KR0160934B1

KR0160934B1 - 효모에서 봉입체로 발현된 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법

Info

Publication number: KR0160934B1
Application number: KR1019960000649A
Authority: KR
Inventors: 김규완; 이상미; 김세훈; 김규돈
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1996-01-15
Filing date: 1996-01-15
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR970059184A

Abstract

본 발명은 효모에서 발현된 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법에 관한 것으로, 인 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF)가 봉입체로 발현된 효모 세포를 파쇄하여 봉입체를 수득하고, 상기 봉입체를 용해하고, 용해된 봉입체를 산화시켜 이황 결합을 형성시키고, 이황 결합이 형성된rhG-CSF를 침전시켜 분리한 후 재용해하여 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행함으로써 고순도의 활성을 갖는 G-CSF를 고수율로 정제할 수 있다.

Description

효모에서 봉입체로 발현된 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법

제1도는 효모에서 봉입체로 발현된 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자(이하,rhG-CSF라함)의 발형 정도를 전기영동으로 확인한 결과이고,

제2도는 본 발명에 따른 정제 공정의 각 단계별 생성물을 전기영동한 결과이며,

제3도는 본 발명의 방법에 따라 정제된 rhG-CSF의 아미노말단을 서열분석기를 통하여 분석한 후 역상 고압 크로마토그래피한 결과이며,

제 4 도는 본 발명의 방법에 따라 정제된 rhG-CSF의 구조를 회전분광법으로 측정한 결과이다.

본 발명은 효모에서 발현된 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효모에서 봉입체로 발현된rhG-CSF를 세포파쇄, 봉입체 세척, 용해 및 산화 과정, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 활성이 있는 형태로 정제하는 방법에 관한 것이다.

인체에서 조혈작용은 주로 골수에서 이루어지며 복잡하고 다양한 경로를 통해 여러 종류의 혈구가 만들어진다. 이러한 혈구의 형성은 특정한 당단백질군에 의해 조절되는 것으로 알려져 있으며, 조혈작용의 경로와 단계에 따라 특이한 당단백질이 조절 인자로 작용하는 것으로 밝혀졌다.

조혈작용에 관여하는 당단백질을 총칭하여 콜로니 자극인자(colony stimulatin

g factor, CSF)라 하는데, 이들은 조혈작용의 단계와 경로에 따라 다음과 같은 4종류로 분리될 수 있다:조혈작용의 단계에서 과립 백혈구의 형성에 관여하는 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stmulating factor, G-CSF),대식세포의 형성에 관여하는 대식세포 콜로니 자극인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 광범위한 조혈작용의 경로와 단계를 조절하는 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 그리고 인터루킨-3(Interleukin-3, multileange colony stimulating factor, multi-CSF).

이들중 G-CSF는 조혈작용 경로에서 특히 과립구 모세포의 성장을 촉징시키고 최종 혈구들의 기능을 활성화시키며 골수 백혈구의 형성 및 활성화에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 조혈작용의 조절인자 기능으로 인해 G-CSF는 인체 암 치료를 위한 화학 요법후에 발생하는 파괴된 면역계 세포의 치료, 골수이식, 심한 화상 및 백혈병의 치료제로 이용되고 있다.

이러한 G-CSF가 과립성 호중구의 성장 및 분화에도 관여하는 것으로 알려진 후(Nicola, et al., J . Biol. Chem., 252,9017(1983))인간 방광암 세포로부터 유래된 G-CSF가 정제되었고(Welte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82,1526(1985)), G-CSF의 cDNA염기서열이 세게카즈등 및 소우자 등에 의해 밝혀졌다.(Shegekazu et al., Nature, 319, 415(1986); and Souza et al., Science, 232, 61(1986)). G-CSF는 폴리 펩티드 사슬에 1개의 O-글리코실화 부위를 갖는 구조의 당단백질로서 글리코실화 정도에 따라 18500 내지 19600의 분자량을 갖는다.

G-CSF의 완전한 폴리펩티드는 174개의 아미노산으로 이루어져 있고 2개의 이황 결합이 존재하며 1개의 당화 부위를 갖는 것으로 밝혀져 있다.

천연 G-CSF는 인간 방광암 세포주 5637(Morioka et al., Res. Exp. Med., 190, 229(1990); and Welte et al., PNAS., 82, 1526(1985)), 내독소가 주입된 마우스의 폐조직(Metcalf et al., J. Cell. Physiol., 116, 198(1983)) 및 인간 편평 상피암 세포주(CHU-2)(Normura et al., EMBO J., 5, 871(1986))등에서 유래된 추출물로부터 황산 암모늄 분획, 수소성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 역상 고압 액체 크로마토그래피 등의 복잡한 과정을 통하여 분획이 분리정제되었다.

