DE3906871A1 - Verfahren zur herstellung von menschlichem leukozyten-interferon - Google Patents
Verfahren zur herstellung von menschlichem leukozyten-interferonInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von hochreinem menschlichen Leukozyten-Interferon, insbe
sondere für therapeutische Zwecke, durch Abtrennen der
Leukozyten (weißen Blutkörperchen), Entfernen der Ery
throzyten (roten Blutkörperchen), Suspendieren der Leu
kozyten in entsprechender Nährlösung, Vorbehandeln mit
Interferon, Induzieren mit einem geeigneten Inducer, Ab
trennen der interferonhaltigen Lösung von den Zellen und
Reinigen des rohen Interferons.
Das menschliche Leukozyten-Interferon (IFN) ist eine
Gruppe von antiviral wirkenden Eiweißen. Außer der anti
viralen Wirkung hat Interferon noch zahlreiche andere
biologische Wirkungen: es hemmt die Zellwucherung bezie
hungsweise Zellproliferation, aktiviert die natürlichen
Killer-Zellen und beeinflußt auch auf andere Weise die
Funktion des Immunsystemes. Aus diesen Gründen ist Inter
feron therapeutisch einsetzbar.
Therapeutisch verwendbares Interferon beziehungsweise
Verfahren zur Herstellung von therapeutisch verwendbarem
Interferon müssen verschiedene speziellen Anforderungen
gerecht werden. Interferon darf bakterielle Endotoxine
nur in streng begrenzter Menge enthalten, das Verfahren
muß von vornherein virenfrei sein, das Produkt soll ein
möglichst breites Spektrum der biologisch aktiven Unter
typen enthalten und auch die Ausbeute muß entsprechend
sein.
Zur Herstellung von Interferon entsprechender Reinheit
werden zahlreiche Verfahren angewandt, zum Beispiel Chro
matographie an Sephadex®G-100 oder G 150 (Bodo, G.:
Methods Enzymol, 78 [1981], 69) beziehungsweise an Ultragel
AcA 54 (Withman, J. E. und Mitarbeiter: J. Interferon
Res. 1 [1981], 305), Chromatographie an Sulfopropyl-Se
phadex® (Bridgen, P. J. und Mitarbeiter: J. Biol. Chem.
252 [1977], 6 585), Chromatographie an Phenyl-Sepharose®
(Whitmann, J. E. und Mitarbeiter: J. Interferon Res. 1
[1981], 305), Cu-Chelat-Chromatographie (Berg, J.: Scand.
J. Immunol. 11 [1980] 489) und CPG-Chromatographie (Chan
da, K. C., I. Interferon Res. 2 [1982], 229).
Durch Kombination dieser Verfahren kann zwar homoge
nes Interferon hergestellt werden, die Ausbeuten sind je
doch gering, und nicht jedes Verfahren ist zur Maßstabs
vergrößerung bis zur technischen beziehungsweise industri
ellen Dimension geeignet.
Zur Herstellung größerer Mengen von therapeutisch ver
wendbarem Interferon sind die folgenden Verfahren bekannt.
Das Verfahren von Cantell und Mitarbeitern (Methods
Enzymol. 78 [1981] 499) zur Reinigung von Interferon be
steht aus einer Reihe von pH-kontrollierten Fällungsschrit
ten, durch die Interferon in 50%iger Ausbeute mit einer
spezifischen Aktivität von 2 · 106 IE/mg erhalten wird.
