KR20050113617A - 단백질 ａ 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제 - Google Patents

단백질 ａ 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제 Download PDF

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Abstract

단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제된 항체로부터, 누출된 단백질 A 를 선택적으로 제거하는 신규의 방법이 개시되어 있다.

Description

단백질 Ａ 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제{ANTIBODY PURIFICATION BY PROTEIN A AND ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 생물 공학적 제조에 있어서, 항체 정제의 분야에 관한 것이다. 상기 항체의 정제를 위한 신규의 방법을 기술하는 것이 본 발명의 목적이다.
단백질 A 크로마토그래피는 항체, 즉 통상적으로 IgG 의, 세포 배양 상층액으로부터 단일 단계에서의 거의 완전한 정제를 가능케 하기 때문에, 항체의 산업상 제조에 널리 사용된다. 단백질 A 친화성 컬럼(column)은 불가피하게 반복된 런(runs) 상의 컬럼으로부터 어느 정도의 리간드의 누출이 발생한다. 부분적으로, 이는 컬럼으로부터의 단백질 A 의 단백분해 클리핑(proteolytic clipping)에 기인한 것일 수 있으며; 약학적 용도에 있어서의 항체의 산업상 제조에서, 어떠한 프로테아제(protease) 저해제 칵테일(cocktail)도 조절의 이유를 위하여 첨가되지 않을 수 있다. 불행히도, 상기 단백질 A 또는 단백질 A 분획(fragment) 오염물질은 IgG 에 대한 그 친화성을 보유하며, 계속적인 복합체 형성때문에 정제된 항체로부터 제거하는 것이 어렵다. 박테리아 단백질인 단백질 A는 원치않는 면역 반응을 유발하기 때문에 제거하는 것이 필수적이며; 또한, 단백질 A 를 단량체 IgG 에 첨가하는 것에 의하여 형성된 모델 복합체가 Fc-함유 백혈구, 및 in vitro (시험관 내) 에서 산화물질(oxidant) 및 아나필라톡신(anaphylatoxin) 활성을 발생시키는 보체 시스템 (Balint 등, Cancer Res. 44,734,1984)을 활성화시킨다고 보고되었다.
재조합 종들(species)이 단일 티오에스테르 결합을 통하여 컬럼 매트릭스에 부착되는, 미국특허 제 6,399,750 호에 기재된 재조합 단백질 A 종들의 상업화는, 고용량 단백질 A 컬럼을 가능케했다. 수반되는 단점으로서, 종종, CNBr 커플링(coupling)에 의하여 수득된 다수의 전통적인, 다중점 부착 천연 단백질 A 매트릭스와는 대조적으로, 상기 재조합 단백질 A 매트릭스의 누출 속도가 매우 증가된다. 따라서, 단백질 A 오염물질 제거는, 수반되는 복합체 IgG 의 제거 없이 진행되어야만 한다.
Balint 등은 상기 IgG-단백질 복합체가 겔 여과에 의하여 비복합 IgG 로부터 분리될 수 있다는 것을 증명하였다. 항체 수율에서의 낮은 스루풋(through-put) 및 손실이 상기 방법의 단점이다.
미국특허 제 4,983,722 호는, 이온 강도를 증가시키는 조건 하에서, 혼합물을 음이온 교환기 물질에 흡수시키고, 항체 및 단백질 A 를 순차적으로 용출(eluting)시켜 양 구성성분을 분리하는 것에 의한, 단백질 A 정제 항체 제제로부터 오염 단백질 A 의 선택적 분리를 교시한다. 상기 해결 방법은, 제공된 항체에 있어서 특이적이고 매우 가변적인 항체의 pI 에 매우 의존적이다. 또한, 스루풋은 분리를 수득하는데에 필요한 염 농도 구배에 의하여 제한된다.
항체, 바람직하게는 IgG 로부터 단백질 A 또는 단백질 A 분획을 분리하는 또다른 방법으로서, 선행 기술의 단점을 회피하는 방법을 고안하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명에 따르면, 상기 목적은 본원 독립항인 제 1 항 및 제 9 항에 의하여 해결된다.
본 발명에 따르면, 항체의 정제 방법은 하기의 단계를 포함하는 방법이다:
첫째, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 항체를 정제시키며, 여기서 단백질 A 는 자연 단백질 A 또는 이의 기능적 유도체이고, 둘째, 단백질 A 또는 그 기능적 유도체의 결합을 가능케 하는 조건 하에서, 정제된 단백질을 이온 교환 물질 상에 로딩하고, 셋째, 어떠한 오염물질 단백질 A 또는 단백질 A 유도체가 이온 교환 물질에 결합하는 동안, 이온 교환기의 플로우-스루(flow-through) 내에서 이온 교환 물질 상에 로드된 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 양의 항체를 수집한다.
단백질 A 는 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)에서 발견되는 세포 표면 단백질이다. 이는 포유동물 항체, 특히 IgG 클래스(class) 항체의 Fc 영역(region)에 결합하는 성질을 가진다. 제공된 클래스의 항체 내에서, 종 기원 및 항체 서브클래스(subclass) 또는 알로타입(allotype)에 관하여, 상기 친화성은 조금씩 변한다 (Surolia, A. 등, 1982 Protein A: Nature's universal, antibody, TIBS 7, 74-76; Langone 등, 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Advances in Immunology 32:157-252). 단백질 A 는 단백질 A 를 분비하는 S. aureus 의 배양으로부터 직접 분리될 수 있거나, 더욱 편리하게는 E. coli 내 에서 재조합적으로 발현된다 (Lofdahl 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:697-701). 항체, 특히 단일클론 IgG 의 정제에의 이의 사용은, 공지기술에 상세하게 기재되어 있다 (예를 들면, Langone 등, 상기; Hjelm 등, 1972; FEBS Lett. 28: 73-76). 단백질 A 친화성 크로마토그래피에의 사용을 위해서, 단백질 A 는 교차결합된, 전하를 띠지 않는 아가로스(천연 아가로스의 전하를 띤 분획으로부터 유리된 세파로스), 트리스아크릴, 교차결합된 덱스트란 또는 실리카-기재 물질과 같은 고체 매트릭스에 커플링된다. 예를 들면, 단백질의 1차 아미노 기능을 통한 CNBr-활성화 매트릭스에 대한 커플링과 같은 방법들이 공지 기술에 통상적으로 알려져 있다. 단백질 A 는 IgG 의 Fc 부분(portion), 즉, [Langone 등, 1982, 상기] 에 기재된 바와 같은 IgG 의 Cγ2-Cy3 인터페이스(interface) 영역에 대하여 높은 친화성 및 높은 특이성을 가지고 결합한다. 특히, 이는 인간 알로타입 또는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 마우스 알로타입 또는 서브클래스 IgG2a, IgG2b, IgG3 와 강하게 결합한다. 또한, 단백질 A 는 VH 유전자 군, VHIII 에 의해 암호화된 면역글로불린의 Fab 영역에 대한 친화성을 나타낸다 (Sasso 등, 1991, J. Immunol, 61: 3026-3031; Hilson 등, J Exp. Med., 178: 331-336 (1993)). 단백질 A 를 암호화하는 유전자의 서열은 두가지 기능적으로 구별되는 영역을 나타내었다 (Uhlen 등, J . Biol. Chem.,259: 1695-1702 (1984); Lofdahl 등, Proc. Nutl. Acad. Sci.(USA), 80: 697-701 (1983)). 아미노-말단 영역은 다섯개의 매우 동종의 IgG-결합 도메인 (E, D, A, B 및 C 라 명명됨) 을 함유하고, 카르복시-말단 영역은 세포벽 및 세포막에 대한 단백질을 고정(anchor)한다. 단백질 A 의 모든 다섯개의 IgG-결합 도메인은 Fc 영역, 예를 들어 단백질 A 의 B- 도메인의 경우에 있어서, Deisenhofer 등 (1981, Biochemistry 20: 2361-2370) 및 Sauer-Eriksson 등 (1995, Structure 3: 265-278) 의 결정 구조에 나타난 바와 같이, 예를 들면, 인간 IgG-Fc 잔기 252-254, 433-435 및 311 을 포함하는 Fc 영역을 통해 IgG 에 결합한다. Fc 부분에서 두가지 필수적으로 인접한 주요 결합 자리의 발견은 [Gouda 등, 1998, Biochemsitry 37: 129-136] 의 NMR-솔루션(solution) 연구에서 확인되었다. 원칙적으로, 단백질 A 의 각각의 IgG-결합 도메인 A 내지 E 는, IgG 의 Fc-부분에 결합하는데 충분하다.
