명에 따른 정제과정에 있어서 S-300를 이용하여 분리한 크로마토그래피의 패턴이다.

제4도는 15% 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)한 결과로서 A는 분자량이 알려진 표준 단백질로서 겔의 위로부터 포스포리라제 B(97.4kd), 우혈청알부민(66.2kd), 오발부민(42.7kd), 카보닉 안하이드라제(31kd), 소이빈 트립신 억제제(21.5kd), 그리고 라이소자임(14.4kd)이다. B,C,D는 셀루파인 설페이트를 이용한 분리 크로마토그래피에서 각각 '가','나','다' 분획을 나다낸다.

제5도는 셀루파인 설페이트 크로마토그래피에서 분리한 '가','나','다'분획의 등전점을 결정한 결과이다.

제6도는 셀루파인 설페이트 크로마토그래피에서 분리된 '가','나','다'분획의 트립신을 이용한 펩티드 지도(peptide mapping)의 결과이다.

본 발명은 효모로부터 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 친화성 크로마토그레피를 정제방법에 채용함으로써 정제 수율을 높이는 방법에 관한 것이다.

1962년 오말리(O'Malley)등은 다당류지질(lipopolysaccharide)의 주입으로 자극받은 쥐로부터 얻은 혈청을 종양을 갖고 있는 다른 쥐에 투여하자 출혈성 괴사(hemorrhagic necrosis)가 유발됨을 발견하였었다(J.N.C.I., 29, 1169-1175, 1962). 그후, 1974년 칼스웰(Carswell)등도 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)계통의 바실러스 칼메트 게린(Bacillus Calmette-Guerin)으로 감염시킨 생쥐, 쥐, 토끼 등에 내독소를 처리한 후 얻어진 혈청이 숙주인 생쥐에는 영향을 미치지 않으면서 암세포만을 괴사시킴을 발견되었다(Proc. Natl. Acad. Sci., USA,72, 3666-3670,1975).

이렇게 혈청내의 암세포를 괴사시키는 인자를 종양괴사인자(Tumor Necrosis Facto

r : TNF-α)라고 불리게 되었는데, 이들 TNF-α는 일반세포에는 영향을 미치지 않으면서 특정한 암세포만을 선택적으로 괴사시킨다는 것이 밝혀졌다.

백혈구에서 생산되는 시토킨(cytokin)으로는 TNF-α외에도 TNF-β가 있음이 발견되었다(J. Biol,Chem.,259, 686,1984). TNF-α는 유사분연물질(mitogen)로 자극된 거식세포에서 분비되는 반면, TNF-β는 유사 분열 물질로 자극된 임파세포에서 분비된다.

1985년 바랏트 아가웰(Bharat Aggarwal)등은 HL-60 전골수 백혈병 세포주를 4β-포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 처리한 후 세포 배양액으로부터 처음으로 인체 TNF-α를 분리정제하는데 성공하였다(J. Biol, Chem.,260, 2345-2354,1985). 정제방법으로는 TNF가 함유된 세포배양액을 조절된 다공유리(controlled-pore glass)에 흡착시킨 후, DEAE-음이온 교환 수지와 모노-Q 컬럼 그리고 역상 고압 크로마토그래피등을 차례로 이용하여 성취되었다. 정제된 TNF의 분자량은 약 17,000달톤이었으며, 등전점은 5.3이었다.

정제된 TNF-α의 아미노산 조성이 결정되었으며, 이를 이용하여 왕(Wang)등에 의하여 인체 TNF-α의 cDNA가 확정되었다(Science,228, 149-154,1985). 그 결과 TNF-α는 233개의 아미노산으로 구성되어 있으며 생체내의 합성시에 76개의 시그널 시퀀스가 분리되면서 157개의 아미노산을 가진 성숙한 단백질로 생체내에 존재함이 밝혀졌다. 현재까지 인체 TNF-α 외에도, 돼지, 소, 토끼, 고양이, 쥐 등의 TNF cDNA 유전자가 규명되었다(Fiers, W., Tumor Necrosis Factors, Structure, Function, and Mechanism of Action, Marcel Dekker, New York, 1991). 특히 인체 및 쥐의 TNF cDNA 유전자가 박테리아(E. coli)에서 다량 발현되었으며, 최근에는 효모에서도 인체 TNF-α가 세포내에 용해된 상태로 다량 발현됨이 확인되었다(조중명 등, 대한민국 특허출원 89-20648 및 89-20649).

