ES2250544T3 - Procedimiento para la purificacion de proteinas de interferon por cromatografia de intercambio cationico. - Google Patents
Procedimiento para la purificacion de proteinas de interferon por cromatografia de intercambio cationico.Info
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Abstract
Un procedimiento para la purificación de proteínas de interferón que consiste en llevar a cabo una cromatografía de intercambio catiónico en una matriz sólida a un pH más básico que el pH correspondiente al punto isoeléctrico, pI, de las proteínas que se deben purificar, pH al cual dichas proteínas permanecen todavía absorbidas, y eluir dichas proteínas aumentando la fuerza iónica y/o el pH de las soluciones tampón acuosas.
Description
Procedimiento para la purificación de proteínas
de interferón por cromatografía de intercambio catiónico.
Gran parte de las ciencias biomédicas se basan en
el uso de proteínas farmacológicamente activas tanto de origen
natural, obtenidas por medio de técnicas extractivas, como de origen
sintético, obtenidas mediante técnicas de ADN recombinante. El nivel
de pureza de los productos de interés es importante en ambos casos,
ya que comprender su actividad está determinado por la posibilidad
de unir exclusivamente el efecto biológico con la presencia de una
cantidad fija de proteína.
En este contexto, los procedimientos de
purificación de proteínas activas farmacológicamente han conseguido
una parte importante ya que la pureza de la proteína fabricada es de
importancia notable si están implicados principios activos o
excipientes contenidos en especialidades medicinales. La posibilidad
de causar efectos tóxicos y/o producir efectos adversos durante la
terapia ha hecho, en efecto, que las autoridades responsables del
registro y la autorización para la comercialización de las medicinas
basadas en proteínas introduzcan normas cada vez más estrictas para
determinar la calidad y la regularidad de comercialización de los
principios activos de origen proteico contenidos en las medicinas
comercializadas.
De lo anterior se deduce claramente la
importancia de los procedimientos de purificación de las proteínas,
en los que la principal dificultad reside en el hecho de que las
proteínas activas farmacológicamente están siempre en mezclas
compuestas junto con muchas otras proteínas.
Este hecho es cierto tanto en el caso de que se
usen fuentes naturales para la extracción de la proteína activa
farmacológicamente, como por ejemplo sangre, extractos de órganos
animales o vegetales, como en el caso de que se usen técnicas de ADN
recombinante ya que las proteínas muestran propiedades
químico-físicas similares entre ellas,
independientemente de su origen.
Por lo tanto de lo anterior resulta que, en el
caso de purificaciones de proteínas activas farmacológicamente, debe
ser aislada con un alto grado de pureza una proteína mezclada junto
con otras proteínas con propiedades similares y a menudo más
cantidad de la proteína buscada extremadamente abundante.
El trabajo es muy riguroso y se usan normalmente
varias etapas de purificación para conseguir los niveles de pureza
buscados. Los procedimientos de purificación llegan a ser de este
modo muy complejos y el éxito de una fabricación industrial de una
proteína está unido fundamentalmente al rendimiento del
procedimiento de purificación ya que este último determina
ampliamente los costes de fabricación.
Se usan muchas técnicas para la purificación de
proteínas como, por ejemplo, precipitaciones selectivas en
disolventes acuosos y orgánicos o con agentes caotrópicos;
separaciones por medio de filtraciones y/o diálisis; procedimientos
de inmunoprecipitación con anticuerpos adecuados; procedimientos
cromatográficos. Estos últimos han conseguido en los últimos años en
gran medida la mayor importancia principalmente porque permiten
obtener los grados de pureza requeridos, según se menciona en
Regnier F. E. en J. Chromatogr. 418, 115-143,
(1987).
Se citan muchas técnicas en la bibliografía
científica y pueden clasificarse según los mecanismos de acción
aplicados para la separación de proteínas como, por ejemplo,
separación según el peso molecular, absorción en matrices polares,
también llamada en fases estacionarias normales, absorción en
matrices no polares, llamada en fases estacionarias inversas,
absorción por afinidad selectiva con ligandos unidos a matrices
inertes, como metales pesados como cobre, cinc, hierro y platino,
tintes químicos como azul brillante, proteínas como proteína A y
proteína G, carbohidratos como los polisacáridos y los
glucosaminoglicanos, absorción por inmunoafinidad con anticuerpos
específicos unidos a matrices inertes, absorción por interacción
iónica con ligandos cargados electrostáticamente unidos a matrices
inertes.
La selectividad, es decir, la capacidad para
reconocer selectivamente la proteína buscada, el coste y la
posibilidad de usarse a nivel industrial, se usan como parámetros
para evaluar las actuaciones de las diferentes técnicas
cromatográficas.
Según estos parámetros, se considera que la
cromatografía por inmunoafinidad garantiza la mayor selectividad,
pero muestra inconvenientes como elevados costes de uso, riesgos de
desnaturalización del anticuerpo y riesgos relacionados con la
seguridad final del producto purificado al ser el anticuerpo de
origen animal.
