DE602004006725T2 - Reinigung von Antikörpern durch Protein A und Ionenaustauschromatographie - Google Patents

Reinigung von Antikörpern durch Protein A und Ionenaustauschromatographie Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Antikörperreinigung in der biotechnologischen Herstellung. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuartigen Prozess zur Reinigung von einem derartigen Antikörper zu beschreiben.
  • Die Chromatographie an Protein A ist in der industriellen Herstellung von Antikörpern weit verbreitet, da sie eine nahezu vollständige Reinigung von Antikörpern, die üblicherweise IgG-Antikörper sind, in einem einzigen Schritt aus Überständen von Zellkulturen gestattet. Die Protein A Affinitätssäulen unterliegen zwangsläufig in gewissem Maße einem Verlust des Liganden von der Säule nach wiederholten Läufen. Teilweise kann dies zurückgeführt werden auf die proteolytische Abspaltung von Protein A von der Säule; in der industriellen Herstellung von Antikörpern für pharmazeutische Anwendungen sollten keine Protease-Inhibitor-Cocktails aus regulativen Beweggründen hinzugefügt werden. Unglücklicherweise behalten das verunreinigende Protein A oder das Protein A-Fragment ihre Affinität für IgG und sind schwierig aus dem gereinigten Antikörper aufgrund anhaltender Komplexbildung zu entfernen, Die Entfernung ist allerdings zwingend erforderlich, da Protein A, welches ein Bakterienprotein ist, eine unerwünschte Immunreaktion auslösen wird; ferner ist für Modellkomplexe, die durch Hinzufügen von Protein A zu monomerem IgG gebildet wurden, berichtet worden, dass sie Fc-Rezeptor-tragende Leukozyten und das Komplementsystem aktivieren, um Oxidantien und Anaphylatoxin-Aktivität in vitro zu erzeugen (Balint et al., Cancer Res. 44, 734, 1984).
  • Die Kommerzialisierung von rekombinanten Protein A-Spezies, wie in der US-Patentschrift Nr. 6,399,750 dargelegt, wobei die rekombinante Spezies über eine einzelne Thioester-Bindung mit der Säulenmatrix verbunden ist, ermöglichte Protein A-Säulen mit höheren Kapazitäten. Als ein begleitender Nachteil von solchen rekombinanten Protein A-Matrizen ist die Verlustfrequenz dabei oft im Gegensatz zu vielen traditionell, über mehrfache Punkte verbundene natürliche Protein A-Matrizen, die durch CNBr-Kopplung erhalten werden, drastisch erhöht. Die Beseitigung der Protein A-Kontamination sollte demzufolge ohne begleitende Entfernung von komplexiertem IgG ablaufen.
  • Balint et al. (ibidem) haben dargestellt, dass solche IgG-Protein Komplexe von nicht komplexiertem IgG durch Gelfiltration abgetrennt werden können. Ein niedriger Durchsatz und Einbußen in der Antikörper-Ausbeute sind die Nachteile dieser Methode.
  • Die US-Patentschrift Nr. 4,983,722 lehrt die selektive Abtrennung von verunreinigendem Protein A auf Protein A-gereinigten Antikörper-Präparationen durch Absorbieren der Mischung an ein Ionenaustauschermaterial und das Trennen beider Komponenten durch nacheinander erfolgendes Eluieren von den Antikörpern und von Protein A unter Bedingungen steigender Ionenstärke. Dieses Auftrennungsverfahren ist äußerst abhängig von dem pI des Antikörpers, welcher spezifisch und hochvariabel für einen vorgegebenen Antikörper ist. Ferner ist der Durchsatz durch die Steilheit von dem Salzgradienten, der für das Erreichen der Abtrennung benötigt wird, eingeschränkt.
  • Jiskoot et al. (Developments in Biological Standardisation, 71, 73, 1990) offenbaren die Verwendung von Anionen-Austauschersäulen als ein Mittel zum Entfernen von verunreinigendem Protein A aus einer Antikörper-Präparation, jedoch enthält, im Unterschied zu der vorliegenden Erfindung, der Durchfluss von dem Ionenaustauschschritt keinen Antikörper und ist deshalb Abfallmaterial.
  • Es ist eine Aufgabe von der vorliegenden Erfindung, ein weiteres verfahren zum Abtrennen von Protein A oder Protein A-Fragmenten von Antikörper, vorzugsweise ein IgG, zu entwickeln, wobei das Verfahren die Nachteile des Standes der Technik vermeidet. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine solche Aufgabe gemäß den unabhängigen Ansprüchen 1 und 14 gelöst.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Reinigen von einem Antikörper entwickelt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Erstens, Reinigen von einem Antikörper mittels der Protein A-Chromatographie, wobei das Protein A ein natives Protein A oder ein funktionelles Derivat davon ist.
  • Zweitens, Laden des gereinigten Antikörpers auf ein Ionenaustauschermaterial unter Bedingungen, welche die Bindung von dem Protein A oder von seinem funktionellen Derivat gestatten und drittens, das Auffangen des Antikörpers, vorzugsweise mindestens 70 % aufzufangen, insbesondere mindestens 80 % aufzufangen, am meisten bevorzugt mindestens 90 % von der Menge des Antikörpers, der auf das Ionenaustauschmaterial geladen wurde, in dem Durchfluss von dem Ionenaustauscher aufzufangen, während jedes verunreinigende Protein A oder Protein A-Derivat an das Ionenaustauschmaterial gebunden wird.
  • Das Protein A ist ein Zelloberflächenprotein, das in Staphylococcus aureus gefunden wird. Es besitzt die Eigenschaft, den Fc-Bereich von einem Säugerantikörper zu binden, insbesondere den von Antikörpern der IgG-Klasse. Innerhalb einer vorgegebenen Klasse von Antikörpern variiert die Affinität hinsichtlich des Speziesursprungs und der Antikörper-Unterklasse oder dem Antikörper-Allotyp (besprochen in Surolia, A. et al., 1982, Protein A: Nature's universal 'antibody', TiBS 7, 74–76; Langone et al., 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Advances in Immunology 32:157–252). Das Protein A kann direkt aus Kulturen von S. aureus, die Protein A sezernieren, isoliert werden oder wird zweckdienlicher in E. coli rekombinant exprimiert (Lofdahl et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 697–701). Seine Verwendung zu Reinigung von Antikörpern, insbesondere monoklonalem IgG, ist ausgiebig in dem Stand der Technik beschrieben (z. B. Langone et al., supra; Hjelm et al., 1972; FERS Lett, 28: 73–76). Für die Verwendung in der Protein A-Chromatographie wird Protein A an eine feste Matrix wie quervernetzte, ungeladene Agarose (Sepharose, die von dem geladenen Anteil der natürlichen Agarose befreit wurde), Trisacryl, quervernetztes Dextran oder Silica-basierende Materialien gekoppelt. Die Verfahren dafür sind üblicherweise auf dem Fachgebiet bekannt, z. B. Kopplung über primäre Aminofunktionen von dem Protein an eine CNBr-aktivierte Matrix. Protein A bindet mit hoher Affinität und hoher Spezifität an den Fc-Anteil von IgG, das ist der Cγ2-Cγ3-Übergangsbereich von IgG, wie in Langone et al., 1982, supra, beschrieben. Insbesondere bindet es stark an die menschlichen Allotypen oder Subklassen IgG1, IgG2, IgG3 und die Maus-Allotypen oder Unterklassen IgG2a, IgG2b und IgG3. Das Protein A weist auch eine Affinität für den Fab-Bereich von Immunglobulinen auf, die durch die VH Genfamilie, VH III, kodiert werden (Sasso et al., 1991, J. Immunol, 61: 3026–3031; Hilson et al., J Exp. Med., 178: 331–336 (1993)). Die Sequenz von dem Gen, welches für Protein A kodiert, lässt zwei funktionell unterschiedliche Bereiche erkennen (Uhlen et al., J. Biol. Chem., 259: 1695–1702 (1984); Lofdahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80: 697–701 (1983)). Der amino-terminale Bereich enthält fünf äußerst homologe IgG-Bindungsdomänen (bezeichnet E, D, A, B und C) und der carboxy-terminale Bereich verankert das Protein an die Zellwand und -membran. Alle fünf IgG-Bindungsdomänen von Protein A binden an IgG über den Fc-Bereich, der z. B. in dem menschlichen IgG-Fc die Reste 252–254, 433–435 und 311 einbezieht, wie es für die Kristallstruktur in Deisenhofer et al. (1981, Biochemistry 20: 2361–2370) und in Sauer-Eriksson et al. (1995, Structure 3: 265–278) im Falle von der B-Domäne von Protein A gezeigt wurde. Das Auffinden von zwei im Wesentlichen zusammenhängenden Hauptbindungsstellen in dem Fc-Anteil ist in der NMR-Auflösungs-Untersuchung von Gouda et al., 1998, Biochemistry 37:129–136 bestätigt worden. Im Prinzip ist jede einzelne von den IgG-Bindungsdomänen A bis E von Protein A für die Bindung an den Fc-Anteil von einem IgG ausreichend.
  • Ferner ist gefunden worden, dass bestimmte Allele von der VH3-Familie im Menschen das wahlweise Binden von menschlichem IgG durch Protein A vermitteln (Ibrahim et al., 1993, J. Immunol. 151: 3597–3603; V-region mediated binding of human Ig by Protein A ). Im Rahmen von der vorliegenden Anmeldung trifft alles das, was in einer weiteren getrennten Aufgabe von der vorliegenden Erfindung über die Bindung von Fc-Bereichen der Antikörper an Protein A gesagt wurde, gleichermaßen auf die Bindung von Antikörpern über derartige Protein A-Bindungsallele der VH3-Familie in dem Fall zu, dass der Fc-Bereich von einem solchen Antikörper nicht von selbst die hochaffine Protein A-Bindung gestattet. Es sollte eine gleichwertige Ausführungsform von dem prinzipiellen Fc-basierenden Verfahren von der vorliegenen Erfindung in Erwägung gezogen werden; das letztere ist weiter in den nachfolgenden Abschnitten beschrieben.
  • Ein IgG-Antikörper sollte verstanden werden als ein Antikörper von einem solchen Allotyp, dass er an Protein A in einem Hochaffinitäts-Modus gebunden werden kann. Ferner, abgesehen von den Fc-Anteilen von dem Antikörper, die für die Bindung an Protein A relevant sind, muss solch ein Antikörper nicht mit einem natürlich vorkommenden Antikörper übereinstimmen. Insbeson dere kann in seinen Anteilen der Bereiche der variablen Ketten es ein künstlich hergestellter chimärer oder Antikörper mit aufgepfropftem CDR (humanisierter Antikörper) sein, wie sie routinemäßig in dem Fachgebiet entwickelt werden. Ein IgG-Antikörper sollte, kurz gesagt, als ein IgG-Typ Antikörper verstanden werden.
  • Ein funktionelles Derivat von Protein A ist durch eine Bindungskonstante von mindestens K = 10–8 M, vorzugsweise K = 10–9 M für den Fc-Anteil von Maus-IgG2a oder menschlichem IgG1 gekennzeichnet. Eine Interaktion, welche mit einem derartigen Wert für die Bindungskonstante übereinstimmt, wird in dem vorliegenden Kontext als „hoch affine Bindung" bezeichnet. Vorzugsweise umfassen solche funktionellen Derivate von Protein A mindestens Bereiche von einer funktionellen IgG-Bindungsdomäne von dem Wildtyp-Protein A, wobei die Domäne aus den natürlichen Domänen E, D, A, B und C oder aus künstlich hergestellten Muteinen daraus, welche ihre IgG-Bindungsfunktionalität bewahrt haben, ausgewählt wurde. Ein Beispiel für eine solche ist das funktionelle 59-Aminosäure große „Z-Fragment" von der B-Domäne von Protein A, wobei die Domäne, wie in US-Patentschrift Nr. 6,013,763 dargelegt, für die Antikörperreinigung verwendet werden kann. Vorzugsweise umfasst ein Antikörper-bindendes Fragment jedoch mindestens zwei intakte Fc-Bindungsdomänen, wie in diesem Absatz festgelegt. Ein Beispiel von solch einem Fragment sind die rekombinanten Protein A-Sequenzen, die z. B in EP-282 308 und EP-284 368 , beide von der Repligen Corporation, offengelegt wurden.
