DE19504852A1

DE19504852A1 - Verfahren zur Reinigung Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren durch Chromatographie

Info

Publication number: DE19504852A1
Application number: DE19504852A
Authority: DE
Inventors: Djuro Josic; Frank Morfeld
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1995-02-15
Filing date: 1995-02-15
Publication date: 1996-08-22
Anticipated expiration: 2015-02-16
Also published as: WO1996025490A1; DE69636594D1; PT813597E; DE69636594T2; IL117110A0; AU4830596A; ATE341617T1; EP0813597A1; ES2274524T3; EP0813597B1; DK0813597T3; IL117110A; DE19504852C2

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren durch Anionen austauscher-Chromatographie sowie eine PPSB-Fraktion oder Protein C und S sowie Faktor IX-Fraktion erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren.

Die EP 0 396 022 beschreibt die chromatographische Herstellung eines Faktor IX-Konzentrats aus Plasma. Es handelt sich dabei um eine Affinitäts-Chromatographie mit einem Trägermaterial an dem 2-Hydroxyaminopropyl (HAP)-Gruppen an eine relativ kurze Kette aus 3 Kohlenstoffatomen (Spacer) gebunden sind. Gefolgt von einem Heparin-Affinitäts-Chromatographieschritt kann nach dem dort beschriebenen Verfahren ein Faktor IX-Konzentrat hergestellt werden, welches eine spezifische Aktivität für Faktor IX von über 200 U/mg enthalten soll. Die Gesamtausbeute des Faktors bezogen auf Plasma soll bei 30% liegen, wenn mit wäßrigen Lösungen, die als Salz lediglich NaCl enthalten (zur Erhöhung der Leitfähigkeit), gewaschen wird. Als Elutionsmittel dient 1-Amino-2-propanol. Dies ist aus Gründen der Arzneimittel sicherheit nachteilig. Desweiteren sinkt die Ausbeute nach der in der EP 0 396 022 beschriebenen Arbeitsweise, wenn Virusinak tivierungsschritte durchgeführt werden. Dies ist aber bei Verwendung von gepoolten Plasma zwingend erforderlich, um Übertragung von Viren durch die Vitamin K-abhängigen Faktoren zu verhindern (z. B. Hepatitis A bzw. B, HIV etc.).

Auch die bislang bekannten Anionenaustauscher oder Affinitäts-Chromatographie-Materialien sind zwar geeignet, eine chromato graphische Trennung der Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren zu gewährleisten, jedoch ist es wünschenswert, Chromatographie-Materialien verfügbar zu haben, die eine weitere Verbesserung der Trennung von Vitamin K-haltigen Gerinnungsfaktoren aus Blutplasma ermöglichen.

Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht somit zum einen darin ein Verfahren anzugeben, mit dem eine verbesserte Ausbeute von Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren wie PPSB-Konzentraten, Protein C und S und Faktor IX-Fraktionen ermöglicht wird und ein Chromatographie-Material bereitzustel len, das in besonders guter Weise geeignet ist, Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren aus entsprechenden Quellen her stellbar zu machen.

Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1. Die Ansprüche 2 bis 9 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsge mäßen Verfahrens. Ansprüche 10 und 11 sind gerichtet auf Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Produkte, die sich durch hohe Reinheit und hohe spezifische Aktivität auszeichnen und mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlich sind. Anspruch 12 betrifft das im erfindungsgemäßen Verfahren an wendbare Chromatographie-Material.

