CN100384874C - 用蛋白质a和离子交换层析来纯化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的从通过蛋白质A亲和层析法纯化的抗体中选择性去除蛋白质A的方法。

Description

用蛋白质A和离子交换层析来纯化抗体
蛋白质A层析
本发明涉及生物技术产业的抗体纯化领域。本发明的一个目的是提供一种抗体纯化的新方法。
蛋白质A层析法已广泛用于抗体的产业化制备，因为该法可一步从细胞培养上清液中几乎完全纯化抗体，通常是IgG抗体。但蛋白质A亲和层析柱反复运作时不可避免地会发生某种程度的配体脱落。这可能部分是由于蛋白酶水解将蛋白质A从柱上剪切下来，而药学应用的产业化抗体制备，因规则原因混合物中不能加入蛋白质酶抑制剂。不幸的是，这种蛋白质A或其片段的污染物仍保留了对IgG的亲和力，由于形成复合物而难以从纯化的抗体中去除。但去除是必须的，因为蛋白质A是细菌蛋白质会引起不良免疫应答反应；据报导将蛋白质A加单体IgG形成的模拟复合物在体内可激活携带Fc的白细胞和补体系统，产生氧化和过敏作用(Balint等，Cancer Res，44；734，1984)。
美国专利6,399,750中介绍了商品化重组蛋白质A的种类，通过硫脂键将重组蛋白质A结合于层析柱基质可使蛋白质A柱具有较高容量，但与通过CNBr交联获得的许多传统多点结合的天然蛋白质A基质相比，其伴随的缺点是这种重组蛋白质A基质的脱落率显著增加。因此，应去除蛋白质A污染物，而不要同时去除了复合物中的IgG。
Balint等(同上)显示可通过凝胶渗滤将这种IgG-蛋白质复合物与未复合的IgG相分离。但产量低和抗体损失大是此法的缺点。
美国专利4,983,722说，可通过将混合物吸附于阴离子交换材料，然后在递增离子强度条件下，顺次洗脱抗体和蛋白质A使这二种组分分开，可从蛋白A纯化的抗体制品中选择性分离去除污染的蛋白质A。此分离法高度依赖于抗体的等电点(pI)，而pI对给定的抗体是特异性的和高度不同的。而且达到分离所需的盐梯度过于急剧限制了此法的实施。
本发明的一个目的是提供使蛋白质A或其片段与抗体，优选IgG抗体相分离的另一种方法，该方法避免了当前技术的缺点。按照本发明的独立权利要求1-9解决了此问题。
本发明设计的纯化抗体方法包括步骤如下：首先，用蛋白质A亲和层析纯化抗体，其中所述蛋白质A是天然蛋白质A或其功能性衍生物。其次，将纯化的抗体加到离子交换材料上，所用的条件能使蛋白质A或其功能性衍生物与基质结合；第三步收集该离子交换介质流穿液中的抗体，宜收集加载到该离子交换材料中抗体量的至少70％，更优选收集至少80％，最优选收集至少90％，而同时污染的蛋白质A或其衍生物仍结合在该离子交换材料上。
蛋白质A是发现于金黄色葡萄球菌的细胞表面蛋白质，它具有结合哺乳动物抗体，特别是IgG类抗体Fc区的特性。在该给定类型的抗体中，对于动物种类来源和抗体亚类或同种异型的不同，其亲和力也略有不同(综述见Surolia.A等，1982，蛋白质A：天然的通用性抗体，TIBS 7，74-76；Langone等，1982，金黄色葡萄球菌蛋白质A和其相关的免疫球蛋白受体，Advances in Immunology，32：157-252)。可直接从分泌蛋白质A的金黄色葡萄球培养物中分离得到蛋白质A，或更方便地在大肠杆菌中重组表达(Lofdahl等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80：697-701)。其在抗体，特别是单克隆抗体IgG纯化中的用途现有技术已有描述(如Langone等，同上；Hjelm等1972；FEBS Lett.，28：73-76)。对于采用蛋白质A亲和层析，应将蛋白质A偶联于固相基质，例如不带电荷的交联琼脂糖(Sepharose，没有天然琼脂糖的带电荷组分)trisacryl交联的的葡聚糖或二氧化硅为基础的材料。方法是本领域公知的，例如通过蛋白质的伯氨功能基团与CNBr活化的基质偶联。蛋白质A与IgG的Fc部分结合是高亲和力和高特异性的，即通过IgG的Cγ2-Cy3界面(见Langone等所述，同上)，具体说，它与人的同种异型或亚类IgG1、IgG2、IgG4和小鼠同种异型或亚类IgG2a、IgG2b、IgG3结合力强。蛋白质A对VH基因家族，VHIII编码的免疫球蛋白Fab区也显示有亲和力(Sasso等，1991，J Immunol.，61：3026-3031；Hilson等，JExp.Med.，178：331-336，1993)。编码蛋白质A的基因序列显示有两个功能不同的区域(Uhlen等，J Biol Chem.，259：1695-1702，1984；Lofdahl等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，80：697-701，1983)。其氨基末端区含有5个高度同源性IgG结合功能域(称为E、D、A、B和C)，其羧基末端区将该蛋白锚定在细胞壁和细胞膜上。蛋白质A的所有5个IgG结合功能域都能通过Fc区IgG，涉及例如人IgG-Fc残基252-254、433-435和311，其晶体结构图见Diesenhofer等(1981，Biochemistry.20：2361-1370)和Sauer-Eriksson等(1995，Structure.3：265-278)的蛋白质A的B-功能域。在Fc部分中发现的两个基本上毗连的主要结合位点已得到Gouda等的NMR分辩研究(1998，Biochemistry，37：129-136)证实。原则上，蛋白质A的IgG结合功能域A-E之每一个都足够与IgG的Fc部分结合。
此外，发现人的某些VH3家族等位基因能任选地介导人Ig与蛋白质A的结合(Ibrahim等，1993，J Immunol.，151：3597-3603；V-区介导人Ig与蛋白质A的结合)。在本申请书内容中，本发明的另一不同目的，所述的可应用于抗体Fc区与蛋白质A结合的任何事情，都同样可应用于通过这类VH3家族蛋白质A结合等位基因(这类抗体的Fc区本身不能高亲和力对结合蛋白质A)结合抗体。这可认为是本发明以Fc为基础方法原理的等同性实施方式，将在后续章节中作进一步叙述。
本发明的任何IgG抗体可理解为能以高亲和力结合蛋白质A的任何这类同种异型抗体。另外，与抗体的结合蛋白质A相关的Fc部分不同，这类抗体不一定对应于天然产生的抗体。具体说其可变链的区域部分，可经工程改造成嵌合性或CDR-移植抗体，如该领域常规设计的那样。简言之，本发明的任何IgG抗体应认为是IgG类型抗体。
本发明的蛋白质A的功能性衍生物特征是对小鼠IgG2a或人IgG1的结合常数至少为K＝10-8M，优选K＝10-9M。依从此结合常数值的相互反应在本文中称为“高亲和力结合”。蛋白质A的功能性衍生物宜含有野生型蛋白质A的至少功能性IgG结合结构域部分，此结构域选自天然结构域E、D、A、B、C或其经工程改造后的保留了IgG结合功能的突变蛋白。例子是蛋白质A的B结构域功能性59氨基酸‘Z’片段，B结构域可用于抗体纯化，见美国专利6013763。然而，优选本发明的抗体结合片段至少含有本节所述的两个完整的Fc结合结构域。一个例子是Repligen公司的欧洲专利EP-282308和EP-284368中公开的重组蛋白质A的序列。
