DD225996A1 - Verfahren zur isolierung von serumalbumin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Isolierung von Serumalbumin mit Reactiv-Blau-2-Cellulose (Cibacronblau F3G-A-Cellulose). Erfindungsgemaess ist das Verfahren zur Isolierung von Serumalbumin mit Hilfe sphaerischer, makroporoeser Cellulose mit kovalent gebundenem Reaktiv-Blau-2 dadurch gekennzeichnet, dass Serumalbumin aus Fraktionen isoliert wird, die nach der Fraktionierung aus Blutserum durch ethanolische Fraktionierung oder Ionenaustauscherchromatographie erhalten werden. Man erhaelt reines Serumalbumin vorzugsweise aus der Zwischenfraktion IV-V der ethanolischen Fraktionierung sowie aus anderen Globulinfraktionen. Der Vorteil des Verfahrens liegt in den hoeheren Ausbeuten an Albumin, die erzielt werden, bzw. seiner Isolierung in hoher Reinheit aus Zwischenfraktionen der Serumproteingewinnung begruendet.

Description

"Verfahren zur isolierung von Serumalbumin"

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Isolierung von Serumalbumin mit Hilfe von Reaktiv-Blau-2-Cellulose (Cibacronblau-Cellulose). Anwendungsgebiet ist die Analytik und Präparation in der Chemie, Biochemie sowie der Medizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Zur Fraktionierung von Eiweißstoffen des Blutserums sind bisher verschiedene Verfahren ausgearbeitet worden (Allen, P. C, Hill, Ξ. A. und Stokes, A. M,: Plasma Proteins, Analytical and Preparative Techniques (1977), Curling, ö. M·: Methods of Plasma Protein Fractionation (1980)).. Zur Isolierung von Eiweißstoffen für therapeutische und prophylaktische Zwecke im industriellen Maßstab werden überwiegend die Frak-

tionierungen nach Cohn eingesetzt (Cohn, E. O. et al: G. Am» Chem. Soc. 63_, 4-59 (1946)).

Erst in den letzten fahren beginnen sich auf diesem Gebiet die chromatographischen Verfahren durchzusetzen. Die lonenaustauscherchromatographie benutzt man z. B. als Hauptreinigungsschritt bei der Isolierung von Serumalbumin und Globulin oder z'T Aufreinigung von Fraktionen, die vorwiegend durch Ausfällungsvsrfahren erhalten vjerden (Curling, 0« M*: Methods of Plasma Fractionation (1930), S. 77 - 153). Ebenso wird die Gelfiltration eingesetzt,

Die Beobachtung/ daß es unter bestimmten Bedingungen zu einer selektiven Wechselwirkung von Serumalbumin und dem an einem Träger kovalent gebundenen Farbstoff Reaktiv Blau 2 (Cibacronblau F3G-A, Procion Blau.H, Ostazin Slau H-3G) kommt (Travis, G. und Pannel, R.: Clin. Chim. Acta 49, 49 (1973)), rief das Interesse zur Verwendung dieses Verhaltens zur Isolierung von Albumin durch die Pseudo-Affinitätschromatograpnie (Dye-Ligand-Chromatography) hervor (Saint-31ancard, D., Kirzin, 0"· M., Riberon, P.,, Petit, F.., Foucart, 0.., Girot, P. und 3oschetti, E,: in Affinity Chromatography and Related Techniques, Eds. Gribnau, T. C· Jv, Visser, O. und Nivard, R. J, F., Elsevier 1982, S* 305).

Eine entscheidende Rolle spielt hierbei die Struktur des Farbstoffs, dessen Konzentration und Bindungsart. Vom Standpunkt der Applikation ist ebenso der Träger, die Zugänglichkei.t des affinen Liganden bei der Adsorption und Elution und die unspezifische Wechselwirkung des Trägermaterials mit den Serumproteinen von Bedeutung.