Erfindungsgemäß wird das die Vitamin K-abhängigen Faktoren enthaltende Quelle mit einem Material versetzt, an dem die HAP-Liganden über sogenannte Tentakel gebunden sind. Unter dem Begriff Tentakel werden bestimmte Spacer verstanden, mit dem Chromatographiematerial modifiziert ist, wie es in der EP 0 337 144 beschrieben wird. Das mit HAP-Liganden modifizierte Chromatographiematerial, das über Tentakel den Liganden gebunden hat, zeigt neue Eigenschaften, die zur Lösung des der Erfindung zugrunde liegenden Problems führen. Die kovalent über die Tentakel an das Chromatographiematerial gebundenen HAP-Liganden sind frei beweglich über die Tentakel an die Matrix gebunden. Unter Verwendung dieses Materials ist es möglich, eine Chroma tographie der Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren aus unverdünntem Plasma durchzuführen und die Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren in hoher Ausbeute und Reinheit zu gewinnen. Die erfindungsgemäß gewonnenen Fraktionen der Gerinnungsfaktoren ergeben dann zusammen mit den Reinigungsschritten des erfin dungsgemäßen Verfahrens hochreine Gerinnungsfaktorkonzentrate.

Die Figur zeigt nach Art eines Flußdiagramms den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens mit bevorzugten Ausführungsformen zur Herstellung des PPSB-Konzentrats sowie des Faktor IX-Kon zentrats.

Erfindungsgemäß wird ausgehend von einer Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren enthaltenden Quelle, diese mittels Affini täts-Chromatographie in die gewünschten Fraktionen aufgetrennt. Dies erfolgt an einem mit 2-Hydroxyaminopropyl-Gruppen modifi ziertem Material. Insbesonders bevorzugt ist hierbei ein Mate rial, das erhältlich ist durch Kopplung von 2-Hydroxyamino propyl-Gruppen an eine Matrix, die dann zu den sogenannten Tentakel-Chromatographie-Materialien (Firma Merck) führt. Die Modifizierung des Materials sowie das Material selbst werden weiter unten charakterisiert.

Die Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Quelle wird aus einer Lösung mit dem Affinitätsmaterial in Kontakt gebracht, wobei die Lösung eine relativ geringe Ionenstärke entsprechend 10 bis 150 mOsm aufweist. Dies erfolgt in besonders einfacher Weise dadurch, daß man das Chromatographie-Material, vorzugsweise in aufgeschlämmter Form, in eine Chromatographie-Säule gibt und die Lösung mit der Vitamin K-abhängige Faktoren enthaltenden Quelle in die Säule gibt. Die Ionenstärke wird so eingestellt, daß die Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren an dem Chromatographie-Material adsorbiert bleiben, wohingegen andere Bestandteile aus der Chromatographiesäule ausgewaschen werden. Gegebenenfalls kann nach dem Auftragen der Lösung enthaltend die Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren mit einer Lösung ähnlicher Ionenstärke, wie die zur Auftragung verwendet wurde, gewaschen werden. Dann wird gemäß Schritt b) des erfin dungsgemäßen Verfahrens eine Lösung höherer Ionenstärke mit dem Chromatographie-Material in Kontakt gebracht. Dies führt dazu, daß die an dem erfindungsgemäßen Chromatographie-Material adsorbierten Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren von der Oberfläche des Chromatographie-Materials desorbiert werden und aus der Chromatographiesäule eluieren. Diese Fraktion enthält die PPSB-Faktoren IX, II, X und VII und die Proteine C und S. Diese Fraktion kann dann in an sich bekannter Weise zu einem handelsfähigen PPSB-Präparat weiterverarbeitet werden kann.

Zur Isolierung von Faktor IX wird die gemäß Schritt b) eluieren de Fraktion gesammelt und einer zweiten Chromatographie in Form einer Heparin-Affinitäts-Chromatographie unterzogen. Die Hepa rin-Affinitäts-Chromatographie ist als solche bekannt und in D. Josic, F. Bal und H. Schwinn, Journal of Chromatography, 632 (1993) 1-10 näher beschrieben.

Um ein nach heutigem Standard einwandfreies Präparat zu erhal ten, findet schließlich vorzugsweise zwischen Schritt b) und c) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Virusinaktivierungs schritt statt. Vorzugsweise wird eine Virusinaktivierung durch chemische Behandlung mit Detergenzien und/oder einer Wärmebe handlung durchgeführt. Als Detergenzien kommen nichtionische Detergenzien in Frage. Diese werden kombiniert mit di-/trialkyl substituierten Phosphaten, wie beispielsweise TNBP (Tri-N-Butyl-Phosphat). Die zur Virusinaktivierung eingesetzten Detergenzien können bis zu 20% eingesetzt werden. Der Wärmebehandlungs schritt entspricht einem Pasteurisierungsschritt, vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 60 bis 65°C für 5 bis 30 Stunden, insbesondere 8 bis 14 Stunden (WO 94/17834).