  • Alleine oder in Kombination mit einem Protein A- oder einem funktionellen Protein A-Fragment oder Derivat, wie in den vorhergehenden Abschnitten festgelegt, werden ferner Protein A-Fragmente bevorzugt, die künstlich so hergestellt sind, dass sie die Einzelpunktverbindung gestatten. Einzelpunktverbindung bedeutet, dass der Proteinrest über eine einzelne kovalente Bindung an ein chromatographisches Trägermaterial von der Protein A-Affinitätschromatographie gebunden ist. Derartige Einzelpunktverbindungen werden mit Hilfe von geeigneten reaktiven Resten, welche ferner ideal an einer exponierten Aminosäureposition platziert sind, namentlich in einer Schleife nahe von dem N- oder C-Terminus oder anderswo an der Peripherie von dem gefalteten Protein hergestellt. Geeignete reaktive Gruppen sind z. B. Sulfhydryl- oder Aminofunktionen. Insbesondere umfasst solch ein rekombinantes Protein A oder ein funktionelles Fragment daraus ein Cystein in seiner Aminosäuresequenz. Am meisten bevorzugt ist das Cystein in einem Segment eingebaut, das aus den letzten 30 Aminosäuren des C-Terminus von der Aminosäuresequenz von dem rekombinanten Protein A oder einem funktionellen Fragment daraus besteht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von einem derartigen Typ ist das rekombinante Protein A oder das funktionelle Fragment daraus mit mindestens 50 % über eine Thioether-Schwefelbindung an das chromatographische Säulen- oder Matrixmaterial von dem Protein A-Affinitätschromatographie-Medium gebunden. Ein Beispiel für eine derartige Ausführungsform ist z. B. beschrieben in der US-Patentschrift Nr. 6,399,750 von Pharmacia und ist käuflich erhältlich unter den Markenbezeichnungen StreamlineTM oder MabSelectTM von Amersham-Biosciences, abhängig von der Beschaffenheit der verwendeten Säulenmatrix. In dem vorliegenen Kontext muss Thioether eingeengt als ein -S-Bindungsschema ohne Rücksicht auf den chemischen Zusammenhang verstanden werden, wobei es in diesem Bezug von dem normalen chemischen Sprachgebrauch abweicht, so dass es möglich ist, zum Beispiel, dass die -S-„Thioether-Brücke" einen Teil einer größeren funktionellen Gruppe wie zum Beispiel eines Thioesters oder eines gemischten Acetals darstellt, wobei es in diesem Zusammenhang in dem Kontext von der vorliegenden Anmeldung von der Reaktivitäts-basierenden normalen Sprache von Chemikern abweicht. Vorzugsweise ist die Thioetherbrücke eine Thioetherbrücke in ihrer allgemeinen, eingeengten chemischen Bedeutung. Solch eine überbrückende Thioethergruppe kann z. B. durch Umsetzen der Sulfhydryl-Gruppe von einem Cysteinrest von dem Protein A mit einer Epoxid-Gruppe, die an dem chromatographischen Trägermaterial angeheftet war, erzeugt werden. Mit einem terminalen Cysteinrest kann eine derartige Reaktion unter Bedingungen ausgeführt werden, die geeignet sind, nur die Kopplung von einer exponierten einzigen Sulfhydryl-Gruppe von einem Protein zu gestatten, um so nur in der Einzelpunktverbindung von solch einem Protein zu resultieren.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Protein A- oder funktionelle Protein A-Derivat das rekombinante Protein A, das in US-Patentschrift Nr. 6,399,750 offengelegt ist, welches einen juxtaterminalen künstlichen Cysteinrest umfasst und das, vorzugsweise mit mindestens 50 insbesondere mindestens 70 an das chromatographische Trägermaterial durch ein Schwefelatom von dem Cysteinrest als dem alleinigen Punkt der Verbindung gekoppelt ist. Ferner ist bevorzugt, dass solch eine Kopplung mittels Epoxid-vermittelter Aktivierung erreicht worden ist, insbesondere entweder mittels 1,4-bis-(2,3-Epoxypropoxy)butan-Aktivierung von z. B einer Agarose-Matrix wie Sepharose Fast Flow (Agarosekügelchen, die mit Epichlorhydrin quervernetzt sind, Amersham Biosciences, UK) oder mittels einer Epichlorhydrin-Aktivierung von z. B einer Agarose-Matrix wie Sepharose FF. Ferner ist in der Kombination mit der vorher genannten bevorzugten Ausführungsform gemäß diesem Absatz bevorzugt, dass der erste Ionenaustauscher ein Anionenaustauscher ist, insbesondere ein auf einem quaternären Amin basierenden Anionenaustauscher wie Sepharose QTM FF (Amersham-Biosciences/Pharmacia), am meisten bevorzugt ist es ein Anionenaustauscher, der eine funktionelle Austauschergruppe Q aufweist, die an eine Säulenmatrix gekoppelt ist, wobei die Gruppe Q N,N,N-Trimethylaminomethyl ist, am meisten bevorzugt ist der Anionenaustauscher Sepha rose QTM FF von Pharmacia/Amersham-Biosciences. Die quaternäre Aminogruppe ist ein starker Austauscher, welcher weiterhin gegenüber Änderungen in dem pH-Wert von dem Beladungs-/Wasch-Puffer nicht empfindlich ist. Die sogenannte Fast-Flow Austauscher-Matrix basiert auf 45–165 μm großen Agarosekügelchen, die einen hohen Grad der Quervernetzung für eine höhere physikalische Stabilität aufweisen; ferner ist Sepharose frei von geladenen, sulfatierten Molekülanteilen von natürlicher Agarose und gestattet keine unspezifische Adsorption des Antikörpers an der Matrix, sogar unter Bedingungen von hoher Antikörperbeladung. Ein Beispiel von einer derartigen Ausführungsform kann in dem experimentellen Abschnitt gefunden werden.
  • Ein verunreinigendes Protein A ist jeder Typ von einem funktionellen IgG-bindenden Abkömmling von einem Protein A oder einem funktionellen Derivat hiervon, wie oben definiert, welches nach dem Eluieren von gebundenem Antikörper von einer Protein A-Affinitätschromatographiesäule erhalten wurde. Solch eine verunreinigende Protein A-Spezies kann z. B. aus der Hydrolyse von Peptidbindungen resultieren, was sich sehr wahrscheinlich durch Enzymwirkung insbesondere in industriellen Herstellungsprozessen ereignet. Die Protein A-Chromatographie wird als ein früher Schritt in der Reingewinnung angewendet, wenn die grob gereinigte, frische Produktlösung noch beträchtliche Proteaseaktivität in sich beherbergt. Absterbende Zellen in dem Zellkulturnährmedium oder Zellen, die in den anfänglichen Zentrifugations- oder Filtrationsschritten zerstört wurden, haben wahrscheinlich Proteasen freigesetzt; zum Zweck der Regulierung wird, im Gegensatz zur biochemischen Forschungspraxis, eine Ergänzung des Zellkulturnährmediums mit Proteaseinhibitoren vor oder während der Reingewinnung üblicherweise nicht durchgeführt. Beispiele sind Phenyl-methyl-sulfonyl-chlorid (PMSF) oder ε-Capronsäure. Solche chemischen Wirkstoffe sind als Zusätze in der Produktion von Biopharmazeutika unerwünscht. Es ist weiterhin möglich, dass rekombinante funktionelle Derivate oder Fragmente von Protein A weniger proteaseresistent sind als das Wildtyp-Protein A, abhängig von der Tertiärstruktur der Proteinfaltung. Die Aminosäuresegmente, die individuelle IgG-Bindungsdomänen miteinander verbinden, könnten exponiert sein, sobald die Gesamtzahl der Bindungsdomänen vermindert ist. Interdomänekontakte können möglicherweise zu der Stabilität bei der Faltung der Domäne beitragen. Es kann auch sein, dass die Bindung von dem Antikörper durch Protein A oder den funktionellen Derivaten daraus die Empfindlichkeit für die Proteasewirkung aufgrund von konformationellen Änderungen, die durch die Bindung von dem Antikörper induziert werden, beeinflusst oder fördert. Noch einmal, Wildtyp- oder komplettes Protein A oder funktionelle, künstlich erzeugte Fragmente davon können sich unterschiedlich verhalten. Vorzugsweise ist das verunreinigende Protein A noch ein funktionelles, IgG-bindendes Protein und ist somit mit dem Protein A-gereinigten Antikörper verbunden, wenn es auf das nachfolgende Ionenaustausch-Trennungsmedium geladen wird. Die auf einer hohen Affinität basierende Assoziation von verunreinigendem Protein A mit dem gereinigten Antikörper ist der Grund, warum es schwierig ist, wirkungsvoll verunreinigendes Protein A von gereinigtem Antikörper abzutrennen.
  • Vorzugsweise wird der Antikörper, der gereinigt werden soll, aus einer Zellkultur vor der Reinigung des Antikörpers mittels einer Protein A-Affinitätschromatographie geerntet. Insbesondere ist die Zellkultur eine Säugerzellkultur. Säugerzellen weisen große Kompartimente auf, Lysosomen genannt, die abbauende Enzyme in sich beherbergen, wobei die Kompartimente durch den Zelltod oder die Ernte zerstört werden. Insbesondere kann die Zellkultur eine Myeloma-Zellkultur wie z. B. NSO-Zellen sein (Galfre, G. und Milstein, C. Methods Enzymology, 1981, 73, 3). Myelomzellen sind Plasmozytomzellen, d. h. Zellen von einer Lymphzell-Linie. Eine beispielhafte NSO-Zelllinie ist z. B. die Zelllinie ECACC Nr. 85110503, die kostenlos von der European Collection of Cell Cultures (ECACC), Zentrum für Angewandte Mikrobiologie und Forschung, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Vereinigtes Königreich, erhalten werden kann. Für NSO-Zellen ist gefunden worden, dass sie in der Lage sind, extrem hohe Produktausbeuten hervorzubringen, insbesondere wenn sie für die Herstellung von rekombinanten Antikörpern verwendet werden. Dafür ist für NSO-Zellen gefunden worden, dass sie reproduzierbar höhere Spiegel an verunreinigendem Protein A hervorrufen, als es andere Wirtszelltypen tun, zumindest mit bestimmten Protein A-Affinitätschromatographiesystemen, welche rekombinante, gekürzte Fragmente von Wildtyp-Protein A einsetzen, wobei das rekombinante Protein A möglicherweise ein über einen Einzelpunkt verbundenes Protein A ist. Ein Beispiel dafür ist das StreamlineTM rProtein A-Affinitätschromatographie-Harz (Amersham Biosciences; im Wesentlichen ein über einen Einzelpunkt-Thioester angekoppeltes rekombinantes Protein A, wie in der US-Patentschrift Nr. 6,399,750 beschrieben). Spiegel von etwa oder höher als 1.000 ng verunreinigendes Protein A/mg Antikörper konnten mit den StreamlineTM rProtein A-Affinitätssäulen erhalten werden. Das Verfahren von der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem Stand der Technik in der wirkungsvollen Verminderung an verunreinigendem Protein A von solch erhöhten Spiegeln auf < 1 ng/mg Antikörper in einem einzigen, schnellen Reinigungsschritt, der mit einem Reinigungsfaktor von etwa 1.000-fach einhergeht.
  • Weiterhin wird, alleine oder in Kombination mit den vorhergehenden Absätzen, bevorzugt, dass der Antikörper, der mittels Protein A-Affinitätschromatographie zu reinigen ist, nicht behandelt wird, um Proteasen bei oder nach der Ernte zu inaktivieren, vorzugsweise ist er nicht mit mindestens einem exogen nach der Ernte zugesetzten Proteaseinhibitor in Vermischung. Am meisten bevorzugt wird, dass der Proteaseinhibitor ausge wählt wird aus der Gruppe bestehend aus PMSF, spezifischen Proteinase-inhibierenden Peptiden, wie beschrieben bei Laskowski et al., 1980, Protein inhibitors of proteinases, Ann. Rev. Biochem. 49, 593–626, und Epsilon-Capronsäure.
  • Der Einsatz von Protein A-Affinitätschromatographie ist in großem Umfang in der technischen Literatur beschrieben worden und braucht hier nicht weiter beschrieben zu werden. Ein weiteres Beispiel getrennt von den oben zitierten ist z. B Duhamel et al., J. Immunological Methods 31, (1979) 211–217, pH Gradient elution of human IgG1, IgG2 and IgG4 from Protein A-Sepharose.