Als Trägermaterial benutzt man bis heute am häufigsten Polysaccharide vom Dextran- und Agarosetyp, neuerdings auch synthetische Polymere vom Methacrylattyp, Traditionelle Formen der Cellulose mit trägerfixiertem Farbstoff sind für praktische Zwecke der Albuminbindung ungeeignet (Angal, S. und Dean,. P. D. G.: Biochem. ο« 167, 301 (1977)), Ss ist aus VVP C 07 G/247 239/2 bekannt, daß dieser Nachteil durch sphärische, makroporöse Cellulose als Trägermaterial behoben wird. Im Vergleich zu den Dextran- und Agaroseträgern sind die Farbstoffderivate auf dieser Basis mechanisch stabiler, haben eine bessere FlieiSeigenschaft bei Arbeiten in Säulen mit hohen Drucken, und das Volumen ändert sich praktisch nicht bei Variation des pH und der Ionenstärke. Diese Eigenschaften und die bessere Zugänglichkeit ermöglichen eine Anwendung im größeren Maßstab. Dieses bekannte Verfahren geht von Voiiserurn aus mit sehr hohem Protein-, insbesondere Se-

rumalbumingehalt. Das kann häufig zu Fremdadsorptionen oder unvollständiger Albuminadsorption führen, was zur Verunreinigung und Ausbeuteverlusten führt«

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein kostengünstiges Verfahren zur Isolierung von Serumalbumin mit guten Ausbeuten aus Serumproteinfraktionen zu entwickeln.

Darlegung das Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß wird beim Verfahren zur Isolierung von Serumalbumin mit einem Träger, bestehend aus sphärischer, makroporöser Cellulose mit kovalent gebundenem Farbstoff Reaktiv Blau 2 (Cibacronblau F3G-A), das Serumalbumin aus Fraktionen isoliert, die man nach Fraktionierung des Blutplasmas durch ethanolische Fällungsmethoden oder durch Ionenaustauscher-Chromatographie erhält.

Reines Serumalbumin wird aus der Zwischenfraktion IV-V der Ethanolfraktionierung nach Cohn erhalten. Es wird jedoch auch vorteilhaft aus anderen Globulinfraktionen isoliert. Das ist einmal aus der Globulinfraktion selbst und zum anderen aus dem überstand, der nach der Entfernung der Immunglobulinfraktion der ethanoliscnen Fraktionierung entsteht. Das erfindungsgetnäße Verfahren hat den Vorteil, daß durch die Kombination von klassischen Verfahren und der Pseudoaffinitätschromatographie höhere Ausbeuten erzielt werden. Anschließend soll die Erfindung an Beispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel Beispiel 1

Der affine Träger (sphärische, makroporöse Cibacronblau FSG-A-Cellulose) wird in einer Chromatographiesäule (Gelbett: 35 χ 1,35 cm, Farbstoffkonzentration: 3,6 ,umol/ml Träger)

mit 0,05 M NaCl-Lösung äquilibriert» Es wird eine 8 %±ge ciweißlösung aufgetragen, die 94 % ^-Globulin, 1 % J^ und ß-Globulin und 5 % Albumin enthält, und auf eine Ionenstärke von 0,08 M NaCl und einem pH von 7,2 - 7,5 eingestellt, die aus der Blutserumfraktionierung nach Cohn erhalten wurde. Hierbei hat sich das Verhältnis 100 ml Lösung zu 50 ml Träger bewährt. Nach Durchlauf der Siweißlösung wird die Säule mit 0,05 M NaCl-Lösung gewaschen, bis kein Eiweiß in Eluat nachweisbar ist. Die so erhaltene reine /"-Globulin-Lösung enthält kein Albumin und wird nach bekannten Methoden aufgearbeitet. Die Regenerierung des Trägers erfolgt mit 3,5 M NaCl-Lösung und nachfolgender Äquilibrierung mit einer 0,05 M NaCl-Lösung„ Nach mehreren Zyklen wird der Träger nach der Regenerierung mit 3,5 M NaCl-Lösung mit 0,2 M HCl₁ 0,1 M NaOH und 0,05 M NaCl-Lösung behandelt.