如以上章节所定义的蛋白质A或其功能性片段或衍生物可单独或联合，更优选工程改造的能单点结合的蛋白质A片段。单点结合意为蛋白质部分通过一个共价键结合于蛋白A亲和层析的层析载体物质。这种单点结合可通过适当的反应性残基而结合，这种反应性残基理想地位于暴露的氨基酸位置，如靠近N-或C-末端的环圈中，或蛋白质折叠的外周部分。适合的反应性基团有例如巯基或氨基。更优选这种重组蛋白质A或其功能性片段在其氨基酸序列中含有半胱氨酸。最优选所述半胱氨酸包含在该重组蛋白质A或其功能性片段氨基酸序列的C-末端至少30个氨基酸组成的区段中。这种类型的另一优选实施方式中，该重组蛋白质A或其功能性片段通过硫醚键至少50％结合于蛋白A亲和层析介质的层析载体或基质材料上。此类实施方式的例子见Pharmacia的美国专利6399750中的描述，可从市场上依据所用载体基质的性质，以Amersham-Biosciences的品牌名StreamlineTM MabSelectTM购买到，在本文中，按通常的化学语言，硫醚狭义理解为-S-键，而不论其化学成分；例如，可以说本发明的-S-‘硫醚键’是较大功能基团的一部分，例如本申请书中的硫醚或混合乙酸来自化学家采用的以反应性为基础的通常语言。硫醚键优选其普通的化学上狭义的硫醚键。对于这种键连接，可通过使蛋白质A半胱氨酸残基的巯基与活化层析载体物质上的环氧基团反应而产生硫醚基团。带有末端半胱氨酸残基时，可在只适合蛋白质暴露的独特巯基偶联的条件下进行这种反应，结果只产生该蛋白质的单点结合。
在一具体优选实施方式中，本发明的蛋白质A或其功能性衍生物是美国专利6399750所公开的重组蛋白质A，其含有并置在末端的工程改造的半胱氨酸残基，通过所述半胱氨酸残基的硫原子作为唯一的结合点，宜至少50％，更优选至少70％偶联于层析载体物质。更优选，这种偶联可通过环氧介导的活化实现，还要优选通过琼脂糖基质，例如Sepharose Fast Flow(用表氯醇交联的琼脂糖珠，AmershamBiosciences，UK)的1，4-双-(2，3-环氧丙氧基)丁烷活化，或通过琼脂糖基质如Sepharose FF的表氯醇活化而实现这种偶联。还优选与本章节上述优选实施方式联合的是，首先的离子交换剂是阴离子交换剂，具体说是季铵为基础的离子交换剂，如Sepharose Q TMFF(Amersham-Biosciences/Pharmacia)，最优选具有能偶联于基质载体的功能性交换剂基团Q的阴离子交换剂，基团Q是N，N，N-三甲基氨基甲基，最优选的阴离子交换剂是Pharmacia/Amersham Biosciences的Sepharose QTM FF。季铵基团是强交换剂，对加载/洗涤时pH的变化不敏感。快流速交换材料是45-165μm的高度交联的琼脂糖珠，物理稳定性较高；另外Sepharose没有天然琼脂糖的带电荷硫酸化分子组分，不会使抗体非特异性吸附于基质，即使在抗体高负荷条件下。可在实验章节中找到这类实施方式的例子。
本发明的蛋白质A污染，是从蛋白质A亲和层析柱上洗脱结合的抗体时获得的上述蛋白质A或其功能性衍物的任何功能类型的IgG结合产物。这类蛋白质A污染可导致例如肽键水解，这特别在产业化制备中由于酶的作用非常可能发生。蛋白质A层析应用于下游加工粗纯时的早期步骤，此时新鲜的产物液仍含有相当量的酶活性。在先前的离心或渗滤步骤中细胞培养基中的死亡细胞和破坏的细胞可能释放出游离蛋白酶。在下游加工前或加工中，通常不能象生化研究实验那样为调控目的在细胞培养基中加入蛋白质酶抑制剂。例子是酚-甲基-磺酰氯(PMSF)或ε-己酸。这些化学试剂作为生物医药产品中的添加剂是不理想的。也有可能重组的蛋白质A功能性衍生物或其片段对蛋白酶的抗性比野生型差，这取决于蛋白质折叠时的三级结构。连接各IgG结合功能域的氨基酸区段一旦暴露，结合功能域的总数即可能减少。各功能域之间的接触对结构域折叠的稳定性可能有贡献。也可能蛋白质A或其所述功能性衍生物与抗体的结合由于结合时产生的构象变化，影响到或促进了其易受蛋白酶的作用。还有，野生型或全长蛋白质A或其功能性改造的片段可能有不同的行为表现。本发明的污染性蛋白质A宜仍是有功能的IgG结合蛋白，因而在加入到本发明后续离子交换分离介质时能与蛋白质A纯化的抗体结合。污染的蛋白质A与纯化抗体的高亲和力结合，是为什么难以分离污染的蛋白质A与纯化抗体的原因。
依据本发明，待纯化的抗体在用蛋白质A亲和层析纯化前，宜收集自细胞培养物。所述细胞培养物宜为哺乳动物细胞培养物。哺乳动物细胞具有大的称为溶酶体的腔室，其中含有细胞死亡时破裂或释放出的降解酶。具体说，所述细胞培养物可以是骨髓瘤细胞培养物如NSO细胞(GalfreG和Milstein，C酶学方法，1981，73，3)。骨髓瘤细胞是浆母细胞瘤细胞，即淋巴样细胞系的细胞。举例的NSO细胞系是例如可从欧洲的Applied Microbiology & Research，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG，UnitedKingdom的细胞培养物收藏中心(ECACC)免费得到的细胞系ECACC No，85110503。发现NSO能获得极高的产品产量，特别是用于生产重组抗体时。还发现至少采用野生型蛋白A的重组短片段的某些蛋白A亲和层析系统时，NSO细胞重复性产生污染性蛋白质A的水平比其它类型宿主细胞高得多，所述重组蛋白A是可以单点结合的蛋白A。其例子是StreamlineTM rProtein A亲和层析树脂(Amersham Biosciences；主要是硫酯键单点结合的重组蛋白A，见美国专利6,399,750)。采用StreamlineTM rProteinA亲和柱可能获得每毫克抗体含约1000纳克或更多的污染性蛋白质A。本发明方法与现有技术不同在于，能在一次快速纯化步骤中有效降低污染的蛋白质A，使上述高水平降至＜1ng/mg，而纯化系数约为1000x。
另一优点是，单独或与上述章节联合时，待用蛋白质A亲和层析法纯化的抗体在收获时或在收获后不必灭活蛋白酶，更优的是收获后不必与至少一种外源添加的蛋白酶抑制剂混合。最优的是，所述蛋白酶抑制剂选自PMSF、Laskowski等人所述的特异性蛋白酶抑制肽(Protein inhibitors of proteinases，Ann.Rev.Biochem.49：593-626)和ε-己酸。
科技文献中对蛋白质A亲和层析的操作已有广泛描述，不需要进一步述说。与以上引用文献不同的另一例子是Duhamel等，J Immunological Methods.31：211-217，1979，从蛋白质A-Sepharose上pH梯度洗脱人IgG1、IgG2和IgG4。
宜在流经第一离子交换剂时将污染的蛋白质A浓度降低至＜10ng/mg抗体，更宜＜4ng/mg抗体，最宜＜1ng/mg抗体，其中所述的抗体应理解为指IgG。验证这些域值的ELISA试验方法见实验章节中的详细描述；但应注意将样品酸化至pH≤4并宜存在温和的洗涤剂，是精确测定脱落蛋白质A量的关键。不必说待了解的这个域值，例如结合蛋白质A的第一离子交换剂的加载容量不能过量，否则将不可避免地导致污染性蛋白质A的断裂。测定蛋白质A或其片段的合适ELISA方法见美国专利4,983,722中所述。合适的抗-蛋白A抗体可从市场上，例如Sigma-Aldrich购买到。特别是采用蛋白A的衍生物时，可工程改造此衍生物使含额外的巯基，蛋白质标准品的保持很重要。可能重要的是应验证用作定量测定测试样品标准品的纯化蛋白质A衍生物的单体特征，因为通过-S-S-桥形成的共价二聚体或多聚体可导致错误的结果。如本领域常规，在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE分析不难实行此种验证。用DTT或β巯基乙醇还原蛋白质A衍生物-标准溶液有助于纠正ELISA-技术测定中的错误。
本发明方法的另一优点是，在第一离子交换柱的离子交换剂流穿液中，可回收到加载抗体量的至少70％，更优至少80％，最优至少90％。