또한, 인간에서의 VH3 패밀리(family)의 특정 대립유전자들은, 단백질 A 에 의해서 인간 Ig 의 결합을 임의로 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Ibrahim 등, 1993, J. Immunol. 151:3597-3603; V-region mediated binding of human Ig by protein A ). 본 출원의 내용, 다르게는, 본 발명의 개별적인 목적에서, 상기 항체의 Fc-영역이 그 자체로 높은 친화성의 단백질 A 결합을 허용하지 않는 경우에, 항체의 단백질 A 에 대한 Fc-영역 결합에 적용되는 모든 언급된 것들은, 마찬가지로, VH3 패밀리 단백질 A-결합 대립유전자와 같은 것을 통한 항체의 결합에 적용된다. 본 원리와 동일한 구현예, 본 발명의 Fc-기재 방법이 고려될 수 있으며, 또한 후자는 이어지는 섹션(section)에서 기술된다.
본 발명에 따르면, IgG 항체는 단백질 A 와 높은 친화성 모드(mode)로 결합될 수 있는 알로타입의 항체로서 인식된다. 또한, 단백질 A 에 대한 결합과 관련되는 항체의 Fc 부분은 별문제로 하고, 상기 항체는 천연적으로 발생하는 항체와 일치해서는 안된다. 특히, 그 가변사슬 영역 부분에서, 이는 공지 기술에서 통상적으로 고안되는, 가공된 키메릭 또는 CDR-이식 항체일 수 있다. 본 발명에 따르면, IgG-항체는 간략히, IgG-타입 항체로서 인식된다.
본 발명에 따르면, 단백질 A 의 기능적 유도체는 마우스 IgG2a 또는 인간 IgG1 의 Fc 부분에 있어서, K = 10-8 M, 바람직하게는 K = 10-9 M 의 결합 상수에 의하여 특징지어진다. 결합 상수에 있어서 상기 값에 순응하는(compliant) 상호작용은 본원에서 '높은 친화성 결합' 으로 불리어진다. 바람직하게는, 단백질 A 의 상기 기능적 유도체는 적어도 와일드-타입(wild-type) 단백질 A 의 기능적 IgG 결합 도메인의 부분을 포함하며, 여기서 상기 도메인은 천연 도메인 E, D, A, B, C 또는 IgG 결합 기능성을 보유한 이의 가공 뮤테인(mutein)으로부터 선택된다. 상기의 예로, 단백질 A 의 도메인 B 의 기능적 59 아미노산 'Z'-분획이 있으며, 여기서 상기 도메인은 미국 특허 제 6,013,763 호에 기재되어 있는 바와 같이 항체 정제에 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 항체 결합 분획은 본 문단에 정의된 바와 같은 2 이상의 비손상(intact) Fc 결합 도메인을 포함한다. 상기의 예로, 유럽 특허 제 282 308 호 및 유럽 특허 제 284,368 호에 개시되어 있는 재조합 단백질 A 서열이 있으며, 양자 모두 Repligen 사의 것이다.
단독으로, 또는 단백질 A 또는 상기 섹션에서 정의된 바와 같은 기능적 단백질 A-분획 또는 유도체와의 조합으로, 추가의 바람직한 것은 단일점 부착을 가능케 하도록 가공된 단백질 A 분획이다. 단일점 부착은 단백질 모이어티(moiety)가 단일 공유 결합을 통하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 크로마토그래피 지지 물질에 부착되는 것을 의미한다. 추가로 노출된 아미노산 지점, 즉 루브(loop) 내에 이상적으로 위치한, 적절하게 반응성인 잔기에 의한 상기 단일점 부착은, N- 또는 C- 말단 또는 단백질 접힘의 외부 환경 어디에든 가깝다. 적절한 반응성 기는 예를 들면, 설프히드릴 또는 아미노 작용기이다. 더욱 바람직하게는, 상기 재조합 단백질 A 또는 그 기능적 분획은 그 아미노산 서열 내에 시스테인을 포함한다. 가장 바람직하게는, 시스테인은 재조합 단백질 A 또는 그 기능적 분획의 아미노산 서열의 C-말단의 최후의 30 개 아미노산으로 이루어진 세그먼트(segment)에 포함된다. 상기 형태의 추가의 바람직한 구현예에서, 재조합 단백질 A 또는 그 기능적 분획은 크로마토그래피 지지체 또는 단백질 A-친화성 크로마토그래피 매질의 매트릭스 물질에 대한 티오에테르 황 결합을 통하여 50 % 이상 부착된다. 상기 구현예의 예는, 파마시아(Pharmacia) 사의 미국 특허 제 6,399,750 호에 기재되어 있으며, Amersham-Biosciences 사의 상품명 StreamlineTM 또는 MabSelectTM 로 시판중이고, 이는 사용된 지지체 매트릭스의 성질에 외존한다. 본원에서, 티오에테르는 협소하게는 통상의 화학 용어와의 관계에서 벗어나서, 화학적 문맥(chemical context)과 상관없이 -S- 결합 골격(scheme)으로서 이해되며, 예를 들면, 본 발명에 따르면, 상기 -S- '티오에테르' 다리(bridge)는 화학자들의 반응성-기재 통상의 용어로부터의 본 출원의 문맥과의 관계에서 벗어나서, 예를 들면 티오에스테르 또는 혼합 아세탈과 같은 더 큰 작용기의 부분이다. 바람직하게는, 티오에테르 다리는 그 통상의, 협소한 화학적 의미에서 티오에테르 다리이다. 상기 다리 티오에테르기는 예를 들면, 단백질 A 의 시스테인 잔기의 설프히드릴기를, 활성화된 크로마토그래피 지지체 물질 상에서 숨겨진(harbored) 에폭시드기와 반응시키는 것에 의하여 생성될 수 있다. 말단 시스테인 잔기를 사용하여, 단백질의 노출되고, 유일한 설프히드릴기의 커플링만을 가능케 하여, 상기 단백질 만의 단일점 부착을 일으키는데 적합한 조건 하에서 상기 반응이 수행될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따르면, 단백질 A 또는 기능적 단백질 A 유도체들은, 미국 특허 제 6,399,750 호에 개시되어 있는 재조합 단백질 A 이며, 이는 곁말단의(juxtaterminal), 가공된 시스테인 잔기를 포함하고, 바람직하게는 50 % 이상, 더욱 바람직하게는 70 % 이상까지, 부착의 단독점(sole point)으로서 상기 시스테인의 황 원자를 통하여, 크로마토그래피 지지체 물질에 커플링된다. 또한 바람직한 것은, 상기 커플링은 엑폭시드 매개 활성화, 더욱 바람직하게는 예를 들면 세파로스 패스트 플로우 (Sepharose Fast Flow; 에피클로로하이드린에 가교된 아가로스 비드, Amersham Biosciences, UK) 와 같은 아가로스 매트릭스의 1,4-비스-(2,3-에폭시프로폭시)부탄의 활성화, 또는 예를 들면, 세파로스 FF 와 같은 아가로스 매트릭스의 에피클로로하이드린 활성화에 의해 달성되었다. 본 문단에 따른 상기 바람직한 구현예와의 조합에 있어서, 또한 바람직한 것은, 1차 이온 교환기가 음이온 교환기, 특히 세파로스 QTM FF (Amersham-Biosciences/Pharmacia) 와 같은 4급 아민-기재 음이온 교환기, 가장 바람직하게는 매트릭스 지지체에 커플링된 기능적 교환기 그룹(group) Q 를 가지는 음이온 교환기이며, 여기서 그룹 Q 는 N,N,N-트리메틸아미노-메틸이고, 가장 바람직하게는 음이온 교환기는 Pharmacia/Amersham-Biosciences 사의 Sepharose QTMFF 이다. 4급 아미노기는 강력한 교환기이며, 이는 또한 로딩/세척 완충용액의 pH 에 있어서의 변화에 대하여 민감하지 않다. 패스트 플로우 교환기(fast flow exchanger) 매트릭스는 더 높은 물리적 안정성을 위한 높은 정도의 가교를 가지는 45 - 165 μm 아가로스 비드(bead) 에 기초하며; 또한 세파로스는 천연 아가로스의 하전을 띤, 황산화 분자 분획이 없으며, 심지어 높은 항체 로드의 조건 하에서도 항체의 비특이적 매트릭스 흡수를 허용하지 않는다. 상기 구현예의 예는 실험 섹션에서 발견될 수 있다.