유전자 조작에 의한 인체 TNF-α의 생산이 용이해짐에 따라, TNF-α의 물리 화학적 특성이 자세히 연구되었으며, 존스(Jones)등에 의하여 X-선 결정방법에 의한 3차 구조도 규명되었다(Nature,338, 225-228, 1989). 자연상태의 TNF-α는 삼중체(trimer)로 존재하며 각 단량체마다 하나의 다이설파이드결합을 가지고 있다.

최근에는 다량의 재조합 인체 TNF-α가 생산됨으로써, 새로운 항암제의 개발이라는 측면에서 상당한 기여를 할 수 있는 가능성이 대두되었으며, 더우기 동물 및 시험관내 시험에서 TNF를 α-,β- 또는-인터페론 등과 병용투여하였을 경우 항 바이러스나 항증식효과 등에서 TNF-α나 인터페론을 단독적으로 사용하는 것보다 흴씬 높은 상승효과를 나타냄이 발견됨으로써 타 항암제와의 병용투여 제제로써 TNF-α의 유용성이 확인되었다(Proc. Natl. Acad. Sci., USA,80, 5397-5401, 1983 ; Cancer Res.,49, 5618-5622, 1989).

유전자 재조합 기술에 의해 제조된 TNF-α를 정제하는 방법이 개발되었는데 염료-결합 가교 아가로즈겔 컬럼을 사용하여 유전자 재조합 토끼 TNF-α를 분리하거나(가지하라 준이찌 등, 대한민국 특허 공개번호 86-4149), 유전자 재조합 포유동물 TNF를 음이온 교환기를 이용하여 대장균으로부터 분리하는 방법(월더 씨. 피어스등, 대한민국 특허 공개번호 86-5023)등이 알려져 있다.

이에 본 발명은 효모에서 발현된 유전자 재조합 인체 종양괴사인자(TNF-α)를 높은 생리활성을 가지며 임상에 적용가능 하도록 파이로젠 함량이 극미량이며, 고순도로 대량 정제시키는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 특히, 본 발명중 셀루파인 설페이트를 사용할 경우, 다른 일반 음이온 교환수지로는 분리할 수 없는 상이한 등전점을 갖는 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)를 분리할 수 있는 장점이 있다. 특기할만한 사실은 셀루파인 설페이트 컬럼에서 분리되는 재조합 종양괴사인자들의 분획이 SDS-폴리아크릴 아미드 전기영동에서 동일한 분자량을 보여주며, 생물학적 비활성면에서도 차이가 거의 없으나, 등전점의 차이가 있다는 점이다. 또한, 본 발명을 통하여 얻을 수 있는 장점은 재질이 강하고 값이 비교적 저가여서 대량정제에 알맞는 셀루파인 설페이트 겔을 사용한다는 것을 들 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 효모로부터 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 재조합 인체종양괴사인자가 발현되어 있는 효모를 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)가 함유된 완충용액에 현탁하여 분쇄시킨 후 침전물을 제거하고, 얻어진 용액에 암모니움 설페이트를 40% 농도로 첨가하여 침전물을 제거하고, 그 상등액에 암모니움 설페이트를 60% 농도가 되게 더 가한후 상등액을 제거하여 침전된 단백질을 얻은 다음, 1종 이상의 크로마토그래피를 수행함으로써 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

이와 같은 본 발명의 정제방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)가 발현되어 있는 효모를 완충용액(10mM 트리스 히드록시 메틸아미노메탄(Tris-HC1), 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF), pH 8.0에 현탁시킨 후 0.5 내지0.75mm 직경의 유리구슬로 다이노밀(Dynomil)에서 세포막을 분쇄시킨다. 여과장치에 의해 유리구슬을 제거한 후 분쇄된 효모용액을 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한다.

이렇게 하여 얻어진 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)를 함유하는 상등액에 암모니움 설페이트를 40%농도로 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 얻고, 그 용액에 암모니움 설페이트를 60% 농도가 되게 더 첨가하여 침전되는 단백질을 얻어낸다. 이 침전된 단백질들을 완층용액(10mM Tris-HCl, 2.5M NaCl, pH8.0)에 용해시킨다.

상기와 같은 얻어진 단백질 용액을 같은 완충용액으로 미리 평형시킨 소수성 컬럼을 통과시켜 크로마토그래피를 한다. 이때 재조합 인체종양괴사인자를 컬럼에 흡착시키지 않고 용출되게 함으로써 재조합 인체종양괴사인자보다 소수성이 강한 오염 단백질을 제거할 수 있다. 겔로서는 페닐-세파로즈 또는 옥틸-세파로즈등을 사용할 수 있다. 얻어진 단백질 용액은 완총용액(10mM Tris-HCl, pH 8.0)에 투석하여 NaCl를 제거한다.

