JPS60139700A - α―およびγ―インターフエロンの調製方法 - Google Patents
α―およびγ―インターフエロンの調製方法Info
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- JPS60139700A JPS60139700A JP59260115A JP26011584A JPS60139700A JP S60139700 A JPS60139700 A JP S60139700A JP 59260115 A JP59260115 A JP 59260115A JP 26011584 A JP26011584 A JP 26011584A JP S60139700 A JPS60139700 A JP S60139700A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明１コ、ヒト白血球お工□びヒトガンマインターフ
ェロンの逐次的な製造方法に関する。
ェロンの逐次的な製造方法に関する。
本発明に従い、同一の細胞集団から２工程でα−お工び
γ−インターラエロンを典造する方法を提供する。従っ
て５本発明は、インターフェロン産生能力をもつ、入手
できるが量が限定的であるヒト白血球の最大限かつ最適
の利用を可能とするものである。 ・・ ヒト白血球から、ウィルｘＨ用いてα−インターフェｉ
ンを産生じ得ることミニひ分裂促進因子の助けにょうて
ｊ−インターフェロンを産生じ得る”ことが知られてい
る。前記２つの型のインターフェロンの産生げ、ヒト白
血球が入手できるが限定的であるという事実に工っ゛て
限定されている。
γ−インターラエロンを典造する方法を提供する。従っ
て５本発明は、インターフェロン産生能力をもつ、入手
できるが量が限定的であるヒト白血球の最大限かつ最適
の利用を可能とするものである。 ・・ ヒト白血球から、ウィルｘＨ用いてα−インターフェｉ
ンを産生じ得ることミニひ分裂促進因子の助けにょうて
ｊ−インターフェロンを産生じ得る”ことが知られてい
る。前記２つの型のインターフェロンの産生げ、ヒト白
血球が入手できるが限定的であるという事実に工っ゛て
限定されている。
ヒトに対する療法にＧボン２つめ型のインターフェロン
が必要でおる。そめ理由畝相異なるインターフェロンの
型が相異なる好都合な性質を有しており（従らて、α−
インターフエｊンは、トリワは抗ウィルス活性を示し、
γ−インターフェロンは抗腫―活性を示す）、かつこれ
らのインターフェロンの組会せの適用は、相異なるイン
ターフェロンが互いに他の活性（抗ウィルス作用、抗腫
瘍作用、免疫調節作用）を増強する場合蚤こ望ましい。
が必要でおる。そめ理由畝相異なるインターフェロンの
型が相異なる好都合な性質を有しており（従らて、α−
インターフエｊンは、トリワは抗ウィルス活性を示し、
γ−インターフェロンは抗腫―活性を示す）、かつこれ
らのインターフェロンの組会せの適用は、相異なるイン
ターフェロンが互いに他の活性（抗ウィルス作用、抗腫
瘍作用、免疫調節作用）を増強する場合蚤こ望ましい。
２つの型のインターフェロンは、限定され７ｃ量である
が入手可能雇晶血録〃為ら一生されるので、１つのイン
ターフ−ロンの型の産ｌｉ＋ｘ他の−の産生を除外する
。□ ” １つのかつ尚−の白血球培養ｖｈらα−お工びγ−イン
ターフェロンを逐次的に調製する方法を練ることが本発
明の目的である。同一の細胞集団から数回にわたってｄ
−インターフェロンを産生させる多くの試みがな□され
た。′シタしながら、これらの試みＧゴ成功しなかった
。その理由・ゴ、ａ胞によって産生された多量のα−イ
シターフェロレが細胞に作用して、細胞を反応性の低い
状態にし。
が入手可能雇晶血録〃為ら一生されるので、１つのイン
ターフ−ロンの型の産ｌｉ＋ｘ他の−の産生を除外する
。□ ” １つのかつ尚−の白血球培養ｖｈらα−お工びγ−イン
ターフェロンを逐次的に調製する方法を練ることが本発
明の目的である。同一の細胞集団から数回にわたってｄ
−インターフェロンを産生させる多くの試みがな□され
た。′シタしながら、これらの試みＧゴ成功しなかった
。その理由・ゴ、ａ胞によって産生された多量のα−イ
シターフェロレが細胞に作用して、細胞を反応性の低い
状態にし。
その結果、次の誘発段階において、細胞のα−インター
フェロ７浬生能力が極端に減少するからである。 □
゛ 本発明は、多量のαニインターフェロンでン一インター
フェロン産生系を処理した後でさえ、この系ＧＪ低反応
状態に至らず、一方、インターフェロンＧゴ未処理試料
の場合エリ多量に産生されるという認識に基づい１いる
。このことをゴα−インターフェロン産生段階の終わり
にも起こり、それに１って多量のα−インターフェロン
が得られ、そして同時に、γ−インターフェロン産生細
胞のインターフェロン産生能力が維持され、さらに増大
する。
フェロ７浬生能力が極端に減少するからである。 □
゛ 本発明は、多量のαニインターフェロンでン一インター
フェロン産生系を処理した後でさえ、この系ＧＪ低反応
状態に至らず、一方、インターフェロンＧゴ未処理試料
の場合エリ多量に産生されるという認識に基づい１いる
。このことをゴα−インターフェロン産生段階の終わり
