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Verfahren zur Gewinnung von Interferon-Ot und Interferon- g Periphere
Blutleukozyten (PBL) erzeugen auf geeignete Stimuli hin zwei Arten von Interferonen
(IFN): Durch virale Inducer werden sie zur Synthese von IFN-o( angeregt, alte Bezeichnung
Leukozyten-Interferon, und durch mitogene Substanzen zur Produktion von IFN-alte
Bezeichnung Immun- oder Typ2-Interferon, (K.E. Mogensen & K. Cantell: Production-
and Preparation of Human Leukocyte Interferon. Pharmac. Ther. C. 1, 369-381 (1977)
und M. De Ley et al.: Interferon Induced in Human Leukocytes by Mitogens: Production,
Partial Puri.fication and Characterization. Eur. J. Immunol. 10, 877-883 (1980)
).
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Beide Arten von Interferonen unterscheiden sich in einer Reihe von
physikochemischen Eigenschaften. Sie sind auch immunologisch unterscheidbar (Stewart
II, W. E.: The Interferon System, 1977, Springer Verlag, Wien und Langford, M. P.
et al.: Large Scale Production and Physicochemical Characterization of Human Immune
Interferon, Infect. Immun.
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26, 36-41). In ihren antitumoralen und antiproliferativen Wirkungen
sollen sie sich gegenseitig verstärken ( Fleischmann, W. R.: Interferon Potentiation
- Antiviral and Antitumor Studies. Abstract des Symposiums der Deutschen Stiftung
für Krebshilfe: Interferon, Properties, Mode of Action, Production and Clinical
Application, 1981).
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IFN-d bzw. -(werden von zwei verschiedenen, sich unter anderem durch
ihre Dichte unterscheidenden Zellarten gebildet: IFN-& von Non B-, Non T-Lymphozyten
und IFN- g von T-Lymphozyten, die beide in peripheren Blutleukozyten enthalten sind
(H. Kirchmer et al.: Studies of the Producer Cell of Interferon in Human Lymphocyte
Cultures. Immunbiol.
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156, 65-75, 1979 und D. L. Archer et al.: Immune Interferon Induction
by T-Cell Mitogens involves different T-Cell Subpopulations. Cell Immunol. 48, 420-426).
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Zwar existieren auch andere Quellen als PBL zur Erzeugung von IFN-ot
oder IFN-(, aber es besteht trotzdem ein großer Mangel an beiden Substanzen, sowohl
für klinische als auch für wissenschaftliche Untersuchungen (eine Übersicht über
bisherige in vivo und in vitro-Studien findet
sich in der Literaturstelle
3).
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine erweiterte Möglichkeit
der Gewinnung von Interferonen zu schaffen.
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Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, daß man aus ein und derselben
PBL-Präparation sowohl IFN-cC als auch IFN- g gewinnt.
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In Verfolg der Erfindung werden dafür die IFN-o(-Form produzierenden
Zellen einerseits und die -Form produzierenden Zellarten andererseits durch Zentrifugation
in einem geeigneten Dichtegradienten-Medium getrennt und separat kultiviert.
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In Verfolg des erfinderischen Gedankens ist es aber auch andererseits
möglich, das verschiedene genealogische Verhalten beider Zellarten zu nutzen. Und
zwar dadurch, daß man zur Gewinnung von IFN-d frische PBL verwendet, die aus höchstens
24 Stunden alten Blutkonserven stammen, während zur Gewinnung von IFN-(PBL verwendet
wird, welches Alter als 24 Stunden ist oder bereits 24-72 Stunden präinkubiert ist.
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Alle diese Vorgänge der Zentrifugation und der Kultivierung werden
unter an sich bekannten Bedingungen und Verfahren durchgeführt.
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Es hat sich gezeigt, daß IFNii nur von relativ frischen PBL (aus
bis zu 24 Stunden alten Blutkonserven) in befriedigender Ausbeute gebildet werden.
Dann sinkt die Syntheserate
scharf ab (H. L. Kanppinen et al.: Large
Seale Production and Properties of Human Leukocyte Interferon Used in Clinical Trials.
In: Human Interferon. Production and Clinical Use, 1977, Plenum Press, New York
& London).
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T-Lymphozyten behalten ihre Fähigkeit IFN-f'zu produzieren dagegen
viel länger; es wurde sogar gezeigt, daß eine Präinkubation der Zellen für 24-72
Stunden (in Kulturmedium, ohne geeignetes Stimulus) die Produktion von IFN- gerhöhen
kann (Nordhoff, H. et al.: Direct Correlation between the Production of Interleukin
2 (IL-2) and Immune Interferon (IF) by Human Mononu-clear Cells (MNL); Behring Inst.
Mitt.