본 발명에 따르면, 오염물질 단백질 A 는 상기 정의된 바와 같이, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터의 결합 항체를 용출하면서 얻어지는 단백질 A 의 결과물(offspring) 또는 이의 기능적 유도체에 결합하는 임의의 타입의 기능적, IgG 이다. 상기 오염물질 단백질 A 종은 예를 들면, 특히 산업상 제조에서 효소 작용에 의하여 발생하기 쉬운 펩티드 결합의 가수분해로부터 유래할 수 있다. 단백질 A 크로마토그래피는 조잡하게(crudely) 정제될 때, 다운스트림(downstream) 공정의 초기 단계로서 적용된다. 세포 배양 브로스(broth) 내의 염색 세포 또는 최초 원심분리 또는 여과 단계에서 파열된(disrupted) 세포들은, 자유 프로테아제를 가지기 쉬우며; 조절을 목적으로 한, 다운스트림 공정의 과정에 앞서 또는 과정 중에 프로테아제 저해제를 사용한 세포 배양 브로스의 보충은, 생화학적 연구 실험과는 대조적으로, 통상적으로 성취되지 않는다. 예로는, 페닐-메틸-술포닐-클로라이드 (PMSF) 또는 ε-카프로산이 있다. 상기 화학 제제는 생물약학제의 제조에 있어서의 첨가제로서 바람직하지 않다. 또한, 단백질 A 의 재조합 기능적 유도체 또는 분획들이, 단백질 접힘(fold)의 3차 구조에 의존하여, 와일드-타입 단백질 A 보다 덜 프로테아제 저항성일 수 있다. 도메인과 결합하는 각각의 IgG 에 연결되는 아미노산 세그먼트가 일단 노출되면, 결합 도메인의 총 수는 감소한다. 인터도메인(interdomain) 접촉은 도메인 접힘의 안정성에 기여할 수 있다. 또한, 단백질 A 또는 이의 상기 기능적 유도체의 결합은, 항체의 결합에 의해 유도된 형태 변화에 기인하여, 프로테아제 작용에 대한 민감도에 영향을 끼치거나 이를 촉진시킬 수 있다. 또한, 와일드-타입 또는 총 길이 단백질 A 또는 그 기능적, 가공된 분획은 상이하게 행동할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 오염물질 단백질 A 는 여전히 기능적, IgG 결합 단백질이고, 따라서 본 발명에 따라서 연속 이온 교환 분리 매질에 로드될 때, 단백질 A-정제 항체와 결합된다. 높은 친화성을 기초로 한 오염물질 단백질 A 와 정제된 항체의 결합은, 정제된 항체로부터 오염물질 단백질 A 를 효과적으로 분리하는 것이 어려운 이유이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 정제되어야 하는 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의하여 항체를 정제하기에 앞서 세포 배양으로부터 수확된다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포 배양은 포유동물 세포 배양이다. 포유동물 세포는 세포 사멸 또는 수집 상에서 파괴된 효소의 분해를 숨기는(harboring) 리소좀이라 불리는 큰 구역(compartment)을 가진다. 특히, 상기 세포 배양은 예를 들면, NSO 세포 (Galfre, G. and Milstein, C. Methods Enzymology , 1981, 73,3) 과 같은 마이엘로마 세포 배양일 수 있다. 마이엘로마 세포는 플라스마사이토마(plasmacytoma) 세포, 즉, 림프구 세포 계통(lineage)의 세포이다. 대표적인 NSO 세포 라인은 예를 들면, European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom 사에서 자유롭게 시판중인, 세포 라인 ECACC No. 85110503 이다. 특히 재조합 항체의 제조에 사용되는 경우, NSO 는 매우 높은 생성물 수율을 일으킬 수 있다는 것이 발견되었다. 반대로, NSO 세포는, 와일드-타입 단백질 A 의 재조합, 단축 분획을 사용하는, (여기서, 재조합 단백질 A 는 단일점 부착 단백질 A 일 수 있음) 적어도 특정 단백질 A 친화성 크로마토그래피 시스템으로, 다른 숙주 세포 타입보다, 더 높은 수준의 오염물질 단백질 A 를 반복적으로 생식시킨다는 것이 발견되었다. 상기의 예로는 StreamlineTM 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지가 있다 (Amersham Biosciences; essentially thioester single-point attached recombinant protein A as described in US 6,399,750). 약 1000 ng 또는 그 초과의 오염물질 단백질 A/mg 항체의 수준은, StreamlineTM 단백질 A 친화성 컬럼을 사용하여 수득될 수 있다. 본 발명의 방법은 단일, 고속 정제 단계, 즉 , 약 1000 배의 정제 인자를 사용한 단계에서, 1 ng/mg 미만 까지 증가된 항체 수준으로부터, 효과적으로 오염물질 단백질 A 를 감소시킨다는 점에서 공지 기술과 구별된다.
또한, 바람직한 것은 단독 또는 앞선 문단과 조합으로, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제되는 항체가 처리되지 않아서 수집에서 또는 후에 프로테아제를 불활성화시키는 것이며, 더욱 바람직한 것은 수집 후에 하나 이상의 외부로부터 보충된 프로테아제 저해제와의 혼합물 내에 있지 않는 것이다. 가장 바람직하게는, 상기 프로테아제 저해제는 PMSF, [Laskowski 등, 1980, Protein inhibitors of proteinases, Ann. Rev. Biochem. 49, 593-626, and epsilon-caproic acid] 에 기재된 바와 같은 특이적 프로테이나제(proteinase) 저해 펩티드, 및 ε-카프로산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피의 작동은 기술 문헌에 널리 기재되어 있으며, 추가로 기술될 것을 요하지 않는다. 상기 인용된 것 이외에, 또다른 예는, 예를 들면, [Duhamel 등, J. Immunological Methods 31, (1979) 211-217], 단백질 A-세파로스로부터의 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 의 pH 구배 용출이다.
바람직하게는, 오염물질 단백질 A 는 1차 이온-교환기의 플로우-스루 내에서 10 ng/mg 미만, 더욱 바람직하게는 4 ng/mg 미만, 가장 바람직하게는 1 ng/mg 미만의 항체 농도까지 감소되며, 여기서, 상기 항체는 바람직하게는 IgG 를 말하는 것으로 인식된다. 상기 역치값의 유효화(validation)를 위한, 엘리자 분석 (ELISA assay) 방법이 실험 섹션에서 상세하게 기재되어 있으며; 바람직하게는 부드러운 세정제의 존재 하에서 샘플의 pH 4 이하로의 산성화(acidification)는 누출된 단백질 A 의 양의 정확한 결정에 있어서 중요하다는 것이 주목되어야 한다. 역치는 불가피하게 오염물질 단백질 A 의 브레이크-스루(break-through)를 이끌면서, 단백질 A 결합을 위한 1차 이온-교환기의 로딩 용량이 결코 증가되지 않은 것과 같이 인식된다는 것은 말할 필요도 없다. 단백질 A 또는 단백질 A 분획을 분석하는 적절한 엘리자-기재 방법은 미국 특허 제 4,983,722 호에 기재되어 있다. 적절한 항-단백질 A 항체들은 예를 들면, Sigma-Aldrich 사로부터 상업적으로 시판 중이다. 특히, 그 유도체들이 가공되어 추가적인 설프히드릴기를 숨기는, 단백질 A 의 유도체를 사용할 때, 단백질 표준의 적절한 유지가 중요하다. -S-S- 다리를 통하여 형성된 공유 이량체 또는 멀티머(multimer)가 잘못된 결과를 이끌수도 있기 때문에, 시험 샘플의 정량의 표준으로서 사용된 상기 순수한 단백질 A 유도체의 단량체 특성을 증명하는 것이 중요할 수 있다. 증명은, 감소 및 비-감소 조건 하에서, SDS-PAGE 분석에 의해서 쉽게 달성될 수 있는데, 이는 공지 기술에서 통상적인 것이다. DTT 또는 β-메르캅토에탄올에 의한 상기 단백질 A 유도체-표준 용액의 감소는, 따라서 엘리자-기술에서 측정의 오류를 회피하는데 도움이 될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 추가의 바람직한 것은, 1차 이온 교환기상에 로드된 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 항체가 이온-교환기의 플로우-스루 내에서 회수될 수 있는 것이다.