にも起こり、それに１って多量のα−インターフェロン
が得られ、そして同時に、γ−インターフェロン産生細
胞のインターフェロン産生能力が維持され、さらに増大
する。
本発明に従って、血液の淡黄膜画分を単離し。
赤血球を除去し、適当力栄養培地中に白血球を懸、濁し
、そしてα−インターフェロン誘発因子を用いお工びγ
−インターフェロン訪発因子を用いて処理することによ
ってα−おＬびγ−インターフェロンを調製する方法を
提供する。この方法ＧＥ、血液の白血球（淡黄ｆｉｇ）
画分を分離し、赤血球を除去し適当な栄養培地中曇ここ
の白血球を懸濁した後に得られた懸濁液をα−またをゴ
β−インターフェロンで予備処理すること、α−インタ
ーフェロン誘発因子と接触させるこ゛と、α−インター
フェロンを含有する液体を細胞から分離し、所望ならば
α−インターフェロンを回収するこト、適当な栄養培地
中で細胞を洗浄し懸濁させること１分裂促進因子で処理
すること、ｒ−インターフェロンを含有する液体を細胞
から分離し、所望ならＩｄｒ−インターフェロンを回収
し、そして所望ならばγ−インターフェロンからα−イ
ンターフェロンを除去すること、に工って同一の白血球
培養中で順次α−インターフェロンおＬびγ−インター
フェロン４ｖ４製することを含んでいる。
、そしてα−インターフェロン誘発因子を用いお工びγ
−インターフェロン訪発因子を用いて処理することによ
ってα−おＬびγ−インターフェロンを調製する方法を
提供する。この方法ＧＥ、血液の白血球（淡黄ｆｉｇ）
画分を分離し、赤血球を除去し適当な栄養培地中曇ここ
の白血球を懸濁した後に得られた懸濁液をα−またをゴ
β−インターフェロンで予備処理すること、α−インタ
ーフェロン誘発因子と接触させるこ゛と、α−インター
フェロンを含有する液体を細胞から分離し、所望ならば
α−インターフェロンを回収するこト、適当な栄養培地
中で細胞を洗浄し懸濁させること１分裂促進因子で処理
すること、ｒ−インターフェロンを含有する液体を細胞
から分離し、所望ならＩｄｒ−インターフェロンを回収
し、そして所望ならばγ−インターフェロンからα−イ
ンターフェロンを除去すること、に工って同一の白血球
培養中で順次α−インターフェロンおＬびγ−インター
フェロン４ｖ４製することを含んでいる。
本発明の方法に従い、出発物質として、０〜８℃で４８
時間以下貯蔵した抗凝血処理のヒト血液の淡黄膜画分（
白血球）を用いる。
時間以下貯蔵した抗凝血処理のヒト血液の淡黄膜画分（
白血球）を用いる。
抗凝血物質として％ＡＣＤ溶液（クエン酸おＬびグルコ
ースを含有する溶液）またＩゴ種夕の塩基（例えば、ア
デニンまた沓ゴグアニン）を補充したＡＣＤ溶液を用い
ることができる。集めた白血球をＩＩＩ度勾配遠心分離
（例えば、フィコール（Ｆｌｃｏｌｌ）’ｔｔｉ；ｚベ
ルコール（Ｐｊｒａｏｌｌ ））に工って、またＧ１好
ましく暑１塩化アンモニウムを用いて実施する溶血０ｃ
工°て取り出す５とができる・ 好ましくは、ａ縮した白血球懸濁液を、（）〜１０℃の
温度を有す、る（）、５〜１．０％１好ましく（１３〜
２０で、好ましくは１：５で混合することに１って実施
することができる。この懸濁液を、攪拌しなからま７ｔ
は！拌しないで、０〜８℃で、５〜２０分間、好ましく
は１０分間インキュベートする。崩壊した赤血球から（
向えば、遠心分離に工って）白血球を分離する。好まし
くは、１容置部の細胞懸濁液をこ対して１０重量部の塩
化アンモ−ウム／Ｓ液を用いることによる塩化アンモニ
ウム処理を繰り返すことによって実施することができ”
る。
ースを含有する溶液）またＩゴ種夕の塩基（例えば、ア
デニンまた沓ゴグアニン）を補充したＡＣＤ溶液を用い
ることができる。集めた白血球をＩＩＩ度勾配遠心分離
（例えば、フィコール（Ｆｌｃｏｌｌ）’ｔｔｉ；ｚベ
ルコール（Ｐｊｒａｏｌｌ ））に工って、またＧ１好
ましく暑１塩化アンモニウムを用いて実施する溶血０ｃ
工°て取り出す５とができる・ 好ましくは、ａ縮した白血球懸濁液を、（）〜１０℃の
温度を有す、る（）、５〜１．０％１好ましく（１３〜
２０で、好ましくは１：５で混合することに１って実施
することができる。この懸濁液を、攪拌しなからま７ｔ
は！拌しないで、０〜８℃で、５〜２０分間、好ましく
は１０分間インキュベートする。崩壊した赤血球から（
向えば、遠心分離に工って）白血球を分離する。好まし
くは、１容置部の細胞懸濁液をこ対して１０重量部の塩
化アンモ−ウム／Ｓ液を用いることによる塩化アンモニ
ウム処理を繰り返すことによって実施することができ”
る。
精製した白血球を、アミノ酸お工び、ビタミンを含有す
る細胞培養の栄養溶液（例えば、イーグル栄養培地、Ｐ
ＲＭＩ １６４０．ダルベック（Ｄｕｌｂｅｃｃｅ ）
変形ＭＥＭ、グラスゴー（Ｇｌａａｇｏｗ ）変形ＭＥ
Ｍ等）中でインキュベートすそ。オートクレーブ処理さ
れていてもよい、下記の組成の安価な栄養培地を用いる
ことも好ましい。
る細胞培養の栄養溶液（例えば、イーグル栄養培地、Ｐ
ＲＭＩ １６４０．ダルベック（Ｄｕｌｂｅｃｃｅ ）
変形ＭＥＭ、グラスゴー（Ｇｌａａｇｏｗ ）変形ＭＥ
Ｍ等）中でインキュベートすそ。オートクレーブ処理さ
れていてもよい、下記の組成の安価な栄養培地を用いる
ことも好ましい。
