ES2241039T3

ES2241039T3 - Metodo de purificacion.

Info

Publication number: ES2241039T3
Application number: ES97906282T
Authority: ES
Inventors: John Edward More; Jacqueline Rott; David Roger Lewin
Original assignee: National Blood Authority
Current assignee: National Blood Authority
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2017-03-07
Also published as: WO1997032893A1; EP0885241B1; GB9604921D0; US6992061B2; JP3787571B2; ATE297943T1; US20050228171A1; AU2102397A; JP2001500839A; CA2247040C; US6387877B1; EP0885241A1; JP2005336193A; CA2247040A1; JP3713277B2; US20020128180A1; DE69733548T2; ZA971998B; DE69733548D1; AU716333B2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA LA ELIMINACION DE LA ENDOTOXINA DE LA PREPARACION DE LA ALFA - 1 - ACIDO GLICOPROTEINA (OROSOMUCOIDE) POR CONTACTO CON UNA RESINA NO TOXICA FINAMENTE DIVIDIDA, TAL COMO SILICE DE PIROLISIS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION PARA LA ALFA - 1 ACIDO GLICOPROTEINA QUE INCLUYE ESTE PASO DE DESPIROGENACION Y AL PRODUCTO DE DESPIROGENACION Y SUS USOS CLINICOS.

Description

Método de purificación.

La presente invención se refiere a un método mejorado para la purificación de alfa-1-glicoproteína ácida, y a los usos terapéuticos de alfa-1-glicoproteína ácida de gran pureza.

La alfa-1-glicoproteína ácida (AGA) es una glicoproteína plasmática de un peso molecular aproximado de 41 kD. Es una proteína de fase aguda presente en el plasma a una concentración de 0,5-1 g/l en personas sanas, que se eleva en estados de enfermedad, particularmente enfermedades inflamatorias, hasta concentraciones de hasta alrededor de 2 g/l.

No se conoce bien el papel fisiológico de AGA. Como proteína de fase aguda, su concentración sérica se incrementa en respuesta a varias agresiones y lesiones, que incluyen infección, traumatismo, quemaduras, etc. Se sabe que AGA actúa sobre una amplia variedad de células, y se ha propuesto que AGA puede desempeñar un papel en la respuesta inmune. Además, se ha demostrado que AGA se une a una diversidad de fármacos, particularmente fármacos básicos y lipofílicos. Se han propuesto en la literatura usos terapéuticos de AGA que se basan en este último aspecto, pero ninguno se ha desarrollado realmente hasta la clínica.

Se cree que una razón de esto es la concentración relativamente alta de contaminantes que permanecen incluso en las denominadas preparaciones de gran pureza. La endotoxina lipopolisacárido (LPS) derivada de las paredes celulares bacterianas, también conocida como pirógeno, es uno de tales contaminantes.

LPS es el agente causante del choque septicémico, que es una causa importante de morbilidad después de una infección por bacterias gram negativas, particularmente en pacientes hospitalizados e inmunodeprimidos. La presencia de LPS en preparaciones de AGA las hace inadecuadas para la terapia humana.

Los métodos disponibles actualmente para purificar AGA son laboriosos y requieren mucho tiempo, e implican un gran número de etapas individuales. Además, son inadecuados para los procesos preparativos a gran escala. Una de tales técnicas está descrita por Hao y Wickerhauser (Biochem. Biophys. Acta, 322, 99-108 (1973)). Esta implica la adsorción y elución de un sobrenadante de la fracción V de Cohn de DEAE Sephadex, concentración, diálisis, adsorción y elución de carboximetilcelulosa, diálisis y finalmente liofilización. Al durar ambas etapas de diálisis 48 horas cada una, el proceso completo dura más de una semana. Además, a pesar de la indicación al contrario de Hao y Wickerhauser, la técnica no es susceptible de aumentar su escala para el tratamiento de los volúmenes de material de partida manejados por los fabricantes comerciales (típicamente, varias cargas por semana de hasta 10.000 L por carga de sobrenadante de la fracción V de Cohn). Aún más importante, éste proceso no ha sido capaz de reducir las concentraciones de LPS contaminante asociado hasta concentraciones aceptables para el uso
clínico.

Otros procesos anteriores para purificar AGA no han conseguido reducir LPS de preparaciones de AGA hasta concentraciones que son aceptables para uso clínico. Un método tal implica la adsorción y elución de preparaciones de AGA de resinas Detoxigel (Boutten et al, Eur. J. Immunol. 22, 2687-2695 (1992)). El propósito de este método fue asegurar que se reducía LPS de una preparación de AGA para uso en estudios in vitro, que estudiaban el efecto del LPS añadido sobre la producción de citocinas. Sin embargo, este medio cromatográfico no es adecuado para usarlo en la preparación de productos para administración humana, y en cualquier caso las concentraciones de LPS se redujeron solamente hasta 200 pg/mg (aprox. 2 UE/mg) de proteína (UE = unidades de endotoxina). Esta concentración todavía es demasiado alta para los productos destinados a uso humano, particularmente a las dosis de AGA que pueden ser necesarias clínicamente (por ejemplo de 10 g a 30 g por dosis), p.ej. en el tratamiento de la toxicidad por fármacos.

Se ha desarrollado un proceso nuevo para eliminar LPS de una preparación que contiene AGA.

Así, en su aspecto más amplio, la presente invención proporciona un método para eliminar LPS de una preparación que contiene AGA, que comprende poner en contacto dicha preparación con una resina atóxica finamente dividida.

De esta manera, es posible reducir LPS de las preparaciones que contienen AGA hasta concentraciones que son compatibles con los usos terapéuticos de las preparaciones.

Las resinas preferidas son resinas sin sustituir.

Dicha resina es una resina basada en silano, inorgánica, hidrofílica, finamente dividida, tal como sílice de combustión. Una resina de sílice de combustión que se puede usar en el método de la invención es el producto de sílice de combustión disponible comercialmente Aerosil^{TM} (Degussa AG, Frankfurt), que tiene grupos siloxano y silanol en la superficie de las partículas.

Previamente se han usado en la industria farmacéutica Aerosil^{TM} y resinas similares, tanto como componente, por ejemplo en la formulación de comprimidos y pomadas, como también en los procesos de purificación, tales como la eliminación de sustancias lipídicas y de tipo lipídico, y lipoproteínas del plasma y de productos derivados del plasma. No se tiene noticia de ninguna indicación previa para usar Aerosil, o ninguna otra resina en partículas finamente dividida como agente de despirogenación para AGA. La naturaleza atóxica de Aerosil representa una ventaja clara sobre otros métodos anteriores para purificar AGA que se basan en técnicas de separación que usan materiales que no son adecuados para aplicaciones terapéuticas.

Para el uso en el proceso de la invención, las partículas pueden tener una elevada proporción de superficie respecto del peso, tal como de 1 m^{2}/g a 1000 m^{2}/g, preferiblemente de 50 m^{2}/g a 700 m^{2}/g, y más preferiblemente de 330 m^{2}/g a 430 m^{2}/g, tal como 380 m^{2}/g.