本发明的第一离子交换剂是阴离子交换树脂；EP-289129B1中描述了二种树脂可结合蛋白质A。可采用柱模式以某种流速，或以分批模式操作第一离子交换剂或阴离子交换剂，即将离子交换树脂浸泡在温和搅拌的样品液中，通过随后的渗滤交换液体介质。依据本发明要考虑给定抗体的等电点pI，可以确定其加载到第一离子交换剂时的合适pH和离子强度条件，此条件应使抗体留在流穿液中，而蛋白质A污染物结合于树脂而从抗体中除去。如前所述本发明方法可将污染的蛋白质A快速与抗体分离。能结合于基质载体的第一阴离子交换剂的功能基团是，例如伯、仲铵基、特别是叔、季铵基，如氨基乙基、二乙氨基乙基、三甲基氨基乙基、三甲基基氨基甲基和二乙基(2-羟丙基)-氨基乙基。阴离子交换用的合适层析载体基质是本领域已知的。例子有琼脂糖为基础的树脂和珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯珠和聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂。最优选的离子交换剂是固定在琼脂糖基质上的季铵阴离子交换剂，如Amersham-Biosciences/Pharmacia的Sepharose CL-6B或Sepharose Fast Flow(FF)。其例子是Amersham-Biosciences/Pharmacia的Sepharose QTM。GN TX与第一阴离子交换剂联用的本发明抗体宜为单克隆抗体，其等电点(pI)宜至少高于上述蛋白质A亲和层析步骤所用的蛋白A的pI两个pH单位，即比之更碱性；例如，天然蛋白质A的pI约为5.0，Streamline的重组蛋白质A的pI约为4.5，本发明优选的单克隆抗体的pI宜至少为6.5或以上，更优选项为7.0或以上，最优选pI至少为7.5或以上。应注意所述的pI是真实收获和纯化抗体的pI，而不只是从氨基酸序列简单预测的pI。真实纯化的抗体将经历多肽骨架的进一步的修饰，如糖基化，这种修饰可能加入带电荷部分从而改变该分子的pI。用等电聚焦(IEF)法测定抗体产品的pI时，抗体蛋白质，如单克隆抗体蛋白翻译后加工的微小异质性，会导致各抗体糖蛋白分子产品更宽广的pI范围，它们在IEF凝胶中类似于涂片而非一条带，因此至少大多数产品都有特定的数值。依据本发明在上述优选实施方式中，“抗体的pI”指抗体产品分子的pI在上述优选的pI范围内。此说法的所有定义，如某给定步骤后抗体的回收比率％，只指符合该pI范围的抗体的回收。
本发明的第一阴离子交换剂的操作模式，要求将蛋白质A亲和层析步骤从第一阴离子交换剂的酸性平衡缓冲液，交换成中性洗脱液。在本发明的方法中，平衡缓冲液与加样缓冲液是相同的。适合用于此目的的常用超滤装置可购买自Amicon或Millipore，这些装置避免了稀释作用同时采用低分子量的多孔渗滤基质，如Sephadex G-25。本发明的平衡缓冲液所含置换盐如氯化钠的的盐浓度，宜在1-150mM范围内，更优选5-110mM，最优选20-100mM的盐。该平衡缓冲液的pH宜在pH 6.5-pH9.0范围内，更优选在pH 7.5-pH 8.5范围内，最优选在pH 7.9-pH 8.4范围内。应记住，蛋白质的N-末端氨基具有约9.25的pK值，从而在较碱性pH下，污染的蛋白质A和任何其它已变成负电荷的蛋白质与阴离子交换剂的结合更强；对于给定的应用，加样缓冲液的pH可能需要细调，以最佳区分给定的一对抗体和pI值不同、半胱氨酸和组氨酸侧链含量不同(它们可能引起电荷在所选pH范围内变化)的污染性蛋白A之间的结合和不结合。此外，更碱性的pH会干扰蛋白A-抗体之间的相互反应，如同离子强度增加那样；同样需要细调离子强度以均衡防止抗体结合与消除污染性蛋白A结合的需要。不用说，本领域技术人员知道，缓冲液的离子强度常与pH值呈相反关系；蛋白A结合阴离子交换剂的强度取决于pH，更多的盐可防止抗体的结合并干扰蛋白A-抗体之间的可能相互反应。因此可理解，上述pH和置换盐浓度的范围是相关的：pH越低，允许在上述给定范围内实施本发明的盐用量越少。此外，加入pH缓冲液中的盐量可进一步提高该溶液的离子强度。可通过测定平衡缓冲液的导电率，确定离子强度。术语“导电率”指水溶液在二电极间传导电流的能力，衡量的是带电离子的总量和计数离子迁移。因此，随着水溶液中存在的离子量增加，溶液的导电性也增高。导电率的测定单位是mS/cm(毫西门子/厘米)，可采用市售的，如Topac Inc.(Hingham，MA/USA)或Honeywell出售的电导计测定。本申请书中，所有的数值指25℃时的特定电导率。阴离子交换第一步所用的加样或平衡缓冲液电导率为0.5-5mS/cm，更优选1-3mS/cm，最优选1.25-2.5mS/cm。理想的电导率约为2mS/cm。合适的缓冲盐例子可在Good，NE(1986，Biochemistry，5：467-476)中找到。例如，常用的Tris-HCl缓冲剂或磷酸氢钠缓冲剂是适合的缓冲剂。缓冲剂的浓度通常[在例如10-40mM缓冲盐范围内。设计缓冲液的可用阴离子剂中，与具有低洗脱强度性能的氯化物相比，优选那些具有洗脱特异性较低强度的阴离子，它们与离子电荷密度几乎呈相反关系，而与离子大小几乎呈正相关。阴离子洗脱液强度的经验性比较，已在生化标准教材中列表说明。更优选本发明的缓冲剂是磷酸缓冲剂。磷酸氢钠具有低的洗脱强度，特别是在pH 8.0或以下使用时，特别是其低的离液性能更优。可进行批次操作模式，第一步阴离子交换宜采用柱操作模式。此时，可优选采用流速约10-60ml/h。加载的抗体浓度宜为每ml交换树脂10-30mg抗体。不用说，采用极稀的样品会使抗体产量降低，这是技术人员知道的。在加载操作时以低流速，用一倍柱体积的同一平衡缓冲液洗涤收集要纯化的抗体。将流穿液的pH调至中性pH，以改善抗体蛋白的稳定性和防止凝聚和/或沉淀。
第一步阴离子交换后，抗体已可应用，或可能需要用常规纯化方法进一步精加工。在另一优选实施方式中，第一步离子交换后是第二离子交换，此第二步中将抗体加载到并结合于第二离子交换介质，用加样液以外的缓冲液，通过提高盐浓度和/或pH洗脱抗体，成为基本上是单体的不凝聚抗体。“基本上”指该成分不到5％。单独或与以上章节所述的优选实施方式联用的第二离子交换剂，宜是阳离子交换剂。这种蛋白质A层析后第一离子交换剂和第二离子交换剂的联用是新颖方法。公知细胞培养基产生的最微量污染蛋白质具有比抗体，特别是IgG抗体低得多的pI值；阳离子交换因而能有效地去除凝聚的抗体和潜在的传染因子如病毒包衣及抗体以外的污染蛋白质。由于加载后，结合和从柱上洗脱操作快速，及加载量高而高效地回收了抗体，一批抗体还可反复地循环操作，因而一轮结合和洗脱中可获得更高的纯化效率。加样缓冲液的pH宜约4-7，更优选pH为4.01-6，最优选pH为4.02-5.5。还优选用0.1-1.2M的盐梯度从阳离子交换剂中洗脱抗体，其中优选的盐是碱金属盐，更优选锂盐、钾盐或钠盐。优选用pH 7-8的洗脱液最大程度去除凝聚物和最大程度减少酸性条件对抗体的损伤。任选采用pH 4-7，更优选4.01-6的洗脱液以最大程度地去除蛋白A的污染；此法可达到每毫克抗体低至＜0.4ng的污染蛋白A。此第二步阳离子交换可赋予传统的凝胶过滤作用，同时具有离子交换通常具有的高容量及快速操作优点。离子交换载体每毫升树脂可加载10-30mg的抗体。在具体优选实施方式中，蛋白质A层析后相配的第一步阴离子交换和第二步阳离子交换的纯化方法可得到临床级的抗体，不需要最后的大小排斥层析(SEC)步骤，此SEC步骤的分子量截留适合将抗体凝聚物和/或抗体-蛋白A复合物与单体抗体如正常IgG相分离。
一般应注意，本发明的方法不适合针对蛋白质A表位的抗体。这种抗体不是本发明权利要求的，虽然这是本领域技术人员明知的局限性。
