DE19504852A1 - Verfahren zur Reinigung Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren durch Chromatographie - Google Patents
Verfahren zur Reinigung Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren durch ChromatographieInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Reinigung Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren durch Anionen
austauscher-Chromatographie sowie eine PPSB-Fraktion oder
Protein C und S sowie Faktor IX-Fraktion erhältlich durch das
erfindungsgemäße Verfahren.
Die EP 0 396 022 beschreibt die chromatographische Herstellung
eines Faktor IX-Konzentrats aus Plasma. Es handelt sich dabei
um eine Affinitäts-Chromatographie mit einem Trägermaterial an
dem 2-Hydroxyaminopropyl (HAP)-Gruppen an eine relativ kurze
Kette aus 3 Kohlenstoffatomen (Spacer) gebunden sind. Gefolgt
von einem Heparin-Affinitäts-Chromatographieschritt kann nach
dem dort beschriebenen Verfahren ein Faktor IX-Konzentrat
hergestellt werden, welches eine spezifische Aktivität für
Faktor IX von über 200 U/mg enthalten soll. Die Gesamtausbeute
des Faktors bezogen auf Plasma soll bei 30% liegen, wenn mit
wäßrigen Lösungen, die als Salz lediglich NaCl enthalten (zur
Erhöhung der Leitfähigkeit), gewaschen wird. Als Elutionsmittel
dient 1-Amino-2-propanol. Dies ist aus Gründen der Arzneimittel
sicherheit nachteilig. Desweiteren sinkt die Ausbeute nach der
in der EP 0 396 022 beschriebenen Arbeitsweise, wenn Virusinak
tivierungsschritte durchgeführt werden. Dies ist aber bei
Verwendung von gepoolten Plasma zwingend erforderlich, um
Übertragung von Viren durch die Vitamin K-abhängigen Faktoren
zu verhindern (z. B. Hepatitis A bzw. B, HIV etc.).
Auch die bislang bekannten Anionenaustauscher oder Affinitäts-Chromatographie-Materialien
sind zwar geeignet, eine chromato
graphische Trennung der Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren
zu gewährleisten, jedoch ist es wünschenswert, Chromatographie-Materialien
verfügbar zu haben, die eine weitere Verbesserung
der Trennung von Vitamin K-haltigen Gerinnungsfaktoren aus
Blutplasma ermöglichen.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht
somit zum einen darin ein Verfahren anzugeben, mit dem eine
verbesserte Ausbeute von Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren
wie PPSB-Konzentraten, Protein C und S und Faktor IX-Fraktionen
ermöglicht wird und ein Chromatographie-Material bereitzustel
len, das in besonders guter Weise geeignet ist, Vitamin K-abhängige
Gerinnungsfaktoren aus entsprechenden Quellen her
stellbar zu machen.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird
gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1. Die Ansprüche 2
bis 9 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsge
mäßen Verfahrens. Ansprüche 10 und 11 sind gerichtet auf Vitamin
K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Produkte, die sich
durch hohe Reinheit und hohe spezifische Aktivität auszeichnen
und mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlich sind.
Anspruch 12 betrifft das im erfindungsgemäßen Verfahren an
wendbare Chromatographie-Material.
Erfindungsgemäß wird das die Vitamin K-abhängigen Faktoren
enthaltende Quelle mit einem Material versetzt, an dem die HAP-Liganden
über sogenannte Tentakel gebunden sind. Unter dem
Begriff Tentakel werden bestimmte Spacer verstanden, mit dem
Chromatographiematerial modifiziert ist, wie es in der
EP 0 337 144 beschrieben wird. Das mit HAP-Liganden modifizierte
Chromatographiematerial, das über Tentakel den Liganden gebunden
hat, zeigt neue Eigenschaften, die zur Lösung des der Erfindung
zugrunde liegenden Problems führen. Die kovalent über die
Tentakel an das Chromatographiematerial gebundenen HAP-Liganden
sind frei beweglich über die Tentakel an die Matrix gebunden.
Unter Verwendung dieses Materials ist es möglich, eine Chroma
tographie der Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren aus
unverdünntem Plasma durchzuführen und die Vitamin K-abhängigen
Gerinnungsfaktoren in hoher Ausbeute und Reinheit zu gewinnen.