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah rens kann sich eine zweite Virusinaktivierung dem Schritt c) anschließen. Dies ist insbesondere dann zu empfehlen, wenn zwischen dem Schritt b) und c) lediglich eine Virusinaktivierung erfolgt. Insbesondere bevorzugt ist eine chemische Virusinak tivierung zwischen Schritt b) und c) und eine physikalische Virusinaktivierung, beispielsweise Wärmebehandlung, nach Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Wird eine zweite Virusinaktivierung nach dem Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt, empfiehlt sich eine dritte chromatographische Reinigungsoperation, die entweder eine zweite Heparin-Affinitäts-Chromatographie, eine Anionenaustau scher-Chromatographie oder eine Chromatographie an dem in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beteiligten Träger ist.

In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah rens kann nach Schritt b) eine physikalische Virusinaktivierung beispielsweise Wärmebehandlung durchgeführt werden. Vorzugsweise schließt sich daran eine Zwischenreinigung an, die entweder eine Anionenaustauscher-Chromatographie oder eine weitere Chromato graphie an dem erfindungsgemäßen Träger gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist. Danach kann eine Solvent/De tergentinaktivierung (EP 131 740 A2) und eine Heparin-Affini täts-Chromatographie erfolgen.

Als Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Quelle kommen insbesondere Blutplasma oder Cryopoorplasma oder Zellkul turüberstände oder andere die Vitamin K-abhängigen Gerinnungs faktoren enthaltende Lösungen in Frage.

Je nach Zustand der Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltenden Quelle kann sich eine Filtration an bioverträgli chen Materialien empfehlen. Als Filter kommen insbesondere Filter mit Porengrößen zwischen 0,5 und 2,0 µm in Betracht.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Konzentrate herstel len. Das Faktor IX- und das PPSB-Konzentrat weist gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Konzentraten eine höhere Reinheit auf und sind damit neue Verbindungen. Weiterhin liegen die Proteine C und S im PPSB-Konzentrat mit einer spezifischen Aktivität von 8 bis 10 U/mg vor. Somit erhält man eine geeignete Ausgangsfunktion für die Herstellung eines neuen hochreinen Protein C und S-Konzentrats.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare erfindungsgemäße Chromatographie-Material ist erhältlich durch Modifizierung sogenannter Tentakel-Materialien mit der 2-Hydroxyaminopropyl-Gruppe (HAP) als Liganden. Das erfindungsgemäße Chromatographie-Material weist auf der Grundmatrix, dem Trägermaterial, einen hydrophilen beweglichen Arm (Spacer) auf. An diesem Arm ist die HAP-Gruppe gebunden. Es zeigt sich überraschenderweise, daß mit der Verwendung des erfindungsgemäßen Chromatographie-Materials die Reinigung der Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren aus entsprechenden Quellen mit hoher Reinheit und Ausbeute möglich ist.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher er läutert.

Die Beispiele 1 und 2 betreffen einen Vergleich zwischen dem aus der EP 0 396 022 beschriebenen Chromatographie-Material mit dem erfindungsgemäßen Chromatographie-Material bei sonst authen tischen Bedingungen, die denen der EP 0 396 022 nachempfunden waren. Dabei betrifft Beispiel 1 die Verwendung des erfindungs gemäßen Materials und Beispiel 2 die Verwendung des aus EP 0 396 022 beschriebenen Materials.

Beispiel 1

Eine 10 ml Säule mit einem 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden, der über Tentakelarm an die Matrix gebunden ist, wird mit 60 ml Puffer A mmol/l Citrat, 10 mmol/l NaHPO₄, 100 mmol/l NaCl, pH 7,5) äquilibriert.

