JPH01281097A

JPH01281097A - ヒトインターフェロンの製造方法

Info

Publication number: JPH01281097A
Application number: JP1050210A
Authority: JP
Inventors: Ferenc Peterfy; フェレンツ　ペーテルフュ; Laszlo Bali; ラースロー　バリ; Zsolt Pallai; ゾルト　パライ
Original assignee: Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
Current assignee: Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
Priority date: 1988-03-04
Filing date: 1989-03-03
Publication date: 1989-11-13
Also published as: IT8919633A0; DE3906871C2; IT8919634A0; IN169468B; HUT49894A; AT391482B; IT1228560B; DE3906871A1; HU201100B; ATA47989A; CN1036961A; IT1228559B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、血液中の白血球を分離する段階と、赤血球を
除去する段階と、白血球を適当な栄養液に懸濁する段階
と、インターフェロンを用いてこれを前処理する段階と
、適当な誘導原を用いて白血球を誘導する段階と、細胞
からインターフェロン含有の液体を分離する段階と、限
定多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇ
ｌａｓｓ、　ＣＰＧ）を用いたクロマトグラフィー、お
よび、アルコールを用いた分画法の組み合わせにより、
未精製インターフェロンを精製する段階とからなるヒト
白血球インターフェロンの製造方法に関する。

〔従来の技術〕

ヒト白血球インターフェロンは、抗ウィルス活性その他
いくつかの生物学的作用を有する一群の蛋白質である。

インターフェロンは、細胞の増殖を阻害し、ナチュラル
キラー細胞を活性化し、かつ、免疫系の機能に影響を及
ぼす。このような特性に基づき、ヒト白血球インターフ
ェロンは、治療目的に効果的に用いるのに好適である。

治療目的上有用なインターフェロン、および、その好適
な製造方法は、いくつかの特別な必要条件を満たさなく
てはならない。すなわち、インターフェロンには、細菌
性内毒素が含まれないこと、またその製造方法において
は、ウィルスの不在が保証され、可能な限り、広範囲の
生物学的活性スペクトルを有するサブタイプが、充分な
収量をもって生産されることなどである。

適切な純度のインターフェロンの調製を目的として、セ
ファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）社品番第Ｇ−１００
号あるいは同第Ｇ−１５０号［ボド（Ｇ、Ｂｏｄｏ）：
メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
Ｅｎｚｙｍｏｌ、）。

７８巻（１，９８１年）６９ページ］、ウルトラゲル品
番第ＡｃＡ　５４号［ホイットマン（Ｊ、Ｅ、Ｗｈｉｔ
ｍａｎｎ）ほか：ジャ　−ナル・オブ・インターフェロ
ン・リサーチ（Ｊ。

Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒａｓ、）、１巻（１９８１年
）３０５ページ］、スルホプロピル・セファデックス［
ブリッジエン（Ｐ。

Ｊ　、　Ｂｒｉｄｇｅｎ　）ほか：ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、）、２５２巻（１９７７年）６５８５ページ］、あ
るいはフェニル・セファロース［ホイットマン（Ｊ　、
Ｅ、Ｗｈｉｔｍａｎｎ）はが：ジャーナル・オブ・イン
ターフェロン・リサーチ（Ｊ、ＩｎｔｓｒｆｅｒｏｎＲ
ｅｓ、）、１巻（１９８１年）３０５ページ］によるク
ロマトグラフィー、あるいは、鋼キレートの利用［ベル
ブ（Ｋ、Ｂｅｒｇ）ほか：ジャーナル・オブ・イミュノ
ロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１ｍｌ巻（１９８０
年）４８９ページ］。

あるいは、ＣＰＧクロマ１−グラフィー［チャンダ（Ｋ
、Ｃ。

Ｃｈａｎｄａ）：ジャーナルハオブ・インターフェロン
・リサーチ（Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、）、
２巻（１９８２年）２２９ベージ］などに記載されてい
る多数の方法が用いられている。

上記の方法を組み合わせることにより、均質なインター
フェロン製品を得ることはできるが、その収量は非常に
低く、また、いくっがの方法は、生産規模を工業的な規
模にまで拡大するには不適当である。

治療目的に有用なインターフェロンの大量生産を目的と
して、現在までに開発された方法は、次のとおりである
。

カンチル（Ｃａｎｔｅｌｌ）らが考案した精製工程〔メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ　、　）、７８巻（１９８１年）４９９ペー
ジコは、ｐＨを制御した一連の沈澱段階から成り、蛋白
質比活性が２ｘ１０″ＩＵ／■のインターフェロンの収
量５０％の生産をみた。