También se ha desarrollado un método nuevo de purificación simple para AGA que incluye una etapa nueva de despirogenación, que produce una preparación de AGA despirogenada adecuada para uso clínico. El método nuevo de purificación supera por tanto las desventajas anteriormente mencionadas asociadas con los procesos anteriores de purificación de AGA.

Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para purificar AGA que comprende poner en contacto una preparación que contiene AGA con una matriz de intercambio aniónico, eluir una fracción enriquecida de AGA de dicha matriz y despirogenar una fracción enriquecida de AGA poniéndola en contacto con una resina atóxica en partículas finamente dividida, seguido de elución de una fracción de AGA reducida en LPS.

Al usar tal técnica, se pueden obtener preparaciones de AGA que contienen tan sólo 0,016 UE/mg de proteína AGA.

Se puede usar una variedad de materiales de partida que contienen AGA, por ejemplo plasma, criosobrenadante y fracciones plasmáticas, por ejemplo sobrenadante de la fracción V de Cohn y sobrenadante de la fracción IV de Cohn. En el caso de producción de AGA recombinante, la técnica también se puede usar con cultivos celulares y sobrenadantes de cultivos celulares y sus fracciones. Por razones económicas, el sobrenadante de la fracción V es un material de partida preferido, ya que permite el máximo uso del plasma donado, ya que es la fracción que es esencialmente un producto de desecho en la purificación de la albúmina, y es particularmente rica en AGA. El sobrenadante de la fracción V contiene típicamente un 40% de etanol, citrato 10 mM, acetato 50 mM a pH 4,8. Tiene un contenido bajo en proteínas (<2 g/l); el 80% del material que absorbe UV (DO280) tiene un peso molecular <10.000 daltons. AGA tiene un peso molecular relativamente bajo y es extremadamente soluble; no precipita durante el proceso de fraccionamiento con etanol en frío, y por lo tanto la mayoría (\sim 60 a 80%) se encuentra en disolución en el sobrenadante de la fracción V. Las concentraciones de AGA típicas en el sobrenadante de la fracción V de Cohn estarán en el intervalo de 0,2 a 0,35 g/l.

Se puede usar cualquier intercambiador de aniones convencional, a condición de que, por supuesto, tenga la capacidad de unir AGA. Los ejemplos incluyen sustratos inertes tales como agarosa, por ejemplo Sepharose que contiene grupos funcionales que tienen la capacidad de unir AGA, tales como grupos cargados positivamente, por ejemplo dietilaminoetilo (DEAE), dietil-(2-hidroxipropil)-aminoetilo (QAE) y amonio cuaternario (Q). Se prefieren las resinas de gran capacidad, y preferiblemente las resinas de tamaño de partícula mayor, en el intervalo de 100 a 300 \mum. La estabilidad incrementada del lecho de perlas grandes es ventajosa al tratar materiales viscosos tales como el sobrenadante de la fracción V, y permite una presión de retroceso mínima cuando el proceso se lleva a cabo mediante cromatografía en columna; además, las fracciones que contienen AGA se pueden extraer rápidamente, lo cual maximiza la recuperación de AGA y reduce el tiempo de proceso. Las matrices preferidas incluyen Q-Sepharose Big Bead, Q Hyper D y Toyopearl Super Q. Todas tienen gran capacidad para AGA.

El material de partida que contiene AGA se puede poner en contacto convenientemente con el intercambiador de aniones en presencia de una disolución etanólica de concentración del 30% al 45%, preferiblemente 35% al 45%, más preferiblemente de alrededor del 40%, al pH de los sobrenadantes de la fracción V, alrededor de pH 4,5 a 5,5, sin que sea necesario ningún ajuste, y a temperaturas en el intervalo de 2ºC a 30ºC, preferiblemente 5ºC a 15ºC, y más preferiblemente alrededor de 10ºC.

La matriz de intercambio aniónico se puede proporcionar en forma de cargas o de columna, y se prefiriere esta última tanto por la velocidad como por la comodidad.

En general, la matriz se usa en una proporción de material que contiene AGA respecto de la matriz de 1000:1 a 5:1, convenientemente alrededor de 200:1 (en volumen).

Al hacer funcionar el método como una columna, el medio de intercambio aniónico se cargará en la columna y después se equilibrará con un tampón de fuerza iónica relativamente baja, a un pH en el intervalo de 4,0 a 5,5, preferiblemente 4,0 a 4,8, y más preferiblemente alrededor de 4,1. Un tampón útil es tampón acetato, por ejemplo acetato sódico de concentración 0,02 M a 0,2 M, preferiblemente 0,1 M a 0,13 M y más preferiblemente alrededor de 0,13 M.

Después de cargar el material que contiene AGA en la columna, las proteínas sin unir se pueden eliminar lavando con un tampón de fuerza iónica baja, por ejemplo el tampón usado para preequilibrar la columna.

Después se puede eluir AGA de diversas maneras. Una manera es por medio de tampones de fuerza iónica creciente basados en el tampón de equilibrio. En general, el electrolito es cloruro sódico, pero se pueden usar otras sales, por ejemplo acetato sódico. Se puede eluir AGA por medio de un gradiente salino lineal o mediante un incremento por etapas de la concentración salina, con cloruro sódico desde 0 M hasta saturación (>3 M), preferiblemente 0 a 1,0 M y más preferiblemente gradientes de 0-0,2 M. Un tampón útil para eluir AGA es acetato sódico 0,13 M y cloruro sódico 0,2 M de pH 4,1.

En un método alternativo, AGA se puede eluir disminuyendo el pH del tampón por debajo de pH 4,1, por ejemplo añadiendo tampones apropiados tales como fosfato sódico 0,1 M, a un pH en el intervalo 2,0-3,0.

La preparación enriquecida de AGA se neutraliza después con hidróxido sódico antes de la despirogenación según la invención y como se describe más adelante.

La despirogenación con partículas finamente divididas como se describieron previamente se puede llevar a cabo convenientemente como un proceso por cargas, usando equipo que ha sido despirogenado según métodos convencionales, por ejemplo lavando con un álcali tal como NaOH 0,5 M, durante al menos una hora o calentando a temperaturas superiores a 200ºC durante más de una hora.

En general, la preparación de AGA parcialmente purificada se pondrá en contacto con las partículas durante un tiempo de contacto de más de 15 minutos hasta una noche, p.ej. durante varias horas, p.ej. 2 horas y en general durante 1 hora, a temperaturas de entre 4ºC a 70ºC, preferiblemente 4ºC a 37ºC y más preferiblemente alrededor de 20ºC.

Las partículas se pueden usar en una proporción peso:peso de partículas respecto de proteína AGA de 50:1 hasta 0,2:1 (en peso), preferiblemente de 5:1 a 0,1:1, preferiblemente 2:1 a 1:1 y más preferiblemente 1:1 con AGA en disolución a una concentración de 0,1 g/l a 250 g/l, preferiblemente 2 a 50 g/l y más preferiblemente alrededor de 3 g/l.