200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von 100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,8 mol/l NaCl enthält, eluiert. 30% des Faktors IX befinden sich im Durch lauf, während 50% mit 0,8 mol/l NaCl eluiert werden. Die spezi fische Aktivität des Faktors IX beträgt 6,5 U/mg. Die Anreiche rung des Protein C beträgt im 0,8 mol/l NaCl-Eluat 30% und des Protein S 20% der Ausgangsmenge.

Beispiel 2

Eine 10 ml Säule mit einer 2-Mydroxyaminopropyl-Liganden tragen den Matrix, bestehend aus einem Copolymerisat von Glycidyl methacrylat, Pentaerythrol-dimethacrylat und Polyvinylalkohol (Toyopearl TSK-Amino, TosoHaas) wird mit 60 ml Puffer A (10 mmol/l Citrat, 10 mmol/l NaHPO₄₁ 100 mmol/l NaCl, pH 7,5) äquilibriert.

200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von 100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,5 mol/l NaCl enthält, eluiert. 75% des Faktors IX befinden sich im Durch lauf, während 13% mit 0,5 mol/l NaCl eluiert werden. Die spe zifische Aktivität des Faktors IX beträgt 7 U/mg. Die Anreiche rung des Protein C beträgt im 0,5 mol/l NaCl-Eluat lediglich 2% der Ausgangsmenge, während Protein S nicht nachweisbar ist.

Das Beispiel 3 zeigt das Ergebnis, das sich bei Verwendung des erfindungsgemäßen Materials im erfindungsgemäßen Verfahren ein stellt unter veränderten Puffer und Elutionsbedingungen, wobei Beispiel 3 eine erfindungsgemäße Optimierung und Beispiel 4 zeigt welches Ergebnis mit dem konventionellen Material bei Anwendung der erfindungsgemäßen optimierten Bedingungen zu erreichen ist.

Beispiel 3

Eine 10 ml Säule mit einem 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden, der über Tentakelarm an die Matrix gebunden ist, wird mit 60 ml Puffer A (20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert.

200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von 100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A, der 0,15 mol/l NaCl enthält, gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,8 mol/l NaCl enthält, eluiert. 18% des Faktors IX befinden sich im Durchlauf, während 75% mit 0,8 mol/l NaCl eluiert werden. Die spezifische Aktivität des Faktors IX beträgt 7 U/mg. Die Anreicherung des Protein C beträgt im 0,8 mol/l NaCl-Eluat 50% und die des Protein S 30% der Ausgangsmenge.

Beispiel 4

Eine 10 ml Säule mit einer 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden tragen den Matrix, bestehend aus einem Copolymerisat von Glycidyl methacrylat, Pentaerythrol-dimethacrylat und Polyvinylalkohol (Toyopearl TSK-Amino, TosoHaas) wird mit 60 ml Puffer A (20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert.

200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von 100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,5 mol/l NaCl enthält, eluiert. 61% des Faktors IX befinden sich im Durch lauf, während 32% mit 0,5 mol/l NaCl eluiert werden. Die spezi fische Aktivität des Faktors IX beträgt 6 U/mg. Die Anreicherung des Protein C beträgt im 0,5 mol/l NaCl-Eluat 5% und die des Protein S 1% der Ausgangsmenge.

Der Vergleich der Beispiele 3 und 4 zeigt, daß mit der Verwen dung des erfindungsgemäßen Materials überraschenderweise eine Verdoppelung der Ausbeute an Faktor IX zu erzielen ist. Gleich zeitig und im Unterschied zum Verfahren gemäß Stand der Technik werden in dieser Fraktion das Protein C und S mit angereichert.

In Beispiel 5 ist eine andere Optimierung mit dem erfindungsge mäßen Material dargestellt. In Beispiel 6 sind die Auftrage- und Waschbedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Trägermaterial gemäß Stand der Technik durchgeführt worden.

Beispiel 5

Eine 250 ml Säule mit einem 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden, der über Tentakelarm an die Matrix gebunden ist, wird mit 2000 ml Puffer A (20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert.