그런 다음, 음이온 교환 크로마토그래피하여 부분 정제된 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)를 얻는다. 음이온 교환수지로는 디이에이이-셀룰로즈, 디이에이이-세파크릴 또는 큐-세파로즈 등이 사용될 수 있다. 이로써, 음이온 교환수지에 강하게 흡착하는 단백질, 핵산 및 발효배지에서 유래된 색소등을 제거할 수있다. 얻어진 단백질 용액은 완층용액(10mM Tris-HCl, pH 8.0)에 투석하여 NaCl을 제거한다.

투석이 끝단 단백질 용액은 같은 완충용액으로 평형화된 셀루파인 설페이트를 이용한 친화성 크로마토그래피를 수행한다. 특히 셀루파인 설페이트를 사용하여 소디움 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)에서 단일 밴드로 나타나지만 등전위점이 다른 인체종양괴사인자를 분리할 수 있는 잇점이있다. 헤파린-설페이트 컬럼을 사용하여도 유사한 결과를 얻을 수 있으나, 셀루파인 설페이트 컬럼은 가격이 헤파린 설페이트보다 저렴하며, 더 좋은 분리능력을 갖는 장점이 있다. 또한, 컬럼 재생(regeneration)후에도 더 안정된 리간드-수지 결합을 이루고 있다.

상기 과정에서 얻은 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α) 용액은 한외여과장치로 농축시킨 후 겔-여과 크로마토그래피한다. 이때 겔로는 S-200 세파크릴이나 S-300 세파크릴 또는 G-75 세파엑스 등을 사용할 수 있다. 이 단계에서 내독소 등 파이로젠 물질들이 제거된다. 소디움 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)하여 겔에서 용출된 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α) 분획들의 순도를 측정한다.

이상과 같은 본 발명의 정제방법은 발현숙주에 관계없이 일반적인 효모나 박테리아로부터 발현된 유전자재조합 종양괴사인자(TNF-α)의 정제에 모두 응용될 수 있으며, 특히 본 출원인에 의해 재단법인 한국종균협회에 1990년 5월 8일에 기탁번호 제10692호로 기탁된 사카로마이세스 세베비시에(Saccharomyces cerevisiaeLUCK-TNF-2Y)로부터 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)를 전제하는데 바람직하다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 다음의 실시예에서 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)가 발현된 효모균주로는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiaeLUCK-TNF-2Y)를 사용하였다.

(실시예 1)

유전자 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)가 발현된 효모 세포 100g을 200ml 완충용액(10mM Tris-HCl, 0.1mM PMSF, pH 8.0)에 고루 풀어준 후 유리구슬(0.5∼0.75mm, Shinmaru Enterprises Coporation사, 일본)과 비드비터(Beadbeater, Bio-Prod

uct사, 미국)를 사용하여 분쇄시켰다. 분쇄된 세포용액을 12,000rpm에서 1시간동안 원심분리(Becknmn, JA-14 Rotor)하여 상등액을 모으고 암모니움 설페이트를 첨가하여 최종농도가 40%가 되도록 한다음 4℃에서 교반시키면서 4시간 이상 방치하였다. 침전이 생긴 용액을 같은 속도로 1시간 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 얻은 후 암모니움 설페이트를 첨가하여 최종농도가 60%가 되도록 한 후 4℃에서 교반시키면서 4시간 이상 방치하였다. 같은 속도로 1시간동안 원심분리하여 침전물을 모은 후 100ml 완충용액(10mM Tris-HCl, 2.5M NaCl, pH 8.0)에 녹였다.

(실시예 2)

같은 완충용액(10mM Tris-HCl, 2.5M NaCl, pH 8.0)으로 평형화된 페닐 세파로즈 컬럼(Phanmcia사 Sweden)에 단백질 용액을 15cm/hr의 속도로 투입하면서 겔에 붙지 않고 나오는 부분을 모은다. 다 투입된 후에도 레코더의 피크가 다 띨어질 때까지 같은 완충용액을 흘려보내주면서 단백질 용액을 모은다. 모아진 단백질 용액은 10mM Tris-HCl, pH 8.0 완충용액에 투석시켰다.

(실시예 3)

상기와 동일한 완충용액(10mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형시킨 디. 이. 에이. 이-셀룰로즈 컬럼(DEAE-Cellulose, Whatman)에 투석이 끝난 단백질 용액을 15cm/hr 속도로 투입한 후 겔에 붙지않는 단백질이 더 이상 나오지 않을때까지 다시 완층용액을 흘려보내 준다. 레코더의 피크가 다 띨어지면 완충용액에 NaCl의 농도가 각각 0M인 것과 0.1M인 것을 겔 부피의 5배로 준비하여 9cm/min의 속도로 선형구배시켜 흘려보내서 단백질을 용출시키는데 그 결과를 제1도에 나타내었다. 용출된 단백질은 소디움도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 분석하여 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)가 가장 많은 부분을 모아 10mM Tris-HCl, pH 8.0인 완충용액에 투석시켰다.