La cromatografía que usa la interacción iónica,
también llamada cromatografía de intercambio iónico, se considera la
técnica menos arriesgada para mantener la actividad farmacológica de
las proteínas y la más fácil de llevar a cabo de manera industrial
con bajos costes de fabricación pero muestra el inconveniente de ser
muy poco selectiva.
Por lo tanto, sería muy ventajoso encontrar
condiciones de ejecución de una cromatografía de intercambio iónico
que aumenten su selectividad de modo que la hagan más competitiva
con las otras técnicas desde el punto de vista de la pureza del
producto obtenido.
La cromatografía de intercambio iónico se lleva a
cabo usualmente usando columnas de varios tamaños, rellenas con
matrices sólidas que contienen grupos químicos que, permanentemente
o bajo condiciones particulares, están cargados
electrostáticamente.
Un compuesto puesto en una columna de intercambio
iónico interacciona por medio de la atracción/repulsión de Coulomb
con las cargas unidas a la matriz. Los diferentes compuestos
contenidos en una mezcla serán capaces de unirse ellos mismos a la
fase estacionaria en función de la cantidad de la carga que posean y
por consiguiente se mantendrán más o menos, para definir su
separación a la salida de la columna.
La cromatografía se llama cromatografía de
intercambio catiónico si las cargas de la matriz son negativas,
porque los cationes se mantienen, mientras que se llama
cromatografía de intercambio aniónico si las cargas de la matriz son
positivas.
Las proteínas son compuestos que tienen elevado
peso molecular, mayor de 10.000 Daltons, hechas de polímeros
heterogéneos de aminoácidos; algunos aminoácidos tienen en su cadena
lateral grupos funcionales que pueden ionizarse en función del pH de
la solución de manera negativa, aminoácidos acídicos, o de manera
positiva, aminoácidos básicos y por lo tanto todas las proteínas
poseen un gran número de cargas negativas y positivas. El punto
isoeléctrico, pI, de una proteína es el pH al cual la proteína es
neutra porque la contribución de las cargas negativas es igual que
la de las cargas positivas; una proteína puesta en un campo
electrónico al pI no es atraída por ninguna de las polaridades del
campo eléctrico.
El número de las cargas negativas aumenta a pH
mayores que el pI y la proteína consigue una carga negativa neta
mientras ocurre lo contrario a pH menores que el pI y la proteína
consigue una carga positiva neta. Cada proteína tiene su propio pI
característico el cual la distingue de las otras y muchas proteínas
tienden a llegar a ser insolubles en el punto isoeléctrico.
Si una proteína se encuentra en una solución a un
pH menor que el pI tiene una carga positiva neta y por lo tanto
puede interaccionar con una matriz cargada negativamente y puede
someterse a una cromatografía de intercambio catiónico mientras la
proteína puede someterse a una cromatografía de intercambio aniónico
a pH mayores que su pI, según se menciona en Regnier F. E., Science
238, 319-323, (1987) y en Yamamoto S. y
colaboradores, Chromatographic Science Series, 43,
(1988), Marcel Dekker, Inc. Publisher, Nueva York.
Por el contrario hemos visto, sorprendentemente,
y en este hecho se basa el objeto de la presente invención, que es
posible encontrar un intervalo de valores de pH más elevados que el
correspondiente pI de la proteína a cuyo pH las proteínas permanecen
todavía absorbidas en matrices de cromatografía de intercambio
catiónico de modo que todavía es posible llevar a cabo las
cromatografías de intercambio catiónico. Dicha situación es
importante en particular porque se consigue una elevada selectividad
entre las proteínas bajo estas condiciones ya que también
diferencias muy pequeñas de pI entre proteínas llegan a ser
suficientes para obtener separaciones significativas permitiendo así
un elevado rendimiento de purificación.
Este último aspecto es importante en particular
en los procedimientos de purificación de proteínas recombinantes en
los que el producto buscado se acompaña a menudo de impurezas
correlacionadas, es decir, hechas de muchos pequeños cambios
estructurales del producto, como, por ejemplo, diferentes estados de
oxidación, acetilaciones, pérdida de funciones amídicas, etcétera.
También es muy difícil eliminar este tipo de impurezas por medio de
cromatografías de inmunoafinidad ya que, en la mayoría de los casos,
los anticuerpos no son capaces de distinguirlas.
El mecanismo que puede explicar que se encuentre
un fenómeno basado en el hecho de que la distribución de las cargas
a lo largo de la superficie externa de las proteínas no sea uniforme
de modo que también, si el pH es un poco más elevado que el pI y la
proteína tiene una carga negativa neta total, haya todavía algunas
cargas positivas localizadas en la molécula que puedan interaccionar
con una fase estacionaria negativa.
Para hacer efectivo este mecanismo es importante
que el exceso de cargas negativas no sea demasiado acentuado, si no
los campos eléctricos creados desde las cargas negativas podrían
también elevarse para prevenir la interacción de la misma proteína
con la matriz cromatográfica cargada negativamente.
Por otra parte, es necesario que la fuerza iónica
de las soluciones usadas como eluyentes se controle adecuadamente ya
que una fuerza iónica elevada tendría el efecto de proteger la
proteína para prevenir su interacción con la fase estacionaria.
