KR850000145B1 - B형 간염 바이러스 표면 항원의 분리 정제방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

B형 간염 바이러스 표면 항원의 분리 정제방법

본 발명에 따라 제조된 B형간염 표면항원(HBsAg)와 인혈장(Human Plasma)의 면역 전기영동 결과를 나타낸 도면으로 제1도는 항인혈청(Anti-Human Serum), 제2도는 항면역 글로블린A(Anti-Ig A), 제3도는 항면역 글로블린G(Anti-Ig G), 제4도는 항면역 글로블린M(Anti-Ig M), 제5도는 항B형 간염표면 항원(Anti-HBsAg)에 대한 결과이다.

본 발명은 B형간염 백신을 제조하기 위한 B형간염 바이러스 표면항원(HBsAg)의 분리정제에 관한 것이며 특히 순도와 역가가 높으며 수율을 높이는 B형간염 표면항원의 개량된 제조방법에 관한 것이다. 블룸버그 박사가 1964년에 B형간염 바이러스를 발견한 이래로 이 바이러스를 이용하여 예방백신을 만들고자 하는 많은 연구가 있었다.

B형간염 바이러스는 영장류 동물에만 증식하여 발병하며 조직배양법에 의한 배양이 불가능한 성질이 있어 이 바이러스를 대량으로 얻기 위해서는 사람의 체액에서 얻을 수 밖에 없었으므로 사람의 체액에서 분리정제하는 방법의 개발이 시급하였다.

B형간염 바이러스의 여러가지 항원중 백신 제조에 가장 적합한 것이 표면항원으로 밝혀지고 부터는 이 표면항원의 분리정제하는 방법의 연구에 많은 연구자들이 심혈을 기울여 왔다.

이 방법에 대한 일반적인 사항은 미국 특허 제3,636,191호 및 독일 특허 명세서 제2,049,515호에 상세히 기재되어 있다. 상기의 방법은 원료가 되는 출발물질을 곧바로 원심함으로서 대량생산을 위해서는 고가인원 심기가 많이 필요하여 시설비가 많이 들 뿐만 아니라 처리하는 시간도 길어야 한다는 문제점이 있었다.

이러한 문제점은 미국 특허 제4,088,748호 및 일본 공개특허 제57-54123호에 기재되어 있듯이 황산암모늄이나 황산알루미늄으로 출발물질을 농축하여 정제 공정으로 들어감으로써 시설 투자비 및 처리시간을 단축할 수 있었다. 그러나, 이 방법도 아직 감마 글로블린등 혈청 단백의 잔존으로 순도 및 역가가 낮을뿐 아니라 수율을 더욱 높여야 한다는 문제점이 있다.

본 발명자는 이런 문제점을 해결하고자 연구한 결과 출발물질의 농축과정을 변화시킴으로써 바람직한 결과를 얻었다. 종래에는 B형간염 표면항원의 정제법에서 출발물질을 농축할 때 황산암모늄, 황산알루미늄, PEG-6,000, 에어로실R 380등으로 처리해 왔으나 인혈청 단백을 분획할 때 특히 감마글로블린 성분을 침전시키는데 황산나트륨이 우수한 성능이 있음을 착안하고 처리조건을 조정함으로써 순도 및 역가가 높고 수율이 향상 되었으며 면역 전기영동법으로 확인한 결과 감마글로블린이나 기타 혈청단백은 잔존하지 않았다.

본 발명은 공지의 기술중 출발물질의 농축 과정에서 황산나트륨을 최종 농도가 10w/v% 내지 14w/v%가 되도록 하고 온도를 실온으로 하여 1시간동안 진탕하여 3,600rpm으로 30분간 원심분리함을 특징으로 하는 B형간염 바이러스 표면항원의 분리정제 방법이다.