  • Vorzugsweise wird das verunreinigende Protein A auf eine Konzentration von < 10 ng/mg Antikörper vermindert, insbesondere < 4 ng/mg Antikörper und am meisten bevorzugt < 1 ng/mg Antikörper in dem Durchlauf von dem ersten Ionenaustauscher, wobei Antikörper bevorzugt in Bezug auf IgG zu verstehen ist. Das ELISA-Testverfahren zur Validierung von diesen Schwellenwerten ist detailliert in dem experimentellen Abschnitt beschrieben; es sollte beachtet werden, dass die Ansäuerung von der Probe auf einen pH-Wert ≤ 4, vorzugsweise in der Anwesenheit von einem milden Detergens, äußerst wichtig für die akkurate Bestimmung von der Menge an ausgelaufenem Protein A ist. Es muss nicht besonders angesprochen werden, das dieser Schwellenwert so zu verstehen ist, dass die Beladungskapazität von dem ersten Ionenaustauscher für Protein A-Bindung niemals überschritten wird, was unvermeidlich zu einem Hindurchlaufen von verunreinigendem Protein A führt. Ein geeignetes, auf einem ELISA basierenden Verfahren zum Testen von Protein A oder Protein A-Fragmenten ist in der US-Patentschrift 4,983,722 beschrieben. Geeignete Anti-Protein A-Antikörper sind handelsüblich erhältlich z. B. von Sigma-Aldrich. Insbesondere wenn Derivate von Protein A verwendet werden, wobei die Derivate tech nisch konstruiert worden sind, zusätzliche Sulfhydrylgruppen zu beherbergen, ist die ordnungsgemäße Erhaltung von dem Proteinstandard bedeutsam. Es kann wichtig sein, den monomeren Charakter von einem derartigen reinen Protein A-Derivat, das als ein Standard für die Quantifizierung von der Testprobe verwendet wurde, zu bestätigen, da kovalente Di- oder Multimere, die über -S-S-Brücken gebildet wurden, zu falschen Ergebnissen führen könnten. Die Nachprüfung kann leicht durch SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen erreicht werden, wie es auf dem Fachgebiet gebräuchlich ist. Die Reduktion von solch einer Protein A-Derivat-Standardlösung mittels DTT oder beta-Mercaptoethanol hilft entsprechend Fehler in der Messung in der ELISA-Technik zu umgehen.
  • Ferner ist bevorzugt, dass in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 % von dem Antikörper, der auf den ersten Ionenaustauscher geladen wurde, in dem Durchfluss von dem Ionenaustauscher wiedererlangt werden kann.
  • Der erste Ionenaustauscher ist ein Anionenaustauscherharz; Protein A kann von beiden Harz-Typen, wie beschrieben ( EP-289 129 B1 ), gebunden werden. Der erste Ionenaustauscher oder Anionenaustauscher kann in dem Säulenmodus bei einer bestimmten Flussgeschwindigkeit oder in dem Batch-Arbeitsmodus betrieben werden, indem das Ionenaustauschharz in die leicht bewegte Probenlösung eingetaucht und ferner das flüssige Medium nachfolgend durch Filtration ausgetauscht wird. Wenn man den pI-Wert von einem vorgegebenen Antikörper in Betracht zieht, ist es möglich, geeignete Bedingungen für pH-Wert und Ionenstärke für die Beladung des ersten Ionenaustauschers festzulegen, wobei diese Bedingungen darin resultieren, dass der Antikörper in dem Durchfluss behalten wird, während das verunreinigende Protein A gebunden wird und dadurch von dem Antikörper ab getrennt wird. Wie vorher gesagt wurde, erlaubt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine schnellere Abtrennung eines Antikörpers von verunreinigendem Protein A. Beispiele für funktionelle Gruppen von solch einem ersten Ionenaustauscher, die an einer Säulenmatrix angekoppelt sind, sind z. B. primäre, sekundäre und insbesondere tertiäre oder quaternäre Aminogruppen wie Aminoethyl, Diethylaminoethyl, Trimethylaminoethyl, Trimethylaminomethyl und Diethyl-{2-hydroxypropyl)-aminoethyl. Geeignete chromatographische Säulenmatrizes für den Anionenaustauscher sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele sind auf Agarose basierende Harze und Kügelchen, Dextrankügelchen, Polystyrolkügelchen und Polystyrol-/Divinylbenzen-Harze. Am meisten bevorzugt ist der Anionenaustauscher ein auf einem quaternären Amin basierender Ionenaustauscher, der an einer Agarose-Matrix wie z. B. Sepharose CL-6B oder Sepharose Fast Flow (FF) von Amersham-Biosciences/Pharmacia angekoppelt ist. Ein Beispiel dafür ist Sepharose QTM von Amersham-Biosciences/Pharmacia. Ferner bevorzugt in der Verbindung mit der Verwendung von einem ersten Ionenaustauscher ist, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der einen isoelektrischen Punkt (pI) aufweist, der mindestens zwei pH-Einheiten oberhalb liegt, das heißt, er ist basischer als der pI von dem Protein A, das in dem vorhergehenden Protein A-Affinitätschromatographieschritt verwendet wurde; Z. B. während hingegen das native Protein A einen pI-Wert von etwa 5,0 aufweist, besitzt das Streamline-rekombinante-Protein A einen pI-Wert von etwa 4,5. Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der einen isoelektrischen Punkt (pI) aufweist, der mindestens 6,5 oder oberhalb davon ist, insbesondere 7,0 oder darüber ist, am meisten bevorzugt weist er einen pI-Wert von mindestens 7,5 oder darüber auf. Es sollte beachtet werden, dass dies sich auf den pI-Wert von dem aktuell geernteten und gereinigten Antikörper bezieht, nicht auf den pI-Wert, der einfach allein aus der Aminosäuresequenz vorhergesagt werden kann. Das eigentlich gerei nigte Antikörper-Molekül kann weiteren Modifikationen von dem Polypeptid-Rückgrat unterzogen werden, wie Glykosylierung, wobei diese Modifikationen zusätzliche geladene Reste hinzugefügt haben können und somit den pI-Wert von dem Molekül geändert haben. Nach der Bestimmung von dem pI-Wert für den Produkt-Antikörper mittels der isoelektrischen Fokussierung (IEF) führt die Mikroheterogenität des posttranslationalen Prozessierens von dem Antikörper-Protein, z. B. einem monoklonalen Antikörperprotein, zu einem breiteren pI-Bereich für individuelle Antikörper-Glykoproteinmoleküle des Produktes, wobei diese eher einem Schmier in einem IEF-Gel als einer einzelnen Bande ähneln und somit einem spezifischen numerischen Betrag für mindestens die Mehrheit des Produktes. Der „pI-Wert von einem Antikörper" bezieht sich auf den Anteil von den Antikörper-Produktmolekülen, deren pI-Wert innerhalb des bevorzugten Bereiches von dem pI, wie oben festgelegt, liegt. Alle weiteren Definitionen von dieser Beschreibung wie zum Beispiel der Prozentanteil an Antikörper, der nach einem vorgegebenen Reinigungsschritt gewonnen wurde, beziehen sich nur auf den pI-konformen Anteil von dem Antikörper.
  • Der Betriebsmodus von einem ersten Anionenaustauscher erfordert den Pufferaustausch von dem saueren oder neutralisierten Eluat von dem Protein A-Affinitätschromatographieschritt mit dem Equilibrierungspuffer von dem ersten Anionenaustauscher. Der Equilibrierungspuffer und Beladungspuffer sind in dem Verfahren von der vorliegenden Erfindung identisch. Die üblicherweise eingesetzten Ultrafiltrationsvorrichtungen, wie solche die von Amicon oder Millipore verkauft werden, können zweckdienlicherweise für diese Zielsetzung benutzt werden; diese vermeiden die Verdünnungseffekte solange z. B. niedermolekulargewichtige poröse Filtermatrizen wie Sepharose G-25 verwendet werden. Der Equilibrierungspuffer weist vorzugsweise eine Salzkonzentration von einem Verdrängungssalz wie z. B Natrium chlorid in dem Bereich von 1 bis 150 mM, insbesondere von ab 5 bis 110 mM, am meisten bevorzugt von ab 20 bis 100 mM Salz auf. Der pH-Wert des Equilibrierungspuffers liegt vorzugsweise in dem Bereich von pH 6.5 bis pH 9,0, insbesondere liegt er in dem Bereich von pH 7,5 bis 8,5, am meisten bevorzugt in dem Bereich von pH 7,9 bis 8,4. Es sollte beachtet werden, dass die N-terminale Aminofunktion von einem Protein einen pKs-Wert von etwa 9,25 aufweist, folglich wird die Bindung von verunreinigendem Protein A und jedem anderen bereits negativ geladenen Protein an einen Anionenaustauscher bei basischerem pH-Wert stärker werden; in einer vorgegebenen Anwendung könnte daher der pH-Wert des Beladungspuffers eine Feineinstellung für die optimale Unterscheidung zwischen Bindung und Nicht-Bindung für ein vorgegebenes Paar von Antikörper und Protein A nötig machen, die unterschiedliche pI-Werte und unterschiedliche Gehalte an Cystein- und Histidin-Seitenketten aufweisen, welche zu Änderungen in der Ladung innerhalb des ausgewählten Bereiches des pH-Wertes beitragen können. Ferner beeinträchtigt ein basischerer pH-Wert die Protein A-Antikörper Interaktionen, wie es jede Zunahme in der Ionenstärke tun wird; gleichermaßen benötigt die Ionenstärke eine Feineinstellung, um die Balance herzustellen zwischen der Verhinderung der Bindung von Antikörper und der Notwendigkeit, die Bindung von verunreinigendem Protein A zu blockieren. Es muss für den Fachmann nicht besonders angesprochen werden, dass die Ionenstärke von dem Puffer üblicherweise in umgekehrter Weise mit dem pH-Wert korreliert ist; je stärker Protein A abhängig von dem pH-Wert an den Ionenaustauscher gebunden wird, desto mehr Salz wird für die Verhinderung der Bindung von dem Antikörper und dem Interferieren von potentiellen Protein A-Antikörper Interaktionen toleriert. Demzufolge sind die oben vorgegebenen Bereiche für den pH-Wert und das Verdrängungssalz als miteinander korreliert zu verstehen. Je niedriger der pH-Wert, desto weniger Salz wird als zulässig innerhalb der vorstehend vorgegebenen be vorzugten Arbeitsbereiche der Erfindung gefunden werden. Ferner wird eine Salzfracht durch die den pH-Wert puffernde Substanz hinzugefügt, was weiterhin die Ionenstärke von der Lösung erhöht. Die Ionenstärke kann durch die Bestimmung der Leitfähigkeit von dem Eguilibrierungspuffer bestimmt werden. Die Bezeichnung „Leitfähigkeit" bezieht sich auf die Fähigkeit von einer wässrigen Lösung, einen elektrischen Strom zwischen zwei Elektroden zu leiten und ist ein Maß für die Gesamtmenge an Ionen, wobei zusätzlich die Ladung und die Ionenbeweglichkeit in Betracht gezogen werden. Demzufolge wird mit einer zunehmenden Menge von Ionen, die in der wässrigen Lösung vorhanden sind, die Lösung eine höhere Leitfähigkeit aufweisen. Die Einheit für die Messung der Leitfähigkeit ist mS/cm (milliSiemens/cm) und sie kann unter Verwendung eines handelsüblich erhältlichen Leitfähigkeitsmessgerätes, z. B. von Topac Inc. (Hingham, MA/USA) oder von Honeywell, gemessen werden. In dem Rahmen von der vorliegenden Anmeldung sind alle Zahlenwerte auf die spezifische Leitfähigkeit bei 25 °C bezogen. Vorzugsweise weist der Beladungs- oder Equilibrierungspuffer für den ersten Anionenaustauscher-Schritt eine Leitfähigkeit von 0,5–5 mS/cm auf, insbesondere von ab 1–3 mS/cm, am meisten bevorzugt von ab 1,25–2,50 mS/cm. Idealerweise weisen sie eine Leitfähigkeit von etwa 2 mS/cm auf. Beispiele für geeignete Puffersalze können in Good, N. E. (1986, Biochemistry 5: 467–476) gefunden werden; z. B. sind Tris-HCl oder ein Natriumhydrogenphosphat-Puffer, wie sie gewöhnlicherweise eingesetzt werden, geeignete puffernde Substanzen. Die Konzentration von der Puffersubstanz ist gebräuchlicherweise in dem Bereich von z. B. 10–40 mM Puffersalz. Unter den potentiellen Anionenspezies, die für die Entwicklung von einem Puffer verwendbar sind, sind diejenigen bevorzugt, die verglichen mit Chlorid eine niedrigere spezifische Stärke der Anionenelution aufweisen, wobei die Eigenschaft der niedrigeren Elutionsstärke ungefähr umgekehrt mit der Dichte der Ionenladung korreliert ist und ungefähr proportional zu der Größe der Ionen. Empirische Vergleiche der Stärke der Anionenelution sind in den Standard-Textbüchern der Biochemie tabellarisch aufgelistet. Insbesondere bevorzugt ist die Puffersubstanz ein Phosphatpuffer. Hydrogenphosphat weist eine niedrige Elutionsstärke auf, insbesondere wenn es bei einem pH-Wert bei oder unterhalb von pH 8 eingesetzt wird, und es weist sich ferner durch insbesonders geringe chaotrope Eigenschaften aus.