본 발명에 따르면, 1차 이온 교환기는 음이온 교환기 수지이며; 단백질 A 는 유럽 특허 제 289 129 B1 호에 기재된 바와 같이, 수지의 양 타입에 의하여 결합될 수 있다. 1차 이온 교환기 또는 음이온 교환기는, 이온 교환기 수지를 부드럽게(mildly) 교반된 샘플 용액 내로 담그고 추가로 여과에 의하여 액체 매질을 연속적으로 교환하는 것에 의하여, 특정 유속(flow rate)에서의 컬럼 모드 또는 배치 작동 모드에서 작동될 수 있다. 본 발명 및 제공된 항체의 pI 설명에 따르면, 1차 이온 교환기를 로딩하기 위한 pH 및 이온강도의 적절한 조건을 정의하는 것이 가능하며, 상기 조건은, 단백질 A 오염물질이 결합하여 항체로부터 제거되는 동안 플로우 스루 내에서 항체의 유지를 야기시킨다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 오염물질 단백질 A 로부터 항체의 더 빠른 분리를 가능케 한다. 상기 작용기의 예는, 매트릭스 지지체에 부착된 1차 음이온 교환기이며, 예를 들면 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 트리메틸아미노에틸, 트리메틸아미노메틸 및 디에틸-(2-하이드록시프로필)-아미노에틸과 같은 1급, 2급 및 특히 3급 또는 4급 아미노기이다. 음이온 교환기에 있어서 적절한 크로마토그래피 지지체 매트릭스은 공지 기술에 알려져 있다. 예로는, 아가로스-기재 수지 및 비드, 덱스트란 비드, 폴리스티렌 비드 및 폴리스티렌/디비닐-벤젠 수지가 있다. 가장 바람직하게는, 이온 교환기는, 예를 들면, Amersham-Biosciences/Pharmacia 사의 세파로스 CL-6B 또는 세파로스 패스트 플로우 (FF) 와 같은 아가로스 매트릭스 상에 봉입된(mounted), 4급 아민-기재 음이온 교환기이다. 상기의 예로 Amersham-Biosciences/Pharmacia 사의 Sepharose QTM 이 있다. 1차 음이온 교환기의 사용에서 또한 바람직한 것은, 본 발명에 따른 항체가 2 이상의 상기 pH 단위인 등전위점 (pI) 를 가지는, 즉, 상기 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계에서 사용되는 단백질 A 의 pI 보다 더욱 염기성인, 단일클론 항체인 것이며; 예를 들면, 본래의(native) 단백질 A 는 약 5.0 의 pI 를 가지는 반면, 스팀라인(Steamline) 재조합 단백질 A 는 약 4.5 의 pI 를 가진다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 6.5 이상, 더욱 바람직하게는 7.0 이상, 가장 바람직하게는 7.5 이상의 등전위점(pI)를 가지는 단일클론 항체이다. 이는 실제 수집되고 정제된 항체의 pI 를 말하는 것이지, 단순히 아미노산 서열 단독으로부터 예측된 pI 가 아님에 주목하여야 한다. 실제 정제된 항체 분자는 글리코실화(glycosylation)와 같은 폴리펩티드 골격(backbone)의 변형을 추가로 겪을 수 있으며, 이러한 변형은 전하를 띤 모이어티를 첨가할 수 있으므로, 분자의 pI 를 변화시킬 수 있다. 등전위 초점화(isoelectric focusing; IEF)에 의해서 생성물 항체의 pI 를 결정함에 있어서, 예를 들면 단일 클론 항체 단백질과 같은 항체 단백질의 후번역(posttanslational) 공정의 미세이종성(microheterogenity)은, 각각의 생성물 항체 글리코프로테인(glycoprotein) 분자에 있어서 더 넓은 pI-범위를 이끌며, 단일 밴드보다 IEF 겔 내에서 표본(smear)와 유사하므로, 적어도 생성물의 대부분에 있어서 특정 수치이다. 본 발명에 따르면, 상기 언급된 바람직한 구현예에서, '항체의 pI' 는, pI 가, 상기 상술된 바와 같은 pI 의 바람직한 범위 내인, 항체 생성물 분자의 공유(share)를 말한다. 제공된 정제 단계 후에 회수된 항체의 %-비율 과 같은, 상기 기술의 모든 추가의 정의는, 상기 항체 단독의 pI-순응 공유(pI-compliant share)를 말한다.
본 발명에 따른 1차 음이온 교환기의 조작 방식은 1차 음이온 교환기의 등장 완충 용액을 가지고 단백질 A 친화성 크로마토그래피로부터 산성 또는 중성 용출액의 완충 용액 교환을 필요로 한다. 등장 완충 용액 및 로딩 완충 용액은 본 발명의 방법에서 동일한다. 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Millipore)에서 시판 중인 것과 같은 통상적으로 사용되는 초여과법 기구는 그 목적을 위해 편의상 사용될 수 있다; 그것은 예를 들어 Sephadex G-25 같은 저분자량 다공성 여과 매트릭스를 사용하는 동안 희석 효과를 피하는 것이다. 본 발명에 따른 등장 완충 용액은 바람직하게 1 내지 150 mM, 더욱 바람직하게 5 내지 110 mM, 가장 바람직하게 20 내지 100 mM 범위의 염 내의 예를 들어 염화나트륨과 같은 치환기 염의 농도를 가진다. 등장 완충 용액의 pH 는 pH 6.5 내지 pH 9.0 의 범위, 더욱 바람직하게 pH 7.5 내지 pH 8.5 의 범위, 가장 바람직하게 pH 7.9 내지 pH 8.4 의 범위이다. 단백질의 N-말단 아미노기가 약 9.25 의 pKs 값을 가진다는 것을 주목해야 하며, 이에 따라 오염물질 단백질 A 및 이미 음성 전하를 띠는 임의의 다른 단백질에 음이온 교환기의 결합은 강한 염기성 pH 에서 강해질 것이며; 본 출원에서, 로딩 완충 용액의 pH 는 pH 의 선택된 범위 내에서 전하의 변화에 기여할 수 있는 다른 pH 값 및 다른 내용물의 시스테인 및 히스티딘 측쇄(side chain)을 가진 주어진 한쌍의 항체 및 오염물질 단백질 A 의 결합 및 비결합의 최상의 구별을 위해 조정이 필요할 수 있다. 게다가, 강한 염기성 pH 는 단백질 A-항체 상호반응을 방해함으로써, 이온 강도를 증가시킬 것이다; 한편, 이온 강도는 오염물질 단백질 A 의 결합을 파괴할 필요가 있어 항체의 결합의 방해가 균형잡히도록 조정이 필요하다. 완충 용액의 이온 강도는 보통 pH 값과 가역적 상호관련성이 있다는 것이 당업자에게 자명하며; 더욱 강력한 단백질 A 는 pH 에 의존하여 음이온 교환기에 결합하고, 더 많은 염이 항체의 결합을 방해하고 잠재적인 단백질 A-항체의 상호반응을 방해하는 것을 억제시킨다. 따라서, 상기 주어진 범위의 pH 및 치환기 염은 상호관련이 있음이 이해된다: pH 가 낮을수록, 염이 적을수록 본 발명의 실행에 있어 상기 주어진 바람직한 범위 내에서 허용될 수 있음이 발견된다. 더욱이, 염 수송은 용액의 이온성 힘을 추가로 증가시키는 pH 완충 물질에 의해 더해진다. 