本发明方法最吸引人的特征是通过阴离子交换剂，以非结合或流穿形式纯化抗体，柱的容量均不限制物质的流通；柱的容量只由保留的污染蛋白A的最小量决定。这就节约了大量加工时间和原料，同时能够非常有效地去除蛋白A污染。
实验
1.蛋白质A ELISA
已报道了许多的蛋白质A或重组蛋白质A的ELISA测试方法(见美国专利4983722和其中的参考文献)。对于下述所有工作，采用简单的夹心ELISA法，其中平底96孔微滴板(NuncTM)上包被有捕获性抗-蛋白A抗体来保留蛋白A。然后用生物增强活力化抗-蛋白A检测抗体，再与链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(Amersham #RPN 1231)结合，来检测结合的蛋白质A。用于捕获的抗-蛋白A兔抗体(针对天然金黄色葡萄球菌蛋白质A)购自Sigma-Aldrich(#P-3775)。此研究整个过程都用此抗体。检测用的兔抗体同样购自Sigma-Aldrich(#P-3775)。利用非特异性吸附过程包被蛋白后，利用包被的蛋白质来保留特异性捕获蛋白A的抗体，该捕获抗体再用生物素化兔抗蛋白A抗体和链霉亲和素-辣根过氧化物酶检测。采用四甲基联苯胺作为产色底物。针对采用待测的污染蛋白A的非常亲本的蛋白A或其衍生物制作的标准曲线，读取未知样品的浓度。用酸性pH包被及标准品的制备证明是重要的。特别是重组的蛋白A经工程改造而携带了半胱氨酸残基，如Streamline Protein ATM(Amersham-Biosciences，原先为Pharmacia)，发现标准溶液需要用还原性巯基试剂预处理以确保该蛋白质标准溶液处于单体状态。相反，购自一些公司如Sigma-Aldrich/Switzerland(#P6031)或Pharmacia(#17-0770-01)的野生型蛋白A标准品不需要这种预处理。以下叙述的实验显示了从StreamlineTM基质上脱落的污染蛋白质A，采用获自厂商的非偶联重组蛋白质A作为标准品。
1.1富含半胱氨酸蛋白质A-标准品的预处理
购自Pharmacia/Amersham-Biosciences的冻干纯化重组蛋白A-Cys，用于StreamlineTM蛋白A亲和层析(Amersham-Biosciences)柱材料。将20mg/ml蛋白质溶于含0.5M NaCl、1mM EDTA和20mM二硫赤藓糖醇的0.1M Tris pH 8.0液中，室温培育15-30分钟，用一次性使用的PD-10凝胶过滤柱(Amersham-Biosciences)脱盐。用于处理标准液的所有缓冲液在包被前，应用N2-处理以防巯基氧化。蛋白质标准液最好在临用于包被微滴板前制备。任选地，制备1mg/ml的贮藏液冰冻保存于-65℃；融化后测定加到非还原性SDS-PAGE上的等份样品中的单体蛋白A性质。蛋白标准液的浓度用Bradford试验测定(Bradford等，1976，Anal.Biochem.72：248-254；Splittgerber等，1989，Anal.Biochem.179：198-201)以及进行自动化氨基酸分析。图1显示此预处理的结果，采用非还原性10％SDS-PAGE分析葡萄球菌蛋白A标准液(泳道1：天然蛋白A；泳道2：预处理后)和纯化的非偶联StreamlineTM重组蛋白A(由Pharmacia，现为Amersham-Biosciences惠赠；泳道4：天然重组蛋白A；泳道5：预处理后)。泳道1是分子量标志，相应于垂轴上所指分子量。Pharmacia的重组蛋白A在还原为低分子量后含有一额外的半胱氨酸残基转移；保存了一条约34kD的带很强，二硫桥二聚体解离后形成明显的条带。
1.2 ELISA
1.2.1样品制备
通过二步稀释，制备含1mg/ml的蛋白A标准贮藏液的1∶200000稀释液，提供50ng/ml的最高标准液。从其制备0.2ng/ml的稀释液用于测定标准曲线。此外，用标准稀释液(‘加料液(spiking solution)’)来加料一式二份待测产品样品，以排除样品中存在的干扰性物质。
对于最终产品样品的测试，将每份样品分成二等份体积500微升。一份用100ng/ml，如合适用10μg/ml的加料液加料，达到每毫克抗体最终含有10纳克的蛋白A。另一半用相同体积的相同缓冲液加料；计算出产品样品因加料液所致的稀释系数。以下将二种类型制品称为“加料样品(Spiked sample)”。将7.51g甘氨酸(碱)、5.84g NaCl、0.5ml Triton X-100溶于1升去离子水或双蒸水中制备样品缓冲液。为了最佳精确测定，用本领域公知的常规ELISA法预先测定样品中的抗体浓度。标准液加入等量的蛋白A亲和常数相当的已知标准抗体，来测定酸化步骤的效应，和解决因抗体结合所引起的任何潜在性系统误差，从而清除该试验捕获的蛋白质A。
酸化：在450μl的加料样品或标准液中加入200μl的0.2M柠檬酸/0.05％TritonX-100 pH 3.0缓冲液。所有样品疫一式三份进行测试。制备样品稀释液并测试一式三份，因为对于1mg/ml-0.2mg/ml范围内的抗体浓度该试验运作得最佳。酸化步骤是该试验释放污染的蛋白A或其片段的关键，否则蛋白A或其片段会结合样品液中的过量抗体。
1.2.2用抗体包被微滴板
制备由1.59g/L Na2CO3、2.93g/L NaHCO3 0.20g/L叠氮钠组成的包被缓冲液。调整该缓冲液的pH至9.6。每孔加入100μl抗体液，其抗体含量足够使蛋白A标准液不会饱和。用塑料膜封盖板，置于潮湿箱中37℃培育过夜约18小时。用至少300μl洗涤缓冲液(NaCl 5.8g/L、Na2HPO4 1.15g/L、NaH2P.H2O 0.26g/L、EDTA3.7g/L、Tween-20 0.2g/L、丁醇10ml/L pH 7.2)淋洗所有孔3次，拍干。每孔加入250μl封闭缓冲液(含0.5％酪蛋白hammarsten的包被缓冲液)在旋转摇动平台上室温培育2小时(速度120rpm)。用至少300μl洗涤缓冲液淋洗所有孔3次，拍干。
1.2.3培育样品并检测
将标准液和样品液(包括加料样品液)置入测定板中，100μl/孔。用塑料膜封盖板，在旋转摇动平台上室温培育90分钟。所有孔用至少300μl洗涤缓冲液淋洗3次，拍干。以预定的最佳条件稀释生物素化兔抗蛋白质A抗体。加入100μl/孔，用塑料膜封盖板，在旋转平台上室温培育90分钟。反复淋洗。以预定的最佳条件，用偶联缓冲液(Na2HPO4 1.15g/L、NaCl 5.84g/L、NaH2P.H2O 0.26g/L、EDTA3.73g/L、TritonX-100 0.05％(v/v)、pH 7.2)稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶。加入100μl/孔，用塑料膜封盖板，旋转摇动室温培育45分钟。反复淋洗。加入新鲜配制的四甲基联苯胺(TMB，ICN产品#980502)底物液。如下制备底物液：将10mg TMB溶于1ml DMSO中。取10μl该贮藏液和10μl H2O2加入到2.05％(w/w)乙酸钠水溶液中，用0.5M柠檬酸调pH至6.0。不用说，所用的制备该试验任何试剂的水都是最高质量的水，即去离子超纯水或至少是双蒸水。
在摇动台上室温培育该底物液8-11分钟。每孔加入中止液(13％H2SO4)50μl中止反应。加入中止液后10分钟内在平板读数分光光度仪上测定各孔450nm波长吸光度。
此ELISA的检测限度是0.2ng/ml蛋白质A，工作范围0.2-50ng/ml，试验间变异系数不到10％。
图2显示从硫醚键单点结合蛋白A的StreamlineTM重组蛋白A层析柱洗脱的抗体中，脱落的重组蛋白A的水平。轮次数指用1M氯化钠洗脱后重新平衡反复使用的次数。而杂交瘤细胞培养物的细胞培养液的渗漏量通常为500ppm级，其它类型细胞渗漏水平高至1000ppm。表1给出了不同来源基质渗漏速率的概况；按厂商说明书进行层析。