Das rohe Leukozyten-Interferon wird bei einem pH-Wert von
3,5 mit Kaliumrhodanid gefällt, dann in saurem Äthanol ge
löst, und die begleitenden Verunreinigungen werden durch
stufenweises Erhöhen des pH-Wertes (5,3, dann 5,8) selektiv
gefällt. Aus der äthanolischen Lösung wird das Interferon
durch Erhöhen des pH-Wertes auf 8,0 gefällt und dann in
einem 0,1 m Phosphatpuffer erneut gelöst. Der Puffer ent
hält auch 0,5 m Kaliumrhodanid. Die Verunreinigungen wer
den durch Senken des pH-Wertes auf 5,2 gefällt. Das bei
diesem pH-Wert noch in Lösung befindliche Interferon wird
bei einem pH-Wert von 3,0 gefällt, der Niederschlag in
einem 0,1 m Phosphatpuffer (pH-Wert: 8,0) gelöst und ge
gen eine physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
Nach dem Verfahren der Wellcome Research Laboratories
zur Reinigung von aus Namalva-Zellen stammendem Interferon
(Reuveny, S. und Mitarbeiter: Ann. Virol. 133 [1982], 191)
ist eine durchschnittliche spezifische Aktivität von
6 · 107 IE/mg Eiweiß erreichbar. Das rohre Lymphoblastoid-
Interferon wird mit 2,5%iger Trichloressigsäure gefällt
und der Niederschlag bei einem pH-Wert von 3,5 mit
94%igem Äthanol extrahiert. Der äthanolische Auszug wird
durch stufenweises Erhöhen des pH-Wertes gereinigt. Das
auf diese Weise gereinigte Interferon wird durch Affini
tätschromatographie mit polykolonalen Antikörpern gerei
nigt.
Von den Forschern des New York Blood Center wurde ein
zweistufiges chromatographisches Verfahren zur Herstellung
von hochreinen Interferon beschrieben (Horowitz, B.: Me
thods Enzymol. 119 [1986], 39). Das rohe Interferon wird
an einer Füllung aus CPG-10775 adsorbiert und dann mit
einem 50% Äthylenglykol enthaltenden Puffer eluiert. Das
Eluat wird durch Affinitätschromatographie mit monoklona
len Antikörpern weiter gereinigt (NK2-Sepharose®, Cell
tech). Die erhaltene Substanz hat eine spezifische Aktivi
tät von 3,6 · 108 IE/mg Eiweiß und die Ausbeute beträgt
50%.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfah
ren zur Herstellung von menschlichen Leukozyten-Inter
feron, durch welches dieses in höchster Reinheit viren
frei, mit hoher spezifischer Aktvität und mit einem brei
ten Spektrum der Interferon-Untertypen, sowie in sehr gu
ter Ausbeute und damit wirtschaftlich erhalten werden
kann, zu schaffen.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfin
dung erreicht.
Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß
mit einem Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leu
kozyten-Interferon, bei welchem das Reinigen durch eine
Kombination der "Controlled pore glass"-Chromatographie
mit alkoholischer Fraktionierung vorgenommen wird, und
weitere im folgenden angegebene Bedingungen eingehalten
werden, ein Produkt erhalten wird, welches den oben ange
benen Bedingungen völlig gerecht wird. Das erhaltene
Präparat ist hochrein, enthält sehr wenig Endotoxin, in
folge bestimmter Schritte der Verfahrenstechnik bezie
hungsweise Technologie werden etwaig in das Präparat ge
langte Viren inaktiviert und es enthält ein breites Spek
trum der Interferon-Untertypen, unter anderen einen bedeu
tenden Anteil an säurelabilen Komponenten. Die Ausbeute
ist sehr gut, das heißt, das Verfahren ist wirtschaftlich.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Herstellung von menschlichem Leukozyten-Interferon durch
Abtrennen der Leukozyten, Entfernen der Erythrozyten,
Suspendieren der Leukozyten in entsprechender Nährlösung,
Vorbehandeln mit Interferon, Induzieren mit einem geeigne
ten Inducer, Abtrennen der interferonhaltigen Lösung von
den Zellen und Reinigen des rohen Interferons unter Anwen
dung der "Controlled pore glass"-Chromatographie, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß zum Entfernen der Erythro
zyten eine Ammoniumchloridlösung ver
wendet wird, als Nährlösung eine solche mit einem Zusatz
von menschlichem Serum eingesetzt wird, zum Induzieren
die Leukozyten in einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 · 107
Zellen/ml in der Nährlösung suspendiert werden und das
Reinigen mittels einer Kombination der "Controlled pore
glass"-Chromatographie mit alkoholischer Fraktionierung
und gegebenenfalls Membrantechnik vorgenommen wird.
Die vorteilhaften Eigenschaften des Leukozyten-Inter
feron-Produktes werden durch die einzelnen Schritte des
Verfahrens gewährleistet.
Vorteilhaft wird zur "Controlled pore glass"-Chromato
graphie als Füllung "Controlled pore glass" 10/75 verwen
det.