황산나트륨의 최종 농도가 10w/v%이하가 되면 수율도 낮을 뿐만 아니라 순도와 역가도 낮았고, 14w/v%이상이 되면 수율은 높아졌으나 순도와 역가는 낮았으며, 최종 농도가 12w/v%일 때 가장 바람직한 결과를 얻었는 바 이는 황산나트륨의 농도에 따라 감마글로블린등 혈청 단백의 혼재가 있었기 때문이었다. 즉, 감마글로블린은 황산나트륨의 최종 농도가 12w/v%일때 변성되어 침전이 가장 원활하였다. 본 발명을 공지 기술을 포함한 일련의 공정으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 종래의 방법 예컨대 혈구반환채장법(Plasmapheresis)에 의해 얻어진 혈장을 출발물질로 하였는데 기타의 사람의 체액도 가능하다. 혈장을 염화칼슘 및 질화나트륨을 처리하여 피브리노겐을 제거하고 인산염 완충액을 가한 다음 무수황산 나트륨으로 처리하여 감마글로블린을 제거하기 위해 최종 농도를 10w/v%내지 14w/v%로 맞추고 실온에서 1시간동안 진탕한 후 3,600rpm으로 30분간 원심분리하여 감마글로블린분획을 제거하고 상청액을 흐르는 물에서 3일간 투석하여 황산나트륨을 제거한다.

여기에 PEG-6,000을 가하여 HBsAg가 함유된 알파글로 블린 분획을 수거하고 적당한 pH하에서 펩신을 가하여 기타 단백을 소화시키고 투석 및 농축하여 HBsAg 펠렛을 수거한다. 이 펠렛을 인산염 완충액에 용해시켜 자당밀도 기울기 원심 분리법에 의해 정제된 HBsAg를 얻는 방법이며 이 중에서 특히 무수황산나트륨 10w/v% 내지 14w/v%로 조정하여 감마글로블린을 제거하는 것을 특징으로 한다.

본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

가. 칼슘화에 의한 피브리노겐의 제거

본 발명에서 출발물질은 역간접 혈구응집법(RPHA)으로 정량하여 1 : 4,000 이상인 혈장을 혈구반환채장법등 통상적인 방법으로 공혈자에게서 얻었다. 이 혈장 1리터에 염화칼슘 1.5g 및 질화나트륨 0.2g을 가하고 1시간동안 진탕한 후 실온에서 하룻밤동안 정치하여 거즈로 피브리노겐을 제거하고 혈청 1리터를 얻었다

나. 황산나트륨 처리에 의한 감마글로블린 분획의 제거

상술한 혈청 1리터에 동량의 인산염 완충액을 가하여 2리터로 하여 무수황산나트륨 240g(12w/v%)을 가하여 실온에서 1시간동안 진탕한 후 3,600rpm으로 30분간 원심분리하여 상청액 약 2리터를 얻고 흐르는 물에서 3일간 투석하여 황산나트륨을 제거하였다.

다. PEG-6,000 처리에 의한 알파글로블린 분획의 수거

투석을 시킨 용액 2리터에 2N-염산으로 pH를 4.6이 되게 조정한후 PEG-6,000을 8w/v%(약 160g)가 되도록 조정하고 완전히 녹인후 냉장고에서 하룻밤 동안 정치하여 상청액을 제거하고 침전된 알파글로블린 분획을 수거하였다. 이 과정에서 알파글로블린을 제외한 모든 혈청단백 성분이 제거되는데 HBsAg는 알파글로블린 분획에 남게 된다. 침전된 알파글로블린분획의 양은 80g이었고 역가는 1g을 인산염 완충액 10ml에 용해 역간접혈구응집법(RPHA)으로 측정한 결과 1 : 160,000이었다.

라. 펩신처리 및 농축

HBsAg를 함유한 침전을 0.5리터의 증류수에 용해하고 2N-염산으로 pH를 2.2로 조정한후 0.2g의 펩신을 가하여 잘 혼합한 다음 37℃ 수욕조에서 3시간동안 가온한다. 여기에 2N-수산화나트륨으로 pH를 7.4로 조정하고 총용량이 30ml가 될때까지 아미콘엑스엠 100(Amicon XM100)을 이용하여 3일동안 투석 및 농축시켰다.

마. HBsAg의 펠렛팅

농축액을 베크만(Beckmann) SW50Ti에 넣어 20℃에서 15분간 5,000rpm으로 원심분리하여 불순단백을 침전시켜 침전물을 제거한 다음, 상청액을 수거하여 다시 SW50Ti에 넣고 20℃에서 192,000×g로 5시간 동안 원심분리하여 HBsAg를 펠렛팅시켜서 이 펠렛을 수거한 다음 인산염 완충액 EDTA 1.2ml에 용해시켰다.