表1
 基质  供应商 偶联化学方法  典型渗漏ppm  工作容量(mg/ml)  流速(cm/h)
 Native Protein AAsepharose 4FF  Amersham-Biosciences 多点结合CNBr  10-20  5-20  30-300
 rmp Protein ASepharose  Amersham-Biosciences 多点结合  10-20  5-20  30-300
 Poros A HighCapacity  AppliedBiosystems 多点结合  10-50  10  500-1000
 Protein ACeramic HyperD  Biosepra 多点结合  高达300  10-20  200-500
 rProtein ASepharose  Amersham-Biosciences 单点结合硫醚键  50-1000  20-40  30-300
 MabSelect  Amersham-Biosciences 单点结合硫醚键  50-1000  20-40  500
 STREAMLINErProtein A  Amersham-Biosciences 单点结合硫醚键  50-1000  20-40  200-400
图3还提供关于采用同一亲和基质材料进行多轮蛋白A亲和层析时污染性蛋白A脱落不大为降低的资料；如以下章节2.1所述反复使用野生型蛋白A多点结合的Sepharose FF(Amersham-Biosciences)，用上述ELISA法测定洗脱液(在其进一步加工之前)中污染性蛋白A的水平。
2.蛋白质A和Sepharose Q层析
2.1用StreamlineTM进行蛋白A亲和层析
离心和充分渗滤初步纯化NS0骨髓瘤细胞培养物的细胞培养上清液，并超滤浓缩；还利用超滤将培养液交换成PBS pH 7.5。细胞产生的抗体滴度为0.2mg/ml，总共加入1升经缓冲液交换的上清液。该单抗#5的pI为8.5。预先用10倍柱体积的50mM甘氨酸/甘氨酸盐pH 8.8 4.3M NaCl平衡蛋白质A StreamlineTM柱(5ml体积)，流速200cm/ml。加样时此柱操作流速为50cm/h，加载量约每毫升基质材料20mg。洗脱前用至少10倍柱体积的含200mM NaCl 0.1％、Tween-20的甘氨酸平衡缓冲液洗涤。用0.1M甘氨酸/HCl pH 4.0的洗脱缓冲液获得洗脱液。洗脱后立即将含抗体峰的组分用0.5M Tris HCl pH 7.5等份水溶液中和，用Amicon渗滤装置交换缓冲液，成为本发明后续阴离子交换步骤用的加样/平衡缓冲液(10mM Tris HCl pH 8.0，0.5mM NaCl)，防止其过久暴露于酸性pH下。如上所述测定抗体浓度和污染的蛋白A浓度。渗滤前洗脱中的污染蛋白A水平约为1434ng/mg抗体，渗滤后为1650ng/mg抗体。加载前依据缓冲液交换的上清液滴度，抗体回收率为81％，渗滤液的抗体浓度为3.6mg/ml。
2.2非结合模式中的Q-SepharoseFF阴离子交换步骤
如下所述进一步加工章节2.1纯化的抗体：用10ml 0.1M NaCl液，然后2倍柱体积的0.1M Tris pH 8液填装Q-Sepharose FF柱(Amersham-Biosciences)，用10倍柱体积的10mM Tris pH 8/50mM NaCl平衡，流速75cm/h。平衡后将流速降低至50cm/h。将6ml渗滤后的抗体液加入柱中，收集流穿液作进一步加工；继续收集流穿液直到加完最初的6ml抗体液，持续到加完后或平衡缓冲液(10mM Tris pH 8、50mM NaCl)，监测流穿液的280nm吸收值直到返回基线。流穿液中的抗体总共回收到23mg(87％)。测定的蛋白A污染水平为＜3ng/mg抗体。
在Sephacryl S-300上用10mM pH 7.0磷酸缓冲液、140mM NaCl，流速10cm/h进行凝胶过滤(大小排除层析SEC)进一步加工Q-Sepharose纯化的抗体，加载比率为每毫升胶15mg抗体，发现基本上不会改变痕量的蛋白A污染水平。凭经验，可SEC将污染性蛋白A的约30-100ng/mg水平进一步降低至约1-5ng/mg。因此对于痕量蛋白A，SEC的纯化系数很低，可能是由于抗体与污染蛋白A之间的亲和性相互反应而致。然而，由于样品的稀释不可避免，缓慢加工时抗体蛋白的同样衰变，SEC可获得加入抗体量70％的回收。这意味着SEC不可避免地会导致材料的损失，同时需要更多时间。
如上所述，将分离的洗脱物用2M NaCl再平衡，重新循环使用Q-Sepharose柱。
3.蛋白质A和用后续阳离子交换步骤进行Sepharose Q纯化
另一实验中，将实验2.2的抗体以非结合模式用Q-Sepharose阴离子交换层析纯化。不测试最后的SEC纯化步骤，将SepharoseQ柱流穿液中收集的抗体，用SP-SepharoseFF(SP＝Sulphopropyl-)基质(购自Amersham-Biosciences)作第二步阳离子交换层析。SP-SepharoseFF允许的流速为100cm/h，加载后抗体的可重复性产率为93％，洗涤并从阳离子交换剂中洗脱抗体。为了加样，将获自SepharoseQ纯化步骤的抗体液pH用50mM pH 4.5乙酸缓冲液调至4.5-5.0。加载容量设为10mg/ml基质材料，加载导电率为17mS/cm。再用50mM pH 4.5乙酸缓冲液洗涤至基线。用50mM pH 4.5乙酸钠、1M NaCl高盐缓冲液洗脱抗体；单体抗体先洗脱，而凝聚体洗脱在高离子强度的末尾组分中。同样可行的是在泵入该柱前采用不太陡的盐梯度洗脱液洗脱；直接采用高盐缓冲液可使抗体较少稀释、随后采样较精确并缩短留迟在酸性液中的时间。洗脱后将酸性缓冲液迅速交换成PBS pH 7.5。测定合并洗脱液中的污染蛋白A水平＜0.4ng/mg，大小排除HPLC测定表明＞99％的抗体为单体。
4.用顾客定制的多点结合蛋白质A进行StreamlineTM蛋白A亲和层析
Pharmacia Biotech(现为Amersham-Pharmacia)为顾客定制提供了这种多点结合的StreamlineTM蛋白A亲和基质。厂家通过将含有末端Cys残基的同样34kD的StreamlineTM型重组蛋白质A偶联于同样的Sepharose基质材料，但采用传统的CNBr化学试剂活化和偶联，代替环氧化物介导的活化和只偶联-SH基团的选择性反应条件(见厂家的产品资料)，制备了这种亲和基质。重复实验2.1的方法，测得污染性蛋白A的水平为353ng/mg抗体。这意味着该交联模式解释了高容量单点结合的重组蛋白质A亲和基质蛋白质脱落增加的原因；导入这种重组蛋白质A的氨基酸序列中的修饰也相当于野生型全长蛋白质A，对蛋白质脱落的增加有相当影响。
5.方法的平行比较：与Miles法(美国专利4,983,722)比较
Miles专利(No：4,983,722)要求权利如下：采用结合性DEAE Sepharose作为盐梯度(0.025M-0.25M NaCl)洗脱的第二层析步骤，可将洗脱液中脱落的蛋白A含量减少至15ng/mg抗体以下(蛋白A的范围是0.9-14ng/mg抗体)。
表2用单点和多点结合蛋白质A亲和基质纯化的6A1
抗体洗脱样品中的残留蛋白质A比较
 基质 样品  蛋白质A水平(ng/mg)
 rProtein A Sepharose(单点结合) 蛋白质A洗脱液  20.2
 rmp Protein A Sepharose(多点结合) 蛋白质A洗脱液  2.16
 Native Protein A Sepharose(多点结合) 蛋白质A洗脱液  ＜2.0