Zweckmäßig werden auf 1 ml Füllung 50 bis 200 ml rohes
Interferon aufgebracht.
Vorzugsweise werden bei der "Controlled pore glass"-
Chromatographie zum Eluieren 0,1 bis 1,5 Mol eines pri
mären, sekundären oder tertiären Amines oder quaternären
Ammoniumhydroxydes enthaltende Lösungen verwendet.
Es ist auch bevorzugt, die alkoholische Fraktionierung
bei Temperaturen von 0 bis -40°C durchzuführen. Zur alko
holischen Fraktionierung wird als Alkohol zweckmäßig
Äthanol verwendet. Dabei ist die Verwendung von wasserhal
tigem Alkohol umfaßt. Vorzugsweise wird zur alkoholischen
Fraktionierung eine 55- bis 75 vol.-%ige Alkoholendkonzen
tration eingestellt, das heißt das Eluat bis zur Errei
chung einer Alkoholendkonzentration von 55 bis 75 Vol.-%
mit dem Alkohol versetzt.
Ferner ist es bevorzugt, zum Entfernen der Erythro
zyten als Ammoniumchloridlösung eine 0,75 bis 0,9 gew.-%ige,
insbesondere 0,83 gew.-%ige, auf einen pH-Wert von
6 bis 7,5, insbesondere 7,2 bis 7,4, gepufferte Ammonium
chloridlösung, vorteilhaft bei 0 bis 5°C, zu verwenden.
Weiterhin ist es bevorzugt, daß in der Nährlösung als
menschliches Serum über "Controlled pore glass" gereinig
tes gammaglobulinfreies menschliches Serum in einer Menge
von 0,5 bis 2,5 mg/ml eingesetzt wird.
Vorzugsweise werden zum Induzieren die Leukozyten in
einer Konzentration von 1 bis 1,3 · 107 Zellen/ml in der
Nährlösung suspendiert.
Nach einer zweckmäßigen Ausführungsform des erfindungs
gemäßen Verfahrens wird wie folgt vorgegangen.
Aus menschlichem Blut stammende Leukozyten (weiße
Blutkörperchen) werden durch Hämolyse mit Ammoniumchlorid
von den anhaftenden Erythrozyten (roten Blutkörperchen)
befreit. Dabei ist es bevorzugt, die Hämolyse bei 0 bis
5°C mit einer 0,83 gew.-%igen, auf einen pH-Wert von
7,2 bis 7,4 gepufferten wäßrigen Ammoniumchloridlösung
in zwei Schritten vorzunehmen. Im ersten Schritt wird das
Gewichtsverhältnis von Zellensuspension zu Ammoniumchlorid
zu 1 : 3 und im zweite Schritt zu 1 : 9 gewählt. Aus dem
Hämolysemedium werden die Leukozyten mit einer Beschleu
nigung von 1000 bis 2000 g abzentrifugiert. Die erhal
tene Leukozytensuspension wird in einer Nährlösung wie
Eagle MEM, RPMI oder MSKD, die auch menschliches gamma
globulinfreies Serum in einer Menge von 0,5 bis 2,5 mg/ml
enthält, suspendiert, wobei die Konzentration etwa
1 bis 1,3 · 107 Zellen/ml beträgt.
Zum Zwecke der Vorbehandlung (priming) wird die Zell
kultur bei 37°C in Gegenwart von 100 bis 200 IE/ml mensch
lichem Interferon 1,5 bis 3 Stunden lang bebrütet. An
schließend wird die Interferon-Erzeugung durch Zusatz von
100 bis 200 HA-Einheiten/ml Sendei-Virus
induziert. 1 bis 3 Stunden nach der Induktion werden die
Bedingungen der Bebrütung (pH-Wert, Salzkonzentration,
Temperatur, Zusatz von Wasserstoffperoxyd [H2O2]) in ge
eigneter Weise geändert. Nach weiteren 15 bis 25 Stunden
langem Bebrüten werden die Leukozyten durch Zentrifugie
ren von der das rohe Interferon darstellenden Nährlösung
abgetrennt.