La preparación de AGA se puede concentrar para uso terapéutico usando métodos convencionales, que incluyen ultrafiltración o liofilización. La ultrafiltración (UF) se puede llevar a cabo convenientemente usando un cartucho de UF de 10 kD (es decir, un filtro que tiene un umbral de peso molecular de 10.000 daltons) usando flujo tangencial, para alcanzar una concentración en el intervalo de 10 a 250 g/l, convenientemente 100 g/l.

La despirogenación puede tener lugar antes o después de esta etapa de concentración, sin embargo se ha descubierto que se prefiere la concentración después de la despirogenación, ya que reduce las pérdidas de AGA en la despirogenación y mejora los rendimientos.

Para procesar adicionalmente la AGA purificada hasta una forma adecuada para uso terapéutico, la preparación se puede dializar en un tampón adecuado para la administración a humanos, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato a pH 7,5.

La preparación de AGA se puede someter a una variedad de etapas de inactivación viral, que actualmente son un requisito obligatorio en la mayor parte de los países para los productos derivados de sangre y plasma. Se ha descubierto que la AGA purificada según el proceso de la invención es estable al calentamiento prolongado a temperaturas elevadas. Así, una etapa de inactivación viral preferida comprende calentar AGA purificada en disolución a temperaturas de pasteurización de 58ºC a 70ºC durante al menos 2 horas, preferiblemente durante alrededor de 10 horas, opcionalmente en presencia de estabilizantes reconocidos tales como sales, aminoácidos o azúcares, ejemplos de los cuales incluyen cloruro sódico, glicocola y sacarosa, aunque los estabilizantes no son absolutamente necesarios para tales preparaciones de AGA.

Comparado con la mayoría de las proteínas, AGA es una molécula relativamente pequeña; así, otro método para eliminar virus de una preparación que contiene AGA según la invención es la filtración de virus a través de filtros de tamaño de poro <50 nm, preferiblemente 15 nm.

Las recomendaciones actuales del Comité de Especialidades Farmacéuticas de la Comisión Europea son dos etapas independientes de inactivación/eliminación de virus para productos intravenosos producidos a partir de plasma. Ambos métodos se pueden usar secuencialmente para tratar las preparaciones de AGA según la invención. Otros métodos que se pueden usar incluyen el tratamiento con solvente/detergente, p.ej. como se describe en Edwards et al., Vox. Sang. 52, 53-59 (1987), y el tratamiento térmico de preparaciones de AGA liofilizadas según la invención.

Usando el proceso de la invención, se ha podido purificar AGA a partir de sobrenadante de la fracción V con un rendimiento medio de hasta un 80% y una pureza de >98%, medidos mediante electroforesis en acetato de celulosa. Además, usando este método es posible producir, por primera vez, preparaciones de AGA sustancialmente despirogenadas que tienen una concentración de LPS inferior a 0,1 UE/mg de proteína, que pasa el ensayo de pirógenos en animales de la Farmacopea Europea para las sustancias de este tipo.

Así, visto desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona AGA sustancialmente exenta de LPS, y dicha AGA tiene una concentración de LPS inferior o igual a 0,1 UE/mg de AGA, preferiblemente inferior a 0,075 UE/mg y más preferiblemente inferior a 0,050 UE/mg, y de forma especial preferiblemente inferior a 0,02 UE/mg. Tal preparación de AGA sustancialmente reducida en LPS según la invención se denomina más adelante Apo-AGA.

Según un aspecto adicional, la presente invención proporciona una preparación de Apo-AGA inactivada o reducida en virus. La inactivación se puede llevar a cabo mediante métodos que incluyen el tratamiento con solvente/detergente, o la pasteurización, anteriormente mencionados, y métodos de reducción que incluyen la filtración de virus anteriormente mencionada.

Según otro aspecto adicional, la presente invención proporciona Apo-AGA según la invención para uso en terapia.

Se sabe que AGA tiene propiedades útiles de unión de fármacos, y la nueva Apo- AGA de gran pureza es particularmente útil para el tratamiento clínico de la sobredosis de fármacos, por ejemplo en el caso de antidepresivos tricíclicos, en los que la sobredosis puede ser mortal.

Así, visto desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para tratar la toxicidad por fármacos, que comprende administrar a un paciente necesitado de tal tratamiento una cantidad efectiva de Apo-AGA.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de Apo-AGA en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de la toxicidad por fármacos.

Este aspecto es particularmente útil para tratar los efectos tóxicos asociados con la sobredosis de fármacos básicos tales como quinina, lignocaína, propanolol y particularmente antidepresivos tricíclicos, tales como amitriptilina, desipramina y nortriptilina.

Para la terapia según la invención, AGA se puede formular según métodos convencionales de farmacia, junto con excipientes, vehículos o disolventes farmacéuticamente aceptables como, por ejemplo, se describe en Remingtons Pharmaceutical Sciences ed Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, EE.UU. (1990). Se pueden usar componentes adicionales tales como conservantes. AGA se puede formular en composiciones para administración mediante cualquier vía conveniente, p.ej. por vía enteral o parenteral, mediante administración transmucosa, p.ej. por vía rectal, en implantes o mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea, etc.

Visto desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende AGA junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Estas composiciones pueden tomar la forma, por ejemplo, de disoluciones, emulsiones, óvulos vaginales y supositorios, así como otras presentaciones estabilizadas tales como tapones, espumas y vidrios liofilizados. La formulación se puede elegir para que sea apropiada para la vía de administración, que puede ser mediante todos los métodos convencionales, que incluyen la vía parenteral (p.ej. por vía intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa) o la vía transmucosa (p.ej. por vía oral, nasal, vaginal, rectal y por medio de la vía intraocular).

Los regímenes de tratamiento o los regímenes y dosis profilácticos concretos dependerán en gran medida del paciente individual, y pueden ser ideados por el médico basándose en las circunstancias individuales. Las dosis pueden estar en el intervalo de 10 a 30 g de AGA.

La invención se describirá a continuación por medio de los siguientes ejemplos no limitantes, con referencia a las figuras que muestran:

Figura 1: Una imagen escaneada de un gel de agarosa que muestra AGA purificada a partir de un sobrenadante de la fracción V. Se muestra tanto el material de partida como la AGA purificada.

Figura 2: Una representación esquemática de un perfil cromatográfico de un sobrenadante de la fracción V aplicado a una columna Q Sepharose Big Bead y eluido con un gradiente por etapas de NaCl 0,2 M.

En los siguientes ejemplos se midió LPS mediante el ensayo de coagulación para endotoxinas que usa el Lisado de Amebocitos de Limulus, con endotoxina de E. Coli de Atlas Bioscan como control positivo.

Este ensayo se llevó a cabo usando reactivos y agua para inyección (WFI) comerciales. Se preparó una serie de diluciones del material de ensayo por duplicado diluyendo con WFI. No fue necesario el ajuste del pH, ya que las muestras están siempre en el intervalo de pH 6,5-7,5. Los ensayos se realizaron por duplicado con: muestras de ensayo diluidas; un control positivo (patrón de endotoxina diluido, según la Farmacopea Europea Ph. Eur: V2.1.9.) y un control negativo (WFI).