5000 ml Cryopoorplasma werden aufgetragen und mit 750 ml Puffer A gewaschen. Dann wird mit 2000 ml Puffer A, der 0,15 mol/l NaCl enthält, gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,8 mol/l NaCl, 0,1% Aminosäuren, wie Lysin, 0,1% Arginin enthält, eluiert. Der Faktor IX dieser Fraktion besitzt eine spezifische Aktivität von 8 U/mg. Die Ausbeute an Faktor IX beträgt 85% der Ausgangsaktivität im Cryopoorplasma. In dieser Fraktion ist das Protein C zu 55% und das Protein S zu 40% der Ausgangsmenge enthalten.

Das Eluat wird gegen 20 mmol/l Citratpuffer, pH 7,0 diafil triert, bis eine Osmolarität von 200 mOsmol erreicht ist. Die Lösung wird mit 1% Tween und 0,3% TNBP versetzt und 7 Stunden bei 25°C inkubiert.

Eine 500 ml Heparin-Sepharose (Pharmacia) wird mit 1500 ml Puffer A äquilibriert. Das Faktor IX-Eluat wird aufgetragen und mit 1000 ml Puffer A gewaschen. Anschließend eluiert man den Faktor IX mit einem linearen Gradienten von 0-1 mol/l NaCl in Puffer A. Die Fraktionen mit einer spezifischen Faktor IX-Aktivität über 200 werden gepoolt, mit Stabilisatoren versetzt und pasteurisiert. Danach erfolgt mit der verdünnten Lösung eine zweite Heparin-Chromatographie. Man erhält ein doppelt virusin aktiviertes Faktor IX-Konzentrat mit einer spezifischen Akti vität von <200 U/mg, bei einer Ausbeute von 40% aus Plasma.

Beispiel 6

200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von 100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A, der 0,15 mol/l NaCl enthält, gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,5 mol/l NaCl enthält, eluiert. Im Säulendurch lauf befinden sich 50% der Faktor IX-Menge. Im Wash mit 0,15 mol/l NaCl sind weitere 38% zu finden. Im 0,5 mol/l NaCl-Eluat waren lediglich 5% Ausbeute an Faktor IX zu finden.

Beispiel 6 macht deutlich, daß die Verwendung des konventionel len Materials entscheidende Nachteile mit sich bringt, da sich die Hauptmenge an Faktor IX im Durchlauf und in der Waschfrak tion befinden. Der Faktor IX und auch die anderen Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren binden an das Chromatographiemate rial gemäß Stand der Technik nur ungenügend, wenn sie aus viskosen Lösungen wie z. B. unverdünntem Plasma oder aus Lösungen mit hoher Ionenstärke aufgereinigt werden sollen.

Beispiel 7 betrifft die Herstellung eines PPSB-Konzentrats unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gels. Als sogenannter Capture-Schritt wurde eine Chromatographie des Cryopoorplasmas mit Q-Sepharose-FastFlow durchgeführt. Mit diesem Zwischenprodukt wurde dann eine Chromatographie mit dem erfindungsgemäßen Chromatographie-Material durchgeführt. Der Capture-Schritt kann auch mit anderen Gel-Materialien, die starke Anionenaustauscher eigenschaften aufweisen, eingesetzt werden.

Beispiel 7

Eine 200 ml Säule mit Q Sepharose FF (Pharmacia) wird mit Puffer A (0,005 mol/l NaHPO₄, pH 6) äquilibriert.

5000 ml Cryopoorplasma werden mit einer Flußrate von 100 cm/h aufgetragen und mit 500 ml Puffer A gewaschen. Danach wird die Säule mit 500 ml Puffer A, der 0,05 mol/l NaCl enthält, gewa schen. Anschließend wird mit Puffer A, der 0,4 mol/l NaCl ent hält, eluiert. Diese Fraktion wird gegen 25 mmol/l Citrat, pH 7 dialysiert bis die Osmolarität 150 mOsm beträgt. Der Lösung werden 1% Tween und 0,3% TNBP zugemischt und 8 Stunden bei 25°C inkubiert.