(실시예 4)

투석이 끝난 단백질 용액을 10mM Tris-HCl, pH 8.0으로 평형화된 셀루파인 설페이토 컬럼(Cellufine Sulfate, Amicon사, 미국)에 9cm/hr의 속도로 투여하여 단백질을 붙인 후 같은 완충용액을 흘려보내어 겔에 붙지 않는 단백질은 모두 제거한다. 레코더의 피크가 다 떨어지면 같은 완충용액에 NaCl의 농도가 각각 0M, 0.2M인 용액을 겔 부피의 5배를 준비한 다음 9cm/hr의 속도로 선형 구배시켜 흘려보내서 켈에 붙은 단백질을 용출시킨다. 그 결과를 제2도에 나타내었는데, 재조합 인체종양괴사인자는 더 세분화되었다. 용출된 단백질은 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통하여 분석한 후 TNF-α가 가장 많은 부분을 모아 한외여과장치(Amicon사, YM10)를 사용하여 20ml까지 농축시켰다.

(실시예 5)

농축된 단백질 용액을 10mM Tris-HCl, 0.2M NaCl, pH 8.0인 완충용액으로 평형화된 세파크릴 에스-300 컬럼(Sephacryl S-300, Pharmacia사, 스웨덴)에 3cm/hr의 속도로 투여한 다음 같은 완충용액을 같은 속도로 흘려보내주어 단백질을 용출시켰다. 그 결과를 제3도에 나타내었다. 용출된 단백질을 소디움 도네실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 하여 순수한 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)부분만을 모았다.

재조합 인체종양괴사인자의 분자량 측정

상기 실시예 2에 따라 셀루파인 설페이트 컬럼에서 분리된 '가','나' 및 '다'분획(제2도 참조)을 15% 에스. 디. 에스-폴리아크릴아미드 전기영동한 결과 상기 셀루파인 설페이트에서 분리된 분획은 모두 동일한 분자량을 나타내었으며 이를 제4도에 나타내었다. 제4도의 B,C 및 D는 각각 상기 '가','나' 및 '다'분획에 해당되는 것이다.

재조합 인체종양괴사인자의 등전점 결정

등전점 결정용 겔(Ampholine PAG Plate, pH 3.5∼9.5, Pharmacia사, 스웨덴)을 전기 영동장치(Multiphor II electrophoresis unit, Pharmacia사)에 올려놓은 후 전극용 종이에 전극용액(음극 : 1M 소디움 히드록시드, 양극 : 1M 인산)을 충분히 적셔 겔의 음극과 양극에 각각 놓는다. 시료투여용 종이조각을 음극으로부터 약 1cm 정도 떨어진 곳에 위치시킨 다음 단백질이 증류수에 1-5mg/ml 정도 녹아 있도록 시료를 준비한 후 종이조각에 10 내지 20μl를 투여한다. 전압과 전류 그리고 전력의 한계값을 정해주고 전원을 연결시킨 다음 90분동안 실행시킨다. 이때 한계값은 24.5cm 길이의 겔의 경우 1500V, 50mA, 30W이며 겔의 길이에 비례해서 전류의 값만 증감시킨다. 전기영동이 끝난 후 겔을 고정용액(11.6% 트리클로로아세트산, 3.4% 설포살리실산)에 담가 30분 반응시킨 후 세정용액(25% 에탄올, 8% 아세트산)에 5분 동안담근 후 염색용액(0.12% 쿠마시블루 R-250, 25% 에탄올, 8% 아세트산)에서 10분간 염색시킨다. 염색이 끝나면 다시 세정용액에 담가서 원하는 정도까지 색을 뺀 후 셀로판 종이사이에 끼워 상온에서 말린다.

제5도에서는 셀루파인 설페이트 크로마토그래피 분획중 '가','나' 및 '다'분획만을 모아서 등전점을 결정한것이다. 제5도에서 보여 주듯이 '나' 및 '다'분획은 등전점이 약간만 상이하였으나, '가'분획은 나머지 두 분획에 비해서 현격한 차이를 보여주었다. 셀루파인 설페이트에서 분리된 '가','나' 및 '다'분획은 통상적인 음이온 교환수지 크로마토그래피에서는 분리하기가 힘들었다. 따라서, TNF-α,의 극미한 구조 차이에 의해 셀루파인 설페이트에서 분리됨을 보여주었다.