Método de ensayo

Este fue según la Farmacopea Europea Ph. Eur: V2.1.9. Se añadieron 0,1 ml de muestra diluida o control a un tubo de vidrio sódico apirógeno que contenía 0,1 ml de lisado (validado previamente), y se agitó el tubo suavemente para mezclar. Los tubos se incubaron, destapados, en un baño de agua a 37ºC durante 1 hora.

El ensayo se interpretó invirtiendo cuidadosamente cada tubo 180º. Se registró un ensayo positivo si el coágulo permaneció intacto al invertir el tubo 180º. Los positivos en el punto final para los duplicados deberían estar dentro de una dilución a un medio uno del otro. Cuando los positivos en el punto final no fueron iguales, se calculó la media geométrica multiplicando la concentración de endotoxina de los positivos en el punto final y hallando después la raíz cuadrada. Los resultados se expresaron como UE/ml, convertidos a UE/mg de AGA usando la concentración de proteína de la disolución de AGA.

El control positivo (0,06 UE/ml) y el control negativo (WFI como diluyente) se ensayaron con cada grupo de muestras. Cuando no se formó coágulo en el control positivo se comprobó la calidad del lisado usando un nuevo lisado. Cuando esto no hizo resaltar un lisado de mala calidad como culpable del resultado negativo, se hizo un nuevo control positivo y se ensayó mediante el método de validación.

La muestra de ensayo a la dilución más baja que coagula es equivalente a 0,06 UE/ml, y el resultado es 0,06 x factor de dilución. Las muestras se diluyeron según la serie siguiente:

Sin diluir, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 y 1/256.

Ejemplo 1A

Purificación de alfa-1-glicoproteína ácida (AGA) de grado técnico a partir de sobrenadante de la fracción V

El gel DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia) se suministra en forma de polvo seco. Se hidrataron 675 g de gel seco durante la noche en 100 litros de acetato sódico (NaAc) 0,25 M, pH sin ajustar. Después de la hidratación el gel se equilibró por cargas con 4 alícuotas de NaAc 0,13 M, pH 4,1, conductividad = 1,85 mS/cm. El gel se escurrió después de cada alícuota. Se usó un total de 250 litros de tampón de equilibrio. Se añadieron aproximadamente 450 litros de sobrenadante de la fracción V, producido mediante el método de fraccionamiento de plasma de Kistler y Nitschmann (Vox Sang, 7, 414-424, 1962) al gel equilibrado, y se mezcló durante 90 minutos. La disolución de proteína sin unir se escurrió del gel. El gel se lavó con 4 alícuotas de NaAc 0,13 M, pH 4,1, conductividad = 1,85 mS/cm. La masa de gel lavado resultante se eluyó por cargas con 35 litros de NaAc 0,13 M, cloruro sódico (NaCl) 1 M, pH 4,1. Esto produjo 41,8 kg de disolución de eluido. Se añadieron 3 litros de hidróxido sódico (NaOH) 1 M al eluido para conseguir un pH 6,4. El eluido de pH ajustado se concentró mediante ultrafiltración hasta 1 litro, y después se dializó con 4 litros de fosfato sódico 10 mM, pH 7,0. Se produjo una concentración final de proteína de aproximadamente 100 g/l.

Ejemplo 1B

Purificación de grado clínico de \alpha_{1} glicoproteína ácida (AGA) a partir de sobrenadante de la fracción V Preparación de la columna

Se despirogenó Q Sepharose Big Bead (25,2 cm x 19 cm - 9,5 litros) con 30 litros de hidróxido sódico (NaOH) 0,5 M durante 1 hora. El gel se equilibró con 50 litros de acetato sódico (NaAc) 0,13 M de pH 4,1.

Preparación de sobrenadante de la fracción V

Este se preparó según el método de Kistler y Nitschmann, Vox Sang. 7, 414-424, (1962).

Preparación de AGA

1.1 Se filtraron en profundidad 750 litros de sobrenadante de la fracción V a <0ºC, se calentaron a 10ºC, después se cargaron en el gel a 2 litros por minuto. Después de la carga, se lavó la columna con 50 litros de NaAc 0,13 M de pH 4,1 para arrastrar la proteína sin unir.

1.2 Se eluyó AGA con 50 litros de NaAc 0,13 M, cloruro sódico (NaCl) 0,2 M de pH 4,1, a 2 litros por minuto. El gel se lavó con 50 litros de NaAc 0,13 M, NaCl 1 M de pH 4,1 y después 20 litros de NaOH 0,5 M, y se almacenó en NaOH 10 mM.

1.3 La AGA eluida se neutralizó con NaOH antes de filtrar de forma estéril.

1.4 La etapa de purificación produjo 27,4 litros de 5,7 g/l de AGA, un total de 156 g de AGA.

1.5 Se trataron 154 g de AGA con 154 g de Aerosil 380 para eliminar los pirógenos. Después de mezclar durante 2 horas a 20ºC, se eliminó el Aerosil mediante filtración a través de filtros de fibra de vidrio.

1.6 La AGA despirogenada se concentró hasta 120 g/l mediante ultrafiltración, usando membranas con un umbral de peso molecular de 10.000. La disolución concentrada se dializó con 4 litros de fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM de pH 7,5 (PBS).

1.7 La inactivación viral del concentrado de AGA se consiguió mediante filtración a través de un filtro de virus con un tamaño de poro de 15 nm. Después de cargar de forma estéril, se consiguió la inactivación viral del producto mediante pasteurización durante 10 horas a 60ºC.

1.8 Todos los procesos se llevaron a cabo en condiciones de limpieza, y todas las superficies que estaban en contacto con el producto se despirogenaron con NaOH.

1.9 El material de partida y el producto se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa usando geles de agarosa del 1% prefabricados de Ciba Corning. Se sometió a muestras de 5-10 g/l de sobrenadante de la fracción V (que se habían dializado con solución salina para eliminar sales y etanol) y a AGA purificada a electroforesis en tampón de barbital 60 mM de pH 8,6. La Fig. 1 muestra un gel teñido con azul de Coomassie.

Usando este método se obtuvo una preparación de AGA que tenía 0,016 UE/mg de AGA.

Ejemplo 2 Selección de resinas de intercambio aniónico adecuadas para uso en la preparación de AGA a partir de sobrenadante de la fracción V para despirogenación subsiguiente

El elevado contenido en etanol (40%) hace al sobrenadante de la fracción V muy difícil de procesar. Esto puede ser debido a su elevada viscosidad relativa (2,8 a 20ºC).

La aproximación inicial fue eliminar el etanol y concentrar mediante ultrafiltración, pero se comprobó que los grandes volúmenes y los bajos caudales (debidos al etanol) hacían los tiempos de proceso extremadamente largos. Se eligió en su lugar la captura cromatográfica directamente del sobrenadante de la fracción V, idealmente sin modificar el pH o la concentración de etanol. La mayor parte de los intercambiadores de aniones tienen capacidades muy bajas en estas condiciones y presiones de retroceso elevadas, que permiten solamente una capacidad baja de tratamiento y que necesitan grandes volúmenes de intercambiador de aniones. Por lo tanto, para mejorar la viabilidad del proceso se buscó un intercambiador de aniones con una buena capacidad (>10 g de AGA/L de gel) a caudales elevados.