최근 유전자 재조합 G-CSF를 발현시킨 후 이를 순수하게 분리하여 그의 활성을 보고한 바 있다. 그 예로, 미국 암젠(Amgen)사의 경우 대장균에서 재조합 G-CSF를 발현시키고 라우르산 나트륨을 이용하여 용해시킨 후 역상 고압 액체 크로마토 그래피로 정제하여 95%이상의 재조합 G-CSF 단백질을 얻었으며(Souza et al., Science, 232, 61(1986)), 일본 쭈가이(Chugai)사의 경우 동물세포에서 발현된 재조합 G-CSF를 겔 여과 크로마토그래피 및 소수성 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.(Tsuchiya et al., EMBO J., 6, 611(1987); and Oheda et al., J. Biochem., 103, 544(1988)).

그러한 재조합 G-CSF 단백질 중에서 대장균 유래 단백질의 경우에는 대장균으로부터 유래된 발열물질을 제거하기가 쉽지 않아 의약품으로 제조하려면 발열물질을 제거하는 과정을 필히 추가해야 하고, 산화 및 원상화 과정시 정상화된 단백질 구조를 이루지 못한 것들이 소실되며, 안정성이 좋지 못하다. 또한 동물세포로부터 유래된 재조합 G-CSF를 정제하는 경우에는 정제 초기 단계인 겔 여과 크로마토그래피과정을 위해 세포 배양액을 과도하게 농축해야 하기 때문에 소규모의 정제과정에서는 가능할 지 모르나 대량으로 정제하기에는 적합하지 못하다.

또한 봉입체로 발현된 rhG-CSF의 경우에는 천연 단백질의 구조를 이루지 못하므로 천연적인 구조를 갖도록 하기 위한 일련의 과정들이 정제 과정에 포함되어야 하는데, G-CSF구조의 2개의 이황 결합을 이루는 산화과정이 천연 단백질 구조를 이루게 하는 원상화 과정에 필수적인 과정이라고 보고된 바 있다.(Lu, H. S. et al., J. Biol. Chem., 267, 8770(1992)). 따라서, 봉입체로 발현된 단백질을 정제하기 위해서는 먼저 2개의 이황결합이 정상적으로 이루어진 경우와 그렇지 않은 경우를 구분 조사할 수 있는 방법이 필요하며, 여기에는 SDS전기영동시 시료용 완충용액에 베타 머캡토 에탄올등의 환원성 시약을 첨가하지 않는 방법이 있다.

본 발명자들은 효모에서 봉입체로 대량 발현된 rhG-CSF를 효율적으로 정제하기 위해 연구를 거듭한 결과, rhG-CSF가 발현된 효모세포를 파쇄하여 얻은 봉입체를 구아니딘 염을 사용하여 용해시키고, 이황결합을 이룰수 있도록 산화시킨 다음 황산암모늄을 이용하여 침전시키고, 요소를 이용하여 재용해하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 후, 요소를 제거하여 소수성 크로마토그래피와 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여서 원상화함으로써 고순도의 활성을 갖는 G-CSF 를 고수율로 정제할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 효모에서 봉입체로 발현된 rhG-CSF를 고순도의 활성을 가진 형태로 고수율로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF)가 봉입체로 발현된 효모 세포를 파쇄하여 봉입체를 수득하고, 상기 봉입체를 용해하고, 용해된 봉입체를 산화시켜 이황 결합을 형성시키고, 이황 결합이 형성된 rhG-CSF를 침전시켜 분리한후 재용해하여 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 효모에서 rhG-CSF를 분리 정제하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자를 봉입체로 발현시킬 수 있는 형질전환된 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 배양하고, 배양된 세포를 원심분리로 모은후, 이를 트리톤 X-100, 염화나트륨, 베타-머캡토 에탄올, 수크로오스등을 첨가한 완충용액(pH 9.0) 에 현탁시킨후, 이를 다이노 밀이나 비드 비터를 이용하여 4℃에서 세포를 파쇄한다.

세포 파쇄 현탁액을 원심분리하여 단백질 침전물을 얻고, 이를 상기와 동일한 완충용액으로 세척하여 불순물들을 완전히 제거한 다음, 6M 구아니딘염 또는 8M요소를 포함한 수용액으로 변성시키면서 봉입체를 용해하고 원심하고 원심분리하여 불용성 불순물을 제거한다.