Lampson G. P. y colaboradores, Anal.
Biochem. 11, 374-377, (1965), informan del
caso de proteínas como la gamma globulina humana, ribonucleasa,
hemoglobina, delta quimotripsina, globina y lisozima en las que
haciendo pequeñas variaciones de pH pero manteniendo una fuerza
iónica demasiado elevada, dada por una solución de fosfatos 0,1 M,
ocurre la elución en cromatografías de intercambio catiónico a un pH
casi 0,4 unidades por debajo del pI.
El principio anteriormente mencionado, en el que
se basa la presente invención, nunca se ha usado, según el
conocimiento de los inventores, para llevar a cabo procedimientos
eficaces de purificación de proteínas.
La posibilidad de usar las diferencias del punto
isoeléctrico de las proteínas para optimizar los procedimientos de
purificación descritos por Kontturi A. K. y colaboradores,
Acta Chem. Scand., 50 (2), 102-106. (1996) se
refiere en efecto al uso convencional de la cromatografía de
intercambio iónico en el que la cromatografía de intercambio
catiónico se lleva a cabo siempre a un pH más bajo que el punto
isoeléctrico, mientras que la cromatografía de intercambio aniónico
se lleva a cabo a un pH más elevado que el punto isoeléctrico. El
procedimiento descrito en la presente solicitud de patente es tal
que las cromatografías de intercambio catiónico se llevan a cabo por
el contrario a un pH más elevado que el punto isoeléctrico de la
proteína.
El procedimiento descrito en la presente
solicitud de patente puede considerarse de naturaleza general como
se muestra en los ejemplos presentados en los que se ha demostrado
cómo se aplica satisfactoriamente tanto a una proteína de origen
natural como a una proteína de ADN recombinante. La diferencia entre
proteína y proteína está en la extensión del intervalo del campo del
pH, más elevado que el pI, útil para la purificación de la proteína
de interés. En efecto, por ejemplo, como se mostrará en los ejemplos
siguientes, dicho intervalo es de aproximadamente 0,2 unidades de pH
en el caso de las proteínas interferón mientras que es de
aproximadamente una unidad de pH en el caso de la albúmina.
La solicitud de la presente invención para la
purificación de un interferón alfa recombinante (rIFN\alpha) cuyo
punto isoeléctrico es 5,9, según se menciona en Thatcher D. y
Panayotatos N., Methods Enzymol. 119,
166-177, (1986), se presentará entre los ejemplos y
se mostrará cómo es posible y ventajoso purificarlo en intercambio
catiónico a un pH de 6,1. Por otra parte se mostrará el ejemplo de
la albúmina sérica humana cuyo pI es 4,9, según se menciona en
Rylatt D. B. y colaboradores, J. Chromatogr., 865,
145-153, (1999) y se mostrará cómo es posible y
ventajoso purificarla en intercambio catiónico a un pH de 6,0.
Las ventajas del procedimiento objeto de la
presente invención destacan mucho si se comparan con los resultados
de los procedimientos descritos en publicaciones científicas y/o
patentes dirigidas a la purificación de \alpha interferón y de
albúmina sérica humana, procedimientos que usualmente requieren tres
o más tratamientos posteriores, hecho que provoca un coste
industrial elevado y una disminución de los rendimientos.
Thatcher D. y Panayotatos N. describen la
purificación del interferón alfa recombinante humano
rIFN-\alpha2, Methods Enzymol., 119,
166-177 (1986) a través de cinco tratamientos
posteriores: a) cromatografía de intercambio catiónico; b)
cromatografía de intercambio aniónico; c) cromatografía por afinidad
a metales pesados; d) tratamiento con una solución saturada de
sulfato amónico; e) cromatografía de exclusión molecular.
La patente europea 0.108.585 describe, para la
purificación del interferón, el uso posterior de tres tipos de
cromatografía: a) inmuno afinidad; b) intercambio catiónico; c)
exclusión molecular.
La patente de EE.UU. 4.765.903 describe, en la
purificación del interferón, el uso secuencial de cuatro tipos de
cromatografía: a) inmuno afinidad con un anticuerpo monoclonal; b)
fase inversa; c) intercambio catiónico; d) exclusión molecular.
La patente europea 0.679.718 describe un
procedimiento para la producción de interferón alfa que plantea las
siguientes cuatro etapas cromatográficas: a) quelación de metal; b)
intercambio catiónico; c) intercambio aniónico; d) filtración en
gel.
Otras publicaciones y patentes describen tres o
más tratamientos necesarios para la purificación de las proteínas
interferón, por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.732.683, la
solicitud de patente internacional WO 8.604.067 y la publicación de
Khan F. R. y Rai V. R., Bioprocess Technol., 7,
161-169, (1990).