Método

Se seleccionó una amplia variedad de resinas de intercambio aniónico, y se investigaron derivados tanto de Q como de DEAE. Las resinas se cargaron en columnas cromatográficas a los caudales recomendados por los fabricantes. Después de equilibrar en NaAc 0,13 M de pH 4,1, las resinas se sobrecargaron con sobrenadante de la fracción V; hubo que reducir los caudales en muchos de los geles debido a una presión de retroceso excesiva. Las proteínas sin unir se eliminaron con tampón de equilibrio; la AGA unida se eluyó con NaCl 1 M, NaAc 0,13 M de pH 4,1. Las capacidades de las resinas se calcularon dividiendo la AGA total eluida por el volumen de resina usado. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Resultados TABLA 1

Resina	Capacidades de unión
	de AGA (mg/ml)
DEAE Sephadex A50 (Pharmacia)	7,9
DEAE Sepharose FF (Pharmacia)	6,7
Q-Sepharose Big Bead (Pharmacia)	20,0
Resource Q (Pharmacia)	8,5
Macro Prep High Q (BioRad)	3,6
Macro Prep DEAE (BioRad)	2,6
Toyopearl Super Q (Toso Haas)	17,0
Poros Q (Perseptive Biosystems)	4,2
Poros HQ (Perseptive Biosystems)	5,8
Q Hyper D (F) (Biosepra)	31,6
Q Hyper D (M) (Biosepra)	31,5

Conclusión

Basándose en la capacidad, Q Hyper D, Q Sepharose Big Bead (QSBB) y Toyopearl Super Q tenían capacidades aceptables para AGA en las condiciones de ensayo usadas.

Ejemplo 3 Optimización de las condiciones de elución de la resina de intercambio aniónico

Se equilibró una columna de 1 ml de QSBB (0,5 x 5 cm) con acetato sódico 0,13 M de pH 4,1. Una preparación pura de AGA preparada según el Ejemplo 1A y después diluida 3 veces con tampón de equilibrio se cargó en la columna, de forma que ésta estaba sobrecargada. Después de la carga de proteína se lavó con tampón de equilibrio, de forma que el efluente monitorizado con UV volvió a un registro de valor inicial. Se aplicó un gradiente salino lineal continuo de NaCl a la columna de 0 M a 1 M durante 15 volúmenes de columna. La elución se continuó a la concentración límite durante otros 5 volúmenes de columna. El eluido se monitorizó mediante absorbancia UV a 280 nm.

Resultados

La elución de producto se inició mediante una concentración de NaCl de 0,17 M. El pico eluido de proteína coincidió con NaCl 0,26 M.

Conclusión

Cuando se cargó QSBB con una preparación pura de AGA, se demostró que es necesario un tampón adecuado que contiene por lo menos 0,17 M de NaCl para iniciar la elución de la proteína unida de la columna.

Ejemplo 4 Optimización de las condiciones de elución (continuación)

Se equilibró una columna de 1 ml de QSBB con acetato sódico 0,13 M de pH 4,1. Se aplicaron 5 volúmenes de columna de sobrenadante de la fracción V (material de partida del proceso) a la columna. La carga de sobrenadante de la fracción V se lavó directamente con tampón de equilibrio, de forma que el efluente monitorizado con UV volvió a un registro de valor inicial. Se aplicó un gradiente salino lineal continuo a la columna durante 15 volúmenes de columna. El gradiente salino de NaCl se aplicó desde 0 M a 0,5 M. Después el gradiente se escalonó hasta NaCl 1 M y se mantuvo durante 5 volúmenes de columna. El eluido se monitorizó mediante absorbancia UV a 280 nm.

Resultados

La elución del producto se inició mediante una concentración de NaCl 0,13 M. El pico eluido de proteína coincidió con NaCl 0,15 M.

Conclusión

Cuando se cargó QSBB con sobrenadante de la fracción V, se demostró que es necesario un tampón adecuado que contiene por lo menos 0,13 M de NaCl para iniciar la elución del componente unido de la columna.

Ejemplos 5A-B

Confirmación de las condiciones de elución

La elución en gradiente por etapas es el método preferido de elución en la cromatografía a escala de proceso. Los ejemplos 3 y 4 han demostrado que al usar un gradiente lineal era necesaria una concentración salina mínima de NaCl 0,13 M para iniciar la elución de AGA de la columna. En un gradiente por etapas, para conseguir la elución en un volumen adecuado, a menudo se necesitan concentraciones de NaCl ligeramente superiores. El propósito de este experimento fue evaluar las propiedades de elución de NaCl 0,2 M y 0,3 M para determinar la concentración de NaCl mínima necesaria para una recuperación de AGA aceptable.

Una columna de 1 ml de QSBB se equilibró, se cargó con sobrenadante de la fracción V y se lavó como en el Ejemplo 4. Se aplicó una elución salina en gradiente por etapas a la columna. Después de la elución por etapas inicial, la columna se eluyó con NaCl 1 M para observar si se eluían componentes unidos.

Ejemplo 5A

La columna se equilibró, se cargó y se lavó como anteriormente. Se aplicó un gradiente por etapas de NaCl 0,3 M a la columna durante 7 volúmenes de lecho, seguido de 5 volúmenes de lecho de NaCl 1 M.

Resultados 5A

Toda la proteína unida detectable se eluyó con NaCl 0,3 M. No se observó ningún pico eluido adicional con NaCl 1 M.

Ejemplo 5B

La columna se equilibró, se cargó y se lavó como anteriormente. Se aplicó un gradiente por etapas de NaCl 0,2 M a la columna durante 7 volúmenes de lecho, seguido de 5 volúmenes de lecho de NaCl 1 M.

Resultados 5B

De la proteína unida total, el 96% se eluyó con NaCl 0,2 M. Se observó que el material unido restante se eluía con NaCl 1 M; la Fig. 2 muestra el perfil cromatográfico.

Conclusiones 5A-5B

Estos resultados demuestran que es necesaria una concentración salina de NaCl de 0,2 M a 0,3 M en un tampón adecuado para proporcionar una elución aceptable de la proteína unida.

Ejemplos 6-7

Demostración del efecto del tratamiento con Aerosil sobre la concentración de endotoxina Materiales

Se produjo AGA a partir de sobrenadante de la fracción V como se describió previamente en el Ejemplo 1A.

Ejemplo 6

Se preparó una disolución de AGA de 50 g/l. Esta no se trató con Aerosil y proporcionó una muestra de control.

Ejemplo 7

Se trató una disolución de AGA de 50 g/l con 5% p/v de Aerosil 380 y se agitó a 37ºC durante 2 horas.