Die erfindungsgemäß gewonnenen Fraktionen der Gerinnungsfaktoren
ergeben dann zusammen mit den Reinigungsschritten des erfin
dungsgemäßen Verfahrens hochreine Gerinnungsfaktorkonzentrate.
Die Figur zeigt nach Art eines Flußdiagramms den Ablauf des
erfindungsgemäßen Verfahrens mit bevorzugten Ausführungsformen
zur Herstellung des PPSB-Konzentrats sowie des Faktor IX-Kon
zentrats.
Erfindungsgemäß wird ausgehend von einer Vitamin K-abhängigen
Gerinnungsfaktoren enthaltenden Quelle, diese mittels Affini
täts-Chromatographie in die gewünschten Fraktionen aufgetrennt.
Dies erfolgt an einem mit 2-Hydroxyaminopropyl-Gruppen modifi
ziertem Material. Insbesonders bevorzugt ist hierbei ein Mate
rial, das erhältlich ist durch Kopplung von 2-Hydroxyamino
propyl-Gruppen an eine Matrix, die dann zu den sogenannten
Tentakel-Chromatographie-Materialien (Firma Merck) führt. Die
Modifizierung des Materials sowie das Material selbst werden
weiter unten charakterisiert.
Die Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Quelle
wird aus einer Lösung mit dem Affinitätsmaterial in Kontakt
gebracht, wobei die Lösung eine relativ geringe Ionenstärke
entsprechend 10 bis 150 mOsm aufweist. Dies erfolgt in besonders
einfacher Weise dadurch, daß man das Chromatographie-Material,
vorzugsweise in aufgeschlämmter Form, in eine Chromatographie-Säule
gibt und die Lösung mit der Vitamin K-abhängige Faktoren
enthaltenden Quelle in die Säule gibt. Die Ionenstärke wird so
eingestellt, daß die Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren
an dem Chromatographie-Material adsorbiert bleiben, wohingegen
andere Bestandteile aus der Chromatographiesäule ausgewaschen
werden. Gegebenenfalls kann nach dem Auftragen der Lösung
enthaltend die Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren mit einer
Lösung ähnlicher Ionenstärke, wie die zur Auftragung verwendet
wurde, gewaschen werden. Dann wird gemäß Schritt b) des erfin
dungsgemäßen Verfahrens eine Lösung höherer Ionenstärke mit dem
Chromatographie-Material in Kontakt gebracht. Dies führt dazu,
daß die an dem erfindungsgemäßen Chromatographie-Material
adsorbierten Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren von der
Oberfläche des Chromatographie-Materials desorbiert werden und
aus der Chromatographiesäule eluieren. Diese Fraktion enthält
die PPSB-Faktoren IX, II, X und VII und die Proteine C und S.
Diese Fraktion kann dann in an sich bekannter Weise zu einem
handelsfähigen PPSB-Präparat weiterverarbeitet werden kann.
Zur Isolierung von Faktor IX wird die gemäß Schritt b) eluieren
de Fraktion gesammelt und einer zweiten Chromatographie in Form
einer Heparin-Affinitäts-Chromatographie unterzogen. Die Hepa
rin-Affinitäts-Chromatographie ist als solche bekannt und in
D. Josic, F. Bal und H. Schwinn, Journal of Chromatography, 632
(1993) 1-10 näher beschrieben.
Um ein nach heutigem Standard einwandfreies Präparat zu erhal
ten, findet schließlich vorzugsweise zwischen Schritt b) und
c) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Virusinaktivierungs
schritt statt. Vorzugsweise wird eine Virusinaktivierung durch
chemische Behandlung mit Detergenzien und/oder einer Wärmebe
handlung durchgeführt. Als Detergenzien kommen nichtionische
Detergenzien in Frage. Diese werden kombiniert mit di-/trialkyl
substituierten Phosphaten, wie beispielsweise TNBP (Tri-N-Butyl-Phosphat).
Die zur Virusinaktivierung eingesetzten Detergenzien
können bis zu 20% eingesetzt werden. Der Wärmebehandlungs
schritt entspricht einem Pasteurisierungsschritt, vorzugsweise
in einem Temperaturbereich von 60 bis 65°C für 5 bis 30 Stunden,
insbesondere 8 bis 14 Stunden (WO 94/17834).