상기 이온 강도는 등장 완충 용액의 전도도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 용어 "전도도" 는 두 전극 전하를 추가로 가지는 이온의 총양전류를 전도시키는 수용액의 능력을 의미한다. 따라서, 수용액 내 존재하는 이온의 증가된 양으로, 상기 용액은 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도의 측정 단위는 mS/cm (milliSiemens/cm) 이고, 예를 들어 Topac Inc. (Hingham, MA/U.S.A.) 또는 Honeywell 사로부터 입수가능한 전도도 측정기를 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 내용상, 모든 수치는 25 ℃ 에서 특정한 전도도를 포함한다. 1차 음이온 교환기 단계를 위한 로딩 또는 등장 완충 용액은 바람직하게 0.5-5 mS/cm, 더욱 바람직하게 1-3 mS/cm, 가장 바람직하게 1.25-2.5 mS/cm 의 전도도를 가진다. 이상적으로, 대략 2 mS/cm 의 전도도를 가진다. 적당한 완충 용액 염의 예들은 Good, N.E. (1986, Biochemistry 5:467-476) 에서 발견될 수 있다. 통상적으로 사용되는 예를 들면, Tris. HCl 완충 용액 또는 소듐 하이드로겐 포스페이트 완충 용액이 적당한 완충 물질이다. 완충 물질의 농도는 통상적으로 예를 들어 10-40 mM 완충 염의 범위내이다. 완충 용액을 고안하는데 사용되는 잠재적 음이온 종류 중에서, 낮은 용출액 강도의 특성이 대략 이온 전하의 농도와 가역적으로 상호관련성이 있으며, 대략 이온 크기에 비례하는 염소와 비교하여, 음이온 용출액의 더 낮은 특정한 강도 가진 것들이 바람직하다. 음이온성 용출액의 강도의 비교 실험들은 생화학의 표준 교재에서 표로 되어 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 따르는 상기 완충 물질은 포스페이트 완충 용액이다. 인산은 특히 pH 8 또는 그 이하에서 사용될 때 낮은 용출액의 힘을 가지며, 더욱이 특히 낮은 무질서 (chaotropic) 특성에 의해 촉진된다. 배치 방식 조작이 가능한 반면, 칼럼 조작 방식은 1차 음이온 교환기 단계에서 바람직하다. 상기 경우에, 약 10 내지 60 ml/h 의 유속이 유익하게 사용될 수 있다. 로딩된 항체의 로딩 농도는 10 내지 30 mg 의 항체/ml 교환기 수지의 범위내가 바람직할 수 있다. 매우 희석된 샘플의 사용은 항체의 수율의 감소를 일으킨다는 것이 당업자에게 자명하다. 정제되어 찾아진 상기 항체는 동일한 등장 완충 용액으로 세척된 대략 하나의 칼럼 부피를 포함하는 로딩 조작의 로우-스루(low-through)에서 수집된다. 플로우-스루의 pH 는 중성 pH 로 조정되어 안정성을 개선하고 항체 단백질의 응집 및/또는 침전을 방해할 수 있다.
1차 음이온 교환기 이후에, 상기 항체는 적용하여 사용할 수 있도록 준비되거나 통상적인 정제 방법에 의해 추가로 광택낼 필요가 있는 것으로 생각될 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 1차 이온 교환 단계에서 제 2 단계 항체가 로딩되고, 2차 이온 교환 매질에 결합되고, 염 및/또는 pH 을 증가시킴으로써, 본질적으로 모노머릭(monomeric), 비-응집 항체로서, 로딩 완충 용액보다 다른 완충 용액으로 용출되는 2차 이온 교환기 단계가 이어진다. '본질적으로' 는 상기 문맥에서 5 % 미만을 의미한다. 바람직하게, 이전 섹션에서 기술된 바람직한 구현예 단독 또는 조합으로, 제 2 이온 교환기는 양이온 교환기이다. 1차 음이온 교환기에 이어지는 단백질 A 크로마토그래피 단계 및 2차 양이온 교환기 단계의 조합은 신규하다. 세포 배양액으로부터의 대부분의 미량 오염물질 단백질은 항체, 특히 IgG 항체보다 매우 낮은 pH 수치를 가진다는 것이 공지되어 있다; 따라서 양이온 교환은 집합적 항체 및 바이러스 캡사이드 (virus capsid) 뿐만 아니라 항체와는 다른 단백질 오염물질 같은 잠재적 감염제 양자 모두를 효과적으로 제거를 하게 할 것이다. 빠른 조작, 로딩 후 항체의 높은 효율의 회수, 로딩과 동등하거나 더 높은 수용력으로 결합 및 용출에 기인하여, 일회의 결합 및 용출에서 얻어지는 정제 인자의 추가 효과를 가지고 단일 배치의 항체로 반복적이고 순환형인 조작이 또한 허용된다. 바람직하게, 로딩 완충 용액의 pH 는 약 pH 4 내지 7, 더욱 바람직하게 pH 4.01 내지 6, 가장 바람직하게 pH 4.02 내지 5.5 이다. 더욱 바람직하게, 상기 항체는 0.1 내지 1.2 M 범위의 염 내 염 성분들을 가지고 양이온 교환기로부터 용출되는데, 상기의 염은 바람직하게 알칼리 금속염, 더욱 바람직하게 리튬, 칼륨 또는 나트륨 염이다. 바람직하게, 용출은 산성 조건 때문에 항체를 최대한 집합적으로 제거하고 항체에 최소한의 손해를 주기 위해 pH 7 내지 8 에서 이루어진다. 선택적으로 바람직하게, 용출은 오염물질 단백질 A 의 최대의 제거를 위해 pH 4 내지 7, 더욱 바람직하게 4.01 내지 6 의 산성 pH 에서 일어나며; <0.4 ng/mg 만큼 낮은 농도 수준의 항체는 이 방식으로 실현될 수 있다. 상기 2차 양이온 교환기 단계는, 높은 용량 뿐만 아니라 빠른 조작의 허용이 이온 교환기에서 전형적인 반면, 전통적인 겔 여과 문제점을 준다. 이온 교환기는 10-30 mg 항체/ml 수지의 로드를 지원한다. 특히 바람직한 구현예에서, 단백질 A 크로마토그래피 후에 1차 음이온 교환기 및 제 2 양이온 교환기 단계의 정제 방식은, SEC 단계가 정상적인 IgG 같은 모노머릭 항체로부터 항체 응집물 및/또는 항체-단백질 A 복합체를 분리하기에 적당하게 잘린 분자량을 가진 추가적, 말단 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 단계의 부존재 하에서, 임상적 등급 항체를 준다.
일반적으로, 본 발명의 방식은 단백질 A-기원 에피토프 (epitope) 에 대응하여 생기는 항체에 사용될 수 없다. 당업자에게 명백하게 제한됨에도 불구하고, 상기 항체들은 부인된다.
본 발명의 방식의 가장 주목할 특징은 비-결합 또는 플로우-스루 방식으로 음이온 교환기를 통해 항체를 정제하는 것이고, 컬럼의 수용력은 재료의 처리량을 모두 제한하는 것은 아니며; 상기 수용력은 오직 오염물질 단백질 A 의 최소 보유량과 관련하여 결정된다. 이것은 단백질 A 오염 물질의 매우 효과적인 제거를 허용하는 반면 많은 공정 시간 및 재료 공급원을 줄인다.