这些实验的目的是证实采用较低pI的抗体进行MabSelect(新的单点结合重组蛋白质A基质)纯化的结果，并直接比较非结合性Q-Sepharose方法(采用不同的平衡/加样缓冲液)与Miles专利方法。
应用的方法：
纯化6A1抗体(pI6.5-7.5)包括二步层析，即MabSelect蛋白质A后进行Q-Sepharose阴离子交换层析(非结合性)或DEAE Sepharose层析(结合性)步骤。见L0 9007和L0 9375。
MabSelect蛋白质A层析：
柱基质      MabSelect重组蛋白质A(单点结合的rPA)
柱尺寸      1.6cm内径×15cm床高
柱体积      30ml
操作流速    500cm/hr(16.80ml/分)
清洗        6M盐酸胍(2倍柱体积)
加载容量    35mg/ml基质
平衡液      50mM甘氨酸/甘氨酸盐pH 8.0/250mM NaCl(8倍柱体积)
加样后洗涤  50mM甘氨酸/甘氨酸盐pH 8.0/250mM NaCl(8倍柱体积)
洗脱缓冲液  100mM甘氨酸pH 3.50(6倍体积)
洗涤        100mM柠檬酸pH 2.1(2倍柱体积)
在连接有AKTA FPLC系统的MabSelect柱(30ml)上纯化含6A1抗体的培养上清液。所有条件见上表所述。用0.1M pH 3.5甘氨酸洗脱抗体。洗脱后将洗脱液pH调至7，然后将洗脱液样品分成5等份，每份用不同缓冲液渗滤作阴离子交换层析。
第一等份用50mM Tris HCl pH 8/75mM NaCl渗滤作Q-Sepharose层析运作1。第二等份用50mM Tris HCl pH 8/100mM NaCl渗滤作Q-Sepharose层析运作2。第三等份用20mM磷酸钠pH 6.5/80mM NaCl渗滤作Q-Sepharose层析运作3。第四和五等份用25mM Tris HCl pH 8/25mM NaCl交换评价Miles专利所述结合性DEAE-Sepharose方法。运作4和5之间的差别是，运作4中主峰收集为一个组分，用标准的磷酸缓冲盐水渗滤然后分析，运作5的洗脱峰分组分收集用Miles专利所述方法制备的磷酸缓冲液渗滤。
5个柱各自运作条件如下：
Q-Sepharose层析：运作1
柱基质    Q-Sepharose Fast Flow
柱尺寸    1.6cm内径×8cm床高
柱体积    16ml
柱准备    用0.1M氢氧化钠，150cm/hr装填
操作流速    100cm/hr(3.35ml/分)
清洗        0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
加载容量    15mg/ml基质
平衡液      50mM Tris HCl pH 8.0/75mM NaCl(8倍柱体积)
加样后洗涤  50mM TrisHCl pH 8.0/75mM NaCl(5倍柱体积)
洗脱缓冲液  2M氯化钠(2倍柱体积)
洗涤        0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
Q-Sepharose层析：运作2
柱基质      Q-Sepharose Fast Flow
柱尺寸      1.6cm内径×8cm床高
柱体积      16ml
柱准备      用0.1M氢氧化钠，150cm/hr装填
操作流速    100cm/hr(3.35ml/分)
清洗        0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
加载容量    7.5mg/ml基质
平衡液      50mM Tris HCl pH 8.0/100mM NaCl(8倍柱体积)
加样后洗涤  50mM Tris HCl pH 8.0/100mM NaCl(5倍柱体积)
洗脱缓冲液  2M氯化钠(2倍柱体积)
洗涤        0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
Q-Sepharose层析：运作3
柱基质      Q-Sepharose Fast Flow
柱尺寸      1.6cm内径×8cm床高
柱体积      16ml
柱准备      用0.1M氢氧化钠，150cm/hr装填
操作流速    100cm/hr(3.35ml/分)
清洗        0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
加载容量    7.5mg/ml基质
平衡液      20mM磷酸钠pH 6.5/80mM NaCl
加样后洗涤  20mM磷酸钠pH 6.5/80mM NaCl(5倍柱体积)
洗脱缓冲液  2M氯化钠(2倍柱体积)
洗涤        0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
DEAE Sepharose：运作4
柱基质      DEAE-Sepharose
柱尺寸      1.6cm内径×8cm床高
柱体积      16ml
柱准备      用平衡缓冲液，150cm/hr装填
操作流速    100cm/hr(3.35ml/分)
清洗        0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
加载容量    7.5mg/ml基质
平衡液      25mM Tris HCl pH 8.6/25mM NaCl(8倍柱体积)
加样后洗涤  25mM Tris HCl pH 8.6/25mM NaCl(5倍柱体积)
洗脱缓冲液  25mM Tris HCl pH 8.6/25mM NaCl至
            25mM Tris HCl pH 8.6/250mM NaCl(10倍柱体积)
洗涤        2M氯化钠(2倍柱体积)
DEAE Sepharose结合法：运作5(Miles方法)
柱基质      DEAE-Sepharose
柱尺寸      1.6cm内径×8cm床高
柱体积      16ml
柱准备      用平衡缓冲液，150cm/hr装填
操作流速    100cm/hr(3.35ml/分)
清洗        0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
加载容量    7.5mg/ml基质
平衡液      25mM Tris HCl pH 8.6/25mM NaCl(8倍柱体积)
加样后洗涤  25mM Tris HCl pH 8.6/25mM NaCl(5倍柱体积)
洗脱缓冲液  25mM Tris HCl pH 8.6/25mM NaCl至
            25mM Tris HCl pH 8.6/250mM NaCl(10倍柱体积)
洗涤        2M氯化钠(2倍柱体积)
此项研究中所用的不同缓冲液性质见表3。每次阴离子交换层析运作的洗脱曲线图见图2-5。
在rPA ELISA中测定了5次离子交换运作产生的洗脱样品中的蛋白质A水平，结果见表4所示。
表3：此研究中所用的缓冲液
  平衡缓冲液   运作号   电导率(mS/cm)   树脂   pH
  50mM Tris HClpH 8.0/75mM NaCl   1   10.74   Q-Sepharose(非结合性)   8.00
  50mM Tris HClpH 8.0/100mM NaCl   2   12.85   Q-Sepharose(非结合性)   8.01