Los ejemplos citados tratan la materia más
relevante presentada sobre la purificación de interferón en general
y de alfa interferón en particular. Ellos muestran cómo la
purificación de este último es particularmente difícil y requiere
muchas etapas de purificación. Por otro lado se ha destacado cómo
niveles de purificación elevados son obtenidos en particular por
medio de cromatografías de inmunoafinidad usando anticuerpos
monoclonales de origen murino. Sin embargo, la presencia de una
técnica cromatográfica tal dentro de los procedimientos de
producción industrial dirigida a la fabricación de los principios
activos para uso farmacéutico en humanos provoca el riesgo de
posibles contaminaciones virales de virus de origen murino por la
presencia de posibles fragmentos inmunogénicos que proceden de
inmunoglobulinas murinas en el producto final y por las dificultades
para validar las matrices cromatográficas desde el punto de vista
industrial.
Por otro lado, a partir de los ejemplos
ilustrados brevemente, la cromatografía de intercambio catiónico
resulta ser ampliamente usada pero nunca como única técnica
separativa ya que sus interpretaciones se limitan con relación al
incremento de los niveles de pureza.
Las publicaciones de Babu K. R. y
colaboradores, Appl. Microbiol. Biotechnol., 53 (6),
655-660, (2000) y Bouyon R. y colaboradores,
Biotecnología aplicada, 14, 189-192, (1997),
describen los procedimientos de purificación de alfa interferón en
una etapa por medio de cromatografía de intercambio iónico en
gradiente salino. Sin embargo, en ambos casos para obtener un
producto suficientemente puro los autores tienen que aislar sólo
algunas de las fracciones cromatográficas que contienen el alfa
interferón para obtener rendimientos muy bajos, hasta un 7,5%
mínimo. Por otro lado, los procedimientos de purificación descritos
de cromatografía en gradiente salino no son aptos para usarse a
nivel industrial.
Se describen también muchas técnicas de
purificación cromatográfica en el caso de la albúmina humana que
parten de preparaciones de albúmina obtenida por fraccionamiento del
suero humano o por medio de técnicas de ADN recombinante, técnicas
complejas y apenas transferibles a nivel industrial que confirman
cómo el problema de una purificación eficaz de albúmina humana,
tanto de origen natural como recombinante, existe todavía.
Las patentes de EE.UU. 6.150.504 y 5.521.287
describen la purificación de la albúmina por medio de cromatografía
de intercambio iónico e interacción hidrófoba. El esquema de
purificación descrito en la patente de EE.UU. 6.034.221 concibe la
purificación de albúmina por medio de dos etapas cromatográficas, un
procedimiento de ultrafiltración y dos etapas más de purificación
cromatográfica.
Se usan procedimientos menos convencionales de
purificación de albúmina en los que las cromatografías de
intercambio aniónico en lecho fluido o las cromatografías por
afinidad interaccionan con matrices disponibles comercialmente como
Streamline®, o preparadas de forma adecuada, como partículas de
circonio modificadas o emulsiones de perfluoro hidrocarburos,
descritos en la patente de EE.UU. 5.962.649 y en las publicaciones
de Sumi A. y colaboradores, Bioseparation, 8
(1-5), 195-200, (1999), Mullick
A. y Flickinger M. C., Biotechnol. Bioeng., 65 (3),
282-290, (1999) y Mc Creath G. E. y
colaboradores, J. Chromatogr., 597 (1-2),
189-196, (1992).
Por último, también se han descrito técnicas de
purificación de albúmina en metales pesados en Yang L. y
colaboradores, Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao, 16 (1),
74-77, (2000) y se han descrito técnicas de afinidad
en matrices a cuyas moléculas se han unido tintes como azul Cibacron
F3G de Compagnini A. y colaboradores, J. Chromatogr. A.,
736 (1-2), 115, (1996).
El documento US 6.194.553 describe el
procedimiento para la purificación del inhibidor de la
alfa-1 proteinasa usando cromatografía de
intercambio catiónico en una matriz sólida en la que se lleva a cabo
la cromatografía de intercambio catiónico a un pH más básico que el
pH correspondiente al punto isoeléctrico.
El documento EP 0.203.382 describe un
procedimiento para la purificación de alfa interferón usando
cromatografía de intercambio catiónico a un pH de 4,5 a 5,0.
Todas estas técnicas muestran de diversas maneras
los problemas de complejidad de realización y de elevados costes de
modo que no se resuelve el problema de individualizar nuevos
procedimientos de purificación de proteínas farmacológicamente
activas que sean posibles desde un punto de vista industrial fácil y
eficiente y económicamente ventajosos.
La invención anteriormente descrita da una
respuesta a estos importantes requisitos proporcionando un
procedimiento para la purificación de proteínas interferón de fácil
explotación industrial y de bajo coste con ventajas económicas
destacables.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación de proteínas de interferón que
consiste en llevar a cabo una cromatografía de intercambio catiónico
en una matriz sólida a un pH más básico que el pH que corresponde al
punto isoeléctrico, pI, de las proteínas a purificar, pH al cual
dichas proteínas permanecen todavía absorbidas, y eluir dichas
proteínas al aumentar la fuerza iónica y/o el pH de las soluciones
tampón acuosas.