すなわち、未精製白血球インターフェロンを、イソチオ
シアン酸カリウムを用いてｐｌ＋３．５で沈澱させ、次
いで、酸を含有するエタノール中で溶解させ、更に、ｐ
Ｈを初め５．３１次いで５．８まで徐々に上昇させて、
混入物を選択的に沈澱させる。エタノール溶液のｐＨ値
を８．０まで上昇させることにより、インターフェロン
を沈澱させ、次いで、イソチオシアン酸カリウムを０．
５モル含有の０．１モル燐酸緩衝液中に再溶解させる。

ｐＨを５．２まで低下させることにより、更に混入物を
沈澱させる。溶解しているインターフェロンは、ｐＨ３
，０において沈澱させる。その後、この沈澱を、０．１
モル燐酸緩衝液（ｐＨ８，０）中に溶解させ、燐酸緩衝
食塩水に対して透析する。

ウェルカム研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）においては、ナマルバ（Ｎａ
ｍａｌｖａ）細胞由来のインターフェロンの精製を目的
とする別の方法が開発された［ルーベニ−（Ｓ　、　Ｒ
ｏｕｖｅｎｙ）ほか：アナルス・オブ・ヴイロロジ−（
Ａｎｎ　、　Ｖｉｒｏｌ　、　）、１３３巻（１９８２
年）１９１ページコ。その結果、蛋白質比活性が平均６
ｘ１０７ＩＵ／ｍｇのインターフェロンを得ることがで
きた。

この方法によれば、２．５％トリクロル酢酸溶液を用い
て、未精製のリンパ芽球インターフェロンを沈澱させ、
次いで、沈澱を９４％エタノールを用いて、　ｐＨ３，
５で抽出した。エタノール抽出物は、ｐＨ値を段階的に
上昇させて精製する。

このようにして得られたインターフェロンは。

ポリクローナル抗体に対するアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いて更に精製する。

ニューヨーク血液センター（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｂｌｏ
ｏｄＣｅｎｔｅｒ）においては、ホロビッツ（Ｂ　、　
Ｈｏｒｏｗｉｔｚ）らが、クロマトグラフィーの利用に
よる高純度インターフェロンの２段階製造方法を考案し
た［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　Ｅｎｚｙ＋ｓｏ１．）、１ｍｌ９巻（１９８６年）
３９ページ］。未精製インターフェロンはＣＰＧ第１０
−７５番なる充填剤に吸着させ、５０％のエチレングリ
コール含有の緩衝液を用いて溶出させる。溶出液は、モ
ノクローナル抗体に対するアフィニティークロマトグラ
フィー（セルチック（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）社のＮＫ２セ
ファロースによる）を用いて更に精製し、蛋白質比活性
が３゜６×１０７ＩＵ／■の製品を５０％の収量で得て
いる。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のとおり、従来の技術を用いた製造方法によれば、
均質なインターフェロン製品を得ることはできるが、そ
の収量は非常に低く、大量生産に適した方法を用いた場
合、純度および収量ともに非常に優れているとは言い難
い。

〔課題を解決するための手段〕

本発明による方法を用いることにより、上記の必要条件
を、非常に効果的に満たす製品を得ることができる。得
られる製品の純度は高く、内毒素の含有量は非常に低い
。

本製法における特定の段階により、製品に効果的に混入
するウィルスは不活化される。得られる製品は、酸に不
安定な成分をも高い比率で含有し、広範囲なスペクトル
のインターフェロンサブタイプを含有している。収量は
非常に高く、したがって、製造コストの低減が可能とな
る。

このように１本発明は、高力価の未精製インターフェロ
ンの製造と、限定多孔質ガラス（ＣＰＧ）クロマトグラ
フィー、アルコールを用いた分画法、および透析膜使用
法の組合わせを用いたその精製とに関する。製造工程の
個々の段階が相まって、製品の優れた特性が確保される
。

本発明による製造工程の間に、ヒトの血中白血球は、塩
化アンモニウムに誘発された溶血によって、混入赤血球
から分離精製される。

本発明の製造方法の好適実施例によれば、緩衝液を用い
て、ｐＨ値を７．２〜７．４に調整した、温度が０〜５
℃の０．８３％塩化アンモニウム溶液を用い、２段階で
溶血を行なう。塩化アンモニウム溶液に対する細胞懸濁
液の比率は、第１段階においては１：３であり、第２段
階では１：９である。溶血の実施媒体から白血球は、　
１，０００〜２，０００ｘＧの遠心分離により沈澱させ
る。得られた白血球は、適当な栄養液（イーグルＭＳＭ
、ＲＰＭｌ、　ＭＳＫＤなど）に、１ｍｌ！あたりの細
胞数が１ｘ１０７〜１．３×１０７個の密度で懸濁させ
る。栄養液には、０．５〜２．５ｗ：／ｌ１ｍｌ１のヒ
トγグロブリン除去血清も加えておく。