실험
1. 단백질 A 엘리자( Elisa )
단백질 A 또는 재조합 단백질 A 의 테스트를 위한 수많은 엘리자들이 기술되어있다 (미국 특허 제 4983722 호 및 이에 기술된 참고문헌을 참조). 하기에 기술된 모든 실험을 위해, 간단한 샌드위치(sandwich) 엘리자는 평평한 바닥의 96 웰 마이크로타이터 (microtiter) 판 (NuncTM) 상에 코팅된 캡쳐 (capture) 항-단백질 A 항체는 단백질 A 를 보유하는데 사용된다. 결합 단백질 A 는 이어서 비오티닐화 항-단백질 A 탐지 항체를 탐지하고, 상기에서 스트렙파비딘 (streptavidin) 이 콘쥬게이트된 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제 (Amersham #RPN 1231) 의 추가 결합을 허용한다. 캡쳐를 위해 상업적으로 이용가능한 항-단백질 A 래빗 항체 (천연 S. aureus 단백질 A 에 대응하여 생김) 는 Sigma-Aldrich (#P-3775) 에서 시판중이다. 상기 항체는 이 연구 내내 사용되었다. 상기 탐지 래빗 항체는 Sigma-Aldrich (#3775) 로부터 동일하게 구입되었다. 불특정한 흡수 공정에 의한 단백질 코팅 후에, 상기 코팅된 단백질은 캡쳐 항체가 추가로 비오티닐화된 래빗 항-단백질 A 및 스트렙파비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제로 탐지되는 단백질 A-특정 단백질 A 캡쳐 항체를 보유하는데 사용된다. 테트라 메틸 벤지다인은 색원체 물질로 사용된다. 비공지된 농도의 샘플을 탐지되어 찾아진 오염물질 단배질 A 의 원조 모-단백질 A 또는 -단백질 A 유도체를 사용한 표준 곡선으로 읽힌다. 산성 pH 에서 코팅 뿐만 아니라 표준 물질의 알맞은 제조를 중요하게 입증한다. 예를 들어, Streamline 단백질 ATM (Amersham Biosciences, formerly Pharmacia) 같은 첨가적 시스테인 잔여물을 수송하기 위해 조작되는 재조합 단백질 A 를 위해 특히, 상기 표준 용액은 단백질 표준 용액의 모노성(단량체성) 상태를 보증해 주는 설프하이드릴화제를 감소시킴으로써 전처리를 필요로 하는 것을 발견하였다.
와일드-타입형 단백질 A 표준 물질은, 반대로, 예를 들어, Sigma-Aldrich/Switzerlandd (#P6031) 또는 Pharmacia (#17-0770-01) 같은 다수의 회사로부터 입수가능하며, 상기 전처리를 필요로 하지 않는다. StreamlineTM 매트릭스로부터 오염물질 단백질 A 의 누출이 관찰되는 하기에서 기술되는 실험들을 위해, 제조업자로부터 수득된 콘쥬게이트 되지 않은 재조합 단백질 A 의 샘플을 표준 물질로 사용하였다.
1.1 시스 -풍부 단백질 A-표준 물질의 전처리
StreamlineTM 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (Amersham Biosciences) 컬럼 재료내 상업적인 순수 재조합 단백질 A-시스를 Pharmacia/Amersham Biosciences 로부터 동결 건조 상태로 수득하였다. 20 mg/ml 이하의 단백질을 0.5 M NaCl, 1mM EDTA 및 20 mM 디티오에리트리톨를 포함하는 0.1M 트리스 pH 8 에 용해시키고, 15-30 분 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 처분가능한 PD-10 겔 여과 칼럼 (Amersham Biosciences) 으로 탈염시켰다. 코팅 전에 표준 용액을 다루기 위해 사용되는 모든 완충용액을 티올기의 산화를 방지하기 위해 N2-처리해야 한다. 단백질 표준 물질의 제조를 마이크로타이터 판의 코딩을 위해 표준 물질의 사용 직전에 수행했다. 선택적으로, 1 mg/ml 의 원액을 제조하고 냉동고 내 -65℃ 에서 보존했다; 해동시킨 후, 단백질 A 의 단량체성 특성은 비-환원 SDS-PAGE 상에 로딩된 분취물(aliquote) 로부터 분석된다. 단백질 표준 물질의 농도는 Bradford 분석법 (Bradford 등, 1976, Anal.Biochem. 72:248-254; Splittgerber 등, 1989, Anal.Biochem. 179:198-201) 뿐만 아니라 자동화 아미노산 분석법에 의해 결정되었다. 상기 전처리의 결과는 포도상구균 (staphylococcal) 단백질 A 표준 물질 (레인 1: 천연 단백질 A; 레인 2: 전처리 후) 및 순수하고 결합되지 않은 StreamlineTM 재조합 단백질 A (Pharmacia, 현재 Amersham-Biosciences 의 호의로 제공됨; 레인 4: 천연 재조합 단백질 A; 레인 5: 전처리후) 를 위한 비-감소성 SDS-PAGE 을 이용하여 도 1 에서 보여준다. 레인 1 은 수직 축에 표시된 분자량에 상응하는 분자량 마커이다. 추가성 시스 잔여물이 존재하는 Pharmacia 사의 재조합 단백질 A 는 분자량을 감소시킨 후 변형한다; 대략 34 kD 에서 모노모성 밴드는 보존되고, 더욱 더 강력하고, 이황화 결합 이량체의 분해를 명백하게 저지한다.
1.2 엘리자
1.2.1 샘플의 제조
두 희석 단계에 의해, 1 mg/ml 단백질 A 표준물질 원액의 1:200.000 희석액을 제조하여 50 ng/ml 에서 상부 표준 물질을 제공한다. 0.2 ng/ml 가 되도록 희석액 하부를 표준 곡선 분석을 위해 제조한다. 더욱이, 표준 물질 ('스파이킹 (spiking) 용액') 의 희석액을 샘플 내 방해 물질의 존재를 배제하기 위해 테스트된 복제 산물 샘플의 스파이킹을 위해 사용하였다.
최종 산물 샘플 테스팅을 위해, 모든 샘플을 500 ㎕ 의 2 개의 동등한 부피로 나눈다. 하나는 1000 ng/ml 스파이킹 용액, 또는 적당하다면 10 ㎍/ml 용액으로 스파이킹되어, 항체의 1 mg 당 10 ng 단백질 A 을 포함하는 최종 단백질 A 를 제공한다. 다른 절반은 동일한 부피의 샘플 완충 용액으로 스파이킹되며; 따라서, 스파이킹에 기인한 산물 샘플의 희석 요인이 원인이 된다. 제조물의 두 타입 모두 하기에서 '스파이킹된 샘플' 로 의미될 것이다. 상기 샘플 완충 용액을 1 L 부피의 탈이온화 또는 증류된 (bidistillate) 물에 7.51 g 글리신 (염기), 5.84 g NaCl, 0.5 ml Triton X-100 으로 구성하였다.
㎕최적의 정확한 측정을 위해서, 샘플 내 항체 농도를 업계에 공지된 통상적인 엘리자 (Elisa) 로 미리 결정하였다. 추가적 표준 용액을 단백질 A 에 비교할만한 일정 영역 친화성을 갖는 공지된 표준 항체의 동일 양으로 스파이킹하여, 산성화 단계의 효율을 결정하고, 분석 중에 캡쳐 (capture) 기원의 단백질 A 에 결합하고 이어 분리되는 항체에 의해 도입된 임의의 잠재적인 체계적 오류를 해결했다.
산성화: 450 ㎕의 스파이킹 샘플 또는 표준 물질을 200 ㎕ 의 0.2 M 의 시트레이트/0.05 % Triton X-100 용액을 pH 3.0 에서 첨가한다. 모든 샘플은 세번씩 반복되었다. 더욱이, 상기 분석법이 1 mg/ml 및 0.2 mg/ml 범위를 가지는 항체 농도에 최적으로 수행되기 때문에 샘플의 희석액을 제조하고 세번 테스트했다 . 상기 산성화 단계는 샘플 용액 내 존재하는 초과된 항체에 다르게 결합하는 오염 물질 단백질 A 또는 A 분절을 유리시키기 위해 현 분석법에서 중요하다.
1.2.2 항체를 사용한 마이크로타이터 판의 코팅
코팅 완충용액을 1.59 g/L Na2CO3, 2.93 g/L NaHCO3 및 0.20 g/L 소듐 아자이드로부터 만들었다. 완충용액의 pH 를 pH 9.6 으로 조정하였다. 단백질 A 표준에 대하여 포화를 나타내지 않게 하기에 충분한 양의 항체를 포함하는 웰 당, 100 μl 항체 용액을 첨가하였다. 플라스틱 필름으로 판을 덮고, 습실(humidity chamber)에 두었다. 37℃ 에서 약 18 시간 동안 밤새 인큐베이션하였다. 모든 웰을 3 차례 300 μl 이상의 세척 완충 용액 [NaCl 5.8 g/L, Na2HPO4 1.15 g/L, NaH2PO.H20 0.26 g/L, EDTA 3.7 g/L, 트윈-20 0.2 g/L, 부탄올 10 ml/L, pH 7.2] 및 탭 드라이(tap dry)로 씻었다. 블로킹(blocking) 완충용액 250 μl [코팅 완충용액 0.5 % 카제인 하마스텐(hammarsten)] 을 각각의 웰에 첨가하고, 상온에서 2 시간 동안 오비탈 쉐이커 벤치탑 (orbital shaker benchtop) 상에서 인큐베이션 하였다 (speed 120 rpm). 모든 웰을 300 μl 이상의 세척 완충용액, 및 탭 드라이로 세척하였다.