Das Roh-Interferon wird durch Filtrieren von Schweb
stoffen und Zelltrümmern befreit und dann durch eine das
"Controlled pore glass" CPG 10/75 enthaltende Säule ge
drückt, die vorher mit einer salzhaltigen Phosphatpuffer
lösung (phosphate buffer saline [PBS]) durchgewaschen wor
den war. Die Phosphatpufferlösung hat die folgende Zusam
mensetzung:
| mg/l | |
| NaCl | 8 800 |
| KCl | 220 |
| Na2HPO4 · 12 H2O | 3 500 |
| NaH2PO4 · H2O | 224 |
| pH-Wert: | 7,2 bis 7,4. |
Das Interferon wird mit einem Puffergradienten (0,05
bis 0,1 m Tris HCl + 1,5 m NaCl, pH-Wert = 8,0) eluiert.
Der Tris-Puffer enthält tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan,
welches das Interferon nicht inaktiviert, jedoch die Tren
nung verbessert. Es können auch andere Amine verwendet wer
den.
Das Interferon-Eluat wird bei -20°C bis 55 bis 75
vol.-%igem Äthanol behandelt. Die gefällten Eiweiße wer
den durch Zentrifugieren entfernt. Die das Interferon ent
haltende überstehende äthanolische Flüssigkeit wird mit
tels eines Ultrafilters auf das 10- bis 20fache aufkonzen
triert, dann wird das Äthanol durch Diafiltration oder
Dialyse gegen einen geeigneten Puffer ausgetauscht (Membrantechnik). Es
ist auch möglich, das Interferon aus der alkoholischen Lösung
erneut zu adsorbieren. Die nach der Diafiltration bezie
hungsweise Dialyse erhaltene Interferon-Lösung ist hoch
rein und kann sofort lyophilisiert werden.
Die Virenfreiheit ist durch die Kombination der genann
ten Chromatographie mit der Behandlung mit 55- bis 75 vol.-%igem
Alkohol gewährleistet. Etwaig enthaltene Endotoxine werden
ebenfalls durch die alkoholische Behandlung beseitigt,
weil sie in den Niederschlag eingehen.
Da das Verfahren keine bei niedrigem pH-Wert vorgenom
menen Schritte enthält, verlieren auch die säurelabilen
Interferon-Untertypen nichts von ihrer Aktivität.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele
näher erläutert.
Eine aus menschlichem Blut stammende leukozytenreiche
Blutfraktion (buffy coat) wird unter Eiskühlung mit dem
dreifachen Volumen einer auf 0 bis +4°C gekühlten, 0,83
gew.-%igen Ammoniumchloridlösung 10 Minuten lang behan
delt. Danach wird bei +4°C mit einer Beschleunigung von
1500 g zentrifugiert, wobei sich die Leukozyten absetzen.
Die Leukozyten werden in physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert und erneut mit 0 bis +4°C warmer, 0,83
gew.-%iger Ammoniumchloridlösung behandelt, dieses Mal
jedoch mit dem neunfachen Volumen. Nach 10 Minuten wird
unter den beschriebenen Bedingungen erneut zentrifugiert.
Danach werden die Leukozyten in einer Konzentration von
1,0 · 107 Zellen/ml in einer Nährlösung Eagle MEM suspen
diert. Der Nährlösung wird in einer Menge von 1 mg/ml
gammaglobulinfreies menschliches Serum zugesetzt. Die Zell
kultur wird mit 150 IE/ml menschlichem Interferon versetzt
und in einem Thermostaten bei 37°C 2 Stunden lang gerührt.
Anschließend wird mit 100 HA-Einheiten (Hämagglutinin-Ein
heiten) Sendei-Viren pro ml die Interferonproduktion indu
ziert, und die Zellen werden weitere 15 bis 20 Stunden
lang bei 37°C inkubiert. Dann werden die Zellen von der das
rohe IFN darstellenden IFN-haltigen Nährlösung durch Zen
trifugieren abgetrennt.
Das Rohinterferon hat eine spezifische Aktivität von
200 000 IE/mg Protein.