反応開始にあたり、細胞培養液は、１００〜２００ＩＩ
／ｍｌ１のヒトインターフェロンを加え、３７℃にて１
．５〜３時間温置装る。次に、１００〜２００ＨＡ単位
／１Ｉ１ｍｌのセンダウィルスを用いて、インターフェ
ロン生産を誘導する。誘導の１〜３時間後、＠置条件（
ｐＨ１塩類濃度、温度、過酸化水素の添加量）を適切に
変化させ、更に１５〜２５時間温置を続装る。

次いで、遠心分離により、栄養液から白血球を回収する
。この栄養液が未精製インターフェロンということにな
る。

未精製インターフェロンは濾過して、浮遊する混入物お
よび細胞の残骸を除去し、次いで、ＣＰＧ第１０−７５
番充填剤を詰めたカラムに圧入する。充填剤は、まず燐
酸緩衝食塩水を用いて洗浄し、次いで、０．０５〜０．
１モルのトリス塩酸および１．５モルの塩化ナトリウム
を含有するｐＨ８，０の溶液を用いて、インターフェロ
ンを溶出させる。

燐酸緩衝食塩水の組成は次のとおりである。

■／ａＮａＣ１８，８００ＫＣＩ　　　　　　　　　　２２ＯＮａ、　ＨＰＯ，・１２Ｈ，０，３、５０ＯＮａＨ，Ｐ
Ｏ４・Ｈ２Ｏ２２４ｐＨ：１．２〜７．４トリス緩衝液には、トリス（ヒドロキシメチル）−アミ
ノメタンが含まれているが、これは、インターフェロン
を不活化することはなく、むしろ溶出効率を高める。他
の第一級、第二級、あるいは第三級アミンを用いること
も可能である。

インターフェロンを含有する溶出液には、−２０℃の５
５〜７５％のエタノールを加える。沈澱する蛋白質は、
遠心分離により除去する。インターフェロンを含有する
エタノール溶液の上清は、限外濾過器を用いて１０〜２
０倍に濃縮し、次いで、透析濾過あるいは透析により、
エタノールを適当な緩衝液に置き換える。

このようにせずに、アルコール溶液の上清中に存在する
インターフェロンを再度吸着させることもできる。得ら
れた高純度のインターフェロン溶液は、そのまま凍結乾
燥させることができる。

存在するウィルスは、クロマトグラフィーにより、ある
いは５５〜７５％のアルコールの添加により、確実に排
除される。結果的に生成され得る内毒素も、アルコール
処理により、すべて沈澱するので除去される。

本発明の製造方法には、いかなる低ｐ＋＋値の段階も関
与しないため、酸に不安定なインターフェロンサブタイ
プも、その活性を失うことがない。

〔実　施　例〕

以下、実施例に基づき本発明の詳細な説明するが、これ
は１本発明を限定するものではない。

末１−例」− ヒトの血液から採ったバフィーコート（白血球に富む血
液の１分画）を、３倍量の０．８３％塩化アンモニウム
溶液とともに、０〜４℃に氷冷しつつ。

１０分間攪拌する。１０分後、４℃にて１．．５００ｘ
Ｇで遠心分離を行ない、白血球を沈澱させる。次いで、
白血球を燐酸緩衝食塩水に懸濁させ、細胞懸濁液の９倍
量の０．８３％塩化アンモニウム溶液にて再び処理する
。１０分後、上記と同様の遠心分離を行なって細胞を沈
澱させ１次いでイーグルのＭＥＭ栄養液に懸濁して、１
ｍｌ０６あたりの細胞数を１．０ＸＩＯ７個とする。栄
養液には、１■／ｆｆ１ｎの、γグロブリンを除去した
ヒト血清も添加物として含有させる。

細胞培養には、１５０ＩＵ／ａｌｌのヒトインターフェ
ロンを加え、次いで、３７℃にて２時間攪拌すると、１
００ＨＡ！１位／１ｍｌ６のセンダイウィルスの添加に
よって、インターフェロン生産が誘導されるようになる
ので、３７℃にて更に１５〜２０時間温置する装その後
、インターフェロンを含有する栄養液から、遠心分離に
より細胞を分離する。