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67, 90-94). Eine derartige Präinkubation des T-Zellanteils von PBL
liegt aber quasi automatisch vor, wenn diese zur Produktion von IFN α benutzt
werden. Die Inkubationsdauer in Gegenwart von Inducer-Virus beträgt 20 bis 24 Stunden.
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Trennt man also danach die Zellen vom Roh-Interferon-α ab und
resuspendiert sie in frischem Kulturmedium, erzeugen sie nach Stimulation mit Mitogenen
zusätzlich Interferon- g Man kann also Interferon-d und -Y'aus ein und derselben
Präparation von Leukozyten gewinnen und zwar: 1) nach Separierung der IFN-(* bzw.synthetisierenden
Zellfraktion durch Dichtezentrifugation und nachfolgende separate Kultivierung beider
Fraktionen, und 2) durch zweimalige Kultivierung unfraktionierter PBL,
das
erste Mal unter Bedingungen, bei denen IFN-entsteht, das zweite Mal zur Synthese
von IFN-(.
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Die Erfindung soll nun anhand von Beispielen näher erläutert und ihre
Fortschrittlichkeit demonstriert werden Vergleichsversuch 1: Produktion von IFN-O(
durch unprozessierte PBL.
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Aus Blutkonserven wurden durch Zentrifugation die Buffy Coats gewonnen.
Erythrozyten wurden durch Behandlung mit 0,83 %-iger Ammoniumchloridlösung lysiert
und die PBL in Nährmedium (minimal Essential Medium mit Earle's Salzen pH 7,4 mit
0,42 g/l IgG-freiem humanem Serumprotein) suspendiert. Die Zellkonzentration wurde
auf /ml eingestellt.
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Die Suspension wurde bei 37 0C im Wasserbad unter Magnetrührung in
6l-Rundkolben, die maximal zur Hälfte gefüllt waren, inkubiert, zunächst für 2 Stunden
in Gegenwart von 100 Einheiten/ml Interferon-ot. Dann wurden zusätzlich 100 hämagglutimerende
Einheiten Sendai-Virus zugefügt und für weitere 20 Stunden inkubiert. Die Zellen
wurden dann abzentrifugiert und der Überstand isoliert.
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Die Interferon-Aktivität wurde durch Inhibition des zytopathischen
Effektes von Vesieular Stomatitis-Virus auf eine humane Amnion-Zell-Linie bestimmt.
Eine Interferon-Einheit
ist definiert als der Reziprokwert derjenigen
IFN-Verdünnung, die die Lysis des Zellrasens durch den Assay-Virus zu 50 % hemmt.
Als Referenz-IFN-& wurde der Standard der Nr. G-023-901-527 vom NIH der USA
benutzt.
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Der IFN-o(-Titer des Zellsuspensions-Überstandes betrug im vorliegenden
Experiment 27 000 Einheiten/ml.
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Vergleichsversuch 2: Produktion von IFN- gdurch unprozessierte PBL.
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Buffy Coat PBL wurden in Nährmedium (RPMI 1640, pH 7,4 mit 2,4 g/l
humanem Serumprotein) suspendiert und auf eine Zelldichte von 5 x 106/ml eingestellt.
Inkubation: bei 37 0C im C02-begasten Brutschrank in 41 fassenden Penicillinkolben,
die jeweils 11 Zellsuspension enthielten. Zu Beginn wurden der Suspension 10 ug/ml
4ß-Phorbol-12ß-Myristat, 13OC-Acetat (PMA) zugefügt und für zwei Stunden inkubiert.
Dann wurde Mitogen hinzugefügt und für 24-72 Stun -den nachinkubiert. Die Zellen
wurden abzentrifugiert und die Überstände isoliert.
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Folgende IFN-α-Titer wurden erzielt:
Mitogen Konzentration IFN-α-Titer nach -nach (h) - |
(ug/ml) |
24 48 72 |
Concanavalin A |
(Con A) lo 270-810 2430-7290 2430 |
Antilympho zyten |
Serum (ALS) 50 270-810 2430 2430 |
Staphylokokken- |
Enterotoxin A (SEA) 0,05 270-810 2430-7290 810-2430 |
Phytohämagglutinin |
A (PHA) 10 90-270 810-2430 2430 |
SEA (ohne PMA) 0,05 90-270 270-810 270-810 |
Beispiel 1: Produktion von IFN-ot und IFN- γ durch fraktionierte PBL.
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Aus Blutkonserven wurden PBL gewonnen und die Erythrozyten durch
Behandlung mit 0,83 %-iger Ammoniumchlorid-Lösung entfernt.
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Ein Teil der Zellen wurde zur Produktion von IFN-α benutzt,
wie im Vergleichsversuch i beschrieben. Man erhielt die Kontrollprobe 1.
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Ein anderer Teil der Zellen wurde zur Produktion von IFN-verwendet,
wie im Vergleichsversuch 2 beschrieben. Dies ergab die Kontrollprobe 2.