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah
rens kann sich eine zweite Virusinaktivierung dem Schritt c)
anschließen. Dies ist insbesondere dann zu empfehlen, wenn
zwischen dem Schritt b) und c) lediglich eine Virusinaktivierung
erfolgt. Insbesondere bevorzugt ist eine chemische Virusinak
tivierung zwischen Schritt b) und c) und eine physikalische
Virusinaktivierung, beispielsweise Wärmebehandlung, nach Schritt
c) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Wird eine zweite Virusinaktivierung nach dem Schritt c) des
erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt, empfiehlt sich eine
dritte chromatographische Reinigungsoperation, die entweder eine
zweite Heparin-Affinitäts-Chromatographie, eine Anionenaustau
scher-Chromatographie oder eine Chromatographie an dem in
Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beteiligten Träger
ist.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah
rens kann nach Schritt b) eine physikalische Virusinaktivierung
beispielsweise Wärmebehandlung durchgeführt werden. Vorzugsweise
schließt sich daran eine Zwischenreinigung an, die entweder eine
Anionenaustauscher-Chromatographie oder eine weitere Chromato
graphie an dem erfindungsgemäßen Träger gemäß Schritt a) des
erfindungsgemäßen Verfahrens ist. Danach kann eine Solvent/De
tergentinaktivierung (EP 131 740 A2) und eine Heparin-Affini
täts-Chromatographie erfolgen.
Als Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Quelle
kommen insbesondere Blutplasma oder Cryopoorplasma oder Zellkul
turüberstände oder andere die Vitamin K-abhängigen Gerinnungs
faktoren enthaltende Lösungen in Frage.
Je nach Zustand der Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren
enthaltenden Quelle kann sich eine Filtration an bioverträgli
chen Materialien empfehlen. Als Filter kommen insbesondere
Filter mit Porengrößen zwischen 0,5 und 2,0 µm in Betracht.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Vitamin
K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Konzentrate herstel
len. Das Faktor IX- und das PPSB-Konzentrat weist gegenüber den
aus dem Stand der Technik bekannten Konzentraten eine höhere
Reinheit auf und sind damit neue Verbindungen. Weiterhin liegen
die Proteine C und S im PPSB-Konzentrat mit einer spezifischen
Aktivität von 8 bis 10 U/mg vor. Somit erhält man eine geeignete
Ausgangsfunktion für die Herstellung eines neuen hochreinen
Protein C und S-Konzentrats.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare erfindungsgemäße
Chromatographie-Material ist erhältlich durch Modifizierung
sogenannter Tentakel-Materialien mit der 2-Hydroxyaminopropyl-Gruppe
(HAP) als Liganden. Das erfindungsgemäße Chromatographie-Material
weist auf der Grundmatrix, dem Trägermaterial, einen
hydrophilen beweglichen Arm (Spacer) auf. An diesem Arm ist die
HAP-Gruppe gebunden. Es zeigt sich überraschenderweise, daß mit
der Verwendung des erfindungsgemäßen Chromatographie-Materials
die Reinigung der Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren aus
entsprechenden Quellen mit hoher Reinheit und Ausbeute möglich
ist.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher er
läutert.
Die Beispiele 1 und 2 betreffen einen Vergleich zwischen dem
aus der EP 0 396 022 beschriebenen Chromatographie-Material mit
dem erfindungsgemäßen Chromatographie-Material bei sonst authen
tischen Bedingungen, die denen der EP 0 396 022 nachempfunden
waren. Dabei betrifft Beispiel 1 die Verwendung des erfindungs
gemäßen Materials und Beispiel 2 die Verwendung des aus EP
0 396 022 beschriebenen Materials.
Eine 10 ml Säule mit einem 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden, der
über Tentakelarm an die Matrix gebunden ist, wird mit 60 ml
Puffer A mmol/l Citrat, 10 mmol/l NaHPO₄, 100 mmol/l NaCl, pH
7,5) äquilibriert.
200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von
100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A gewaschen. Der
Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,8 mol/l NaCl
enthält, eluiert. 30% des Faktors IX befinden sich im Durch
lauf, während 50% mit 0,8 mol/l NaCl eluiert werden. Die spezi
fische Aktivität des Faktors IX beträgt 6,5 U/mg. Die Anreiche
rung des Protein C beträgt im 0,8 mol/l NaCl-Eluat 30% und des
Protein S 20% der Ausgangsmenge.