この栄養液が未精製インターフェロンということになる
。この粗製インターフェロンは、蛋白質比活性が２００
，０ＯＯＩＵ／■である。

未精製インターフェロンは、燐酸緩衝食塩水を用いて平
衡に至らせたＣＰＧ第１０−７５番充填剤を含有するカ
ラムに、ＣＰＧ　１　ｍｌの割合で圧入する。カラムは
、蛋白質を認めなくなるまで燐酸緩衝食塩水で洗浄し２
次いで、トリス緩衝液を用いた１、５モル塩化ナトリウ
ム溶液を用いて、インターフェロンを溶出する。溶出液
の蛋白質比活性は１０．０００，０ＯＯＩＵ／■である
。溶出液を一２０℃に保ったエタノールど一２０℃で混
合し、アルコールの最終濃度を７５％とする。このアル
コール混合液を、−２０℃で２４時間保存し、次いで遠
心分離を行なう。

沈澱の棄却後、−２０℃に保ちつつ、限外濾過器を用い
て」二清を濃縮する。透析濾過によりメタノールを除去
し、随意に緩衝液と置換する。得られた製品をアンプル
に分は取り、凍結乾燥を施す。

失に貫主実施例１に記載の方法により、未精製インターフェロン
の調製、およびこれに続（ＣＰＧグロマトグラフィーを
行なう。

インターフェロンは、これを含む７５％アルコール溶液
から沈澱させて分離することもできる。インターフェロ
ン含有アルコール溶液は、エタノール３０％を含有する
。ｐ）１５の０．０５モルクエン酸緩衝液に対して一１
０℃で透析を施す。沈降する蛋白質は、遠心分離を用い
て沈澱させ、対応する量の燐酸緩衝食塩水中に回収する
。得られた製品は、そのまま凍結乾燥させることができ
る。

夫産涯王実施例２を行なうが、インターフェロンの７５％アルコ
ール溶液は、限外濾過器を用いて濃縮し、次いで、エタ
ノール２０％含有のｐＨ５の０．０５モルクエン酸緩衝
液に対して透析を施す。続いて、沈澱した蛋白質は、実
施例２に記載の方法で処理する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）血液中の白血球を分離し、赤血球を除去し、白血
球を栄養液に懸濁させ、インターフェロンを用いて白血
球を前処理し、誘導原を用いて白血球を誘導し、細胞か
らインターフェロン含有の液体を分離し、かつ未精製イ
ンターフェロンを精製することにより、ヒトインターフ
ェロンを製造する方法において、赤血球の除去に塩化ア
ンモニウム溶液を用い、ヒト血清を用いて栄養液を補強
し、誘導を目的として、白血球を１ｍｌあたり０．５×
１０＾７〜１．５×１０＾７個の密度で栄養液に懸濁し
、かつ、限定多孔質ガラスクロマトグラフィーと、アル
コールを用いた分画法との組み合わせにより、精製を行
うことを特徴とするヒトインターフェロンの製造方法。
（２）精製の際、限定多孔質ガラス第１０−７５番なる
充填剤を使用する請求項（１）記載のヒトインターフェ
ロンの製造方法。
（３）充填剤１ｍｌに対して、それぞれ未精製インター
フェロン５０〜２００ｍｌを適用する請求項（１）また
は（２）記載のヒトインターフェロンの製造方法。
（４）０．１〜１．５モルの第一級、第二級、あるいは
第三級アミン、または第四級アンモニウム塩溶液を用い
て溶出を行う請求項（１）乃至（３）のいずれかに記載
のヒトインターフェロンの製造方法。
（５）溶出液を、最終濃度が５５〜７５％であるエタノ
ールにより処理する請求項（１）乃至（４）のいずれか
に記載のヒトインターフェロンの製造方法。
（６）エタノールによる処理を、０℃〜−４０℃の温度
で行う請求項（１）乃至（５）のいずれかに記載のヒト
インターフェロンの製造方法。
（７）赤血球を除去するため、緩衝液を用いてｐＨ値を
６〜７．５に調整した０．８３％塩化アンモニウム溶液
を用いる請求項（１）乃至（６）のいずれかに記載のヒ
トインターフェロンの製造方法。
（８）限定多孔質ガラスクロマトグラフィーによって、
予め精製された０．５〜２．５ｍｇ／ｍｌのヒトγグロ
ブリン除去血清を用いて、栄養液を強化する請求項（１
）乃至（７）のいずれかに記載のヒトインターフェロン
の製造方法。