  20mM磷酸钠pH 6.5/80mM NaCl   3   10.20   Q-Sepharose(非结合性)   6.50
  25mM Tris HClpH 8.6/25mM NaCl   4/5   3.35   Q-Sepharose(结合性)   8.60
  25mM Tris HClpH 8.6/250mM NaCl*   4/5   24.54   Q-Sepharose(结合性)   8.61
*梯度洗脱缓冲液
收集重组蛋白质A ELISA中DEAE-Sepharose运作5(Miles法)诸组分洗脱图并分析；结果见表5中所示。
表4：蛋白质A ELISA的结果 *其中的CV指柱体积
  样品ID  重组蛋白A水平(ng/mg)   抗体浓度(mg/ml)   回收率％   洗脱液体积(CV)*
  Q-Sepharose洗脱运作1  ＜0.4   1.42   82   4.5
  Q-Sepharose洗脱运作2  2.94   1.49   70   3.5
  Q-Sepharose洗脱运作3  0.73   1.86   85   3.4
  DEAE-Sepharose合并洗脱液运作4(所有组分合并)  1.72   2.16   75   2.5
  -Sepharose合并洗脱液(Miles法)运作5(组分2-6合并)  1.55   1.83   73   3
表5：结合性DEAE-Sepharose分离(Miles法)获得的洗脱峰各洗脱组分中的重组蛋白质A水平
  组分序号   重组蛋白A水平(ng/mg)   吸光度(A<sub>280</sub>)
  1   3.33   0.018
  2   0.4   0.108
  3   0.4   0.22
  4   0.4   0.169
  5   2.01   0.092
  6   16.7   0.042
  7   6.38   0.016
在Q-Sepharose上采用20mM磷酸钠pH 6.5/80mM NaCl缓冲液(相应于运作3)的非结合性条件下，获得了该抗体(6A1；pI6.5-7.5)的最高回收率(85％)和重组蛋白质A的最佳清除。运作1也显示了良好的回收(82％)和蛋白A的清除，然而此运作的洗脱体积显著高于非结合性方法所预计的；提示抗体部分保留在柱上的此缓冲液系统中。提高NaCl浓度导致较低的蛋白A清除，因此运作3所用的缓冲液系统更适合此抗体。我们先前观察到运作1所用的缓冲液系统更适合高pI抗体，而运作3的缓冲液系统特别适合用于中性或微酸性抗体。这些实验具有相似的容量(7.5mg/ml树脂)，我们预计这种非结合性方法可能采用高得多的容量(＞30mg/ml)。我们预计这种非结合性方法适用于许多阴离子交换层析，如阴离子交换膜吸附剂(如Mustang Q、InterceptQ和Sartobind Q)以外的Q-Hyper D。我们也预计，与Miles法相比较，此法更适合大规模生产，因为可采用更高容量等等。
就运作5(Miles法)而言，如表5所示，洗脱主峰中可观察到重组蛋白A的分级。因此需要小心合并各组分以保证良好清除蛋白质A。这将影响到回收率(73％)，甚至不如用非结合性方法获得的很好清除率。因为对于细胞系/抗体，Miles法更难达到良好清除率和高回收率，其方法可见到非常高的脱落(如通常用单点结合基质获得的那样)。
运作5的数据代表了Miles专利法所述的情况。这些方法的比较和获得的数据综合见以下表6中所示。
表6不同方法纯化抗体时污染的重组蛋白质A的水平小结
Figure C20048000934700231
*所有实施例采用7.5mg/ml交换载量，或15mg/ml加载容量：
浓缩和渗滤
(50mM Tris Hcl/75m M NaCl pH 8.00)
和
阳离子交换Q(＜0.4)
(50mM Tris Hcl/75m M NaCl pH 8.00)
注意：括弧中的重组蛋白A水平为ng/mg；注意并非所有NSO克隆细胞系上清液的蛋白A污染水平都相似。
6.高pI抗体的纯化
高pI抗体的纯化，先用蛋白A亲和层析(MabSelect-单点结合重组蛋白A基质)，继用Q-Sepharose阴离子交换层析(在非结合性条件下，去除痕量污染物)，再用SP-Sepharose阳离子交换层析(在结合条件下，去除凝聚物)
抗体X(pI＞8,00)
      ↓
MabSelect蛋白质A
      ↓
   浓缩/渗滤
      ↓
Q-Sepharose层析
      ↓
   浓缩/渗滤
      ↓
SP-Sepharose层析
实验材料和方法
MabSelect蛋白质A层析：
柱基质       MabSelect重组蛋白质A(单点结合的rPA)
柱尺寸       1.6cm内径×15cm床高
柱体积       30ml
操作流速     500cm/hr(16.80ml/分)
清洗         6M盐酸胍(2倍柱体积)
加载容量     35mg/ml基质
平衡液       50mM甘氨酸/甘氨酸盐pH 8.0/250mM NaCl(8倍柱体积)
加样后洗涤   50mM甘氨酸/甘氨酸盐pH 8.0/250mM NaCl(8倍柱体积)
洗脱缓冲液   100mM甘氨酸pH 3.50(6倍体积)
洗涤         100mM柠檬酸pH 2.1(2倍柱体积)
在连接有AKTA FPLC系统的MabSelect蛋白A亲和柱(30ml)上纯化含高pI抗体的培养上清液。所用条件见上表所述。用0.1M pH 3.5甘氨酸洗脱抗体。洗脱后将洗脱液pH保持在3.69(不需要调节)60分钟(低pH病毒灭活步骤)，然后用2M Tris碱中和至pH 8。在蛋白A上进行三轮循环；测定回收产物的A280nm，每轮结果见表7。
表7 MabSelect蛋白A柱的回收率％
  轮次   回收率％
  1   81
  2   81
  3   80
在MabSelect蛋白A亲和层析后，将三轮的洗脱液合并在一起，并用Amic用Amicon的装有10kDa Millipore膜的搅拌小室on的装有10kDa Millipore膜的搅拌小室浓缩器将缓冲液交换成25mM Tris pH 8.0(Q-Sepharose平衡缓冲液)。
Q-Sepharose层析：
柱基质        Q-Sepharose Fast Flow
柱尺寸        1.6cm内径×15cm床高
柱体积        30ml
柱准备        用0.1M氢氧化钠，225cm/hr装填
操作流速      150cm/hr(5.0ml/分)
清洗          0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
加载容量      40mg/ml基质
平衡液        20mM Tris pH 8.0/100mM NaCl(8倍柱体积)
加样后洗涤    20mM Tris pH 8.0/100mM NaCl(5倍柱体积)
洗脱缓冲液    20mM Tris pH 8,0/2M氯化钠(2倍柱体积)
洗涤          0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
将40ml浓缩/渗滤的MabSelect蛋白A亲和洗脱液加到Q-Sepharose柱上，加载量为40mg/ml基质。以非结合模式操作该柱，收集含抗体的不结合组分，A280测定此步回收率为69％，略低于这些条件下此抗体获得的回收率。可能是FPLC加样泵加载量因保留体积估计不够精确所致。