  • Während hingegen das Arbeiten im Batch-Verfahren möglich ist, wird das Arbeiten mit der Säule für den ersten Anionenaustauscher-Schritt bevorzugt. In diesem Falle kann eine Flussgeschwindigkeit von etwa 10 bis 60 ml/h vorteilhafterweise eingesetzt werden. Die Beladungskonzentration von dem Antikörper, der auf die Säule geladen wird, kann günstigerweise in dem Bereich von 10 bis 30 mg Antikörper/ml Austauscher-Harz liegen. Es muss nicht ausdrücklich angesprochen werden, dass, wie es dem Fachmann bekannt ist, die Verwendung von außerordentlich verdünnten Proben eine verringerte Ausbeute an Antikörper hervorrufen würde. Der Antikörper, der für die Reinigung vorgesehen ist, wird in dem Durchlauf von dem Arbeitsschritt der Beladung aufgefangen, einschließlich von etwa einem Säulenvolumen des Waschschrittes mit demselben Equilibrierungspuffer. Der pH-Wert von dem Durchlauf kann auf einen neutralen pH-Wert eingestellt werden, um die Stabilität zu verbessern und die Aggregation und/oder die Präzipitation von dem Antikörper-Protein zu verhindern.
  • Nach dem ersten Anionenaustauscher ist der Antikörper bereit für die Verwendung in Anwendungen oder kann erachtet werden, noch eine weitere Verfeinerung durch gebräuchliche Reinigungsverfahren zu benötigen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform folgt dem ersten Anionenaustauscher-Schritt ein zweiter Ionenaustausch-Schritt, wobei in diesem zweiten Schritt der Antikörper auf das zweite Ionenaustauschermaterial aufgeladen und durch es gebunden wird und mit einem Puffer, der hinsichtlich erhöhtem Salzgehalt und/oder pH-Wert unterschiedlich zu dem Beladungspuffer ist, als ein im Wesentlichen monomerer, nicht-aggregierter Antikörper eluiert werden. In diesem Zusammenhang bedeutet „im Wesentlichen" weniger als 5 Vorzugsweise ist, alleine oder in Kombination mit einer bevorzugten Ausführungsform, die in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben wurde, der zweite Ionenaustauscher ein Kationenaustauscher. Eine derartige Kombination von einem Protein A-Chromatographie-Schritt, gefolgt durch einen ersten Anionenaustauscher- und einen zweiten Kationenaustauscher-Schritt ist neuartig. Es ist gut bekannt, dass Spuren verunreinigender Proteine aus Zellkulturnährmedien viel geringere pI-Werte als Antikörper aufweisen, insbesondere IgG-Antikörper; der Kationenaustausch wird folglich die wirksame Entfernung sowohl von aggregiertem Antikörper als auch von potentiellen infektiösen Substanzen wie Viruscapside sowie Proteinkontaminationen von anderen Antikörpern ermöglichen. Aufgrund des schnellen Arbeitsablaufes, der hohen effizienten Wiedergewinnung von dem Antikörper nach der Beladung, das Binden an und die Elution von der Säule und der hohen Kapazität der Beladung, gestattet der Kationenaustausch ebenfalls den wiederholten, zyklischen Arbeitsablauf mit einer einzelnen Charge an Antikörper mit dem zusätzlichen Effekt von dem Reinigungsfaktor, der in einer einzelnen Runde von Bindung und Elution erreicht wurde. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert von dem Beladungspuffer etwa pH 4 bis 7, insbesondere pH 4,01 bis 6, am meisten bevorzugt pH 4,02 bis 5,5. Ferner ist bevorzugt, dass der Antikörper von dem Kationenaustauscher mit einem Salzgradienten in dem Bereich von ab 0,1 bis 1,2 M Salz eluiert wird, wobei das Salz vorzugsweise ein Alkalimetallsalz, insbesondere ein Lithium-, Kalium- oder Natriumsalz ist. Vorzugsweise findet die Elution bei einem pH-Wert von ab pH 7 bis 8 statt, um eine maximale Entfernung der Aggregate und eine minimale Beschädigung von dem Antikör per aufgrund von sauren Bedingungen zu haben. Wahlweise findet die Elution bevorzugt bei einem sauren pH-Wert von ab pH 4 bis 7 statt, insbesondere von ab 4,01 bis 6,0 zum Maximieren des Entfernens von verunreinigendem Protein A; Spiegel so niedrig wie < 0,4 ng/mg Antikörper können auf diesem Wege realisiert werden. Dieser zweite Kationenaustauscher-Schritt macht die traditionelle Gelfiltration irrelevant, während er eine hohe Kapazität sowie einen schnellen Arbeitsablauf, wie es für Ionenaustauscher kennzeichnend ist, gestattet. Ionenaustauscher unterstützen eine Beladung von 10–30 mg Antikörper/ml Harz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erbringt das Reinigungsverfahren mit einem ersten Anionenaustauscher- und einem zweiten Kationenaustauscher-Schritt, die nach der Protein A-Chromatographie folgen, Antikörper in klinischer Güteklasse in der Abwesenheit von einem weiteren abschließenden Größenausschlusschromatographie- (SEC-) Schritt, wobei der Schritt eine Molekulargewichtausschlussgrenze aufweisen müsste, die geeignet ist zum Abtrennen von Antikörper-Aggregaten und/oder Antikörper-Protein A-Komplexen von monomerem Antikörper, wie zum Beispiel einem normalen IgG.
  • Als eine allgemeine Notiz, das Verfahren von der vorliegenden Erfindung kann nicht für Antikörper ausgenutzt werden, die gegen von Protein A-abstammende Epitope gezüchtet wurden. Derartige Antikörper werden abgelehnt, obwohl dies eine offensichtliche Einschränkung für den Fachmann darstellt.
  • Das am meisten ansprechende Merkmal von dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist, dass die Reinigung des Antikörpers über einen Anionenaustauscher in einem nicht-bindenden oder Durchfluss-Modus erfolgt, die Kapazität von der Säule keinesfalls den Durchsatz des Materials einschränkt; und die Kapazität nur ausschlaggebend ist in Bezug auf das Zurückhalten von geringen Mengen an verunreinigendem Protein A. Dies spart viel Prozessierungszeit und Materialressourcen, während eine sehr effiziente Entfernung von verunreinigendem Protein A gestattet wird.
  • Experimente
  • 1. Protein A-ELISA
  • Zahlreiche ELISAs zur Untersuchung von Protein A oder rekombinantem Protein A sind beschrieben worden (siehe US-Patentschrift Nr. 4,983,722 und darin beschriebene Verweise). Für sämtliche nachfolgend beschriebene Arbeit wurde ein einfacher Sandwich-ELISA verwendet, in welchem der Anti-Protein A-Fangantikörper, mit dem eine 96-Well Mikrotiterplatte (NuncTM) mit flachem Boden beschichtet wurde, das Protein A zurückhält. Das gebundene Protein A wird dann durch einen biotinylierten Anti-Protein A-Nachweisantikörper nachgewiesen, welcher die weitere Bindung von Streptavidinkonjugierter Meerrettich-Peroxidase (Amersham # RPN 1231) gestattet. Handelsüblich erhältlicher Anti-Protein A-Kaninchen Antikörper (hergestellt gegen das natürliche S. aureus Protein A) kann als Fangantikörper von Sigma-Aldrich (# P-3775) käuflich erworben werden. Es war dieser Antikörper, der durchgehend in dieser Studie verwendet wurde. Der Kaninchen-Nachweisantikörper wurde gleichfalls von Sigma-Aldrich (# 3775) käuflich erworben. Nach dem Beschichten mit dem Protein durch einen unspezifischen Adsorptionsprozess, wird das beschichtete Protein verwendet, um den Protein A-spezifischen Fangantikörper für Protein A zu halten, wobei der Fangantikörper ferner mit biotinyliertem Kaninchen Anti-Protein A-Antikörper und Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase nachgewiesen wird. Tetramethylbenzidin wird als das chromogene Substrat verwendet. Die Proben mit der unbekannten Konzentration werden gegen eine Standardkurve abgelesen, die unter Verwendung des ursprüng lichen Protein A oder des Protein A-Derivates von dem verunreinigenden Protein A, das nachgewiesen werden soll, erstellt wurde. Das Beschichten bei saurem pH-Wert sowie die ordnungsgemäße Herstellung von dem Standard hat sich als entscheidend erwiesen. Insbesondere für rekombinante Protein-A's, die künstlich erzeugt wurden, um einen zusätzlichen Cysteinrest zu tragen, wie z. B. Streamline Protein ATM (Amersham Biosciences, ehemals Pharmacia), wurde gefunden, dass sie eine Vorbehandlung mit einem reduzierenden Sulfhydrylreagenz benötigen, um den monomeren Zustand von der Protein-Standardlösung zu gewährleisten.
  • Im Gegensatz dazu ist der Wildtyp-Protein A-Standard handelsüblich von einer Reihe von Firmen erhältlich, z. B. Sigma-Aldrich Schweiz (# P-6031) oder Pharmacia (# 17-0770-01) und benötigt nicht eine derartige Vorbehandlung. Für die nachfolgend beschriebenen Experimente, in denen ein Auslaufen von verunreinigendem Protein A aus der StreamlineTM-Matrix beobachtet wurde, wurden Proben von unkonjugiertem Protein A, die von dem Hersteller erhalten wurden, als Standard verwendet.
  • 1.1 Vorbehandlung von Cys-angereichertem Protein A-Standard
  • Reines rekombinantes Protein A-Cys, wie es handelsüblich in dem Säulenmaterial StreamlineTM für die Protein A-Affinitätschromatographie (Amersham Biosciences) vorkommt, wurde gefriergetrocknet von Pharmacia/Amersham Biosciences erhalten. Bis zu 20 mg/ml Protein wurden in 0,1 m Tris, pH 8, das 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA und 20 mM Dithioerythritol enthält, gelöst, für 15–30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mit einer PD-10 Einweg-Gelfiltrationssäule (Amersham Biosciences) entsalzt. Alle Puffer, die für die Bearbeitung der Standardlösung vor dem Beschichten verwendet werden, sollten mit N2 behandelt werden, um die Oxidation von den Thiolgruppen zu verhindern. Die Herstel lung von dem Proteinstandard wurde am besten unmittelbar vor der Verwendung von dem Standard zum Beschichten von den Mikrotiterplatten durchgeführt. Wahlweise wurde eine 1 mg/ml Stammlösung hergestellt und bei –65 °C in einem Gefrierschrank aufbewahrt; nach dem Auftauen wurde die monomere Beschaffenheit von Protein A mit einem Aliquot, das auf ein nicht-reduzierendes SDS-PAGE-Gel aufgetragen wurde, untersucht. Die Konzentration von dem Protein-Standard wurde durch den Bradford-Assay (Bradford et al., 1976, Anal. Biochem. 72: 248–254; Splittgerber et al„ 1989, Anal. Biochem. 179: 198–201) sowie durch eine automatisierte Aminosäurenanalyse bestimmt. Das Ergebnis von einer derartigen Vorbehandlung ist in 1 mittels eines nicht-reduzierenden 10 % SDS-PAGE-Gels für einen Protein A-Standard aus Staphylokokkus (Spur 1: natives Protein A; Spur 2: nach der Vorbehandlung) und ein reines, ungekoppeltes StreamlineTM rekombinantes Protein A (bereitgestellt durch das Entgegenkommen von Pharmacia, jetzt Amersham Biosciences; Spur 4: natives, rekombinantes Protein A; Spur 5: nach der Vorbehandlung) dargestellt. Spur 1 zeigt einen Molekulargewichtsmarker mit den dazugehörigen Molekularmassen, die an der vertikalen Achse gekennzeichnet sind. Das rekombinante Protein A von Pharmacia, das einen zusätzlichen Cys-Rest beherbergt, verschiebt sich nach der Reduktion zu einem niedrigeren Molekulargewicht; eine monomere Bande bei etwa 34 kDa wird erhalten und ist sehr viel intensiver, was offensichtlich aus der Dissoziation des über Disulfidbrücken gebildeten Dimers herrührt.