塩化カルシタム １７５〜３５０
塩化カリウム ３００〜５００
硫酸マグネシウムまたＧゴ塩化マ
グネシウム １７５〜５００
塩化ナトリウム ５，０００〜７，０００炭酸水素ナト
リウム ２００〜３，５００燐酸二水素ナトリウム ３
０〜１５０ グルコース ５００〜５，５００ 硝酸第二鉄 Ｏ〜 ０．２ 細胞数Ｈｔｏ’ 〜ｔｏ’、好Ｉ Ｌ／ ＜ Ｇｊ １
０７ＩＩ Ｐｈｉ ／ ｔｔｔｉに調整する。
リウム ２００〜３，５００燐酸二水素ナトリウム ３
０〜１５０ グルコース ５００〜５，５００ 硝酸第二鉄 Ｏ〜 ０．２ 細胞数Ｈｔｏ’ 〜ｔｏ’、好Ｉ Ｌ／ ＜ Ｇｊ １
０７ＩＩ Ｐｈｉ ／ ｔｔｔｉに調整する。
由いる栄養培地に、動物またはヒトの血清１九Ｇｊガン
マグロブリンネ含血清を補充子る（０．５〜１０％）。
マグロブリンネ含血清を補充子る（０．５〜１０％）。
栄養培地に、尊生物質（例えば、ネオマイシンまたＧｌ
ゲンタマイシン）を加えることが好ましい。
ゲンタマイシン）を加えることが好ましい。
”次いで、細胞を、α−またはβ−イ〜ター７−ロンで
処理する。この目的のために、誘発因子不含の七ＬＭ！
ｚ＋ｔｌ／ＮｉＡのインター７エロ゛ン、１０〜５ ｏ
ｏ ＩＴＴ／ｗ／、好ＩＬ＜４２２１３０−３００Ｉ
Ｕ／ｍｅの譬で剛いることができる。この予備的処理を
、３５〜３９℃、好ましくは３゛７℃で、１〜６時間。
処理する。この目的のために、誘発因子不含の七ＬＭ！
ｚ＋ｔｌ／ＮｉＡのインター７エロ゛ン、１０〜５ ｏ
ｏ ＩＴＴ／ｗ／、好ＩＬ＜４２２１３０−３００Ｉ
Ｕ／ｍｅの譬で剛いることができる。この予備的処理を
、３５〜３９℃、好ましくは３゛７℃で、１〜６時間。
好ましくは２時間実施する。
次いで、細胞を、α−インターフェロン誘発因子、好ま
しくＧゴ、１００〜８００．好１しくげ４００赤血球凝
集単位／ｌｘｅのａ度で好都合に適用するｔ１製−、（
７ＣＧｆｆ精製のセンダイウィルスト接触させる。
しくＧゴ、１００〜８００．好１しくげ４００赤血球凝
集単位／ｌｘｅのａ度で好都合に適用するｔ１製−、（
７ＣＧｆｆ精製のセンダイウィルスト接触させる。
３５〜３９℃１好ましく Ｇ；Ｊ ３７℃の温度で、５
〜４８時間、好筐しくけ１５〜２０時間、インキュベー
トする。その後、細胞を水性相から分離する。この上清
をゴ、−２０℃〜＋４℃の間の温度で貯蔵することがで
きるか、筐たは公知の方法で精製することができる、粗
製のα−インターフェロン、を含有している。
〜４８時間、好筐しくけ１５〜２０時間、インキュベー
トする。その後、細胞を水性相から分離する。この上清
をゴ、−２０℃〜＋４℃の間の温度で貯蔵することがで
きるか、筐たは公知の方法で精製することができる、粗
製のα−インターフェロン、を含有している。
次いで、好ましくＧゴ生理的食塩水を用、いて、とりわ
け前記組成を石する栄養培地を出いて１回。
け前記組成を石する栄養培地を出いて１回。
細胞を洗浄する。細胞を洗浄した後、！１度を、栄養培
地中、好１しくは前記開示の組成を有する栄養培地中、
５ｘｌＯ’−ｙｌＯ’の値、好ましくは２．５ＸＩＯ’
の値に調整する。前記栄養培地は、ヒトまたは動物の血
清またＧゴグロブリン不含血清を、好１しくけヒトのグ
ロブリンネ含血清゛を、０．５〜５ｗｇ／ｍｌ 、好ま
しくＧｌｌ 〜２■／ｌｌの濃度（３〜６％）で含んで
いる。
地中、好１しくは前記開示の組成を有する栄養培地中、
５ｘｌＯ’−ｙｌＯ’の値、好ましくは２．５ＸＩＯ’
の値に調整する。前記栄養培地は、ヒトまたは動物の血
清またＧゴグロブリン不含血清を、好１しくけヒトのグ
ロブリンネ含血清゛を、０．５〜５ｗｇ／ｍｌ 、好ま
しくＧｌｌ 〜２■／ｌｌの濃度（３〜６％）で含んで
いる。
次いで、細胞をγ−インターフェロン誘発因子と接触さ
せる。この目的のため、好ましくＧ）コンカナバリンＡ
、フィトヘムアグルテニンまたはスタフィロコンカスの
エンテロトキシンヲ用いルコとができる。誘発因子とし
て、コンカナバリンＡを１．好都合には２．５〜３０μ
ぬ／ｖｔｌ 、とりわけ１５μＩ ／ｙｘｌの濃度で用
いることが好ましい。
せる。この目的のため、好ましくＧ）コンカナバリンＡ
、フィトヘムアグルテニンまたはスタフィロコンカスの
エンテロトキシンヲ用いルコとができる。誘発因子とし
て、コンカナバリンＡを１．好都合には２．５〜３０μ
ぬ／ｖｔｌ 、とりわけ１５μＩ ／ｙｘｌの濃度で用
いることが好ましい。
誘発は１通常、３５〜３９℃、好ましくは３７℃の温度
で、８〜４８時間、好ましくＧ１１２〜１６時間実施す
る。この誘発因子は、所望ならば所定の時間（例えば、
１時間）の後に洗浄によって除去してもよいが、この工
程は省略してもよい。
で、８〜４８時間、好ましくＧ１１２〜１６時間実施す
る。この誘発因子は、所望ならば所定の時間（例えば、
１時間）の後に洗浄によって除去してもよいが、この工
程は省略してもよい。
その理ｄａｂゴ、誘発因子の存在が、不都ｆ１次工うに
インターフェロンの産生に影響を与えないからである。
インターフェロンの産生に影響を与えないからである。
この理由で１通常ｆｅｌｔ、誘発因子を除去しない。次
、いで１Ｃ胞を液相から分離する。この上清は、α−イ
ンターフェロン壜こ工゛っで汚染されている粗製のγ−
インターフェロンを含有している。。