Das Roh-IFN wird auf eine mit der oben angegebenen
Phosphatpufferlösung vorbehandelte, mit CPG 10/75 gefüllte
Säule aufgegeben, wobei man 1 Volumteil CPG auf 100 Volum
teile Lösung verwendet. Nach der Adsorption werden die
restlichen Eiweiße mit physiologischer Kochsalzlösung von
der Säule gewaschen. Dann wird das Interferon mit 1,5 m
NaCl enthaltendem Tris-Puffer eluiert. Das Eluat hat eine
spezifische Aktivität von 10 000 000 IE/mg Protein. Das
Eluat wird bei -20°C mit auf -20°C abgekühltem Äthanol
vermischt, bis eine Alkoholendkonzentration von 75 Vol.-%
eingestellt ist. Das äthanolische Gemisch wird 24 Stunden
lang bei -20°C gelagert und dann zentrifugiert. Der Nie
derschlag wird verworfen, die überstehende Flüssigkeit wird bei
-20°C mittels eines Ultrafilters aufkonzentriert. Der Al
kohol wird in einem anschließenden Diafiltrationsschritt
gegen einen beliebigen Puffer ausgetauscht. Die erhaltene
Flüssigkeit wird in Ampullen gefüllt und lyophilisiert.
Die Herstellung des rohen IFN und seine CPG-chromato
graphische Reinigung erfolgen auf die im Beispiel 1 be
schriebene Weise. Aus der resultierenden 75 vol.-%igen
alkoholischen Lösung kann das Interferon jedoch auch
durch Ausfällen abgetrennt werden. Dazu wird die alkoholi
sche Lösung gegen einen 30 Vol.-% Alkohol enthaltenden
0,05 m Citratpuffer (-10°C, pH-Wert 5) dialysiert. Das ausge
fallene Eiweiß wird abzentrifugiert und in die entspre
chende Menge physiologische Kochsalzlösung aufgenommen.
Die erhaltene Lösung wird unmittelbar filtriert.
Man arbeitet auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise,
konzentriert jedoch die 75 vol.-%ige alkoholische Lösung
mit einem Ultrafilter und dialysiert mit nur 20 Vol.-%
Alkohol enthaltendem Citratpuffer. Anschließend wird ge
mäß Beispiel 2 gearbeitet.
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leuko
zyten-Interferon durch Abtrennen der Leukozyten,
Entfernen der Erythrozyten, Suspendieren der Leu
kozyten in entsprechender Nährlösung, Vorbehan
deln mit Interferon, Induzieren mit einem geeigne
ten Inducer, Abtrennen der interferonhaltigen Lö
sung von den Zellen und Reinigen des rohen Inter
ferons unter Anwendung der "Controlled pore glass"-
Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man
zum Entfernen der Erythrozyten eine wäßrige Ammoniumchlorid
lösung verwendet, als Nährlösung eine solche mit
einem Zusatz von menschlichem Serum einsetzt, zum
Induzieren die Leukozyten in einer Konzentration
von 0,5 bis 1,5 · 107 Zellen/ml in der Nährlösung
suspendiert und das Reinigen mittels einer Kombina
tion der "Controlled pore glass"-Chromatographie mit
alkoholischer Fraktionierung und gegebenenfalls Mem
brantechnik vornimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet
daß man zur "Controlled pore glass"-Chromatographie
als Füllung "Controlled pore glass" 10/75 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich
net, daß man auf 1 ml Füllung 50 bis 200 ml rohes
Interferon aufbringt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich
net, daß man bei der "Controlled pore glass"-Chroma
tographie zum Eluieren 0,1 bis 1,5 Mol eines primä
ren, sekundären oder tertiären Amines oder quater
nären Ammoniumhydroxydes enthaltende Lösungen ver
wendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeich
net, daß man die alkoholische Fraktionierung bei Tem
peraturen von 0 bis -40°C durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeich
net, daß man zur alkoholischen Fraktionierung einen
55- bis 75 vol.-%ige Alkoholendkonzentration einstellt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeich
net, daß man zum Entfernen der Erythrozyten als Am
moniumchloridlösung eine 0,83 gew.-%ige, auf einen
pH-Wert von 6 bis 7,5 gepufferte Ammoniumchloridlösung
verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeich
net, daß man in der Nährlösung als menschliches Serum
über "Controlled pore glass" gereinigtes gammaglobu
linfreies menschliches Serum in einer Menge von 0,5
bis 2,5 mg/ml einsetzt.
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