1.2.3 샘플 및 검출의 인큐베이션
100 μl/웰 을 사용하여, 어떠한 스파이크된(spiked) 샘플을 포함하는 표준 및 샘플을 평판배양하였다. 플라스틱 필름으로 판을 덥고, 오비탈 벤치탑 쉐이커 상에서 상온에서 90 분 동안 인큐베이션하였다. 모든 웰을 300 μl 이상의 세척 완충용액, 및 탭 드라이로 세척하였다. 100 μl/웰을 첨가하고, 플라스틱 필름으로 판을 덮고, 90 분 동안 상온에서 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 세척을 반복하였다. 스트렙파비딘-호스래디시 퍼록시다제를 이미 결정된 최적의 희석 조건에서, 콘쥬게이트 완충용액 [Na2HPO4 1.15 g/L, NaCl 5.84 g/L, NaH2PO4.H20 0.26 g/L, EDTA 3.73 g/L, 트리톤 X-100 0.05% (v/v), pH 7.2] 를 사용하여 희석하였다. 100 μl/웰을 첨가하고, 플라스틱 필름으로 판을 덮고, 45 분 동안 상온에서 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 세척을 반복하였다. 100 μl 의 신선하게 제조된 테트라메틸-벤즈이미드 (TMB, ICN 생성물 번호 #980502) 기질 용액을 첨가하였다. 기질 용액은 하기와 같이 제조하였다: 스톡 솔루션(stock solution)을 1 ml DMSO 내의 10 mg 의 TMB 를 용해시킴으로써 제조하였다. 10 μl 의 스톡, 추가로 10 μl 의 H2O2 를, 0.5 M 시트르산을 사용하여 pH 6.0 으로 조정된, 2.05 % (w/w) 아세트산 나트륨 수용액에 첨가하였다. 본 분석의 어떠한 시약의 제조에 사용된 모든 물은 매우 고품질이고, 탈이온화된 초순수 또는 적어도 비데스틸레이션된(bidestillated) 물이다.
상기 기질 용액을 상온에서 8 내지 11 분 동안 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 반응을 웰 당 50 μl 의 정지 용액(stop solution) [13% H2SO4] 을 첨가하여 정지시켰다. 정지 용액의 첨가 후, 10 분 내에, 파장 450 nm 에서 웰의 흡광도를 판-해독 분광광도계(spectrophotometer) 상에서 결정하였다.
상기 엘리자의 검출 제한은 0.2 내지 50 ng/ml 의 작동 범위 내에서, 0.2 ng/ml 단백질 A 이다. 상기 교차분석 가변률을 10 % 미만이다.
도 2 는 티오에테르 결합 내의 단일점 부착 단백질 A 를 사용하여 스트림라인TM 재조합 단백질 A 크로마토그래피로부터의 항체 용출액 내에서 누출된 재조합 단백질 A 의 수준을 나타낸다. 회전수는 1 M 염화나트륨의 용출 후의 반복된 사용 및 재-평형을 의미한다. 하이브리도마(hybrodoma) 세포 배양으로부터의 세포 배양 브로스로부터의 누출이 전형적으로 500 ppm 내인 반면, 다른 세포 타입은 1000 ppm 만큼의 수준을 제공한다. 상이하게 소스된(sourced) 매트릭스로부터의 누출 속도의 검토는 [표 1] 에 나타나있으며; 크로마토그래피는 제조자의 지침에 의하여 수행된다.
매트릭스 공급자 커플링 화학 전형적인 누출 ppm 작동 용량(mgml-1) 유속(cmh-1)
본래의 단백질 A 세파로스 4FF Amersham-Biosciences 다중점 부착CNBr 10 - 20 5 -20 30 - 300
rmp 단백질 A 세파로스 Amersham-Biosciences 다중점 부착 10 - 20 5 - 20 30 - 300
포로스(poros) A 고용량 AppliedBiosystems 다중점 부착 10 - 50 10 500 - 1000
단백질 A 세라믹 하이퍼D Biosepra 다중점 부탁 300 까지 10 - 20 200 - 500
r단백질 A 세파로스 Amersham-Biosciences 단일점 부착 티오에테르 결합 50 - 1000 20 - 40 30 - 300
MabSelect Amersham-Biosciences 단일점 부착티오에테르 결합 50 - 1000 20 - 40 500
스트림라인r단백질 A Amersham-Biosciences 단일점 부착티오에테르 결합 50 - 1000 20 - 40 200 - 400
또한, 도 3 은 동일한 친화성 매트릭스 물질을 사용한 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 반복된 런(run) 동안, 미량으로 감소된 오염물질 단백질 A 의 누출에 관한 데이터를 제공하며; 와일드-타입 단백질 A 다중점-부착 세파로스 4 FF (Amercham-Biosciences) 를 섹션 2.1 하단 에 기재된 바와 같이 반복적으로 사용하였고, 용출액 내에서 오염물질 단백질 A 의 수준을, 용출액의 어떠한 추가의 공정 전에, 상기 기재된 엘리자에 의하여 결정하였다.
2. 단백질 A 및 세파로스 Q 크로마토그래피
2.1 스트림라인 TM ( Streamline TM )을 사용한 단백질 A 친화성 크로마토그래피
NS0 마이엘로마 세포 배양으로부터 세포 배양 상층액을 원심분리에 의해, 심층여과 내에서 조잡하게 정제하고, 초여과에 의해 농축하였다; 초여과를 또한 사용하여 상기 배양액을 PBS pH 7.5 로 교환하였다. 상기 세포들에 의해 생산된 항체 #5 의 적정농도는 0.2 mg/ml 였으며, 전체 1L 완충용액-교환 상층액을 로딩하였다. 단일클론 항체 #5 의 pI 는 8.5 였다. 앞서 단백질 A 스트림라인TM 컬럼 (5.0 ml 부피)을 50mM 글리신/글리시네이트 pH 8.8, 4.3 M NaCl, 10 컬럼 부피으로 평형을 유지시켰다; 유속은 200 cm/h 였다. 로딩동안, 상기 컬럼을 유속 50 cmh- 1 로 조작하였다; 로딩 용량은 약 20 mg/ml 매트릭스 물질였다. 용출에 앞서, 상기 컬럼을 추가적 200 mM NaCl 및 0.1% 트윈-20 으로 보충된 글리신 평형 완충용액, 10 컬럼 부피 이상으로 세척하였다. 0.1 M 글리신/HCl pH 4.0 완충용액로 구성된 용출 완충용액을 가지고 용출을 달성하였다. 용출 후 즉시, 산성 pH 에 대한 보다 장기간의 노출을 방지하기 위한 이어지는 음이온성 교환기 단계를 위하여, 상기 항체 피크를 포함하는 용출물의 분획들을 적절한 분취량의 0.5 M 트리스HCl pH 7.5 및 본 발명의 로딩/평형 완충용액 (10 mM 트리스/HCl pH 8.0, 50 mM NaCl)를 포함하는 아미콘(Amicon) 투석여과 장치로 교환된 완충용액로 중화하였다. 상기 항체 농도 및 오염물질 단백질 A 농도는 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 용출물 내 오염물질 단백질 A 의 수준은 투석여과 전에는 1434 ng/mg 항체에 달했으며, 투석여과 후에는 1650 ng/mg 항체에 달했다. 로딩 전 완충용액 교환 상층액 용액의 적정농도에 기초한 항체의 회수율은 81% 였다; 투석여과된 용액 내 항체의 농도는 3.6 mg/ml 이었다.