、いで１Ｃ胞を液相から分離する。この上清は、α−イ
ンターフェロン壜こ工゛っで汚染されている粗製のγ−
インターフェロンを含有している。。
その理由は、インターフェロン産生の第２段階におムて
（すなわち、γ−インーターフェロン産生の段階４こお
いて）、α−インターフェロン−生細胞も多少の量のイ
ンターフェロンを産生ずるからである。
（すなわち、γ−インーターフェロン産生の段階４こお
いて）、α−インターフェロン−生細胞も多少の量のイ
ンターフェロンを産生ずるからである。
これらのインターフェロン【コ、互いに他の抗ウィルス
活性を増強するので、α−お工びγ−インターフェロン
の混合物中のγ−インターレエロンの実際の量はＪ検量
線（第１図）によってのみ計算することができる。ｒ−
インターフェロンの蓋を計算するたｂに、増強された力
価お工び混合物中のα−インターフェロン装を知ること
が必要である。後者の値ｆ１．重合物をｐＨ２で処理し
、その後それを滴定することに工って決定することがで
きる。その理由は、γ−インターフェロンが、このｐＨ
値で選択的蛋と分解され得るからである。
活性を増強するので、α−お工びγ−インターフェロン
の混合物中のγ−インターレエロンの実際の量はＪ検量
線（第１図）によってのみ計算することができる。ｒ−
インターフェロンの蓋を計算するたｂに、増強された力
価お工び混合物中のα−インターフェロン装を知ること
が必要である。後者の値ｆ１．重合物をｐＨ２で処理し
、その後それを滴定することに工って決定することがで
きる。その理由は、γ−インターフェロンが、このｐＨ
値で選択的蛋と分解され得るからである。
純粋なγ−インター゛フエ
ンターフェロン中のα−インターフェロンｔを除去する
こと、に工？・そ得られる。この粗製の”ｉ−インター
７エロ゛ンを、好まし９＜ハα−インターフェロンを除
去する前に、（例えば、ＣＰＧ−３５０多孔質ガ□ラス
粒子、Ｅｌｅｃｔｒｏｒｒ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃ Ｎ、
Ｊ′。
こと、に工？・そ得られる。この粗製の”ｉ−インター
７エロ゛ンを、好まし９＜ハα−インターフェロンを除
去する前に、（例えば、ＣＰＧ−３５０多孔質ガ□ラス
粒子、Ｅｌｅｃｔｒｏｒｒ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃ Ｎ、
Ｊ′。
米国、に工って）部分的に精製し、そして濃縮する。下
記の方法を用いることがモきる。１つの方法は％２つの
型のインターフェロンの相異なる分子量（α＝１８，０
００〜２１．０００ダルドア、７−４０．０００〜４５
，０００ダルトン）に基づくものであり、ゲル濾過（例
えば、セファクリル（５ｅｐｈａｅｒ）’ｌ ） Ｓ
−２００クロマトグラフ４− ’） ｉコニって実施す
るものである。他の方法によれば。
記の方法を用いることがモきる。１つの方法は％２つの
型のインターフェロンの相異なる分子量（α＝１８，０
００〜２１．０００ダルドア、７−４０．０００〜４５
，０００ダルトン）に基づくものであり、ゲル濾過（例
えば、セファクリル（５ｅｐｈａｅｒ）’ｌ ） Ｓ
−２００クロマトグラフ４− ’） ｉコニって実施す
るものである。他の方法によれば。
ｒ−インターフェロンを汚染しているα−インターフェ
ロン′ｌ＆−，セファロースゲルに結合した抗−α−イ
ンターフェロン抗体に工って結合させる。
ロン′ｌ＆−，セファロースゲルに結合した抗−α−イ
ンターフェロン抗体に工って結合させる。
本発明の方法の好都合は、α−お工びγ−インターフェ
ロンが同一の白血球培養中で２工程で調製され得るとい
うことである。インターフェロン１単位の調製コス）Ｇ
ゴ、有意に減少する。なぜならば、インターフェロンの
、製造コストの大部分が。
ロンが同一の白血球培養中で２工程で調製され得るとい
うことである。インターフェロン１単位の調製コス）Ｇ
ゴ、有意に減少する。なぜならば、インターフェロンの
、製造コストの大部分が。
血液試料の集収、「淡黄膜」画分の調製および白血球の
精製からなっているηλらである。本発明の方法（′Ｘ
、限定的ではあるが入手可能な白血球のインターフェロ
ン産生の有意な増加を可能とするものである。
精製からなっているηλらである。本発明の方法（′Ｘ
、限定的ではあるが入手可能な白血球のインターフェロ
ン産生の有意な増加を可能とするものである。
本発明の一層の詳細を、以下の実施例に示すが。
これは、前記実施例の保護の範囲を限定するもので１な
い。
い。
実施例１
血液試料を％ＡＣＤ溶液（クエン酸お工びグルコースを
含有する水溶液）中に＋４℃で３時間貯蔵した。この工
９をこして得られた１容置部の白血球コンセントレート
を、氷冷した０、８３憾塩化アンモニウム水溶液５重量
部と混会した。この懸濁液を、赤血球の溶解が起こる１
で（５〜１０分間）水冷下に放置し、その後、下記の組
成：以下余白 成 分 量、■／ｊ 塩化カルシウム １７５〜３５０ 塩化カリウム ３００〜３５０ 硫酸マグネシウムまたげ 塩化マグネシウム １７５〜５００ 塩化ナトリウム ５，０００〜７，０００炭酸水素ナト
リウム ２００〜３，５００燐酸二水素ナトリウム ３