Los productos de los ejemplos 6 y 7 se sometieron a análisis de LAL. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

Ejemplo	AGA g/l	Aerosil % p/v	LAL UE/ml	LAL UE/mg
6	50	0	157	3,14
7	50	5	2,36	0,047

Conclusiones de los ejemplos 6-7

La actividad de endotoxina de una disolución de AGA de 50 g/l se redujo drásticamente mediante el tratamiento con Aerosil 380 a 37ºC durante 2 horas.

Ejemplos 8-14

Optimización de la concentración de tratamiento con Aerosil

Ejemplo 8

Se preparó una disolución de AGA de 50 g/l como se describió en el Ejemplo 1A. Esta no se trató con Aerosil y proporcionó una muestra de control.

Ejemplo 9

Se trató una disolución de AGA de 50 g/l con 0,1% p/v de Aerosil 380 y se agitó a 37ºC durante 2 horas.

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Ejemplo 10

Se trató una disolución de AGA de 50 g/l con 0,3% p/v de Aerosil 380 y se agitó a 37ºC durante 2 horas.

Ejemplo 11

Se trató una disolución de AGA de 50 g/l con 0,5% p/v de Aerosil 380 y se agitó a 37ºC durante 2 horas.

Ejemplo 12

Se trató una disolución de AGA de 50 g/l con 1% p/v de Aerosil 380 y se agitó a 37ºC durante 2 horas.

Ejemplo 13

Se trató una disolución de AGA de 50 g/l con 3% p/v de Aerosil 380 y se agitó a 37ºC durante 2 horas.

Ejemplo 14

Los productos de los ejemplos 8 a 14 se sometieron a análisis de LAL. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

Ejemplo	AGA g/l	Aerosil % p/v	LAL UE/ml	Actividad específica UE/mg
8	50	0	25-62,5	0,5-1,25
9	50	0,1	12,5-25	0,25-0,5
10	50	0,3	6,25-12,5	0,125-0,25
11	50	0,5	7,5-12,5	0,15-0,25
12	50	1	7,5-12,5	0,15-0,25
13	50	3	3,75-7,5	0,075-0,15
14	50	5	3,75-7,5	0,075-0,15

Conclusiones de los ejemplos 8-14

La eliminación de la actividad de endotoxina se incrementó con la concentración de Aerosil 380, con una concentración óptima de Aerosil 380 de 3-5% p/v al tratar una disolución de AGA de 50 g/l. La eliminación óptima de endotoxina ocurre por lo tanto en el intervalo de 0,6 a 1 g de Aerosil/g de AGA.

Ejemplos 15-17

El tratamiento con Aerosil 380 a concentraciones altas y bajas de AGA da como resultado la despirogenación de un producto final

Se procesó una carga de AGA producida como se describió en el Ejemplo 1B hasta la etapa 1.3 en tres alícuotas: antes de procesar, la concentración de AGA fue aproximadamente 4 g/l.

Ejemplo 15

Se concentró la primera alícuota de AGA desde aproximadamente 4 g/l hasta aproximadamente 20 g/l mediante ultrafiltración, usando membranas con un umbral de peso molecular de 10.000. Esta alícuota no se sometió a tratamiento con Aerosil 380 y proporcionó una muestra de control.

Ejemplo 16

La segunda alícuota se trató con Aerosil 380 en una proporción 1 g:1 g, a 37ºC durante 2 horas. El Aerosil 380 se eliminó mediante filtración. La disolución de AGA se concentró hasta 20 g/l mediante ultrafiltración como en el Ejemplo 15.

Ejemplo 17

La tercera alícuota de disolución de AGA se concentró desde aproximadamente 4 g/l hasta aproximadamente 20 g/l mediante ultrafiltración como en el Ejemplo 15. El concentrado de proteína se trató con Aerosil 380 en una proporción 1 g:1 g a 37ºC durante 2 horas. El Aerosil 380 se eliminó mediante filtración.

Los productos de los ejemplos 15, 16 y 17 se sometieron a análisis de LAL. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

Ejemplo	LAL UE/ml	LAL UE/mg
15	25-50	1-2
16	2,5-5	0,103-0,205
17	2,5-5	0,123-0,245

Conclusiones de los ejemplos 15-17

Los resultados mostrados en la Tabla 4 indican que hay una eliminación igual de endotoxina al tratar en la etapa de proteína diluida o concentrada.

Aerosil 380 tiene una proporción volumen/peso elevada y puede retener un volumen relativamente grande de disolución acuosa. El tratamiento de una disolución de proteína diluida con Aerosil en una proporción 1 g:1 g redujo el porcentaje p/v de Aerosil. Por esta razón la pérdida de producto se reduce enormemente. Por lo tanto, el tratamiento con Aerosil 380 está favorecido en la etapa de proteína diluida.

Ejemplos 18-22

Optimización del tiempo de tratamiento

Se trató una disolución de AGA producida como se describió en el Ejemplo 1A de 50 g/l con Aerosil 380 en una proporción 1 g:1 g, mezclando a 37ºC. Se extrajeron muestras a intervalos de tiempo y se eliminó Aerosil 380 mediante centrifugación. Se analizó la presencia de endotoxina en el sobrenadante mediante análisis de LAL. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

Ejemplo	Tiempo de tratamiento min.	LAL UE/ml	Actividad específica UE/mg
6	Sin tratamiento	157	3,14
18	0	2,89	0,058
19	30	6,03	0,121
20	60	4,54	0,091
21	90	2,31	0,046
22	1080	5,49	0,110

Conclusiones de los ejemplos 18-22

El Ejemplo 6 proporciona un control para los ejemplos 18-22. En todos los casos, ejemplos 18-22, la actividad de endotoxina se ha reducido. Es significativo que, independientemente del tiempo de tratamiento, el grado de eliminación de endotoxina es del mismo orden. El tiempo de tratamiento indicado en la Tabla 5 no incluye el tiempo para la eliminación de Aerosil 380. El tiempo de tratamiento de 0 minutos ha tenido un tiempo de contacto efectivo con Aerosil de hasta 20 minutos. Sin embargo, la eliminación óptima de endotoxina ocurre dentro de este tiempo.

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Ejemplos 23-25

Optimización de la temperatura de tratamiento

Se procesó una carga de AGA producida como se describió en el Ejemplo 1B en tres alícuotas.

Ejemplo 23

La primera alícuota de disolución de AGA de aproximadamente 4,5 g/l se concentró hasta 100 g/l mediante ultrafiltración. Esta no se trató con Aerosil 380 y proporcionó una muestra de control.

Ejemplo 24

La segunda alícuota de disolución de AGA de aproximadamente 4,5 g/l se trató con Aerosil 380 en una proporción 1 g:1 g, a temperatura ambiente (TA) alrededor de 20ºC durante 2 horas. Se eliminó Aerosil 380 mediante filtración y la proteína se concentró hasta 100 g/l mediante ultrafiltración.

Ejemplo 25

La tercera alícuota se procesó como en el Ejemplo 24, pero la temperatura de tratamiento con Aerosil 380 fue 37ºC.