이어서, 2배 내지 4배 부피의 황산구리를 포함한 산소로 포화된 4내지 6M, 바람직하게는 6M 구아니딘염 또는 6내지 8M, 바람직하게는 8M요소 수용액에, 환원상태의 단백질 농도가 1㎎/㎖이하를 유지할 수 있도록 펌프를 사용하여 가하여 상기 봉입체 용액을 산화시킨다. 이때, 황산 구리의 양은 40μM내지 100μM정도로 조절하고, 비정상적인 이황결합을 막기 위하여 0.2mM 이하의 베타-머캡토에탄올을 첨가하여 준다.

산화과정이 완료되면, 포화 황산 암모늄 용액을 동일 부피로 가하여 단백질을 침전시킨다. 원심분리하여 단백질 침전물을 얻은 후, 이를 초산 나트륨 완충용액으로 완전히 세척하여 이온농도를 낮춘다.

이렇게 얻은 단백질 침전물은 8M요소 수용액으로 충분히 녹이고, 초산나트륨 완충용액을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면SP 양이온 교환수지를 수행한다. 단백질 용출은 60mM초산 나트륨 완충용액을 사용하여, pH5.8 내지 6.2 바람직하게는 pH6.0으로 단계구배시켜 실시한다.

용출된 단백질 용액은 4℃에서 투석여과(diafiltration)시켜 요소를 부분제거한 후에 소수성 크로마토그래피를 수행하는데. 이때 페닐세파로즈 수지를 사용하면 바람직한 결과를 얻을 수 있으며, 용출은 요소의 농도를 0내지 4M로 선형구배시켜 수행한다. 소수성 크로마토그래피로부터 용출된 단백질은, 예를 들면 세파크릴 S-100수지를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행함으로써 분자량이 큰 불순물, 내독소 및 요소를 제거하여 활성도를 갖는 3차구조를 형성하게 된다.

이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 : 효모에서 봉입체로 발현된 rhG-CSF의 분리 및 정제]

(단계1) rhG-CSF를 생산하는 효모 세포의 배양

-80℃의 냉동고에 보관한 rhG-CSF 생산균주(pYLBC A/G-UB-Met G-CSF/DC04, 한국 특허출원 제95-44345 호 참조)1㎖를 루이신 결핍 선택배지 50㎖를 함유한 플라스크에 접종하고 30℃에서 180rpm 으로 24시간 동안 진탕배양기에서 배양하였다. 이 배양액을 YPD 접종배지(효모 추출물 1%, 효모 펩톤 2%, 포도당 8%)150㎖에 5%(v/v)비율로 2차 접종하여 30℃에서 12내지 15시간 동안 진탕배양기에서 180rpm으로 배양하여 이를 3ℓ배양의 접종액으로 사용하였다.

상기 배양접종액을 YPD(효모 추출물 2%, 효모펩톤3%, 포도당3.5%)3ℓ배지에 5%(v/v)비율로 접종하여 pH4.5 내지 5.5이하 30℃에서 500rpm,1vvm 통기속도로 48시간 동안 배양을 실시하였다. 배양이 완료된 효모 세포는 8,500rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 -30℃냉동고에 보관하였다.

제1도는 상기와 같이 효모에 봉입체로 발현된 rhG-CSF의 발현정도를 전기 영동으로 확인한 것이다. 즉, 배양접종액과 3ℓ배지에서 배양 시작 41시간 및 48시간 경과후 O.D(600nm)가 5인 시료를 각각 1㎖씩 취하여 14,000rpm에서 1분간 원심분리하여 얻은 세포침전물에, 8M 요소용액 200㎕와 미세 유리구슬(외경0.5㎜)300㎕를 첨가하여 비드 비터(bead-beater, 바이오스펙, 미국)에서 2분간 세포를 파쇄하고 14,000rpm에서 1분간 원심분리 하여 얻은 상등액을 15% SDS 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 rhG-CSF의 발현을 각각 확인할 수 있다.

[(단계2) 세포 파쇄]

0.1%트리톤 X-100, 100mM 염화나트륨, 10mM 베타-머캡토에탄올, 10% 수크로오스 등을 첨가하고 수산화나트륨으로 pH를 8.5로 맞춘 초산 나트륨 완충용액 100㎖에, 상기 단계1에서 배양후 원심분리하여 얻은 효모세포 50g을 현탁시킨후 미세 유리구슬(외경 0.5㎜)200㎖를 첨가하여 4℃에서 비드 비터로 30초씩 5회 세포를 파쇄하였다.

세포 파쇄가 끝난 후의 현탁액은 8,500rpm으로 25분간 원심분리하여 세척된 단백질 침전물을 얻었다.