０〜１５０ グルコース ５００〜５，５００ 硝酸第二鉄 Ｏ〜 ０．２■／Ｅ をＭする栄養培地中に白血球を懸濁した。
含有する水溶液）中に＋４℃で３時間貯蔵した。この工
９をこして得られた１容置部の白血球コンセントレート
を、氷冷した０、８３憾塩化アンモニウム水溶液５重量
部と混会した。この懸濁液を、赤血球の溶解が起こる１
で（５〜１０分間）水冷下に放置し、その後、下記の組
成：以下余白 成 分 量、■／ｊ 塩化カルシウム １７５〜３５０ 塩化カリウム ３００〜３５０ 硫酸マグネシウムまたげ 塩化マグネシウム １７５〜５００ 塩化ナトリウム ５，０００〜７，０００炭酸水素ナト
リウム ２００〜３，５００燐酸二水素ナトリウム ３
０〜１５０ グルコース ５００〜５，５００ 硝酸第二鉄 Ｏ〜 ０．２■／Ｅ をＭする栄養培地中に白血球を懸濁した。
１部の白血球懸濁液に対して、０．８３％塩化アンモニ
ウム水溶液１０容量部を用いたという相違点をもって、
前記の赤血球の溶解操作を繰り返した。この白血球を、
前記組成の栄養培地中に懸濁し、細胞数をｌＸｌ０’細
胞／ ｍｌの値に調整した。
ウム水溶液１０容量部を用いたという相違点をもって、
前記の赤血球の溶解操作を繰り返した。この白血球を、
前記組成の栄養培地中に懸濁し、細胞数をｌＸｌ０’細
胞／ ｍｌの値に調整した。
前記栄養培地ｉ１ 、 ２１１ｇ ／ｌｘｌのヒトグロ
ブリンネ含血清（約６％）を含有していた。前記細胞を
。
ブリンネ含血清（約６％）を含有していた。前記細胞を
。
３７℃において一定の攪拌下に、 ２００ ｒＵ／ｌａ
ｇの誘発因子不含の崖縮ヒトαＬインターフェロンで処
理した。２時間後、細胞を４００赤血球凝集単位のセン
ダイウィルスで誘発した。インキュベーションは、誘発
の後、１８時間す内で終えた。上清の抗ウイルス性α−
インターフェロンの力価Ｇｆ５４．２００Ｔυ／ｌｅ
Ｔ： ｔｂった。 α−インターフェロンの産生のため
に用いた細胞を、前記の栄養培地で１回洗浄し、前記白
血球を栄養培地中に２，５×１０７細胞／ｍｅの態度で
懸濁した。この栄養培地【ゴ、１ ｍｇ ／ ｍｅのグ
ロブリンネ含のヒト血清（約３％）を含んでいた。次い
で、細胞を１５μ９７ｍｅのコンカナバリンＡで刺激し
た。この誘発因子Ｇゴ系から除去しなかった。インキュ
ベーションを３７℃で一定の攪拌下に実施し、誘発後１
６時間以内に上清を遠心分離に１って細胞から取り出し
た。γ−インターフェロンを含む上清の抗ウイルス性力
価をＷＩＳＨヒト羊水細胞に裏って決定し、この力価ヲ
ヒトα−インターフェロン標準と比較してＵ ／ ｗｅ
（単位／ｗｅ）で表わし７′ｌ：（現在のところ。
ｇの誘発因子不含の崖縮ヒトαＬインターフェロンで処
理した。２時間後、細胞を４００赤血球凝集単位のセン
ダイウィルスで誘発した。インキュベーションは、誘発
の後、１８時間す内で終えた。上清の抗ウイルス性α−
インターフェロンの力価Ｇｆ５４．２００Ｔυ／ｌｅ
Ｔ： ｔｂった。 α−インターフェロンの産生のため
に用いた細胞を、前記の栄養培地で１回洗浄し、前記白
血球を栄養培地中に２，５×１０７細胞／ｍｅの態度で
懸濁した。この栄養培地【ゴ、１ ｍｇ ／ ｍｅのグ
ロブリンネ含のヒト血清（約３％）を含んでいた。次い
で、細胞を１５μ９７ｍｅのコンカナバリンＡで刺激し
た。この誘発因子Ｇゴ系から除去しなかった。インキュ
ベーションを３７℃で一定の攪拌下に実施し、誘発後１
６時間以内に上清を遠心分離に１って細胞から取り出し
た。γ−インターフェロンを含む上清の抗ウイルス性力
価をＷＩＳＨヒト羊水細胞に裏って決定し、この力価ヲ
ヒトα−インターフェロン標準と比較してＵ ／ ｗｅ
（単位／ｗｅ）で表わし７′ｌ：（現在のところ。
国際的なヒトｒ−インターフェＰン標準組成物はナイ）
。上ｆｆｏ 力価＋１． １ ”’０．６０−ＯＵ／
ｍｌ テｔｂ ッ友が、これをゴ調製したγ−インター
フェロン組成物がα−インターフェロンをも含んでいた
ため増強されたレベルのものであった。もとの物質の力
価お工びｐＨ２で処理した揚台の力価に基づき、第１図
の検敏線に工れは、実際のγ−インターフェロンのｔは
１． ｓ ４０ Ｕ／ｍｌでめった。
。上ｆｆｏ 力価＋１． １ ”’０．６０−ＯＵ／
ｍｌ テｔｂ ッ友が、これをゴ調製したγ−インター
フェロン組成物がα−インターフェロンをも含んでいた
ため増強されたレベルのものであった。もとの物質の力
価お工びｐＨ２で処理した揚台の力価に基づき、第１図
の検敏線に工れは、実際のγ−インターフェロンのｔは
１． ｓ ４０ Ｕ／ｍｌでめった。
比較のために、ｒ−インターフェロン産生の前にセンダ
イウィルスを用いないで細胞を１日間インキュベートし
た以外は前記した方法を繰り返した。コンカナバリンＡ
に工って産生されたγ−インターフェロンカイ曲は、３
４０Ｕ／ｍｌであった。
イウィルスを用いないで細胞を１日間インキュベートし
た以外は前記した方法を繰り返した。コンカナバリンＡ
に工って産生されたγ−インターフェロンカイ曲は、３
４０Ｕ／ｍｌであった。
比較のために、第１の段階、すなわち、α−インターフ
ェロン産生段階を省略して、単離した白血球を直接コン
カナバリンＡで誘発した。産生されたγ−インターフェ
ロンの力ｆｌｆｌｉＧ！ ４５０ Ｕ ／ ｍｅであっ
た。