El rendimiento eficaz de la presente invención
requiere la individualización de la correcta combinación entre la
matriz cromatográfica usada, el valor del pH más elevado que el pI y
la fuerza iónica usada en los eluyentes cromatográficos ya que, una
vez definida la matriz cromatográfica, pueden obtenerse
purificaciones eficaces a menudo, haciendo variaciones limitadas de
pH y/o fuerza iónica de décimas de unidades de pH y/o variaciones de
fuerza iónica de algunos cientos de \muS.
Pueden usarse todas las matrices sólidas
funcionales usadas comúnmente como fases estacionarias para
cromatografías de intercambio catiónico, sin embargo, en particular,
las fases estacionarias llamadas de intercambio catiónico fuerte se
han preferido si el pI de la proteína a purificar es menor de 6
mientras que pueden usarse sin excepción fases estacionarias con
intercambio catiónico tanto fuerte como débil para proteínas que
tienen el pI más elevado que 6. Dichas fases estacionarias pueden
tener matriz silícea o polimérica, funcionalizada por medio de
grupos sulfónicos o carboxílicos tanto bajo forma de protón o sales
alcalinas. Pueden usarse fases estacionarias disponibles
comercialmente como, por ejemplo, Source® S (Pharmacia Biotech),
Sepharose® SP-Flujo rápido, Sepharose®
SP-Alto rendimiento, Sepharose®
SP-XL (Pharmacia Biotech), Fractogel® S (Merck,
Darmstadt), Mustang® S (Pall Corporate), CM Sepharose® FF (Pharmacia
Biotech), Dowex®, Bio-Rad® AG
(Bio-Rad), Poros® S (PerSeptive Biosystems),
Shodex®-S, Toyopearl® SP (Tosohass).
El intervalo de valores de pH al cual se puede
llevar a cabo la presente invención eficazmente es muy amplio,
dependiendo de los puntos isoeléctricos de las proteínas interferón
que tienen que purificarse y está comprendido entre 2 y 11,
preferentemente entre 4 y 8,5.
La extensión del intervalo de valores de pH más
elevados que el pI dentro del cual se aplica el procedimiento
descrito en la presenta invención puede variar desde valores de pH
que corresponden al pI de las proteínas interferón a una unidad de
pH sobre dicho pI, mostrando diferencias destacables de proteína a
proteína.
Por ejemplo, se ha descubierto que, en el caso
del interferón alfa 2b recombinante
(rIFN\alpha-2b), es posible obtener la absorción
de la proteína en una matriz de intercambio catiónico hasta 0,2
unidades de pH sobre su pI de 5,9 y por consiguiente es posible
llevar a cabo su purificación por medio de una cromatografía de
intercambio catiónico, mientras se ha descubierto, en el caso de la
albúmina sérica humana (ejemplo comparativo) que la proteína
permanece absorbida hasta una unidad de pH sobre su pI.
El intervalo de las concentraciones salinas de
las soluciones acuosas empleadas como eluyentes utilizables
eficazmente depende del tipo de proteínas interferón que se deben
purificar y se ha descubierto que comprenden valores de 1 mM y 100
mM, preferentemente entre 1 mM y 30 mM.
Por ejemplo, en el caso de la purificación del
interferón alfa 2b recombinante (rIFN\alpha-2b) la
concentración de las soluciones salinas acuosas está comprendida
entre 1 mM y 30 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM.
La necesidad de tener valores de pH fijos y
estables de los eluyentes usados para las cromatografías objeto de
la presente invención hace muy útil, incluso si no absolutamente
necesario, emplear soluciones acuosas tamponadas adecuadamente que
contengan de 5 a 100 mM, preferentemente de 10 a 20 mM de mezclas
tamponadas. Cada sustancia química o mezcla de sustancias químicas
que tenga un poder de tamponación en el intervalo de pH entre 2 y 11
puede emplearse ventajosamente ya que los valores de pH de los
eluyentes que pueden usarse están comprendidos entre 2 y 11.
Pueden usarse de manera ventajosa muchas
soluciones tampón acuosas para llevar a cabo la presente invención,
comprendidas aquellas que contienen: glicina y cloruro sódico, ácido
maleico e hidróxido sódico, ácido malónico e hidróxido sódico, ácido
láctico e hidróxido sódico, ácido fórmico e hidróxido sódico o de
litio, ácido succínico e hidróxido sódico,
N-metilpiperacina y ácido clorhídrico, piperacina y
ácido clorhídrico o acético, L-histidina y ácido
clorhídrico, ácido
4-(2-hidroxietil)-1-piperacinetanosulfónico)
e hidróxido sódico o de litio, N-metildietanolamina
y ácido sulfúrico, N-metildietanolamina y ácido
clorhídrico o acético, piridina y ácido fórmico, citrato sódico
dibásico e hidróxido sódico, ftalato potásico monobásico y ácido
clorhídrico y ftalato potásico monobásico e hidróxido sódico,
fosfato potásico monobásico y fosfato sódico dibásico, bicina e
hidróxido sódico, barbital sódico y ácido clorhídrico, borato sódico
y ácido clorhídrico, borato sódico e hidróxido sódico,
1,3-diaminopropano y ácido clorhídrico, ácido
cítrico y fosfato sódico dibásico, acetato sódico y ácido acético,
imidazol y ácido clorhídrico, trietanolamina y ácido clorhídrico o
acético, tris (hidroximetilaminometano) y ácido clorhídrico,
carbonato sódico y carbonato ácido sódico, etanolamina y ácido
clorhídrico, piperidina y ácido clorhídrico, trimetilamina y ácido
fórmico, piridina y ácido acético, trimetilamina y ácido acético,
trimetilamina y ácido clorhídrico, hidróxido amónico y ácido
fórmico, hidróxido amónico y ácido acético, trimetilamina y
carbonato sódico, carbonato amónico e hidróxido amónico.