Q-Sepharose后，将不结合组分浓缩到13.98mg/ml，用Amicon的装有10kDaMillipore超滤膜的搅拌小室以SP-Sepharose平衡缓冲液(25mM pH 5.0/25mM NaCl)渗滤。
SP-Sepharose层析：
柱基质        Q-Sepharose Fast Flow
柱尺寸        1.6cm内径×15cm床高
柱体积        30ml
柱准备        用0.1M氢氧化钠，150cm/hr装填
操作流速      100cm/hr(3.35ml/分)
清洗          0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
加载容量      10mg/ml基质
平衡液        25mM乙酸钠pH 5.0/25mM NaCl(8倍柱体积)
加样后洗涤    25mM乙酸钠pH 5.0/25mM NaCl(6倍柱体积)
洗脱液        25mM乙酸钠pH 5.00/186mM NaCl(25倍柱体积)
洗脱缓冲液    25mM乙酸钠pH 5.00/2M NaCl(2倍柱体积)
洗涤          0.1M氢氧化钠(2倍柱体积)
将24ml缓冲液已交换的Q-Sepharose洗脱液加到SP-Sepharose柱上，加载容量10mg/ml基质。以结合模式操作此柱；分组分收集洗脱液，用GP-HPLC分析各洗脱组分图，测定凝聚物水平，结果见表8。收集各步层析后的样品，分析残留的重组蛋白质A，结果见表9。
表8：各层析步骤后重组蛋白质A的ELISA测定结果
  样品ID   重组蛋白质A水平(ng/mg)   抗体浓度(mg/ml)
  MabSelect蛋白A洗脱液(浓缩/渗滤后)   2.64   46.7
  Q-Sepharose洗脱液   ＜4   8.10
  SP-Sepharose洗脱液合并F(1-16)   ＜4   1,79
表9：SP-Sepharose组分的GP-HPLC分析
  样品ID   凝聚物％   吸光度(A280)
  SP洗脱液F(1-3)合并   0.57   11.2
  SP洗脱液F(4-6)合并   1.10   2.7
  SP洗脱液F(7-9)合并   2.07   0.655
  SP洗脱液F(10-12)合并   2.12   0.351
  SP洗脱液F(13-15)合并   2.56   0.208
结论：观察了抗体峰分步洗脱时凝聚物的各组分；风表4。富含凝聚物的组分比与不含凝聚物的组分后洗脱(在洗脱峰的尾端)。从主要合并液中删掉此尾端组分获得99％的单体合并液，回收率仍高(＞95％)。
表4：SP-Sepharose洗脱峰中高pI抗体凝聚物组分
Figure C20048000934700271

Claims (20)

1.纯化抗体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
a.通过蛋白质A亲和层析的方法纯化抗体；
b.在允许蛋白质A或其衍生物结合的条件下将纯化的抗体加载到阴离子交换材料上，所述抗体含有蛋白质A污染物，所述蛋白质A污染物是从亲和层析柱上洗脱结合的抗体时获得的，所述条件是使抗体留在流穿液中，而蛋白质A污染物结合于树脂而从抗体中除去；和
c.·在离子交换剂流穿液中收集加载到阴离子交换剂上抗体量的至少70％的抗体，而污染性蛋白质A仍结合在阴离子交换剂上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括在第一阴离子交换剂步骤之后进一步纯化所述抗体的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步纯化所述抗体的步骤通过除去聚集的抗体来完成。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质A含有野生型蛋白质A的至少功能性IgG结合结构域部分，所述结构域选白天然结构域E、D、A、B、C或其经工程改造后的保留了IgG结合功能的突变蛋白，所述蛋白质A对小鼠IgG2a或人IgG1的结合常数至少为K＝10-8M。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质A是重组蛋白质A，所述重组蛋白质A在其氨基酸序列中含有半胱氨酸，所述半胱氨酸包含在该重组蛋白质A氨基酸序列的C-末端至少30个氨基酸组成的区段中，所述重组蛋白质A通过所述半胱氨酸残基的硫原子作为唯一的结合点通过硫醚键偶联于层析载体物质。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，离子交换剂流穿液中的蛋白质A或蛋白质A污染物的浓度降低至1ng/mg IgG以下。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体的pI至少为6.5。
8.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体是IgG抗体，其中IgG抗体可以是嵌合的或CDR-移植的IgG抗体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述IgG抗体是与结合蛋白质A相关的Fc部分，所述IgG抗体起源于对蛋白质A有高亲和力的物种和IgG亚类。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述IgG抗体就抗体的Fc部分而言选自人IgG1、IgG2和IgG4。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体收集自细胞培养物，然后用蛋白质A亲和层析法纯化。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述抗体收集自哺乳动物细胞培养物。
14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述经蛋白质A亲和层析法纯化的抗体未作灭活蛋白酶处理。
15.纯化抗体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
a.通过蛋白质A亲和层析的方法纯化抗体，
b.在允许蛋白质A或其衍生物结合的条件下将纯化的抗体加载到第一离子交换剂上，所述抗体含有蛋白质A污染物，所述蛋白质A污染物是从亲和层析柱上洗脱结合的抗体时获得的，所述条件是使抗体留在流穿液中，而蛋白质A污染物结合于树脂而从抗体中除去，所述离子交换剂是阴离子交换剂；和
c.在离子交换剂流穿液中收集加载到离子交换剂上的抗体，而污染性蛋白质A仍结合在离子交换剂上，所述离子交换剂是阴离子交换剂；
d.再将流穿液抗体加到第二离子交换剂上，与之结合并洗脱，进一步纯化抗体。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，加载到第一阴离子交换剂上抗体量的至少70％在流穿液中回收。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述抗体的pI至少为7.5。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第二离子交换剂是一种阳离子交换剂。
19.如权利要求15或18所述的方法，其特征在于，所述从第二离子交换剂洗脱出的纯化的抗体是单克隆抗体。
20.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述抗体是IgG抗体。
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