ェロン産生段階を省略して、単離した白血球を直接コン
カナバリンＡで誘発した。産生されたγ−インターフェ
ロンの力ｆｌｆｌｉＧ！ ４５０ Ｕ ／ ｍｅであっ
た。
α−インターフェロン産生段階を省略し、ρ為つ誘発の
前！こ４時間、白血球を１，５００Ｉυ／１ｔｔｌのヒ
トα−またＧ１β−インターフェロンで処理（初回抗原
刺激）した揚台に、産生されたγ−インターフェロンの
力価げ２．３００ Ｕ ／ ｗｅであった。
前！こ４時間、白血球を１，５００Ｉυ／１ｔｔｌのヒ
トα−またＧ１β−インターフェロンで処理（初回抗原
刺激）した揚台に、産生されたγ−インターフェロンの
力価げ２．３００ Ｕ ／ ｗｅであった。
実施例２ ゛
栄養培地としてイーグル−溶液を用いた（ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ １４ 、３５９ （１９’６１年））以外は。
ｏｇｙ １４ 、３５９ （１９’６１年））以外は。
実施例１に従って実施した。α−インターフェロンの力
価は、５６． ｏｏｏ ＩＵ／ｒｎｌでめった。産生の
第２の段階における同一の栄養培地中のγ−インターフ
ェロン力価は、１，６８０ Ｕ／ｍｅであった。
価は、５６． ｏｏｏ ＩＵ／ｒｎｌでめった。産生の
第２の段階における同一の栄養培地中のγ−インターフ
ェロン力価は、１，６８０ Ｕ／ｍｅであった。
α−インターフェロン産生を省略した場会に。
産生されたγ−インターフェロンの力価げ２８０Ｕ ／
ｔｒｔｅであった。 ′
ｔｒｔｅであった。 ′
【図面の簡単な説明】
第１図Ｇ２．α−インターフェロンお工びγ−インター
フェロンの混合物中のγ−インターフェロン量を決定す
るための挟置ｆＩＭを表わすものである。 以Ｆ余白
フェロンの混合物中のγ−インターフェロン量を決定す
るための挟置ｆＩＭを表わすものである。 以Ｆ余白
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、血液の淡黄膜画分を単離し、赤血球を除去し、適当
な栄、養培地中に白血球を懸濁し、そしてα−インター
フェロン誘発因子を用いおＬびｒ−インターフェロン訪
発因子を用いて処理することによってα−お工びγ−イ
ンターフェロンを調製Ｔる方法であって。 血液の白血球（淡黄膜）−分を分離し、赤血球を除去し
適当な栄養培地中に前記白血球を懸濁し友後に得られた
懸濁液をα−１訓１β−インターフェロンで予備処理す
ること、α−インターフェロン誘発因子と接触させるこ
と、α−インターフェロンを含有する液体を前記細胞か
ら分離し、所望ならはα−インターフェロン’＆回収Ｔ
ること。 適当な栄養培地中で前記細胞を洗浄し懸濁させること１
分裂促進因子を用いて処理すること、ｒ−インターフェ
ロンを含有する液体を前記細胞から分−し所望ならばγ
−゛インターフェロンを回収し。 そして所望ならばγ−インターフェロンからα−インタ
ーフェロンを除去すること、にＬって同一の白血球培養
中で順次α−インターフェロンおよびγ−インターフェ
ロンを調製することを含んでなる。α−お１びｒ−イン
ターフェロンの調製方法。 ２、前記予備処理’）、１０〜５００ ＩＵ、’ｙノα
−またはβ−インターフェロンを用いて実施することを
含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記予備処理を、１〜６時間実施することを含む、
％ｌＰＦ請求の範囲第１項または第２項記載ｏｉｉ°７
． ４、前記予備処理を、阜５〜３９℃実施することを含む
、特許請求の範−第１項から第４項までのいずれか千町
載の方法。 ５、前記α−インターフェロン誘発因子として、粗製ま
１′ｃは精製のセンダイウィルスを用いルコトを含む、
特許請求の範囲１１１項記載の方法。 ６、前記センダイウィルスを、１ｍｅ当り１００〜８０
０の赤血球凝集単位で用いるこくを含む。 ”特許請求の範囲第５項記載の方法。 、７．前記α−インターフェロンｍ発に、５〜４８時間
実施することを含む、 ’１ｌＦＦ請求の範囲第５項ま
たはｗｌＧ項記載の方法。 ８、前記α−インターフェロンｉｌｉ、３５〜３９℃で
実施することを含む、特許請求の範囲第５項から第７項
１でのいずれかに記載の方′法。 す、前記分裂促進因子として１．コンカナバリンＡ１フ
イトヘムアグルチニン’ｆ７ｔｆＸスタフイロコツカス
のエンテロトキシン年用いることを含む。 特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、前記ｒ−インターフェロンｎ発Ｙｒ、 ｓ〜４８
時間実施することを含む：特許請求の範囲第９項記載の
方法。 １１、前記の得られた粗製γ−インターフェロンを部分
的に精製し濃縮すること、お工びゲル濾過に工ってα−
インターフェロンを除去することまに％苫前記α−イン
ターフェロンを抗−α−インターフェロン抗体と結分さ
せることを含む、 ′Ｖｉｅ請求の範囲第１項から第１
０項１でのいずれかに記載の方法。 肱前記赤血球を、塩化アンモニウムを用いた溶血によっ
て前記涙黄膜画分から除去することを含む、特許請求の
範囲第１項から第１１項１でのいずれかに記載の方法。 １３、前記栄誉培地として、１７５〜３５０膣／ｉｔの
塩化カルシウム、３００〜５００ ｍ１ｌｌの塩化力、