En particular, en el caso de la purificación del
interferón alfa 2b recombinante (rIFN\alpha-2b),
pueden usarse todas las soluciones tampón que muestran un poder
tamponador en el pH comprendido entre 5,9 y 6,1, preferentemente
soluciones tampón en pH entre 5,9 y 6,1 que contengan fosfato
potásico monobásico y fosfato sódico dibásico, ftalato potásico
monobásico e hidróxido sódico, citrato sódico dibásico e hidróxido
sódico, ácido cítrico y fosfato sódico dibásico, imidazol y ácido
clorhídrico, mientras que en el caso de la purificación de la
albúmina sérica humana, las soluciones tampón que pueden usarse
contienen las mismas mezclas de compuestos químicos mostrando un
poder tamponador en el pH comprendido entre 4,9 y 6,0.
Las soluciones acuosas usadas como eluyentes
pueden contener, además de las sustancias químicas usadas para
tamponar el pH, también sustancias químicas que tienen el trabajo de
modificar la fuerza iónica de la solución. En este punto pueden
usarse ventajosamente tanto las sales orgánicas, tales como por
ejemplo carboxilatos, alquilsulfonatos, ftalatos como las sales
inorgánicas, como por ejemplo sulfatos, cloruros, fosfatos, los
cuales pueden salinizarse con sodio, potasio, amonio, aminas
primarias, secundarias, terciarias o aromáticas.
Estos compuestos pueden usarse ventajosamente en
una concentración comprendida entre valores de 1 mM a 100 mM,
preferentemente entre 1 mM y 30 mM.
Por ejemplo, en el caso de la purificación del
interferón alfa 2b recombinante (rIFN\alpha-2b) la
concentración de estos compuestos puede variar entre 1 mM y 30 mM,
preferentemente entre 2 y 20 mM.
El rendimiento de la purificación puede
incrementarse, antes de la elución de las proteínas interferón, por
medio de uno o más lavados llevados a cabo con eluyentes que tienen
pH y fuerza iónica adecuados, para que la columna esté siempre a un
pH más elevado que el pI.
En el caso del interferón alfa 2b recombinante
(rIFN\alpha-2b) cuyo pI es 5,9 los lavados pueden
llevarse a cabo con soluciones tampón a un pH comprendido entre 6,0
y 6,1.
La cantidad de eluyente que pasa durante estos
lavados es variable, normalmente comprendida entre 5 y 100 volúmenes
de columna (VC), en el caso del interferón alfa 2b recombinante
(rIFN\alpha-2b) entre 10 y 80 VC.
La cantidad de producto que se debe purificar que
puede ponerse en la columna depende de las matrices cromatográficas
usadas y puede llegar hasta un máximo de 100 miligramos de proteínas
totales por cada mililitro de fase estacionaria incluso si
usualmente se usan cantidades más bajas, comprendidas entre 5 y 20
mg/ml.
Los eluyentes pueden pasar a través de la columna
a una velocidad lineal compatible con las fases estacionarias hasta
un valor máximo igual a 10 cm/min.
El procedimiento de purificación anteriormente
ilustrado puede aplicarse a todas las proteínas interferón
considerando en particular a los interferones alfa, beta, gamma,
delta, omega, tau, al alfa interferón natural de los leucocitos, al
alfa 2b recombinante e interferones en general de origen natural y
recombinante.
El alcance del procedimiento de purificación
descrito anteriormente es obtener de manera industrial y económica
proteínas farmacológicamente activas en un grado de pureza tal que
se usen directamente para la fabricación de las especialidades
medicinales que las contienen.
En particular, las especialidades medicinales
preferidas dentro del ámbito de la presente invención son aquellas
que contienen interferón, todavía más preferentemente interferón
alfa 2b recombinante (rIFN\alpha-2b), de origen
natural y recombinante.
Se mencionan en este documento algunos ejemplos
ilustrativos del procedimiento objeto de la presente invención.
Una parte de células de la cepa BL21 DE3 de
Escherichia coli se ha transformado con 5 ng del plásmido
pET9a-IFN\alpha-2b, obtenido al
clonar un gen sintético que reproduce la secuencia génica humana del
IFN\alpha-2b, modificada adecuadamente para
adaptar la secuencia a los codones más frecuentes en Escherichia
coli, en el plásmido pET9a (Novagen).
La secuencia proteica expresada de las células
modificadas de Escherichia coli como se mostró anteriormente,
es igual a la mencionada en Methods in Enzymology, Interferons,
parte C, editor Pestka S., 119, 3-14, (1986),
publicado por Academic Press Inc.