Beispiel 2

Auf die Säule wird analog Beispiel 1 eine 2 ^iQe wäßrige Eiweißlösung aufgetragen, die 80 % Serumalburr.in enthält und durch Auflösung der Zwischenfraktion IV-V dar Ethanolfraktionierung nach Cohn oder aus der Fraktion bei der Trennung des Blutplasmas über Ionenaustauscher erhalten wird. Der pH der Lösung wurde auf 8 - 8,5 und die Ionenstärke auf 0,05 M NaCl eingestellt,

Das günstige Verhältnis Träger/Lösung ist 130 - 150 ml/ 100 ml* Nach dem Auftragen der Lösung wird so lange mit 0,05 M NaCl-Lösung· gewaschen-, bis im Eluat kein Eiweiß mehr nachweisbar ist«

Das Sluat enthält kein oder nur geringe Mengen von Serumalbumin* Die Desorption des Serumalbumins erfolgt mit 3,5 M NaCl-Lösung, bis kein Eiweiß mehr eluiert. Die>so erhaltene Lösung wird nach bekannten Verfahren entsalzen und konzentriert.

Beispiel 5

Über eine Säule analog Beispiel 1, äquilibriert mit 0,05 M NaCl-Lösung, wird eine Lösung der Zvvischenfraktion der efchanolischen Fraktionierung nach Cohn gegeben. Die Lösung enthält 19 % Ethanol, 2 % Eiweiß - es ist die Fraktion, die nach, der Entfernung der Fraktionen Ι-Ι1-ΙΙΪ zurückbleibt, der pH ist auf 8,0 - 8,5 und die Ionenstärke auf 0,05 - 0,1 M eingestellt. Die Auftragung der ethanolischen Lösung wird bei O⁰C durchgeführt. Die weiteren Arbeiten (Waschen, Desorption) werden analog 3eispiel 2 durchgeführt.

Seispiel 4

über eine Säule analog Seispiel 1 wird nach A'quilibrieren mit 0,05 M NaCl-Lösung eine Lösung aufgetragen, die nach der Entfernung von lmmunr*globulin als Überstand zurückbleibt. Die Lösung enthält 0,2 % Eiweiß mit Albumin als Hauptanteil und 25 % Ethanol, der pH ist auf 7,5 - 8 und die lonenstärke auf 0,08 M NaCl eingestellt* Dar Adsorptionsschritt erfolgt bei -1 ⁰C. Die weiteren Arbeiten (Waschen, Desorption) werden analog Beispiel 2 durchgeführt.

Beispiel 5

50 ml sphärische, makroporöse Cibacronblau FBG-A-Cellulose werden mit aqua dast. gewaschen und in 100 ml Fraktionierungsüberstand suspendiert, der nach der Entfernung von Imüiunglobulin nach der Cohn-Fraktionierung entsteht. Die Lösung enthält 0,2 % Eiweiß, dessen Hauptanteil Serumalbumin ist, sowie 25 % Ethanol, der pH ist auf 7,8 - 8,5 eingestellt. Die Suspension wird so lange gerührt, bis der Gehalt an Eiweiß wesentlich erniedrigt ist. Der beladene Träger wird durch Sedimentieren oder Filtrieren abgetrennt, dis Flüssigksit verworfen und der Träger mit 0,05 M NaCl-Lösung gewaschen. Die Desorption des Serumalbuinins erfolgt mit 3,5 M NaCl-Lösung im Satch- oder Säulenverfahren.

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Beispiel 6

Die Desorption des Serumalbumins aus den Versuchen 2-5 erfolgt mit einer wäßrigen Lösung, die 5 % NaCl, 1,6 % Natriumcaprylat und 10 % Ethanol enthält.

Claims (5)

1. -τ-

   !rrfindunqsanspruch ,

   1. Verfahren zur Isolierung von Seruraalbumin mit einem Träger, bestehend aus sphärischer, makroporöser Cellulose mit kovalent gebundenem Farbstoff Reaktiv Blau 2 (Cibacronblau F3G-A), dadurch gekennzeichnet, daß das Serumalburain

   aus Fraktionen isoliert wird, die man nach Fraktionierung des Blutplasmas durch ethanolische Fällungsmethoden oder durch lonenaustauscherchromatographie erhält.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vorzugsweise die Zvvischenfraktion IV-V der athanolischen Fraktionierung verwendet.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Globulinfraktion der ethanolischen Fraktionierung verwendet ·
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den überstand verwendet, der nach der Entfernung der Immunglobulinfraktion der ethanolischen Fraktionierung entsteht .
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Seruinalbumin aus der Fraktion IV-I>4 der ethanolischen Fraktionierung" isoliert wird.