[(단계3)봉입체의 용해 및 산화]

단계2에서 얻은 단백질 침전물을 0.1% 트리톤 X-100과 1mM 베타-머캡토에탄올을 포함한 6M 구아니딘 수용액 200㎖로 변성시키면서 상온에서 30분간 용해하였다. 용해가 완료된 후에는 봉입체 용액을 8,500rpm으로 25분간 원심분리하여 불용성 불순물을 침전물로서 제거하였다. 0.1%트리톤 X-100과 100μM 황상구리를 포함하고 산소로 포화된 6M 구아니딘염 수용액 800㎖에, 상기 봉입체 용해액을 환원상태의 단백질 농도가 1㎎/㎖이하로 유지될 수 있도록 펌프를 사용하여 2㎖/분의 속도로 가하였다. 이때, 비정상적인 이황결합을 막기 위하여 0.2mM 베타-메캡토에탄올을 첨가하였다.

산화된 단백질 변성 용액에 포화 황산 암모늄 용액 1ℓ를 가하여 단백질을 침전시키고, 8,500rpm으로 25분간 원심분리하여 단백질 침전물을 얻었다. 이를 30mM 초산나트륨 완충용액 500㎖에 현탁시키고 8,500rpm으로 25분간 원심분리하는 과정을 2회반복하여 이온농도를 낮추었다.

[(단계4)양이온 교환 크로마토그래피]

상기에서 얻은 단백질 침점물을 8M 요소 수용액 500㎖에 가하고 상온에서 1시간 동안 교반하면서 녹였다. 단백질 용액에 초산을 가하여 pH4.2를 유지시킨 후, 8M 요소를 포함하는 30mM 초산나트륨 완충용액(pH4.2)으로 미리 평형화된 SP-세파로즈(파마시아, 스웨덴)컬럼에 흡착시키고 동일 완충용액으로 컬럼내에 유리되어 남아있는 물질들을 씻어낸 후, 50mM NaCl과 8M요소를 포함하는 30mM 초산나트륨 완충용액(pH 4.2)과 8M 요소를 함유하는 60mM초산나트륨 완충용액(pH6.0)을 이용하여 단계 구배시켜 단백질을 용출시켰다.

G-CSF는 8M요소를 함유하는 60mM초산나트륨 완충용액(pH6.0)에 의해 대부분 용출되었다.

[(단계5)소수성 크로마토그래피]

단계4에서 얻어진 단백질 용액을 투석여과하여 요소를 부분제거한 후, 20mM트리스 완충용액(pH7.5)으로 미리 평형화된 페닐 세파로즈(파마시아, 스웨덴)컬럼에 흡착시키고, 동일 완충용액으로 겔내에 유리되어 남아 있는 물질들을 씻어내었다. 20mM트리스 완충용액(pH7.5)과 4M요소를 포함하는 20mM트리스 완충용액(pH7.5)을 이용하여 요소의 농도를 0에서 4M로 선형구배시켜 단백질을 용출시켰다.

G-CSF는 요소농도 2M에서 대부분 용출되었다.

[(단계6)겔 여과 크로마토그래피]

단계 5에서 얻어진 단백질 용액을 농축한 뒤, 내독소를 포함하지 않는 완충용액(0.15M NaCl, 8.1mM Na₂PO₄·H₂O)으로 미리 평형화된 세파크릴 S-100(파마시아, 스웨덴)컬럼에 주입하고 동일 완충용액으로 용출시켰다. 용출시킨 분획 중에서 G-CSF를 함유한 분획만을 수집하였다.

제2도는 본 발명에 따라 정제공정의 각 단계별 생산물을 전기 영동한 결과로서, 세포 파쇄부터 겔 여과 크로마토그래피까지 각 정제 단계의 생성물을 비환원성 15% SDS 전기영동한 결과이다. 여기에서, 레인A와 B는 각각 단계1에서 얻은 세포 파쇄 현탁액과 세첵된 단백질 침전물을 증류수로 현탁한 것이고; 레인 C와 D는 각각 단계 2 에서 얻은 구아니딘염으로 변성시킨 단백질 시료와 산화 과정이 완료된 단백질 시료에 각각 10배의 증류수를 가하여 단백질을 침전시켜 구아니딘염을 제거한 것이고; 레인E 는 단계3에서 요소 수용액에 녹인 단백질 시료이며; 레인 F는 단계 4에서 양이온 교환 크로카토그래피로부터 용출된 단백질 시료이고; 레인 G는 단계5에서 소수성 크로마토그래피로부터 용출된 단백질 시료이며; 레인 H는 단계6에서 겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 단백질 시료이다. 이 결과로부터 단백질 순서를 분석한 결과 순도 95%로 나타났다.