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Der dritte Teil der Zellen wurde in einer Suspension von Percoll(R)
(Ein Polyvinylpyrrolidon-beschitetes Silicagel und wird als Dichtegradientenmedium
von der Firma LKB, Uppsala, vertrieben) in phosphatgepufferter isotoner Kochsalzlösung,
pH 7,4 (PBS) mit einer Dichte von 1.066 g/l suspendiert. Die Zellsuspension wurde
auf 50 ml-Zentrifugenröhrchen verteilt und mit Percoll <R) -PBS, d=1.030 g/ml
überschichtet. Es wurde dann für 20 min.
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und 1500 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert.
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Die PBL hatten sich in zwei Fraktionen aufgetrennt.
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Fraktion 1 befand sich an der Dichte 1.030/1.066 Zwischenphase und
Fraktion 2 auf dem Zentrifugenröhrschen-Boden.
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Beide Fraktionen wurden isoliert, in PBS resuspendiert und bei 200
x g/10 mi rezentrifugiert. Die Zellen wurden in den jeweiligen Nährmedien aufgenommen
und, wie in den Vergleichsversuchen 1 und 2 beschrieben, zur Produktion von IFN-
sowie benutzt.
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Fraktion 1 repräsentierte etwa 16-20 % der Gesamt-PBL und Fraktion
2 etwa 80 %.
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Folgende IFN-Titer wurden erzielt.
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Fraktion IFN-α (U/ml) IFN-γ (U-ml) nach 48 h und PMA (10-yg/ml
und SEA/0,05 µg Kontrollprobe 1 9000-27000 Kontrollprobe 2 - 2430 Fraktion 1 81Q00
410 " " (Ohne PMA) -Fraktion 2 41000 2430 II " (Ohne PMA) - 10-30 Das Ergebnis des
Beispieles 1 gemäß der Erfindung zeigt: 1) die IFN-OCund und IFN-γ systhetisierender
Zellen lassen sich in einer Einschritt-Operation völlig voneinander trennen durch
Dichtezentrifugation.
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2) die Syntheseaktivitäten bleiben voll erhalten, allerdings muß
man die fehlende Monozytenfunktion in Fraktion 2 durch PMA substituieren, um die
Synth.
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von IFNzu gewährleisten.
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3) für die Produktion von IFN-O(ergibt sich eine Reduktion des Zellsuspensionsvolumens
um ca. 80 %.
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Dieses bringt eine entsprechende Ersparnis von Zellkulturmedium,
Serum und Inducervirus sowie nachfolgend einen geringeren Reinigungsaufwand.
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Beispiel 2: Produktion von IFN-O( und IFN- γ aus unprozessierten
PBL durch zweimalige Inkubation derselben Zellpräparation.
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Aus Blutkonserven wurden die Buffy Coats isoliert und die Erythrozyten
durch Behandlung mit 0,83%-iger Ammoniumchloridlösung entfernt. Die PBL wurden zunächst,
wie im Vergleichsversuch 1 beschrieben, zur Produktion von IFN- benutzt und für
20 Stunden inkubiert. Dann wurden durch Zentrifugation Zellen als auch Überstände
isoliert. Die Zellen wurden im Medium RPMI 1640, pH 7,4 mit 2,4 g/l humanem Serumprotein
resuspendiert (gleiches Volumen wie bei der Erstinkubation) und im C02-begasten
Brutschrank bei 37 0C für weitere 24-72 h inkubiert. Als Mitogen wurde SEA (0,05
ug/ml) verwendet. Eine Probe wurde zusätzlich mit PMA (10 ug/ml) inkubiert. Nach
der Inkubation wurden die Uberstände isoliert und die IFN-Titer bestimmt.
IFN-Ot IFN- g (Einheit/mV nach |
(Einheit/ml 24 h 48 h 72h |
Erstinkubation 27000 ~ ~ ~ |
Zweitinkubation |
mit PMA - 810-2430 810-2430 810 |
ohne PMA - 810-2430 810-2430 810 |
Als Ergebnis des Beispiels 2 ergibt sich: 1) die IFN-γ-Syntheseaktivität
der PBL ist trotz der Präinkubation zur Gewinnung von IFN-O(voll erhalten geblieben.
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2) die Inkubation der Zellen mit dem Phorbolester kann unterbleiben,
da sich kein stimulierender Effekt auf die IFN-γ-Synthese ergibt. Dies ist
insofern von Vorteil, als PMA ein Cokanzerogen ist und seine nachfolgende Entfernung
ein schwerwiegendes Problem sein könnte.
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3) maximale IFN- t-Titer werden bereits nach 24 Stunden erreicht.
Das ist um etwa 24 Stunden weniger als bei Verwendung frischer Zellen.
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- Patentansprüche-