  • 1.2 ELISA
  • 1.2.1 Herstellung der Probe
  • Durch zwei Verdünnungsschritte wurde eine 1:200.000-Verdünnung von der 1 mg/ml Protein A Standard-Stammlösung hergestellt, um den höchsten Standard bei 50 ng/ml bereitzustellen. Davon wurden für den Test der Standardkurve Verdünnungen bis herunter zu 0,2 ng/ml hergestellt. Ferner wurden die Verdünnungen von dem Standard („Versetzungs-Lösungen") für das Versetzen von Duplikaten der zu testenden Produktproben verwendet, um die Anwesenheit von störend einwirkenden Substanzen in der Probe auszuschließen.
  • Für die endgültige Untersuchung der Produktproben wurde jede Probe in 2 gleiche Volumen von je 500 μl unterteilt. Eine davon wird mit der 1000 ng/ml Versetzungs-Lösung versetzt, oder falls zweckdienlich, mit der 10 μg/ml Lösung, um einen abschließenden Protein A-Gehalt von 10 ng Protein A pro mg Antikörper zu ergeben. Die andere Hälfte wird mit demselben Volumen Probenpuffer versetzt; dadurch wird der Verdünnungsfaktor von der Produktprobe aufgrund des Versetzens berücksichtigt. Beide Typen der Präparation werden im Nachfolgenden als „versetzte Proben" bezeichnet. Der Probenpuffer wurde aus 7,51 g Glycin (Base), 5,84 g NaCl, 0,5 ml Triton X-100 zusammengestellt und auf 1 L mit entionisiertem oder zweifach destilliertem Wasser aufgefüllt.
  • Für optimale Genauigkeit der Messungen wurden die Antikörperkonzentrationen in den Proben durch handelsübliche ELISAs, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, vorher bestimmt. Eine weitere Standardlösung wurde mit einer gleich großen Menge von einem bekannten Standard-Antikörper mit einer vergleichbaren Affinität für unveränderliche Bereiche von Protein A versetzt, um die Wirksamkeit von dem Ansäuerungsschritt zu bestimmen und irgendeinen potentiellen systematischen Fehler zu enträtseln, der eingeführt wurde durch die Antikörperbindung zu Protein A und demzufolge dem Entziehen des Erfassens im dem Test.
  • Ansäuerung: Zu 450 μl von der versetzten Probe oder dem Standard werden 200 μl 0,2 M Citrat-/0,05 % Triton X-100 Puffer, bei pH 3,0, hinzugefügt. Alle Proben wurden als Dreifachbestimmung durchgeführt.
  • Ferner wurden die Verdünnungen der Proben dreifach hergestellt und getestet, da der Test optimal bei Antikörperkonzentrationen arbeitet, die sich in dem Bereich von 1 mg/ml und 0,2 mg/ml befinden. Der Ansäuerungsschritt in dem vorliegenden Test ist äußerst wichtig, um das verunreinigende Protein A oder Protein A-Fragmente freizusetzen, welche andererseits an den Überschuss von dem Antikörper gebunden sind, der in der Probenlösung vorhanden ist.
  • 1.2.2 Beschichten von Mikroliterplatten mit Antikörper
  • Der Beschichtungspuffer wurde zusammengesetzt aus 1,59 g/L Na2CO3, 2,93 g/L NaHCO3 und 0,20 g/L Natriumazid. Der pH-Wert von dem Puffer wurde auf pH 9,6 eingestellt. Es werden 100 μl Antikörperlösung, die den Antikörper in einer Menge enthalten, die ausreichend ist, keine Sättigung für den Protein A-Standard aufzuzeigen, pro Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wird mit Kunststofffolie abgedeckt und in eine Befeuchtungskammer gestellt. Es wird bei 37 °C über Nacht für ungefähr 18 Stunden inkubiert. Alle Vertiefungen werden 3-mal mit mindestens 300 μl Waschpuffer [NaCl 5,8 g/L, Na2HPO4 1,15 g/L, NaH2PO·H2O 0,26 g/L, EDTA 3,7 g/L, Tween-20 0,2 g/L, Butanol 10 ml/L, pH 7,2] gespült und dann mittels leichtem Abklopfen getrocknet. Es werden 250 μl Blockierungspuffer [Beschichtungspuffer mit 0,5 % Casein nach Hammarsten] in jede Vertiefung hinzugegeben und für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur auf einem Benchtop Orbital-Schüttler (Geschwindigkeit 120 min–1) inkubiert. Alle Vertiefungen werden dreimal mit mindestens 300 μl Waschpuffer gewaschen und durch leichtes Abklopfen getrocknet.
  • 1.2.3 Inkubation der Probe und Nachweis
  • Die Standards und die Proben, einschließlich jeder versetzten Probe, werden mit 100 μl/Vertiefung ausplattiert. Die Platten werden mit Kunststofffolie abgedeckt und für 90 Minuten bei Umgebungstemperatur auf einem Benchtop Orbital-Schüttler inkubiert. Alle Vertiefungen werden dreimal mit mindestens 300 μl Waschpuffer gewaschen und durch leichtes Abklopfen getrocknet. Der biotinylierte Kaninchen Anti-Protein A-Antikörper wird auf die vorher bestimmte optimale Verdünnung verdünnt. Es werden 100 μl/Vertiefung hinzugefügt, die Platten mit Kunststofffolie abgedeckt und für 90 Minuten bei Umgebungstemperatur auf einem Benchtop Orbital-Schüttler inkubiert. Das Spülen wird wiederholt.
  • Die Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase wird auf die vorher bestimmte optimale Verdünnung unter Verwendung von Konjugations-Puffer [Na2HPO4 1,15 g/L, NaCl 5,84 g/L, NaH2PO4·H2O 0,26 g/L, EDTA 3,73 g/L, Triton X-100 0,05 % (v/v), pH 7,2] verdünnt. Es werden 100 μl/Vertiefung hinzugefügt, die Platten mit Kunststofffolie abgedeckt und für 45 Minuten bei Umgebungstemperatur auf einem Benchtop Orbital-Schüttler inkubiert. Das Spülen wird wiederholt. Es werden 100 μl frisch hergestellte Tetramethylbenzidin-(TMB; ICN Produktnummer # 980502) Substratlösung hinzugefügt.
  • Die Substratlösung wird wie folgt hergestellt: Es wird eine Stammlösung durch Auflösen von 10 mg TMB in 1 ml DMSO hergestellt. Es werden 10 μl von dieser Stammlösung und ferner 10 μl H2O2 zu einer wässrigen 2,05 %-igen (w/w) Natriumacetatlösung hinzugefügt, die auf pH 6,0 mit 0,5 M Citronensäure eingestellt war. Es muss nicht ausdrücklich angesprochen werden, dass alles Wasser, das für die Zubereitung von irgendeinem Reagenz von dem Test verwendet wurde, von der höchsten Qualität ist, das heißt entionisiertes ultrareines oder mindestens zweifach destilliertes Wasser.
  • Die Substratlösung wird bei Umgebungstemperatur für 8–11 Minuten auf einem Schüttler inkubiert. Die Reaktion wird dann durch Hinzufügen von 50 μl Stopplösung [13 % H2SO4] pro Vertiefung abgestoppt. Innerhalb von 10 Minu ten nach der Zugabe von der Stopplösung, wird die Absorption von den Vertiefungen bei einer Wellenlänge von 450 nm auf einem Plattenlese-Spektralfotometer bestimmt.
  • Die Nachweisgrenze für einen derartigen ELISA beträgt 0,2 ng/ml Protein A, mit einem Arbeitsbereich von ab 0,2 bis 50 ng/ml. Die Intertest-Variabilität ist niedriger als 10 2 zeigt die Spiegel des ausgelaufenen rekombinanten Protein A in den Antikörper-Eluaten von der StreamlineTM rekombinantes Protein A-Chromatographie mit dem über einen einzelnen Punkt angefügten Protein A in Thioetherverknüpfung. Die Zykluszahl bezieht sich auf die mehrmalige Verwendung nach der Elution mit 1 M Natriumchlorid und erneuter Equilibrierung. Während hingegen das Auslaufen aus Zellkulturnährmedium von der Zellkultur der Hybridomazellen in der Größenordnung von 500 ppm war, ergaben andere Zelltypen Spiegel so hoch wie 1.000 ppm. Eine Übersicht über den Grad des Auslaufens aus unterschiedlichen erhältlichen Matrizen ist in Tabelle 1 dargestellt; die Chromatographie wurde in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Tabelle 1
    Matrix Lieferant Kuppllungs-Chemie Typischer Auslauf p.p.m. Arbeits-Kiapazität (mg ml-1) Flussgesch windigkeit (cm h–1)
    Native Protein A-Sepharose 4FF Amersham-Biosciences Mehrfach punktbefestigt, CNBr 10–20 5–20 30–300
    rmp Protein A-Sepharose Amersham-Biosciences Mehrfach punktbefestigt 10–20 5–20 30–300
    Poros-A High Capacity Applied Biosystems Mehrfachpu nktbefestigt 10–50 10 500–1.000
    Protein A Ceramic HyperD Biosepra Mehrfachpu nktbefestigt Bis zu 300 10–20 200–500
    rProtein A-Sepharose Amersham-Biosciences Einzel punktbefestigt, Thioether-Verbindung 50–1.000 20–20 30–300
    MabSelect Amersham-Biosciences Einzel punktbefestigt, Thioether-Verbindung 50–1.000 20–40 500
    STREAMLINE rProtein A Amersham-Biosciences Einzel punktbefestigt, Thioether-Verbindung 50–1.000 20–40 200–400
  • 3 stellt ferner Daten bereit über unerheblich vermindertes Auslaufen von verunreinigendem Protein A während mehrmaliger Läufe der Protein A-Affinitätschromatographie mit demselben Affinitätsmatrixmaterial; Mehrfachpunkt-befestigte Wildtyp-Protein A Sepharose 4 FF (Amersham Biosciences) wurde, wie in Abschnitt 2.1 nachfolgend beschrieben, wiederholt verwendet und der Spiegel von verunreinigendem Protein A in dem Eluat, vor irgendeinem weiteren Prozessieren des Eluates, durch ELISA, wie oben beschrieben, bestimmt.
  • 2. Protein A- und Q-Sepharose-Chromatographie
  • 2.1 Protein A-Affinitätschromatographie mit StreamlineTM
  • Der Zellkulturüberstand von einer NSO-Myeloma-Zellkultur wurde grob durch Zentrifugation und eingehende Filtration gereinigt und durch Ultrafiltration konzentriert; die Ultrafiltration wurde ebenfalls dazu verwendet, die Kulturflüssigkeit gegen PBS, pH 7,5, auszutauschen. Der Titer von dem Antikörper # 5, der durch die Zellen hergestellt wurde, betrug 0,2 mg/ml, insgesamt wurde 1 L des Puffer-ausgetauschten Überstandes aufgetragen. Der pI-Wert von dem monoklonalen Antikörper # 5 betrug 8,5. Die Protein A-StreamlineTM-Säule (5,0 ml Volumen) wurde vorher mit 10 Säulenvolumen 50 mM Glycin/Glycinat, pH 8,8, 4,3 M NaCl equilibriert; die Flussgeschwindigkeit lag bei 200 cm/h. Zum Beladen wurde die Säule bei einer Flussgeschwindigkeit von 50 cm h–1 betrieben; die Beladungskapazität betrug etwa 20 mg/ml Matrixmaterial). Vor der Elution wurde die Säule mit mindestens 10 Säulenvolumen des Glycin-Equilibrierungspuffers, der mit zusätzlichen 200 mM NaCl und 0,1 % Tween-20 angereichert war, gewaschen. Die Elution wurde mit einem Elutionspuffer erreicht, der aus 0,1 M Glycin/HCl-Puffer, pH 4,0, zusammengesetzt war. Unmittelbar nach der Elution wurden die Fraktionen von dem Eluat, welche die Hauptmenge des Antikörpers umfassen, mit einem entsprechenden Aliquot von 0,5 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 neutralisiert und der Puffer mittels einer Amicon Diafiltrationsvorrichtung gegen Beladungs-/Equilibrierungs-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl) für den nachfolgenden Anionenaustauscherschritt ausgetauscht, um ein längeres Ausgesetztsein gegenüber einem saueren pH-Wert zu verhindern.