[참조예 : 정제된 단백질의 아미노 말단 서열분석]

상기 실시예에서 정제한 G-CSF의 아미노말단의 아미노산서열을 자동화된 서열분석기(모델 471A, Applied Biosystem사, 미국)내에서 에드만 분해반응을 이용하여 분석하였다.(Geoffray Zubay, Biochemistry, 제 2 판, 47-48(1988)).이 반응 결과 생성된 페닐티오히단토인(phenylthiohydantoin)이 붙은 아미노산을 역상 고압 크로마토그래피 컬럼(220mm x 2.1mm, 모델 PTH-222, Applied Biosystem사, 미국)으로 분리하였다.

제3도는 본 발명의 방법에 따라 정제된 rhG-CSF의 아미노말단을 서열분석기를 통하여 분석한 후 역상 고압 크로마토그래피한 결과로서, A, B, C는 각각 아미노 말단으로부터 1,2및 3위치의 아미노산에 해당하는 것이다. 이것을 표준 아미노산의 상기 컬럼에서의 유지시간과 비교한 결과, 정제된 rhG-CSF의 아미노 말단 제1, 2및 3위치의 아미노산 서열은 각각 트레오닌, 프롤린, 그리고 루이신임이 확인되었으며, 이는 천연형 인간 G-CSF의 아미노 말단 서열과 동일한 것이다.

여기에서 살펴보면, 본 서열 분석과정에서의 트레오닌의 불안 정성때문에 첫번째 아미노산 잔기는 상당 부분이 파괴된 것으로 나타났고, 두번째 아미노산 잔기인 프롤린의 순도를 볼 때, 역시 순도 95%이상인 것으로 확인되었다.

[참조예 2 : 회전 분광법을 통한 정제된 rhG-CSF단백질의 구조분석]

상기 실시예 1에 따라 정제된 rhG-CSF를 15㎍/㎖의 농도에서 3㎖를 취해 회전분광기(J-600 CD Spectropolarimeter, 쟈스코, 일본)를 이용하여 회전 분광도를 측정하였다. 측정시 광로길이가 1㎝인 원통형 큐벳(cylindrical cuvett)을 사용하였으며, 질소가스는 고순도로 약 4ℓ/분의 속도로 계속해서 흘려주었으며, 측정온도는 15℃였다. 회전분광도는 2회 측정하여 평균을 취하였으며,[θ]의 계산을 위하여 사용한 rhG-CSF 아미노산의 평균 분자량은 115였다.

제4도는 본 발명의 방법에 따라 정제된 rhG-CSF의 구조를 회전분광법으로 측정한 결과를 도시한 것이다. 여기에서 보듯이 본 발명의 방법에 따라 정제된 rhG-CSF는 정상적인 2차 구조를 가짐을 알수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, rhG-CSF가 봉입체로 발현된 효모세포를 파쇄하여 얻은 봉입체를 구아니딘 염으로 용해하고, 산화시켜 이황결합을 형성하도록 한 다음 황산암모늄으로 침전시키고 요소를 이용하여 재용해한 다음 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 원상화하는 본 발명의 정제 방법에 의하면 고순도의 활성을 갖는 G-CSF를 고수율로 정제할 수 있다.

Claims

인 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF)가 봉입체로 발현된 효모 세포를 파쇄하여 봉입체를 수득하고, 상기 봉입체를 용해하고, 용해된 봉입체를 산화시켜 이황 결합을 형성시키고, 이황 결합이 형성된 rhG-CSF를 침전시켜 분리한 후 재용해하여 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 효모에서 rhG-CSF를 분리 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 봉입체를 4내지 6M 구아니딘 염 또는 6 내지 8M 요소를 이용하여 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 구아니딘 염이 6M 농도이고, 상기 요소가 8M 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용해된 단백질 봉입체를 구리 이온으로 산화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 베타-머캡토에탄올을 최종 농도가 0.2mM이하가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법
제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에서 SP-세파로즈 수지를 사용하여 60mM초산 나트륨 완충액으로 pH5.8내지 6.2에서 단계 구배하여 단백질을 용출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 소수성 크로마토그래피에서 페닐세파로즈 수지를 사용하여 요소의 농도를 1에서 4M의 선형 구배로 단백질을 용출시키는 것을 특징으로 하는방법.
제1항에 있어서, 상기 겔 여과 크로마토그래피에서 세파크릴 S-100수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.