Se analizó la endotoxina en los productos de los ejemplos 23-25 mediante análisis de LAL. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

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TABLA 6

Ejemplo	Temperatura ºC	LAL UE/ml	LAL UE/mg
23	Control	25	0,25
24	TA	6,25	0,0625
25	37	7,50	0,0750

\vskip1.000000\baselineskip

Conclusiones de los ejemplos 23-25

El tratamiento con Aerosil 380 a ambas temperaturas redujo significativamente la actividad de endotoxina en el producto final comparado con el control. Parece que no hay ninguna diferencia significativa entre las temperaturas de tratamiento sobre la eliminación de endotoxina.

Ejemplo 26 Efecto del calor prolongado sobre la estructura de AGA

Se diluyó AGA en PBS de pH 7,5 hasta 50 g/l y después se alicuotó en 3 x 1,5 ml; cada uno se incubó en un baño de agua durante 18 horas a 60, 65 ó 70ºC. Las preparaciones se analizaron mediante cromatografía de penetrabilidad en gel usando una columna de FPLC de Superose 12 (Pharmacia High Resolution 10 x 300 mm) equilibrada con cloruro sódico 0,1 M, Tris 50 mM (Tris(hidroximetil)aminometano), azida sódica 0,05% de pH 7,5 a 0,5 ml/min. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Resultados TABLA 7

Temperatura de incubación	% de agregado	% de dímero	% de monómero
60ºC	1	3,6	94,8
65ºC	2,4	10,2	86,7
70ºC	5,8	8,8	83,5

Control sin calentar	0	1,2	98,5

Conclusión

AGA en PBS de pH 7,5, sin ningún estabilizante, es estable al calentamiento prolongado a temperaturas elevadas. Estos resultados indican que la pasteurización es un método de inactivación viral viable para este producto, y experimentos posteriores han indicado que los productos pasteurizados conservan una integridad molecular completa.

Ejemplo 27 Efecto de los estabilizantes sobre la pasteurización de AGA Método

Se mezcló AGA en PBS de pH 7,5 con diversos productos químicos que se sabe que estabilizan otras proteínas plasmáticas. La concentración final de proteína se ajustó a 50 g/l de AGA. Todas las muestras, excepto el control, se calentaron en un baño de agua a 62ºC durante 18 horas. Al enfriarlas, las muestras se analizaron mediante cromatogra-
fía de penetrabilidad en gel usando una columna de FPLC de Superose 12. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8

1

Conclusión (comparativa)

Las concentraciones crecientes de NaCl por encima de 0,15 M parecen tener un efecto desestabilizante, ya que se forma más dímero al calentar a medida que aumenta NaCl. La glicocola de 30 mM hasta 160 mM no parece tener efecto. La sacarosa de 5% hasta 35% tiene un ligero efecto estabilizante sobre AGA.

Ejemplos 28-31

(Comparativo)

Evaluación de otros métodos para la despirogenación de AGA

Ejemplo 28

Eliminación de endotoxina usando carbón

Chen, R.F. (Journal of Biological Chemistry, 242 (2) págs. 173-181, 1967), describió un método para la eliminación de ácidos grasos de la albúmina usando carbón activo. Se conjeturó que la eliminación de LPS de AGA se podría conseguir con carbón en base a que se sabe que LPS posee un resto de lípido A.

Métodos

A) Se añadieron 370 mg de carbón activo Norit GSX a 10 ml de disolución de AGA producida como se describió en el Ejemplo 1A de una concentración de 74 g/l. La mezcla se ajustó de pH 7,3 a pH 4,0 mediante la adición de HCl 0,2 M. La mezcla se agitó en un baño de hielo durante 1 hora. La masa de carbón se eliminó mediante centrifugación a 2000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se decantó y se filtró a través de filtros de membrana de 0,8 \mum y 0,2 \mum en serie. Se ajustó el pH de la disolución con NaOH 0,2 M hasta un pH final de 7,1. Después se sometió a la muestra a análisis de LAL.

B) Siguiendo el mismo principio para eliminar endotoxina con carbón, se evaluó la eficacia de filtros impregnados con carbón.

Los filtros de 47 mm impregnados con carbón, de grado R53 SLP, fueron suministrados por Cuno Process Filtration. El filtro se lavó con 50 ml de agua apirógena (PFW). Se tomó una muestra del agua de lavado. Se pasaron 30 ml de disolución de AGA producida como se describió en el Ejemplo 1A de una concentración de 74 g/l lentamente a través del filtro para maximizar el tiempo de contacto. Se recogieron 5 x 5 ml de muestra del filtrado. Las 5 muestras del filtrado junto con un control sin filtrar y el agua de lavado del filtro se sometieron a análisis de LAL.

Resultados

Los resultados del análisis de LAL de las muestras producidas en el Ejemplo 28 se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9 Tratamientos con carbón

2

Conclusiones 28

Los resultados del análisis de LAL indican que no existe una disminución significativa de endotoxina mediante ninguno de los métodos de tratamiento con carbón.

Ejemplo 29

Eliminación de endotoxina usando ligandos de afinidad

Se evaluaron dos equipos, PyroBind (Sepracor) y END-X B15 (Atlas Bioscan Ltd.), diseñados específicamente para la eliminación de endotoxina de disoluciones proteicas acuosas. Ambos equipos consisten en un ligando específico, la Proteína Neutralizadora de Endotoxina (ENP), unida a un soporte rígido. Las perlas de END-X B15 son esferas de sílice de 65 \mum revestidas con ENP. PyroBind^{TM} es un soporte de fibra hueco con ENP unida.

END-X B15

Se siguió el protocolo del fabricante. Se diluyó una disolución de AGA producida como se describió en el Ejemplo 1A hasta una concentración de 20 g/l. Se introdujeron 2 ml de la disolución de AGA diluida en un tubo de microcentrífuga que contenía las perlas END-X B15. La disolución se mezcló verticalmente durante 6 horas a temperatura ambiente. A las 1, 4 y 6 horas el tubo de tratamiento se microcentrifugó a 1000 g para sedimentar las perlas END-X, y se extrajo una muestra de 0,5 ml. Después las perlas se resuspendieron y se continuó con el tratamiento. Las muestras correspondientes a cada tiempo, junto con un control sin tratar, se sometieron a análisis de LAL.

PyroBind

Se siguió el protocolo del fabricante. Se usó una disolución de AGA producida como se describió en el Ejemplo 1A de una concentración de 100 g/l. Una segunda alícuota de la misma disolución se diluyó hasta 20 g/l. Se conectó una jeringa que contenía 5 ml de la AGA de 20 g/l a un extremo de la unidad de PyroBind de fibra hueca y una jeringa vacía en el otro extremo. La disolución de AGA se pasó a través de la unidad de una jeringa a la otra 5 veces. Se trataron 5 ml de AGA de 100 g/l de la misma forma, pero la disolución se pasó a través de la unidad de PyroBind 10 veces. Las disoluciones se sometieron después a análisis de LAL junto con las muestras de control sin tratar.

También se evaluó otro protocolo modificado. Se sometió a 6 ml de una disolución de AGA de una concentración de 20 g/l producida como se mencionó anteriormente a 5 pases a través de una unidad de PyroBind. Se retuvieron 3 ml de la AGA tratada primariamente. Los 3 ml restantes se sometieron a 5 pases adicionales a través de una segunda unidad de PyroBind. Las muestras tratadas primariamente y secundariamente, junto con una muestra de control sin tratar se sometieron a análisis de LAL.