  • Die Antikörperkonzentration und die Konzentration des verunreinigenden Protein A wurden, wie oben beschrieben, bestimmt. Der Spiegel von verunreinigendem Protein A in dem Eluat belief sich auf 1434 ng/mg Antikörper vor und 1650 ng/mg Antikörper nach der Diafiltration. Die Wiedergewinnung von dem Antikörper, basierend auf dem Titer von der Lösung des Puffer-ausgetauschten Überstandes, betrug vor der Beladung 81 %; die Konzentration von dem Antikörper in der durch Diafiltration filtrierten Lösung betrug 3,6 mg/ml.
  • 2.2 Q-Sepharose FF Anionenaustausch-Schritt im nicht-bindenden Modus
  • Der gereinigte Antikörper aus Abschnitt 2.1 wurde wie beschrieben weiter bearbeitet: Eine 5,0 ml Q-Sepharose FF Säule (Amersham Biosciences) wurde gepackt mit 10 ml 0,1 M NaOH, gefolgt von 2 Säulenvolumen an 0,1 M Tris, pH 8, und equilibriert mit 10 Säulenvolumen von 10 mM Tris, pH 8/50 mM NaCl, bei einer Flussgeschwindigkeit von 75 cm/h. Nach dem Equilibrieren wurde die Flussgeschwindigkeit auf 50 cm/h vermindert. 6 ml von der durch Diafiltration filtrierten Antikörper- Lösung wurden auf die Säule aufgetragen und der Durchlauf für das weitere Bearbeiten aufgefangen; der Durchlauf wurde, nachdem die Säule mit den anfänglichen 6 ml beladen war und danach mit reinem Beladungs- oder Equilibrierungs-Puffer 10 mM Tris, pH 8, 50 mM NaCl, fortgefahren wurde, solange aufgefangen bis die Absorption von dem Durchlauf, die bei 280 nm kontrolliert wurde, wieder zurück auf der Basislinie war. Die gesamte Wiedergewinnung von dem Antikörper in dem Durchlauf betrug 23 mg Antikörper (87 %). Die Bestimmung von dem Spiegel an verunreinigendem Protein A resultierte in < 3 ng/mg Antikörper.
  • Für das weitere Bearbeiten von dieser durch die Q-Sepharose-Chromatographie gereinigten Antikörpercharge durch Gelfiltration (Größenausschlusschromatographie, SEC) über Sephacryl S-300 in 10 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0, 140 mM NaCl, bei einer Flussgeschwindigkeit von 10 cm/h mit einem Beladungsgrad von 15 mg Antikörper pro ml Gel wurde gefunden, dass dies den Spurengehalt an verunreinigendem Protein A im Wesentlichen nicht mehr ändert. Aufgrund der Erfahrung kann die SEC verwendet werden, um die Spiegel von verunreinigendem Protein A von etwa 30–100 ng/mg auf etwa 1–5 ng/mg zu vermindern. Demzufolge weist die SEC einen sehr niedrigen Reinigungsfaktor im Bezug auf die Spurenmengen von Protein A auf, wozu möglicherweise durch Affinitätsinteraktionen zwischen dem Antikörper und dem verunreinigenden Protein A beigetragen wird.
  • Jedoch wird aufgrund der unvermeidlichen Verdünnung von der Probe und dem langsamen Arbeitsablauf, die einen gewissen Abbau von dem Antikörperprotein gestatten, die SEC nur eine Wiedergewinnung von 70 % von der Menge des Antikörpers, die aufgetragen wurde, gestatten. Dies bedeutet, dass die SEC unvermeidlich in dem Verlust an Material resultieren wird, während gleichzeitig viel Zeit benötigt wird.
  • Die Q-Sepharose-Säule wurde für die weitere Verwendung durch eine getrennte Elution mit 2 M NaCl und weitere Equilibrierung, wie oben beschrieben, wiederaufbereitet.
  • 3. Protein A- und Q-Sepharose-Reinigung mit nachfolgendem Kationenaustausch-Schritt
  • In einem weiteren Experiment wurde der Antikörper verwendet, der in Experiment 2.2 in einem nicht-bindenden Modus durch Q-Sepharose-Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt wurde. Anstatt einen weiteren, abschließenden SEC-Reinigungschritt zu testen, wurde der Antikörper, der in dem Durchlauf von der Q-Sepharose-Säule aufgefangen wurde, einem zweiten Kationenaustausch-Schritt an einer SP-Sepharose FF-Matrix (SP = Sulfo-propyl) von Amersham Biosciences unterworfen. Die SP-Sepharose FF gestattete eine Flussgeschwindigkeit von 100 cm/h mit einer reproduzierbaren Ausbeute von 93 % an Antikörper nach Beladen, Waschen und Eluieren von dem Antikörper von dem Kationenaustauscher.
  • Für das Beladen wurde der pH-Wert von der Antikörperlösung, die nach dem Q-Sepharose-Reinigungsschritt erhalten wurde, auf pH 4,5–5,0 mit 50 mM Acetatpuffer, pH 4,5, eingestellt. Die Beladungskapazität wurde auf 10 mg/ml Matrixmaterial bei einer Leitfähigkeit von 17 mS/cm festgesetzt. Der 50 mM Acetatpuffer wurde ferner zum Waschen bis auf die Basislinie verwendet. Ein 50 mM Na-acetat, pH 4,5, 1 M NaCl Hochsalzpuffer wurde für die Elution von dem Antikörper verwendet; der monomere Antikörper eluierte zuerst, während hingegen die Aggregate in den Fraktionen am Ende bei hoher Ionenstärke zu eluieren pflegten. Die Verwendung von einem weniger steilen Salzgradienten durch die Implementierung von einem Salzgradienten in den Elutionspuffer vor dem Aufpumpen auf die Säule ist gleichermaßen realisierbar; die unmittelbare Anwendung von einem Hochsalz-Puffer resultiert in einem weniger verdünnten Antikörper und dementsprechend in einem präziseren Auffangen und kürzeren Zeiten des Verweilens in der saueren Lösung. Nach der Elution wurde der saure Puffer schnell gegen PBS, pH 7,5, ausgetauscht. Der Spiegel an verunreinigendem Protein A in dem vereinten Eluat wurde mit < 0,4 ng/mg Antikörper bestimmt, wobei für den Antikörper mittels Größenausschlusschromatographie gezeigt werden konnte, dass er zu > 99 % als Monomer vorliegt.
  • 4. StreamlineTM-Protein A-Affinitätschromatographie mit spezialangefertigtem, Mehrfachpunkt-befestigtem Protein A
  • Diese Mehrfachpunkt-befestigte StreamlineTM-Protein A-Affinitätsmatrix wurde durch Pharmacia Biotech (jetzt Amersham-Pharmacia) spezialangefertigt und geliefert. Sie wurde durch den Hersteller mittels Koppeln desselben 34 kD StreamlineTM-artigen rekombinanten Protein A, das einen terminalen Cys-Rest aufweist, an dasselbe Sepharose-Matrixmaterial hergestellt, aber unter Verwendung von traditioneller CNBr-Chemie zur Aktivierung und Kopplung anstelle von der Epoxid-vermittelten Aktivierung und der selektiven Reaktionsbedingungen für das Koppeln nur der -SH-Gruppen (siehe die Produkt-Information des Herstellers). Das Verfahren von Experiment 2.1 wurde wiederholt und der Spiegel an verunreinigendem Protein A wurde mit 353 ng/mg Antikörper bestimmt. Dies bedeutet, das der Modus der Kopplung teilweise zu dem gesteigerten Auslaufen des Proteins von den leistungsfähigen, über einen einzelnen Befestigungspunkt angekoppelten, rekombinanten Protein A-Affinitätsmatrizen beisteuert; die Veränderungen in der Aminosäuresequenz, die in solch einem rekombinanten Protein A im Vergleich zu dem vollständigen Wildtyp-Protein A eingeführt wurden, tragen ebenfalls beträchtlich zu dem gesteigerten Auslaufen des Proteins bei.
  • 5. Paralleler Vergleich der Verfahren: Vergleich mit dem Miles-Verfahren ( US Patentschrift Nr. 4,983,722 )
  • Das Miles-Patent (Nr.: 4,983,722 ) macht geltend, dass die Bindung an die DEAE-Sepharose, die als ein zweiter Chromatographie-Schritt mit einem Salzgradienten (0,025 M bis 0,25 M NaCl) zur Elution verwendet wurde, den auslaufenden Protein A-Gehalt in dem Eluat auf weniger als 15 ng/mg Antikörper vermindern kann (Bereich von Protein A war 0,9 bis 14 ng/mg Antikörper). Tabelle 2
    Vergleich von Protein A-Resten in Eluatproben von 6A1- Antikörper, gereinigt über Einzel- oder Mehrfachpunkt befestigte Protein A-Matrizen
    Matrix Probe Protein A-Spiegel (ng/mg)
    rProtein A-Sepharose (Einzelpunktbefestigt) Protein A-Eluat 20,2
    rmp Protein A Sepharose (Mehrfachpunktbefestigt) Protein A-Eluat 2,16
    Native Protein A Sepharose (Mehrfachpunktbefestigt) Protein A-Eluat < 2,0
  • Das Ziel von diesen Experimenten war, diese Ergebnisse unter Verwendung von MabSelect (neue Einzelpunkt-befestigte rProtein A-Matrix) mit einem Antikörper mit einem niedrigeren pI-Wert (pI 6,5–7,5) zu bestätigen und das nicht-bindende Q-Sepharose-Verfahren (unter Verwendung unterschiedlicher Beladungs-/Equilibrierungs-Puffer) mit dem Miles-Patentverfahren unmittelbar zu vergleichen.
  • Angewendetes Verfahren:
  • Die Reinigung von dem 6A1-Antikörper (pI 6,5–7,5) schloss zwei Chromatographieschritte ein, die aus dem MabSelect Protein A-Schritt, gefolgt durch den Q-Sepharose-Anionenaustauschchromatographie- (nicht-bindend) oder DEAE-Sepharose-Chromatographie-Schritt (bindend) bestanden. Siehe L0 9007 und L0 9375. MabSelect Protein A-Chromatographie:
    Säulenmatrix MabSelect rekombinantes
    Protein A (Einzelpunkt
    befestigtes rProtein A)
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 15 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 30 mL
    Betriebs-
    Flussgeschwindigkeit 500 cm/h (16,80 mL/Min.)
    Säubern 6 M Guanidin-HCl
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 35 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 50 mM Glycin/Glycinat,
    pH 8,0/250 mM NaCl
    (8 Säulenvolumen)
    Waschen nach Beladung 50 mM Glycin/Glycinat,
    pH 8,0/250 mM NaCl
    (8 Säulenvolumen)
    Elutions-Puffer 100 mM Glycin, pH 3,50
    (6 Säulenvolumen)
    Waschen 100 mM Citronensäure, pH 2,1
    (2 Säulenvolumen)
  • Der Kulturüberstand, der den 6A1-Antikörper enthält, wurde über eine MabSelect-Säule (30 ml), die an ein AKTA-FPLC-System angeschlossen ist, gereinigt.
  • Die Bedingungen, die verwendet wurden, waren identisch zu den in der obigen Tabelle beschriebenen. Der Antikörper wurde unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 3,5, eluiert. Nachfolgend auf die Elution wurde der pH-Wert des Eluates auf pH 7,0 eingestellt und dann die Eluatprobe in 5 Aliquote unterteilt; jedes Aliquot wurde dann mittels Diafiltration in einen unterschiedlichen Puffer für die Anionenaustauschchromatographie über führt.