リウム、１７５〜５００ ｍｇ／ｌのｌｊｉ酸マグネシ
ウムまたは当量の塩化マグネシウム、５，０００〜７．
０００■／ｌの塩化ナトリウム、２００〜３．５００Ｉ
ｎｇ／ｍの炭酸水素ナトリウム、３０〜１５０■／Ｅの
燐酸二水系ナトＩＪウム、５００〜５，５００■殉のグ
ルコースお工ひ任意に０．０〜０．２■／ｌの硝酸第二
鉄お工び０，５〜ｌＯ％の血清または血清タンパク（０
，５〜５■／ｆＩＬｌりを含有する水溶液を用いること
を會む、特許請求の範囲第１項から第１２項箇でのいず
れかに記載の方法。 以下余白
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU834237A HU192254B (en) | 1983-12-13 | 1983-12-13 | Process for producing human leucocite and human gamma interferons in consecutive steps |
| HU2251/4237/83 | 1983-12-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60139700A true JPS60139700A (ja) | 1985-07-24 |
| JPH0475920B2 JPH0475920B2 (ja) | 1992-12-02 |
Family
ID=10967404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59260115A Granted JPS60139700A (ja) | 1983-12-13 | 1984-12-11 | α―およびγ―インターフエロンの調製方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4696899A (ja) |
| EP (1) | EP0146107A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60139700A (ja) |
| BG (1) | BG50035A3 (ja) |
| CS (1) | CS260049B2 (ja) |
| DD (1) | DD266002A7 (ja) |
| FI (1) | FI844897L (ja) |
| HU (1) | HU192254B (ja) |
| RO (1) | RO93446B (ja) |
| SU (1) | SU1713591A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01281097A (ja) * | 1988-03-04 | 1989-11-13 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | ヒトインターフェロンの製造方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2129533A1 (en) * | 1992-02-10 | 1993-08-19 | Douglas Testa | Improved alpha interferon composition and method for its production from human peripheral blood leukocytes |
| US5676942A (en) * | 1992-02-10 | 1997-10-14 | Interferon Sciences, Inc. | Composition containing human alpha interferon species proteins and method for use thereof |
| CA2078805C (en) * | 1992-09-22 | 1997-02-25 | Intelcor Biotech Enterprises Inc. | Cytokine preparation |
| HU222980B1 (hu) * | 1998-03-13 | 2004-01-28 | Acapi, Alpha-Chem Advanced Pharmaceutical Industries S.A.E. | Eljárás humán Alfa-interferon előállítására |
| SE519827C2 (sv) | 1998-03-30 | 2003-04-15 | Viranative Ab | Näringsmedium innehållande metionin samt användning av detta |
| WO1999050390A1 (en) | 1998-03-30 | 1999-10-07 | Bionative Ab | Methionin containing animal cell culture medium and its use |
| US6433144B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-08-13 | Viragen, Inc. | Compositions of highly-purified natural mixtures of type I Interferon derived from leukocytes and methods |