La cepa BL21 DE3 de Escherichia coli
transformada por medio del plásmido
pET9a-IFN\alpha-2b se ha puesto en
cultivo en un matraz en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo
una solución que contenga 12 g/l de fitopeptona (Phyto peptoton,
BBL), 24 g/l de extractos de levadura (Extracto de levadura, DIFCO),
4 g/l de glicerol (BDH) y neomicina, a 37ºC durante un tiempo
suficiente para llegar a un valor de densidad óptica a 600 nm igual
a 0,6-0,8, usualmente 7-9 horas. El
cultivo así obtenido se usa entonces a la dilución de 1 a 100 para
inocular en un fermentador de 5 l que contenía un medio de cultivo
igual al del matraz, descrito previamente. El cultivo se mantiene 14
horas a 37ºC con una aireación igual a un volumen de aire por cada
minuto con respecto al volumen del cultivo.
Las células bacterianas se recogen por
centrifugación a 6.000 revoluciones por minuto (rpm) al final del
cultivo, están suspendidas en una solución acuosa adecuada que
contiene ditiotreitol (DTT) 1 mM en cantidades no mayores de 6 ml
por cada gramo de peso húmedo del centrifugado bacteriano. La
suspensión bacteriana se somete a lisis celular por medio de
técnicas consolidadas y descritas, como por ejemplo rotura por
ultrasonidos o por presión hidráulica.
La suspensión resultante se recupera por
centrifugación y la parte sólida se suspende en 50 ml de una
solución salina que contiene DTT 1 mM y se centrifuga de nuevo.
El componente sólido, que forma parte de los
organismos incluidos, se recoge y suspende bajo agitación vigorosa a
temperatura ambiente en 450 ml de una solución que contiene cloruro
de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y EDTA 0,1
mM. La suspensión se centrífuga y el sobrenadante se diluye en el
intervalo de 1 a 100 a 1 a 200 en una solución salina que contiene
Tris-HCl 50 mM a pH 8 y EDTA 0,1 mM a pH 8 adecuada
para la renaturalización de la proteína. La solución para la
renaturalización puede contener aminoácidos, como por ejemplo
glicina o arginina; mezclas de compuestos que contengan sulfuros en
la forma oxidada y reducida con el puente disulfuro formado, como
por ejemplo glutation, etanolamina, cisteína. La renaturalización se
lleva a cabo bajo agitación vigorosa de la solución a 4ºC durante
casi 72 horas y después la solución se filtra y después se concentra
por medio de un procedimiento de diafiltración frente a un tampón
hecho de Tris-HCl 40 mM a pH 8 hasta un factor de
concentración final de 5 a 10 veces. La concentración final de la
solución está comprendida usualmente entre 0,4 y 10 mg/ml.
Una solución 1 M de acetato sódico se añade hasta
la concentración final 20 mM a la mezcla proteica que contiene
rIFN\alpha-2b procedente del ejemplo 1 y la mezcla
se lleva a pH 5,5 con ácido acético. La solución así obtenida se
carga en una columna de intercambio catiónico fuerte que contiene la
matriz cromatográfica disponible comercialmente Mustang® S (Pall
Corporate). La columna de intercambio catiónico se acondiciona,
antes de la carga de la solución proteica, por medio de una solución
de acetato sódico 20 mM a pH 5,5 en cantidad igual a 20 volúmenes de
columna (VC).
La solución proteica se carga después en una
cantidad tal que no exceda de 10 mg de valor de proteínas cargadas
por cada mililitro de fase estacionaria, preferentemente en
cantidades comprendidas entre 6 y 8 mg/ml.
Tras la carga, los productos unidos a la fase
estacionaria se someten a un primer ciclo de lavado por medio de una
solución salina a pH 6,1 hecha de una mezcla de fosfato potásico
monobásico y fosfato sódico dibásico a una concentración total
comprendida entre 5 y 15 mM. La concentración óptima de la solución
se fija de todos modos por el hecho de que la conductividad no ha
excedido de 1800 \muS. Se usa una cantidad total de solución
comprendida entre 5 y 60 VC, preferentemente entre 25 y 35 VC.
Se lleva a cabo después un segundo ciclo de
lavado usando la misma solución del primer ciclo de lavado a la que
se añade una cantidad de cloruro potásico igual a una concentración
final que no excede de 3 mM, preferentemente de 2 mM; se usa una
cantidad total de solución comprendida entre 10 y 100 VC,
preferentemente entre 30 y 60 VC.
Después de los ciclos de lavado se lleva a cabo
una fase de elución usando una solución como la del primer ciclo de
lavado con una cantidad final de cloruro potásico a una
concentración entre 15 y 25 mM. Se usa para la elución una cantidad
total de solución comprendida entre 15 y 40 VC, preferentemente
entre 20 y 30 VC.
Todas las soluciones y las muestras cargadas
pasan a través de la columna a una velocidad lineal comprendida
entre 0,1 y 1 cm/min, preferentemente 0,4 y 0,7 cm/min.