Se realizó un experimento de control usando disolución de albúmina humana (Zenalb^{TM} 4,5, BPL) para demostrar que las unidades de PyroBind eran activas. La disolución de albúmina se diluyó hasta una concentración de 22,5 g/l con agua apirógena (PFW). Se reconstituyó endotoxina patrón de control de Escherichia coli #0113, PPE-E-434 (Associate of Cape Cod Inc.) con PFW. Se añadieron 0,1 ml del patrón de endotoxina a 5 ml de albúmina, se mezcló y se pasó a través de una unidad de fibra hueca de PyroBind 5 veces. Las muestras tratadas y sin tratar se sometieron a análisis de LAL.

Resultados

Los resultados del análisis de LAL de las muestras producidas en el Ejemplo 29 se muestran en la Tabla 10.

Conclusiones

La muestra de albúmina de control demostró que las unidades de PyroBind eliminaron satisfactoriamente el 98% de la endotoxina con 5 pases a través de la unidad. Al usar la unidad de PyroBind para eliminar endotoxina de disoluciones de AGA se demostró en el mejor de los casos solamente una reducción del 53% de endotoxina. Los resultados de END-X B15 fueron similares a los de PyroBind, dando solamente una reducción del 59% de endotoxina después de 6 horas de tratamiento. Ninguno de los equipos cumplió las reivindicaciones de los fabricantes al tratar disoluciones de AGA, y por tanto no serían adecuados para producir una preparación de grado clínico.

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

3

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Ejemplo 30

Cromatografía de intercambio iónico

Los pirógenos tienen un pI bajo; los valores publicados varían, la mayoría citan aproximadamente 4 y algunos citan valores mucho menores. Por lo tanto, para muchas proteínas, p.ej. albúmina pI = 4,7, la despirogenación se puede conseguir mediante cromatografía de intercambio aniónico. Para AGA, que tiene un pI de 2,7, esta técnica tiene menos potencial. En los experimentos preliminares se hizo fluir AGA a través de un intercambiador de aniones en condiciones de ausencia de unión para AGA, para intentar unir los pirógenos.

Se despirogenó una columna de 25 ml de DEAE Sepharose FF (Pharmacia) (1,6 x 12,5 cm) con 250 ml de NaOH 0,5 M, y después se equilibró con 250 ml de acetato sódico 0,13 M de pH 4,1. Se tomó AGA preparada como en el Ejemplo 1A, se añadió NaCl sólido para incrementar la concentración de NaCl hasta 0,2 M; se cargaron 130 ml de esta preparación con una concentración de AGA de 19 g/l y pH 4,4 en el intercambiador de aniones; se recogió la fracción de lavado en un recipiente despirogenado. La fracción de lavado y el material de partida de AGA se ajustaron a pH 7 y se sometieron a ensayo de LAL.

Resultados

Las concentraciones de pirógenos se redujeron solamente de forma marginal de 25-30 UE/ml hasta 20-25 UE/ml.

Conclusión

Este método no redujo significativamente la concentración de pirógenos de la preparación de AGA.

Ejemplo 31

Eliminación de endotoxina usando Amberlite XAD-2

La resina Amberlite XAD-2 es un polímero de poliestireno sintético sin grupos iónicos diseñado para adsorber sustratos orgánicos hidrosolubles; se ha usado para despirogenar agua.

Se produjo AGA como se describió en el Ejemplo 1A y se diluyó hasta 50 g/l. Se añadió 1 g de resina Amberlite XAD-2 sin lavar y sin equilibrar a 4 ml de disolución de AGA. La mezcla se agitó a 37ºC durante 2 horas. Se eliminó Amberlite mediante centrifugación a 1000 g durante 20 minutos. La resina sin sedimentar se eliminó mediante filtración. Las muestras de AGA pre- y pos-tratadas se sometieron a análisis de LAL.

Resultados 31

Los resultados del análisis de LAL de la muestra producida en el Ejemplo 31 se muestran en la Tabla 11.

TABLA 11

Muestra	LAL UE/ml	LAL UE/mg
AGA pre-tratada	157	3,14
AGA pos-tratada	164	3,28

Conclusiones 31

No se consiguió una reducción en la concentración de endotoxina usando la resina de Amberlite XAD-2, y por lo tanto se consideró que el método no es adecuado para un método de tratamiento de AGA.

Claims

1. Un método para eliminar lipopolisacárido (LPS) de una preparación que contiene alfa-1-glicoproteína ácida (AGA), que comprende poner en contacto dicha preparación con una resina atóxica, basada en silanos, hidrofílica, inorgánica y finamente dividida.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la resina es una resina sin sustituir.

3. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la resina es una resina en partículas.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la resina comprende sílice de combustión.

5. Un método para eliminar LPS de AGA según la reivindicación 3, que comprende poner en contacto una preparación que contiene AGA con una matriz de intercambio aniónico, eluir una fracción enriquecida en AGA de dicha matriz y despirogenar una fracción enriquecida en AGA mediante contacto con dicha resina en partículas, atóxica, basada
en silanos, hidrofílica, inorgánica y finamente dividida, seguido de elución de una fracción de AGA reducida en LPS.

6. Un método según la reivindicación 5, en el que la preparación que contiene AGA es el sobrenadante de la fracción V de Cohn.

7. Un método según la reivindicación 5 ó 6, en el que la preparación que contiene AGA se pone en contacto con la matriz de intercambio aniónico en presencia de una disolución etanólica del 30% al 45%.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la proporción de material que contiene AGA:matriz de intercambio aniónico es de 1000:1 a 5:1.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la preparación enriquecida en AGA eluida se neutraliza antes de la despirogenación.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proporción de resina atóxica, basada en silanos, hidrofílica, inorgánica y finamente dividida respecto de proteína AGA es de 50:1 a 0,2:1 (p/p).

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en la etapa de despirogenación la concentración de AGA en disolución es de 0,1 a 250 g/l.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la AGA despirogenada se concentra.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente una etapa de inactivación viral.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que la etapa de inactivación viral comprende la pasteurización.

15. Un método según la reivindicación 13, en el que la etapa de inactivación viral comprende la filtración.

16. AGA sustancialmente exenta de LPS, y que tiene dicha AGA una concentración de LPS inferior o igual a 0,1 UE/mg de AGA.

17. AGA según la reivindicación 16, en la que AGA tiene una concentración de LPS inferior a 0,075 UE/mg de AGA.

18. AGA según la reivindicación 16 ó 17, en la que AGA tiene una concentración de LPS inferior a 0,050 UE/mg de AGA.

19. Una preparación de AGA inactivada viralmente o reducida en virus como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

20. AGA como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para uso en terapia.

21. AGA como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para uso en el tratamiento de la toxicidad por fármacos.

22. El uso de AGA como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de la toxicidad por fármacos.

23. Una composición farmacéutica que comprende AGA como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.