바. 자당밀도 기울기 원심분리

HBsAg의 정제법중 밀도 기울기를 만드는 물질로는 자당, 브롬화칼륨, 염화세슘 등이 사용되고 있는데 본 발명에서는 자당으로 하였다. 5ml용량의 튜브 6개를 준비하여 인산염 완충액 EDTA에 자당을 농도별로 녹여 준비한 다음과 같은 순서로 채웠다.

상술한 방법으로 채워넣은 6개의 각 튜브를 SW 50 Ti 회전자에 넣고 5℃에서 192,000×g로 16시간동안 원심분리하면 HBsAg는 동일한 밀도를 가진 40%자당 농도층에 머무르게 된다. 40% 자당농도 분획을 수거하고, 30% 및50% 자당농도 분획을 수거 검사한 결과 30% 분획에는 미량의 HBsAg가 함유되어 있었고 50%분획에는 거의 없었다. 수율을 높이기 위해 30% 분획을 상기와 같은 방법으로 HBsAg를 계속 수거하였다.

수거된 40% 자당분획을 인산염 완충액을 외액으로 하여 투석시켜 정제된 HBsAg 20mg을 최종적으로 수거했다. 정제 HBsAg에 대해 면역 전기영동법을 실시한 결과 감마글로블린등 혈청단백은 나타나지 않았으며 2mg을 100ml의 인산염 완충액에 용해하여 역간접적혈구응집 반응법(RPHA)으로 검사한 결과 1 : 2048이었다.

[실시예 2]

혈장 15리터를 가지고 전술한 실시예 1과 같은 방법으로 실시한 결과 최종적으로 얻은 HBsAg의 양은 350mg이었고 RPHA 역가는 1 : 2048이었다.

[실시예 3]

RPHA 역가 1 : 4,000인 혈장 15리터를 가지고 실시예 1과 같은 방법으로 정제하되 황산나트륨 대신 황산암모늄을 최종 농도 30w/v%가 되도록 조정한 후 침전시켜 감마글로블린을 제거시킨후 PEG-6,000으로 처리하였다. 이 상태에서의 알파글로블린 분획의 양은 82g으로 높았으나 RPHA역가는 1 : 32,000으로 기타의 혈청단백이 잔존하였다. 최종적으로 얻은 HBsAg의 양은 253mg이었으나 RPHA 역가는 1 : 256이었다.

[실시예 4]

동일한 역가의 혈장 15리터를 가지고 실시예 1과 같은 방법으로 실시하되 황산나트륨 대신 PEG-6,000을 pH 7.2에서 4w/v% 농도가 되게 첨가하여 침전을 제거하고 상청액을 다시 8w/v%가 되도록 PEG-6,000을 첨가하여 알파글로블린 분획 54g을 얻었다.

최종적으로 얻은 HBsAg의 양은 250mg이었으며 RPHA역가는 1 : 512였다.

[실시예 5]

동일한 역가의 혈장 15리터를 가지고 실시예 1과 같은 방법으로 실시하되 황산나트륨 대신 에어로실 380으로 처리하여 그 상청액을 PEG-6,000으로 동일하게 처리한 결과 알파글로블린 분획은 72g이었으며 RPHA역가는 1 : 16,000이었다. 최종적으로 얻은 HBsAg의 양은 305mg이었으며 RPHA역가는 1 : 512였다.

Claims (2)

1. HBsAg를 분리정제 하는 방법에 있어서 소요량 만큼의 HBsAg를 함유하고 피브리노겐이 제거된 혈청으로 부터 황산나트륨으로 처리하여 감마글로블린 분획을 제거하는 것을 특징으로 하는 HBsAg의 분리정제 방법.
2. 제1항에 있어서 황산나트륨 처리시 최종 농도가 10w/v% 내지 14w/v%가 되도록 무수황산나트륨을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 진탕한 후3,600rpm으로 30분간 원심분리하므로써 감마글로블린을 제거하는 방법.

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