Bajo estas condiciones el
rIFN\alpha-2b es eluido de la columna con un grado
de pureza mayor de 98%, mientras en la solución de partida el grado
de pureza era aproximadamente de 40%, con un rendimiento de
recuperación del producto buscado mayor de 80%.
Los perfiles cromatográficos antes y después de
la purificación cromatográfica se muestran en las figuras 1a y
1b.
La figura 1a muestra el perfil cromatográfico de
la solución de interferón antes de la purificación y
la figura 1b el perfil cromatográfico después de
la purificación.
Los perfiles cromatográficos se han llevado a
cabo en HPLC por medio de un cromatógrafo de líquidos HP 1090,
usando una columna Vydac C18 y un equipo detector de UV a 214 nm. La
elución se ha llevado a cabo a un flujo de 1 ml/min usando una
mezcla hecha de dos eluyentes, eluyente A hecho de 700 ml de agua,
298 ml de acetonitrilo y 2 ml de ácido trifluoroacético y eluyente B
hecho de 198 ml de agua, 800 ml de acetonitrilo y 2 ml de ácido
trifluoroacético. Los dos eluyentes se han mezclado durante la
elución según la siguiente tabla:
| Tiempo (minutos) | %A | %B |
| 0 | 72 | 28 |
| 1 | 72 | 28 |
| 5 | 67 | 33 |
| 20 | 63 | 37 |
| 30 | 57 | 43 |
| 40 | 40 | 60 |
| 42 | 40 | 60 |
| 50 | 28 | 72 |
| 60 | 72 | 28 |
El procedimiento se lleva a cabo según la
descripción del ejemplo 2 usando una solución tampón hecha de
ftalato potásico monobásico e hidróxido sódico.
El procedimiento se lleva a cabo según la
descripción del ejemplo 2 usando una solución tampón hecha de
citrato sódico dibásico e hidróxido sódico.
El procedimiento se lleva a cabo según la
descripción del ejemplo 2 usando una solución tampón hecha de ácido
cítrico y fosfato sódico dibásico.
El procedimiento se lleva a cabo según la
descripción del ejemplo 2 usando una solución tampón hecha de
imidazol y ácido clorhídrico.
Claims (8)
1. Un procedimiento para la purificación de
proteínas de interferón que consiste en llevar a cabo una
cromatografía de intercambio catiónico en una matriz sólida a un pH
más básico que el pH correspondiente al punto isoeléctrico, pI, de
las proteínas que se deben purificar, pH al cual dichas proteínas
permanecen todavía absorbidas, y eluir dichas proteínas aumentando
la fuerza iónica y/o el pH de las soluciones tampón acuosas.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque las soluciones tampón acuosas contienen
de 5 a 100 mM y en el que las mezclas tampón se seleccionan entre
aquellas hechas de fosfato potásico monobásico y fosfato sódico
dibásico, ftalato potásico monobásico e hidróxido sódico, citrato
sódico dibásico e hidróxido sódico, ácido cítrico y fosfato sódico
dibásico o imidazol y ácido clorhídrico.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2
caracterizado porque las soluciones tampón contienen sales
orgánicas o inorgánicas de 1 a 100 mM aptas para modificar la fuerza
iónica de la solución.
4. Un procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque las proteínas de
interferón son alfa, beta, gamma, delta, omega, tau, alfa natural de
leucocitos, alfa 2b recombinante e interferones en general.
5. Un procedimiento para la purificación del
interferón alfa-2b recombinante,
rIFN\alpha-2b, según la reivindicación 1 que
consiste en cargar una mezcla proteica procedente de la fabricación
por fermentación de rIFN\alpha-2b añadido a una
solución de acetato sódico 1 M y llevado a pH 5,5 con ácido acético,
en una columna llena de resina de intercambio catiónico fuerte
acondicionada a pH 5,5 por medio de una solución de acetato sódico
20 mM de modo que entre 6 y 8 mg de proteína están presentes por
cada ml de fase estacionaria, someter la columna a dos ciclos de
lavado, primero con una solución tampón a pH 6,1 a una concentración
entre 5 y 15 mM, a continuación con la misma solución tampón añadida
con 2 mM de cloruro potásico y finalmente eluir el
rIFN\alpha-2b puro de la columna usando una
solución tampón a pH 6,1 que contiene cloruro potásico a una
concentración entre 15 y 25 mM.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5
caracterizado porque la resina empleada es un medio de
intercambio catiónico fuerte que consta de un polímero hidrófilo con
grupos de ácido sulfónico entrecruzados en una membrana de
polietersulfona y las mezclas de tampón se seleccionan entre
aquellas hechas de fosfato potásico monobásico y fosfato sódico
dibásico, ftalato potásico monobásico e hidróxido sódico, citrato
sódico dibásico e hidróxido sódico, ácido cítrico y fosfato sódico
dibásico o imidazol y ácido clorhídrico.
7. Uso de los procedimientos según cada una de
las reivindicaciones previas para la fabricación de principios
activos contenidos en las especialidades medicinales basadas en las
proteínas de interferón.
8. Uso según la reivindicación 7
caracterizado porque la proteína de interferón es el
interferón alfa-2b recombinante.
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