Eine 10 ml Säule mit einer 2-Mydroxyaminopropyl-Liganden tragen
den Matrix, bestehend aus einem Copolymerisat von Glycidyl
methacrylat, Pentaerythrol-dimethacrylat und Polyvinylalkohol
(Toyopearl TSK-Amino, TosoHaas) wird mit 60 ml Puffer A
(10 mmol/l Citrat, 10 mmol/l NaHPO₄₁ 100 mmol/l NaCl, pH 7,5)
äquilibriert.
200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von
100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A gewaschen. Der
Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,5 mol/l NaCl
enthält, eluiert. 75% des Faktors IX befinden sich im Durch
lauf, während 13% mit 0,5 mol/l NaCl eluiert werden. Die spe
zifische Aktivität des Faktors IX beträgt 7 U/mg. Die Anreiche
rung des Protein C beträgt im 0,5 mol/l NaCl-Eluat lediglich
2% der Ausgangsmenge, während Protein S nicht nachweisbar ist.
Das Beispiel 3 zeigt das Ergebnis, das sich bei Verwendung des
erfindungsgemäßen Materials im erfindungsgemäßen Verfahren ein
stellt unter veränderten Puffer und Elutionsbedingungen, wobei
Beispiel 3 eine erfindungsgemäße Optimierung und Beispiel 4
zeigt welches Ergebnis mit dem konventionellen Material bei
Anwendung der erfindungsgemäßen optimierten Bedingungen zu
erreichen ist.
Eine 10 ml Säule mit einem 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden, der
über Tentakelarm an die Matrix gebunden ist, wird mit 60 ml
Puffer A (20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert.
200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von
100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A, der 0,15 mol/l
NaCl enthält, gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit
Puffer A, der 0,8 mol/l NaCl enthält, eluiert. 18% des Faktors
IX befinden sich im Durchlauf, während 75% mit 0,8 mol/l NaCl
eluiert werden. Die spezifische Aktivität des Faktors IX beträgt
7 U/mg. Die Anreicherung des Protein C beträgt im 0,8 mol/l
NaCl-Eluat 50% und die des Protein S 30% der Ausgangsmenge.
Eine 10 ml Säule mit einer 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden tragen
den Matrix, bestehend aus einem Copolymerisat von Glycidyl
methacrylat, Pentaerythrol-dimethacrylat und Polyvinylalkohol
(Toyopearl TSK-Amino, TosoHaas) wird mit 60 ml Puffer A
(20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert.
200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von
100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A gewaschen. Der
Faktor IX wird anschließend mit Puffer A, der 0,5 mol/l NaCl
enthält, eluiert. 61% des Faktors IX befinden sich im Durch
lauf, während 32% mit 0,5 mol/l NaCl eluiert werden. Die spezi
fische Aktivität des Faktors IX beträgt 6 U/mg. Die Anreicherung
des Protein C beträgt im 0,5 mol/l NaCl-Eluat 5% und die des
Protein S 1% der Ausgangsmenge.
Der Vergleich der Beispiele 3 und 4 zeigt, daß mit der Verwen
dung des erfindungsgemäßen Materials überraschenderweise eine
Verdoppelung der Ausbeute an Faktor IX zu erzielen ist. Gleich
zeitig und im Unterschied zum Verfahren gemäß Stand der Technik
werden in dieser Fraktion das Protein C und S mit angereichert.
In Beispiel 5 ist eine andere Optimierung mit dem erfindungsge
mäßen Material dargestellt. In Beispiel 6 sind die Auftrage- und
Waschbedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens mit
Trägermaterial gemäß Stand der Technik durchgeführt worden.
Eine 250 ml Säule mit einem 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden, der
über Tentakelarm an die Matrix gebunden ist, wird mit 2000 ml
Puffer A (20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert.
5000 ml Cryopoorplasma werden aufgetragen und mit 750 ml Puffer
A gewaschen. Dann wird mit 2000 ml Puffer A, der 0,15 mol/l NaCl
enthält, gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit Puffer
A, der 0,8 mol/l NaCl, 0,1% Aminosäuren, wie Lysin, 0,1%
Arginin enthält, eluiert. Der Faktor IX dieser Fraktion besitzt
eine spezifische Aktivität von 8 U/mg. Die Ausbeute an Faktor
IX beträgt 85% der Ausgangsaktivität im Cryopoorplasma. In
dieser Fraktion ist das Protein C zu 55% und das Protein S zu
40% der Ausgangsmenge enthalten.