| WO2005069778A2 (en) * | 2004-01-09 | 2005-08-04 | Electric Mobility Corporation | Vehicle with improved turning |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55154919A (en) * | 1979-05-24 | 1980-12-02 | Hayashibara Takeshi | Preparation of interferon |
| SE8204382L (sv) * | 1981-07-21 | 1983-01-22 | Hayashibara Biochem Lab | Sett att framstella malcellysfaktor och anvendning derav |
| DE3136166A1 (de) * | 1981-09-12 | 1983-04-14 | Blutspendedienst der Landesverbände des Deutschen Roten Kreuzes Niedersachsen, Oldenburg und Bremen Gemeinnützige GmbH, 3257 Springe | Verfahren zur gewinnung von interferon-(alpha) und interferon-(gamma) |
| HU184972B (en) * | 1981-12-01 | 1984-11-28 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | Process for preparing human gamma interferone |
-
1983
- 1983-12-13 HU HU834237A patent/HU192254B/hu unknown
-
1984
- 1984-12-10 US US06/681,451 patent/US4696899A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-12-11 FI FI844897A patent/FI844897L/fi not_active Application Discontinuation
- 1984-12-11 RO RO116628A patent/RO93446B/ro unknown
- 1984-12-11 EP EP84115123A patent/EP0146107A3/de not_active Withdrawn
- 1984-12-11 SU SU847773679A patent/SU1713591A1/ru active
- 1984-12-11 JP JP59260115A patent/JPS60139700A/ja active Granted
- 1984-12-11 BG BG67852A patent/BG50035A3/xx unknown
- 1984-12-11 DD DD84270606A patent/DD266002A7/de not_active IP Right Cessation
- 1984-12-12 CS CS849696A patent/CS260049B2/cs unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01281097A (ja) * | 1988-03-04 | 1989-11-13 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | ヒトインターフェロンの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| CS969684A2 (en) | 1988-01-15 |
| EP0146107A3 (de) | 1987-12-16 |
| BG50035A3 (en) | 1992-04-15 |
| SU1713591A1 (ru) | 1992-02-23 |
| RO93446B (ro) | 1988-04-02 |
| HU192254B (en) | 1987-05-28 |
| FI844897L (fi) | 1985-06-14 |
| FI844897A0 (fi) | 1984-12-11 |
| RO93446A (ro) | 1988-03-30 |
| JPH0475920B2 (ja) | 1992-12-02 |
| US4696899A (en) | 1987-09-29 |
| EP0146107A2 (de) | 1985-06-26 |
| HUT38399A (en) | 1986-05-28 |
| DD266002A7 (de) | 1989-03-22 |
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