재조합 TNF-α'의 비활성 측정

10% 우태아혈청이 첨가된 MEF 때지로 T75 플라스크에서 배양한 HeLa 및 L929세포부유액(1.5×10E5세포/ml)을 96공 플레이트에 10μl씩 적가하고, 37℃를 유지하는 5% CO₂인큐베이터에서 10 내지 24시간 배양하여 세포 단층을 만든 후, MEM으로 2배 또는 4배 연속 희석한 재조합 TNF-α,100μl씩을 37℃를 유지하는 5% CO₂배양기에서 24시간 방치하여 결과를 확인한 다음 크리스탈 바이오렛으로 염색하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다.

재조합 TNF-α 희석시 액티노마이신 D가 1μg/ml 들어있는 MEM으로 희석하며 상대적인 역가 검증을 위해 겐자임(Genzyme)사에서 구입한 TNF-M(4×10E7 units/mg)을 이용하였다. 세포가 50% 사멸하는 지점을 종점으로 하여 TNF의 세포병변 효과를 측정하였다. 비활성의 결정을 위한 단백질의 농도는 피어스(Pierce)사에서 구입한 BCA 방법을 이용하였다. 제2도에서 셸루파인 실페이트 컬럼을 이용하여 얻은'가','나' 및 '다'분획의 재조합 인체 TNF-α의 활성을 결정한 결과 모두 1.0×10E8 unit/mg 이상의 비활성을 나타내었다. 또한, 각 분휙간의 비활성의 차이는 실험오차 이대에서 차이가 없었다.

재조합 종양괴사인자의 펩티드 지도(Peptide Mapping)

상기 실시예중 제2도의 셸루파인 설페이트 분획인 '가','나' 및 '다'의 재조합 인체종양괴사인자(TNF-α)를 완충용액(50mM Tris-HCl, 1mM CaCl₂, pH 8.3)에 1mg/ml의 농도로 녹인 후 0.01% 트리 플루오르 아세트산으로 녹인 트립신(Boehringer Mannheim Biochemica, 독일)을 재조합 인체종양괴사인자 절량의 1%를 넣어주고 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그후 다시 1%의 트립신을 넣어주고 14시간 반응시키고,최종적으로 1%의 트립신을 넣어주어 6시간 반응시킨 후 100℃에서 5분 동안 끓인 다음 0.45μm 여과지로 여과시켰다. 여과된 시료는 고압 역상액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하였는데 사용한 기기는 워터스사 제품(Waters 510, Millopore사, 미국) 이었으며 컬럼은 μBONDAPAK C18(Millpore사, 미국)을 사용하였고 프로그램은 아래와 같다. 펩티드 분석도는 제6도에 나타나 있다.

1 A용액의 조성 : 0.05% 트리플루오로 아세트산(TFA)/H₂O

2 B용액의 조성 : 0.05% 트리플루오로 아세트산(TFA),80% 아세토니트릴(Acetonitrile, MERK사, 미국) /H₂O

제6도의 (가)는 셀루파인 설페이트 크로마토그래피의 '가'분획을 트립신 처리한 결과이며, 제6도의 (나)와 (다)는 각각 셀루파인 설페이트 분획 '나'와 '다'를 펩티드 분석한 결과이다. 셀루파인 설페이트 분획 '가'는 '나' 및 '다'와 상당한 차이가 있음을 발견하였다. (나) 및 (다) 분석도에서 보여지는 TR1,TR3,TR4 그리고 TR12 피크들은 나타나지 않았다. 그러나, TR15 피크는 상당히 크게 나타났다. TR15 피크는 종양괴사인자의 피크와 일치한다. 이 실험결과에 의하면 셀루파인 설페이트에셔 먼저 용출된 '가'분획의 재조합 종양괴사인자는 트립신에 의해 완전히 절단되지 않았음을 시사한다.

Claims

조 종양 괴사인자로부터 셀루파인 설페이트(cellufine sulfate) 친화성 크로마토그래피를 이용하여 재조합 종양괴사인자(TNF-α)를 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 조 종양 괴사인자는 가) 세포 분쇄액을 암모니움 설페이트 분별 침전시키는 과정 ; 나) 페닐-세파로즈 크로마토그래피 ; 다) 음이온 교환수지 크로마토그피 등의 단계를 포함하는 정제과정을 통하여 수득된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 재조합 종양괴사인자(TNF-α)는 재조합 인체, 원숭이 또는 쥐의 종양괴사인자인것을 특징으로 하는 방법.