  • Das erste Aliquot wurde mittels Diafiltration in 50 mM Tris-HCl, pH 8/75 mM NaCl, für die Q-Sepharose-Chromatographie, Lauf 1, überführt. Das zweite Aliquot wurde mittels Diafiltration in 50 mM Tris-HCl, pH 8/100 mM NaCl, für die Q-Sepharose-Chromatographie, Lauf 2, überführt. Das dritte Aliquot wurde mittels Diafiltration in 20 mM Natriumphosphat, pH 6,5/80 mM NaCl, für die Q-Sepharose-Chromatographie, Lauf 3, überführt. Bei den Aliquoten vier und fünf wurde der Puffer zur Evaluierung des DEAE-Sepharose-Bindungsverfahrens, das in der Miles Patentschrift beschrieben wurde, ausgetauscht in 25 mM Tris-HCl, pH 8/25 mM NaCl. Der Unterschied zwischen den Läufen 4 & 5 ist, dass in Lauf 4 die Hauptspitze als eine Fraktion aufgefangen und mittels Diafiltration in eine phosphatgepufferte Standard-Salzlösung vor der Analyse überführt wurde, während hingegen in Lauf 5 die Elutionsspitze fraktioniert wurde und in einen Phosphatpuffer dialysiert, der wie in der Miles-Patentschrift beschrieben hergestellt wurde. Die Bedingungen für jeden der fünf Säulenläufe sind nachfolgend beschrieben: Q-Sepharose-Chromatographie: Lauf 1
    Säulenmatrix Q-Sepharose Fast Flow
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 8 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 16 mL
    Säulen-Präparation Gepackt in 0,1 M
    Natriumhydroxid bei 150 cm/h
    Betriebs-
    Flussgeschwindigkeit 100 cm/h (3,35 mL/Min.)
    Säubern 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 15 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 50 mM Tris-HCl pH 8.0/75 mM NaCl
    (8 Säulenvolumen)
    (fortgesetzt)
    Q-Sepharose-Chromatographie: Lauf 1
    Waschen nach Beladung 50 mM Tris-HCl pH 8.0/75 mM NaCl
    (5 Säulenvolumen)
    Säulen-
    Reinigungspuffer 2 M Natriumchlorid
    (2 Säulenvolumen)
    Waschen 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Q-Sepharose-Chromatographie: Lauf 2
    Säulenmatrix Q-Sepharose Fast Flow
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 8 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 16 mL
    Säulen-Präparation Gepackt in 0,1 M
    Natriumhydroxid bei 150 cm/h
    Betriebs-
    Flussgeschwindigkeit 100 cm/h (3,35 mL/Min.)
    Säubern 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 7,5 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 50 mM Tris-HCl, pH 8.0/100 mM
    NaCl (8 Säulenvolumen)
    Waschen nach Beladung 50 mM Tris-HCl pH 8.0/100 mM
    NaCl (5 Säulenvolumen)
    Säulen-
    Reinigungspuffer 2 M Natriumchlorid
    (2 Säulenvolumen)
    Waschen 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Q-Sepharose-Chromatographie: Lauf 3
    Säulenmatrix Q-Sepharose Fast Flow
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 8 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 16 mL
    Säulen-Präparation Gepackt in 0,1 M
    Natriumhydroxid bei 150 cm/h
    (fortgesetzt)
    Q-Sepharose-Chromatographie: Lauf 3
    Betriebs-
    Flussgeschwindigkeit 100 cm/h (3,35 mL/Min.)
    Säubern 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 7,5 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 20 mM Natriumphosphat,
    pH 6,5/80 mM NaCl
    Waschen nach Beladung 20 mM Natriumphosphat,
    pH 6,5/80 mM NaCl
    (5 Säulenvolumen)
    Säulen-
    Reinigungspuffer 2 M Natriumchlorid
    (2 Säulenvolumen)
    Waschen 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    DEAE-Sepharose: Lauf 4
    Säulenmatrix DEAE-Sepharose
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 8 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 16 mL
    Säulen-Präparation Gepackt in Equilibrierungs
    puffer bei 150 cm/h
    Betriebs
    Flussgeschwindigkeit 100 cm/h (3,35 mL/Min.)
    Säubern 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 7,5 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 25 mM Tris-HCl, pH 8,6/25 mM
    NaCl (8 Säulenvolumen)
    Waschen nach Beladung 25 mM Tris-HCl, pH 8,6/25 mM
    NaCl (5 Säulenvolumen)
    Elutions-Puffer 25 mM Tris-HCl pH 8,6/25 mM
    NaCl bis 25 mM Tris-HCl,
    pH 8,6/250 mM NaCl
    (10 Säulenvolumen)
    Waschen 2 M Natriumchlorid
    (fortgesetzt)
    DEAE-Sepharose: Lauf 4
    (2 Säulenvolumen)
    DEAE-Sepharose Bindungsverfahren: Lauf 5 (Miles-Verfahren)
    Säulenmatrix DEAE-Sepharose
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 8 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 16 mL
    Säulen-Präparation Gepackt in Equilibrierungs
    puffer bei 150 cm/h
    Betriebs-
    Flussgeschwindigkeit 100 cm/h (3,35 mL/Min.)
    Säubern 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 7,5 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 25 mM Tris-HCl, pH 8,6/25 mM
    NaCl (8 Säulenvolumen)
    Waschen nach Beladung 25 mM Tris-HCl, pH 8,6/25 mM
    NaCl (5 Säulenvolumen)
    Elutions-Puffer 25 mM Tris-HCl, pH 8,6/25 mM
    NaCl bis 25 mM Tris-HCl,
    pH 8,6/250 mM NaCl
    (10 Säulenvolumen)
    Waschen 2 M Natriumchlorid
    (2 Säulenvolumen)
  • Die Eigenschaften von den unterschiedlichen Puffern in dieser Studie sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Elutionsprofile für jeden der Anionenaustausch-Chromatographie-Schritte sind in den 2–5 gezeigt.
  • Die Eluatproben, die durch die 5 Ionenaustauschläufe erzeugt wurden, wurden auf ihre Protein A-Spiegel in den rPA-ELISAs untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 3
    In dieser Studie verwendete Puffer
    Equilibrierungs -Puffer Lauf Nummer Leitfähig keit (mS/cm) Harz pH
    50 mM Tris-HCl, pH 8,0/75 mM NaCl 1 10,74 Q-Sepharose (nicht-bindend) 8,00
    50 mM Tris-HCl, pH 8,0/100 mM NaCl 2 12,85 Q-Sepharose (nicht-bindend) 8,01
    20 mM Natriumphosphat, pH 6,5/80 mM NaCl 3 10,20 Q-Sepharose (nicht-bindend) 6,50
    25 mM Tris-HCl, pH 8,6/25 mM NaCl 4/5 3,35 DEAE-Sepharose (bindend) 8,60
    25 mM Tris-HCl, pH 8,6/250 mM NaCl* 4/5 24,54 DEAE-Sepharose (bindend) 8,61
    *Gradienten-Elutionspuffer
  • Es wurden Fraktionen quer durch das Elutionsprofil von DEAE-Sepharose Lauf 5 (Miles-Verfahren) aufgefangen und in dem rProtein A-ELISA analysiert: die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 4: rProtein A-ELISA Ergebnisse:
    Proben-ID rProtein A-Spiegel (ng/mg) Antikörper -Konzen tration (mg/ml) % Wiedergewinnun g Elutions -Volumen (SV's)*
    Q-Sepharose-Eluat Lauf 1 < 0,4 1,42 82 4,5
    Q-Sepharose-Eluat Lauf 2 2,94 1,49 70 3,5
    Q-Sepharose-Eluat Lauf 3 0,73 1,86 85 3,4
    DEAE Sepharose-Eluatpool Lauf 4 (Pool von allen Fraktionen) 1,72 2,16 75 2,5
    DEAE Sepharose-Eluatpool (Miles-Verfahren) Lauf 5 (Pool der Fraktionen 2 bis 6) 1,55 1,83 73 3
    *Wobei SV's Säulenvolumen bezeichnet
    Tabelle 5: Spiegel von Protein A in den Eluat-Fraktionen quer über den Elutionspeak, die während der bindenden DEAE-Sepharose-Abtrennung (Miles-Verfahren); Lauf 5, erhalten wurden.
    Fraktions-Nummer rProtein A-Spiegel Absorption
    1 3,33 0,018
    2 0,4 0,108
    3 0,4 0,22
    4 0,4 0,169
    5 2,01 0,092
    6 16,7 0,042
    7 6,38 0,016
  • Die höchste Wiedergewinnung (85 %) und die beste Beseitigung von rProtein A für diesen Antikörper (6A1; pI 6,5–7,5) wurden unter nicht-bindenden Bedingungen an der Q-Sepharose unter Verwendung von 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5/80 mM NaCl, erhalten (entspricht Lauf 3). Lauf 1 zeigte ebenfalls eine gute Wiedergewinnung (82 %) und rProtein A-Beseitigung, jedoch war das Elutionsvolumen für diesen Lauf signifikant höher als für ein nicht-bindendes Verfahren erwartet; dies deutet darauf hin, dass eine teilweise Retardierung von dem Antikörper auf der Säule in diesem Puffersystem stattfindet. Das Steigern der NaCl-Konzentration (Lauf 2) resultierte in einer niedrigeren rProtein A-Beseitigung, demzufolge war das Puffersystem, das in Lauf 3 verwendet wurde, für diesen Antikörper zweckmäßiger. Es war von uns kürzlich beobachtete worden, dass das Puffersystem, das in Lauf 1 verwendet wurde, für Antikörper mit hohem pI-Wert zweckmäßiger ist und das dasjenige, was in Lauf 3 verwendet wurde, insbesondere für neutrale oder leicht saure Antikörper verwendbar ist. Da diese Experimente bei ähnlichen Kapazitäten (7,5 mg/ml Harz) durchgeführt wurden, würden wir erwarten, in der Lage zu sein, dieses nicht-bindende Verfahren bei sehr viel höheren Kapazitäten (> 30 mg/ml) zu verwenden. Wir würden erwarten, dass dieses nicht-bindende Verfahren für viele Anionenaustauscher, zum Beispiel Q-Hyper D, zusätzlich zu Anionenaustausch-Membranabsorbern (wie zum Beispiel Mustang Q, Intercept Q und Sartobind Q) anwendbar ist. Wir würden ebenfalls erwarten, dass dieser Prozess eher auf die Produktion im großen Maßstab anwendbar ist, verglichen mit dem Miles-Verfahren, da höhere Kapazitäten usw. angewendet werden können.
  • In dem Fall von Lauf 5 (Miles-Verfahren), wurde eine Fraktionierung von rProtein A quer über den Hauptelutionspeak beobachtet, wie in Tabelle 5 dargestellt. Das sorgfältige Vereinen der Fraktionen ist daher nötig, um eine gute Beseitigung von rProtein A sicherzustellen. Dies wies einen Einfluss auf die Wiedergewinnung (73 %) auf und ergab sogar in diesem Fall keine so gute Beseitigung, wie sie mit dem nicht-bindenden Verfahren erhalten wurde. Es ist daher mit dem Miles-Verfahren schwieriger, eine gute Beseitigung und eine hohe Wiedergewinnung für die Zelllinien/Antikörper in Fällen zu erreichen, in welchen ein sehr hohes Auslaufen beobachtet wird (wie dies, das mit den Einzelpunktbefestigten Matrizen gewöhnlich erhalten wird).
  • Die Daten von Lauf 5 sind repräsentativ für die Bedingungen, wie sie in der Miles-Patentschrift beschrieben wurden. Eine Übersicht über die Verfahrens-Vergleiche und die dabei erhaltenen Daten ist in Tabelle 6 nachfolgend beschrieben.
  • Tabelle 6 Zusammenfassung der rProtein A-Spiegel bei unterschiedlichen Stadien der Antikörper-Reinigung.
    Figure 00420001
  • Hinweis: Die Spiegel von rProtein A sind in Klammern als ng/mg angegeben; es sollte beachtet werden, dass nicht alle Überstände von den klonalen NSO-Zelllinien ähnlich Verunreinigungs-Spiegel an Protein A ergeben.
  • 6. Reinigung von einem Antikörper mit hohem pI-Wert
  • Ein Antikörper mit einem hohen pI-Wert (pI 9,0–9,3) wurde unter Verwendung von Protein A-Affinitätschromatographie (MabSelect – Matrix mit Einzelpunkt-befestigtem rekombinantem Protein A), gefolgt durch eine Q-Sepharose-Anionenaustausch-Chromatographie (unter nicht-bindenden Bedingungen; zur Entfernung von Verunreinigungsspuren), gefolgt durch SP-Sepharose-Kationenaustausch-Chromatographie (unter bindenden Bedingungen zur Entfernung von Aggregaten).
  • Figure 00430001
  • Experimentelle Materialien und Verfahren
  • MabSelect Protein A-Chromatographie:
    Säulenmatrix MabSelect rekombinantes Protein
    A (Einzelpunkt-befestigtes
    rProtein A)
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 15 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 30 mL
    Betriebs-
    Flussgeschwindigkeit 500 cm/h (16,80 mL/Min.)