Das Eluat wird gegen 20 mmol/l Citratpuffer, pH 7,0 diafil
triert, bis eine Osmolarität von 200 mOsmol erreicht ist. Die
Lösung wird mit 1% Tween und 0,3% TNBP versetzt und 7 Stunden
bei 25°C inkubiert.
Eine 500 ml Heparin-Sepharose (Pharmacia) wird mit 1500 ml
Puffer A äquilibriert. Das Faktor IX-Eluat wird aufgetragen und
mit 1000 ml Puffer A gewaschen. Anschließend eluiert man den
Faktor IX mit einem linearen Gradienten von 0-1 mol/l NaCl in
Puffer A. Die Fraktionen mit einer spezifischen Faktor IX-Aktivität
über 200 werden gepoolt, mit Stabilisatoren versetzt
und pasteurisiert. Danach erfolgt mit der verdünnten Lösung eine
zweite Heparin-Chromatographie. Man erhält ein doppelt virusin
aktiviertes Faktor IX-Konzentrat mit einer spezifischen Akti
vität von <200 U/mg, bei einer Ausbeute von 40% aus Plasma.
Eine 10 ml Säule mit einer 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden tragen
den Matrix, bestehend aus einem Copolymerisat von Glycidyl
methacrylat, Pentaerythrol-dimethacrylat und Polyvinylalkohol
(Toyopearl TSK-Amino, TosoHaas) wird mit 60 ml Puffer A
(20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert.
200 ml Cryopoorplasma werden mit einer linearen Flußrate von
100 cm/h aufgetragen und dann mit 50 ml Puffer A, der 0,15 mol/l
NaCl enthält, gewaschen. Der Faktor IX wird anschließend mit
Puffer A, der 0,5 mol/l NaCl enthält, eluiert. Im Säulendurch
lauf befinden sich 50% der Faktor IX-Menge. Im Wash mit
0,15 mol/l NaCl sind weitere 38% zu finden. Im 0,5 mol/l NaCl-Eluat
waren lediglich 5% Ausbeute an Faktor IX zu finden.
Beispiel 6 macht deutlich, daß die Verwendung des konventionel
len Materials entscheidende Nachteile mit sich bringt, da sich
die Hauptmenge an Faktor IX im Durchlauf und in der Waschfrak
tion befinden. Der Faktor IX und auch die anderen Vitamin K-abhängigen
Gerinnungsfaktoren binden an das Chromatographiemate
rial gemäß Stand der Technik nur ungenügend, wenn sie aus
viskosen Lösungen wie z. B. unverdünntem Plasma oder aus Lösungen
mit hoher Ionenstärke aufgereinigt werden sollen.
Beispiel 7 betrifft die Herstellung eines PPSB-Konzentrats unter
Verwendung des erfindungsgemäßen Gels. Als sogenannter Capture-Schritt
wurde eine Chromatographie des Cryopoorplasmas mit Q-Sepharose-FastFlow
durchgeführt. Mit diesem Zwischenprodukt
wurde dann eine Chromatographie mit dem erfindungsgemäßen
Chromatographie-Material durchgeführt. Der Capture-Schritt kann
auch mit anderen Gel-Materialien, die starke Anionenaustauscher
eigenschaften aufweisen, eingesetzt werden.
Eine 200 ml Säule mit Q Sepharose FF (Pharmacia) wird mit Puffer
A (0,005 mol/l NaHPO₄, pH 6) äquilibriert.
5000 ml Cryopoorplasma werden mit einer Flußrate von 100 cm/h
aufgetragen und mit 500 ml Puffer A gewaschen. Danach wird die
Säule mit 500 ml Puffer A, der 0,05 mol/l NaCl enthält, gewa
schen. Anschließend wird mit Puffer A, der 0,4 mol/l NaCl ent
hält, eluiert. Diese Fraktion wird gegen 25 mmol/l Citrat, pH
7 dialysiert bis die Osmolarität 150 mOsm beträgt. Der Lösung
werden 1% Tween und 0,3% TNBP zugemischt und 8 Stunden bei
25°C inkubiert.