Eine 50 ml Säule mit einem 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden, der über Tentakelarm an die Matrix gebunden ist, wird mit 2000 ml Puffer B (20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert. Das Eluat der Q-Sepharose wird auf die Säule aufgetragen und mit 300 ml Puffer B gewaschen. Anschließend wird mit 250 ml Puffer B, der 0,1 mol/l NaCl enthält, gewaschen und danach mit Puffer B, der 0,8 mol/l NaCl, 0,1% Lysin, 0,1% Arginin enthält, eluiert. Man erhält eine Fraktion, die die PPSB-Faktoren IX, II, X und IX mit einer spezifischen Aktivität von 7 U/mg enthält. Die Gesamtausbeute für die PPSB-Faktoren liegt bei 54%. Zusätzlich liegen in dieser Fraktion das Protein C und S mit einer Ausbeute von 40% bzw. 35% vor.

Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Material führen überraschenderweise zu einer Isolierung des Faktors IX zusammen mit Protein C und S, wobei dies direkt aus Plasma erfolgen kann. Bei den aus dem Stand der Technik bekannten HAP-Materialien befindet sich jedoch der Hauptanteil der Proteine C und S im Säulendurchbruch.

Herstellschema F IX

Claims

1. Verfahren zur Reinigung Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfak toren durch Affinitäts-Chromatographie, wobei, ausgehend von einer die Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren enthaltenden Quelle, Fraktionen dieser Quelle

a) einer Chromatographie an einem mit an Spacern mit mehr als 3 C-Atomen gebundenen 2-Hydroxyaminopropyl- Gruppen modifizierten Material unterzogen wird, wobei die Quelle aus einer Lösung aufgetragen wird, deren Ionenstärke so gewählt wird, daß die Vitamin K-ab hängigen Gerinnungsfaktoren an dem Anionenaustaus cher-Material adsorbiert werden, gegebenenfalls mit einer entsprechenden Pufferlösung gewaschen wird, dann nach Abtrennung des Eluats,
b) eine Pufferlösung höherer Ionenstärke als diejenige des Schrittes a) mit dem Affinitäts-Chromatographie material in Kontakt gebracht wird, so daß die Vitamin K-abhängigen Faktoren eluieren, dann die Fraktion entweder zu einem PPSB-Präparat weiter verarbeitet werden oder diese Faktoren enthaltenden Fraktionen gesammelt werden und danach diese Fraktionen,
c) einem zweiten Chromatographieschritt in Form einer Heparin-Affinitäts-Chromatographie unterzogen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwischen Schritt b) und c) eine Virusinaktivierung stattfindet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Virusinaktivierung durch Behandlung der die Vitamin K-abhängigen Faktoren enthaltenden Fraktionen mit nicht ionischen Tensiden in Gegenwart von Di- oder Trialkylphosphaten mit oder ohne Wärmebehandlung erfolgt.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zwischen Schritt b) und c) eine Chromatographie an einem Anionenaustauscher oder eine Chromatographie ent sprechend Schritt a) des Anspruchs 1 durchgeführt wird.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei nach dem Schritt c) des Anspruchs 1 eine weitere Virusinaktivierung erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der zweite Virusinak tivierungsschritt eine Wärmebehandlung beinhaltet.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei nach der zweiten Virusinaktivierung eine dritte chromatographische Reini gungsoperation erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die dritte chromatographi sche Reinigungsoperation eine Heparin-Affinitäts-Chromato graphie, Anionenaustauscher-Chromatographie oder eine Chromatographie entsprechend Schritt a) des Anspruchs 1 ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Quelle Blutplasma, Cryopoorplasma ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Quelle vor dem Schritt a) des Anspruchs 1 einer Filtration unterworfen wird.

11. PPSB-Fraktion erhältlich durch Sammeln der Fraktionen nach Durchführung des Schrittes b) gemäß Anspruch 1.

12. Faktor IX erhältlich durch Sammeln der Fraktionen nach Durchführung des Schrittes c) des Anspruchs 1.