    Säubern 6 M Guanidin-HCl
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 35 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 50 mM Glycin/Glycinat,
    pH 8,0/250 mM NaCl
    (8 Säulenvolumen)
    Waschen nach Beladung 50 mM Glycin/Glycinat,
    pH 8,0/250 mM NaCl
    (8 Säulenvolumen)
    Elutions-Puffer 100 mM Glycin, pH 3,50
    (6 Säulenvolumen)
    Waschen 100 mM Citronensäure, pH 2,1
    (2 Säulenvolumen)
  • Der Kulturüberstand, der den Antikörper mit dem hohen pI-Wert enthält, wurde über eine MabSelect Protein A-Affinitätssäule (30 ml), die an ein AKTA-FPLC-System angeschlossen ist, gereinigt. Die Bedingungen, die verwendet wurden, waren identisch zu den in der obigen Tabelle beschriebenen. Der Antikörper wurde unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 3,5, eluiert. Auf die Elution folgend, wurde das Eluat bei pH 3,69 (keine Einstellung benötigt) für 60 Minuten (Virus-Inaktivierungsschritt bei niedrigem pH-Wert) gehalten und dann auf pH 8 unter Verwendung von 2 M Tris-Base neutralisiert. Es wurden drei Zyklen an Protein A durchgeführt; die Produkt-Wiedergewinnung wurde durch A280 nm bestimmt und ist in Tabelle 7 für jeden einzelnen Zyklus gezeigt. Tabelle 7: % Wiedergewinnung an MabSelect-Protein A- Säule
    Zyklus-Nummer % Wiedergewinnung
    1 81
    2 81
    3 80
  • Nach der MabSelect Protein A-Chromatographie wurden die Eluate von jedem der drei Zyklen zusammen vereint und der Puffer gegen 25 mM Tris, pH 8,0 (Q-Sepharose Equilibrierungs-Puffer) unter Verwendung einer Amicon-Magnetrührzelle zum Konzentrieren, ausgestattet mit einer 10 kDa Millipore-Membran, ausgetauscht. Q-Sepharose-Chromatographie:
    Säulenmatrix Q-Sepharose Fast Flow
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 15 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 30 mL
    Säulen-Präparation Gepackt in 0,1 M Natriumhydroxid
    bei 225 cm/h
    Betriebs-
    Flussgeschwindigkeit 150 cm/h (5,0 mL/Min.)
    Säubern 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 40 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 20 mM Glycin, pH 8,0
    (8 Säulenvolumen)
    Waschen nach Beladung 20 mM Glycin, pH 8,0
    (5 Säulenvolumen)
    Elutions-Puffer 20 mM Glycin, pH 8,0
    (2 Säulenvolumen)
    Waschen 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
  • 40 ml von dem konzentrierten/über Diafiltration umgepufferten MabSelect-Protein A-Eluats wurden auf die Q-Sepharose-Säule bei einer Beladungskapazität von 40 mg/ml Matrix aufgeladen. Die Säule wurde in einem nicht-bindenden Modus betrieben und die ungebundene Fraktion, die den Antikörper enthält, wurde aufgefangen. Die Wiedergewinnung bei diesem Schritt betrug 69 % bei A280. Dies ist ein bisschen niedriger als sonst unter diesen Bedingungen für diesen Antikörper erhalten wurde und kann verursacht sein durch fehlerhafte Bestimmung von dem Beladungsvolumen aufgrund des Verzögerungsvolumens in der FPLC Probenpumpe.
  • Auf die Q-Sepharose-Chromatographie folgend wurde die ungebundene Fraktion auf 13,98 mg/ml konzentriert und mittels Diafiltration in den SP-Sepharose-Equilibrierungspuffer (25 mM Natriumacetat, pH 5,0/25 mM NaCl) unter Verwendung einer Amicon-Magnetrührzelle, die mit einer 10 kDa Millipore Ultrafiltrationsmembran ausgestattet war, umgepuffert. SP-Sepharose-Chromatographie:
    Säulenmatrix Q-Sepharose Fast Flow
    Säulendimensionen 1,6 cm innerer Durchmesser
    × 15 cm Betthöhe
    Säulenvolumen 30 mL
    Säulen-Präparation Gepackt in 0,1 M
    Natriumhydroxid bei 150 cm/h
    Betriebs-
    Flussgeschwindigkeit 100 cm/h (3,35 mL/Min.)
    Säubern 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
    Beladungskapazität 10 mg/ml Matrix
    Equilibrierung 25 mM Natriumacetat, pH 5,00/
    25 mM NaCl (8 Säulenvolumen)
    Waschen nach Beladung 25 mM Natriumacetat, pH 5,00/
    25 mM NaCl (6 Säulenvolumen)
    Elution 25 mM Natriumacetat, pH 5,00/
    186 mM NaCl (25 Säulenvolumen)
    Säulen-
    Reinigungs-Puffer 25 mM Natriumacetat, pH 5,00/
    2 M NaCl (2 Säulenvolumen)
    (fortgesetzt)
    SP-Sepharose-Chromatographie:
    Waschen 0,1 M Natriumhydroxid
    (2 Säulenvolumen)
  • Es wurden 24 ml von dem umgepufferten Q-Sepharose-Eluat auf die SP-Sepharose-Säule bei einer Beladungskapazität von 10 mg/ml Matrix aufgetragen. Die Säule wurde in einem Bindungs-Modus betrieben; das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen. Es wurden Fraktionen quer durch das Elutionsprofil mittels GP-HPLC analysiert, um die Aggregatgehalte zu bestimmen und die Messwerte sind in der Tabelle 8 dargestellt. Auf jeden Chromatographieschritt folgend, wurden Proben entnommen und auf rProtein A-Reste analysiert; die Ergebnisse sind in Tabelle 9 präsentiert. Tabelle 8: Ergebnisse des rProtein A-ELISA nach jedem Chromatographieschritt
    Proben-ID rProtein A Antikörper-
    MabSelect Protein A-Eluat {nach der Konz./Diafil.) 2,64 46,7
    Q-Sepharose-Eluat < 4 8,10
    SP-Sepharose-Eluatpool F(1–16) < 4 1,79
    Tabelle 9: GP-HPLC-Analyse der SP-Sepharose Fraktionen
    Proben-ID % Aggregate Absorption (A280)
    SP-Eluatpool F(1–3) 0,57 11,2
    SP-Eluatpool F(4–6) 1,10 2,7
    SP-Eluatpool F(7–9) 2,07 0,655
    SP-Eluatpool F(10–12) 2,12 0,351
    SP-Eluatpool F(13–15) 2,56 0,208
  • Schlussfolgerung: Die Fraktionierung von Aggregaten wurde während der Stufenelution von dem Antikörper-Peak beobachtet; siehe Tabelle 4. Die mit Aggrega ten angereicherten Fraktionen eluieren später (an dem auslaufenden Ende von dem Elutionspeak), verglichen mit den Fraktionen, die keine Aggregate enthalten. Die Fraktionen am Ende können aus dem Hauptpool weggelassen werden, um einen 99 % monomeren Pool zu erhalten und trotzdem noch eine hohe Wiedergewinnung (> 95 %) zu erreichen.
  • Tabelle 10: Fraktionierung von Aggregaten quer durch den SP-Sepharose-Elutionspeak für Antikörper mit hohem pI-Wert
    Figure 00480001

Claims (19)

  1. Verfahren. zur Reinigung eines Antikörpers, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: a. Reinigen eines Antikörpers mittels Protein-A-Affinitätschromatographie, b. Aufgeben des eine Protein-A-Verunreinigung umfassenden gereinigten Antikörpers, wobei die Protein-A-Verunreinigung bei der Elution von gebundenem Antikörper von der Protein-A-Affinitätschromatographiesäule erhalten wird, auf ein Anionenaustauschmaterial unter Bedingungen, die die Bindung des Protein A berücksichtigen und dazu führen, daß der Antikörper im Durchlauf verbleibt, während die Protein-A-Verunreinigung gebunden und somit von dem Antikörper abgetrennt wird, und c. Auffangen von wenigstens 70 % der auf das Anionenaustauschmaterial aufgegebenen Antikörpermenge im Durchlauf des Ionenaustauschers, während das verunreinigende Protein A an das Ionenaustauschmaterial gebunden wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Verfahren in einem Schritt nach dem ersten Anionenaustauscherschritt den Antikörper weiter aufreinigt, wobei vorzugsweise die Abtrennung von aggregiertem Antikörper gestattet ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Verfahren den Schritt der weiteren Aufreinigung des Antikörpers durch Abtrennung von aggregiertem Antikörper durchführt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein A um ein Protein A handelt, das wenigstens einen Teil einer funktionellen IgG bindenden Domäne von Wildtyp-Protein A, ausgewählt aus den natürlichen Domänen E, D, A, B, C oder künstlich hergestellten Muteinen davon, bei denen die IgG-Bindungsfunktionalität erhalten ist, umfasst, und wobei das Protein A durch eine Bindungskonstante K von wenigstens 10–8 M für den Fc-Anteil von menschlichem IgG1 oder von Maus-IgG2a gekennzeichnet ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein A um ein rekombinantes Protein A handelt, das ein Cystein in den letzten 30 Aminosäuren des C-Terminus der Aminosäuresequenz des rekombinanten Protein A umfaßt, und daß das Protein A durch das Schwefelatom des Cysteinrests über eine Thioetherbindung als einzigen Befestigungspunkt an das chromatographische Trägermaterial gebunden ist.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein A oder die Protein-A-Verunreinigung auf eine Konzentration von < 1 ng/mg IgG im Durchlauf des Ionenaustauschers reduziert wird.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einen pI-Wert von wenigstens 6,5 oder darüber aufweist.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper, vorzugsweise einen IgG-Antikörper, handelt, wobei letzterer ein chimärischer IgG-Antikörper oder ein IgG-Antikörper mit aufgepfropftem CDR sein kann.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der IgG-Antikörper wenigstens hinsichtlich derjenigen Teile des Antikörpers, die für die Bindung an Protein A relevant sind, besonders bevorzugt hinsichtlich des Cγ2-Cγ3-Schnittstellenbereichs des IgG, der die Bindungsstellen für Protein A umfaßt, aus solchen Spezies bzw. solchen IgG-Unterklassen stammt, die eine hochaffine Bindung an Protein A erlauben.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der IgG-Antikörper bezüglich des Fc-Teils des Antikörpers aus der Gruppe menschliches IgG1, IgG2 und IgG4 ausgewählt ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper aus einer Zellkultur geerntet wird, bevor er mittels Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper aus einer Säugerzellkultur geerntet wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß der mittels Protein-A-Affinitätschromatographie zu reinigende Antikörper nicht zur Inaktivierung von Proteasen behandelt wird und sich vorzugsweise nicht im Gemisch mit wenigstens einem Proteaseinhibitor befindet.
  14. Verfahren zur Reinigung eines Antikörpers, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: a. Reinigen eines Antikörpers mittels Protein-A-Affinitätschromatographie, b. Aufgeben des eine Protein-A-Verunreinigung umfassenden gereinigten Antikörpers, wobei die Protein-A-Verunreinigung bei der Elution von gebundenem Antikörper von der Protein-A-Affinitätschromatographiesäule erhalten wird, auf ein erstes Anionenaustauschmaterial unter Bedingungen, die die Bindung des Protein A berücksichtigen und dazu führen, daß der Antikörper im Durchlauf verbleibt, während die Protein-A-Verunreinigung gebunden und somit von dem Antikörper abgetrennt wird, c. Auffangen des auf das Anionenaustauschmaterial aufgegebenen Antikörpers im Durchlauf des Ionenaustauschers, während das verunreinigende Protein A an das Ionenaustauschmaterial gebunden wird, d. und weiteres Reinigen des Antikörpers, indem dieser auf einen zweiten Ionenaustauscher gegeben, daran gebunden und davon eluiert wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 70 % der auf das erste Anionenaustauschmaterial aufgegebenen Antikörpermenge im Durchlauf wiedergewonnen werden.
  16. Verfahren nach einem Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einen pI-Wert von wenigstens 7,5 oder darüber aufweist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zweiten Ionenaustauscher um einen Kationenaustauscher handelt.
  18. Verfahren nach Anspruch 14 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gereinigten Antikörper um einen monomeren Antikörper handelt und daß der zweite Ionenaustauschschritt die Abtrennung von aggregiertem Antikörper gestattet.
  19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Antikörper um einen IgG-Antikörper handelt.
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