Eine 50 ml Säule mit einem 2-Hydroxyaminopropyl-Liganden, der
über Tentakelarm an die Matrix gebunden ist, wird mit 2000 ml
Puffer B (20 mmol/l Citrat, pH 7,5) äquilibriert. Das Eluat der
Q-Sepharose wird auf die Säule aufgetragen und mit 300 ml Puffer
B gewaschen. Anschließend wird mit 250 ml Puffer B, der
0,1 mol/l NaCl enthält, gewaschen und danach mit Puffer B, der
0,8 mol/l NaCl, 0,1% Lysin, 0,1% Arginin enthält, eluiert.
Man erhält eine Fraktion, die die PPSB-Faktoren IX, II, X und
IX mit einer spezifischen Aktivität von 7 U/mg enthält. Die
Gesamtausbeute für die PPSB-Faktoren liegt bei 54%. Zusätzlich
liegen in dieser Fraktion das Protein C und S mit einer Ausbeute
von 40% bzw. 35% vor.
Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Material
führen überraschenderweise zu einer Isolierung des Faktors IX
zusammen mit Protein C und S, wobei dies direkt aus Plasma
erfolgen kann. Bei den aus dem Stand der Technik bekannten HAP-Materialien
befindet sich jedoch der Hauptanteil der Proteine
C und S im Säulendurchbruch.
Claims (12)
1. Verfahren zur Reinigung Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfak
toren durch Affinitäts-Chromatographie, wobei, ausgehend
von einer die Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren
enthaltenden Quelle, Fraktionen dieser Quelle
- a) einer Chromatographie an einem mit an Spacern mit mehr als 3 C-Atomen gebundenen 2-Hydroxyaminopropyl- Gruppen modifizierten Material unterzogen wird, wobei die Quelle aus einer Lösung aufgetragen wird, deren Ionenstärke so gewählt wird, daß die Vitamin K-ab hängigen Gerinnungsfaktoren an dem Anionenaustaus cher-Material adsorbiert werden, gegebenenfalls mit einer entsprechenden Pufferlösung gewaschen wird, dann nach Abtrennung des Eluats,
- b) eine Pufferlösung höherer Ionenstärke als diejenige des Schrittes a) mit dem Affinitäts-Chromatographie material in Kontakt gebracht wird, so daß die Vitamin K-abhängigen Faktoren eluieren, dann die Fraktion entweder zu einem PPSB-Präparat weiter verarbeitet werden oder diese Faktoren enthaltenden Fraktionen gesammelt werden und danach diese Fraktionen,
- c) einem zweiten Chromatographieschritt in Form einer Heparin-Affinitäts-Chromatographie unterzogen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwischen Schritt b) und
c) eine Virusinaktivierung stattfindet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Virusinaktivierung
durch Behandlung der die Vitamin K-abhängigen Faktoren
enthaltenden Fraktionen mit nicht ionischen Tensiden in
Gegenwart von Di- oder Trialkylphosphaten mit oder ohne
Wärmebehandlung erfolgt.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei zwischen Schritt b) und c) eine Chromatographie an
einem Anionenaustauscher oder eine Chromatographie ent
sprechend Schritt a) des Anspruchs 1 durchgeführt wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4,
wobei nach dem Schritt c) des Anspruchs 1 eine weitere
Virusinaktivierung erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der zweite Virusinak
tivierungsschritt eine Wärmebehandlung beinhaltet.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei nach der zweiten
Virusinaktivierung eine dritte chromatographische Reini
gungsoperation erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die dritte chromatographi
sche Reinigungsoperation eine Heparin-Affinitäts-Chromato
graphie, Anionenaustauscher-Chromatographie oder eine
Chromatographie entsprechend Schritt a) des Anspruchs 1
ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die
Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren enthaltende Quelle
Blutplasma, Cryopoorplasma ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vitamin K-abhängige
Gerinnungsfaktoren enthaltende Quelle vor dem Schritt a)
des Anspruchs 1 einer Filtration unterworfen wird.
11. PPSB-Fraktion erhältlich durch Sammeln der Fraktionen nach
Durchführung des Schrittes b) gemäß Anspruch 1.
12. Faktor IX erhältlich durch Sammeln der Fraktionen nach
Durchführung des Schrittes c) des Anspruchs 1.
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