2.2 비-결합 모드에서 Q- 세파로스 FF 음이온 교환 단계
섹션 2.1 로부터의 정제된 항체를 추가로 하기 기재된 바와 같이 처리하였다: 5.0 ml Q-세파로스 FF 컬럼 (Amersham-Biosciences) 을 0.1 M NaOH 10 ml 로 채우고, 이어서 0.1 M 트리스 pH 8, 2 컬럼 부피를 채우고, 10 mM 트리스 pH 8/50 mM NaCl, 10 컬럼 부피를 유속 75 cm/h 로 평형 유지시켰다. 평형 후, 상기 유속을 50 cm/h 까지 감속시켰다. 투석여과된 항체 용액 6ml 을 상기 컬럼 상에 로딩하고, 추가적 처리를 위하여 그 플로우-스루 (flow-through) 를 수집하였다; 상기 컬럼을 초기 6 ml 로 로딩하고, 그 후에 순수 로딩 또는 평형 완충용액 10 mM 트리스 pH 8, 50 mM NaCl 로 계속한 후, 플로우-스루를 280 nm 에서 모니터링된 플로우-스루의 흡광도가 기준선으로 되기까지 계속하여 수집하였다. 항체의 총 회수율은 23 mg 항체 (87%) 였다. 오염물질 단백질 A 의 수준의 결정은 3 ng/mg 항체 미만으로 나타났다.
상기 Q-세파로스 정제 항체 배치(batch)의, 로딩비 겔(ml) 당 항체 (15 mg), 유속 10 cm/h 에서 10 mM 내 포스페이트 pH 7.0, 140 mM NaCl 완충용액 중 세파크릴 S-300 상에서의 겔 여과 (크기 배제 크로마토그래피, SEC) 에 의한 추가적 처리가 추적 오염물질 단백질 A 수준을 더이상 실질적으로 변화시키지 못함을 발견하였다. 실험으로써, SEC 를 사용하여 약 30 내지 100 ng/mg 오염물질 단백질 A 의 수준을 약 1 내지 5 ng/mg 까지 추가로 낮출 수 있다. 따라서, SEC 는 단백질 A 의 추적량과 관련하여 매우 낮은 정제 인자를 가지며, 이것이 항체와 오염물A 사이에 친화성 상호작용을 설명 가능케 한다. 그러나, 샘플의 피할 수 없는 희석 및 항체 단백질의 같은 부패를 일으키는 느린 처리 때문에, SEC 는 로딩된 항체량의 단지 70% 만을 고려할 것이다. 이는 SEC 가 많은 시간을 요구하는 반면 재료의 손실이라는 피할 수 없는 결과를 초래한다는 것을 의미한다.
상기 Q-세파로스 컬럼은 추가 사용을 위하여 상기 기재된 바와 같이 2M NaCl 내 분리 용출 및 추가적 평형에 의해 재활용하였다.
3. 연속된 양이온 교환 단계를 사용한 단백질 A 및 세파로스 Q 정제
추가적 실험에서, 비-결합 모드에서 Q-세파로스 음이온 교환에 의해 정제된 실험. 2.2 로부터의 항체가 사용되었다. 추가적, 최종적 SEC 정제 단계를 시험하는 대신, 세파로스 Q 컬럼의 플로우-스루에서 수집한 항체를 Amersham-Biosciences 사의 SP-세파로스 FF (SP=술포프로필-) 매트릭스를 갖는 2 차 양이온 교환기 단계를 수행하였다. 양이온 교환기로부터 항체의 로딩, 세척 및 용출 후, 재생 수득률 93% 항체로 100 cm/h 의 유속에서 SP-세파로스 FF 를 수행하였다. 로딩동안, 상기 세파로스 Q 정제 단계 후 얻은 항체 용액의 pH 를 50 mM 아세테이트 완충용액 pH 4.5 를 가지고 pH 4.5 내지 5.0 으로 조정하였다. 로딩 용량은 부하 17 mS/cm 의 전도도(conductivity)에서 10 mg/ml 매트릭스 물질로 설정하였다. 50 mM 아세테이트 완충용액을 추가로 사용하여 기준선까지 세척하였다. 50 mM Na 아세테이트 pH 4.5, 1 M NaCl 고염 완충용액을 항체의 용출에 사용하였d으며; 단량체 항체가 먼저 용출되었으며, 반면 집합물은 높은 이온 강도에서 말미 분획 내에서 용출하는데 사용되었다. 컬럼 상에서 펌핑(pumping)하기 앞서, 상기 용출 완충용액 내 염 농도차의 달성에 의한, 덜 가파른 염 구배의 사용이 마찬가지로 실행가능하였다; 고-염 완충용액의 직접적인 적용은 덜 희석된 항체 및 결과적으로 더욱 정확한 샘플링 및 산성 용액 내 보다 단기의 체류시간을 야기하였다. 용출 후, 상기 산성 완충용액을 신속히 PBS pH 7.5 로 교환하였다. 뭉친(pooled) 용출물 내 오염물질 단백질 A 의 수준은 0.4 ng/mg 항체 미만으로 결정되었으며, 상기 항체는 크기 배제 HPLC 에 의하여 99% 초과 단량체인 것으로 나타났다.
4. 맞춤-제조, 다중점-부착 단백질 A 를 갖는 스트림라인 TM 단백질 A 친화성 크로마토그래피
상기 다중점-부착 StreamlineTM 단백질 A 친화성 매트릭스를 Pharmacia Biotech (현재 Amercham-Pharmacia) 로부터 맞춤 제작하여 공급받았다. 이는 말단 Cys 잔기를 가지는 동일한 34kD StreamlineTM-형 재조합 단백질 A 를 동일한 세파로스 매트릭스 물질에 커플링시킴으로써 제조자에 의해 제조되었으나, 에폭시드-매개 활성화 및 활성화 -SH 기만의 커플링을 위한 선택적 반응 조건 (제조사로부터의 제품 정보를 참조할 것) 대신에 활성화 및 커플링을 위하여 전통적인 CNBr 화학을 사용하였다. 실험 2.1 의 방법을 반복하였으며, 오염물질 단백질 A 의 수준은 353 ng/mg 항체로 결정되었다. 이는 상기 커플링 모드가 고-성능, 단일-지점 부착 재조합 단백질 A 친화성 매트릭스로부터의 증가된 단백질 누출을 부분적으로 설명함을 의미한다; 총-길이 와일드-타입 단백질 A 에 대해 비교한 바와 같이, 상기 재조합 단백질 A 내로 도입된 아미노산 서열 내 변형이 또한 증가된 단백질 누출에 상당히 기여하였다.
5. 방법들의 수평적 비교: 마일즈 (Miles) 법과의 비교 (미국 특허 제 4,983,722 호)
마일즈 특허 (No:4,983,722)는 용출용 염 구배 (0.025M 내지 0.25M NaCl)를 갖는 2차 크로마토그래피 단계로서 사용되는 결합 DEAE 세파로스가 용출물 내 여과된 단백질 A 함량을 15 ng/mg 항체 (단백질 A 의 범위가 0.9 내지 14 ng/mg 항체였음)미만으로 감소시킬 수 있다는 것을 청구하고 있다.
단일 및 다중점 부착 단백질 A 친화성 매트릭스 상에서 정제된 6A1 항체의 용출물 샘플 내 단백질 A 잔류물의 비교
매트릭스 샘플 단백질 A 수준(ng/mg)
r단백질 A 세파로스(단일점 결합) 단백질 A 용출물 20.2
rmp 단백질 A 세파로스(다중점 결합) 단백질 A 용출물 2.16
천연 단백질 A 세파로스(다중점 결합) 단백질 A 용출물 <2.0
상기 실험의 목표는 더 낮은 pI 항체 (pI 6.5 내지 7.5) 를 갖는 MabSelect (신규한 단일점 결합 r단백질 A 매트릭스) 를 사용하여 상기 결과를 확인하고, 비-결합 Q-세파로스 방법을 (상이한 평형/로딩 완충용액을 사용하여) 마일스 특허 방법과 직접적으로 비교하는 것이다.
적용된 방법:
6A1 항체 (pI 6.5 내지 7.5) 의 정제는 MabSelect 단백질 A 단계, 이어서 Q-세파로스 음이온 교환 크로마토그래피 (비-결합), 또는 DEAE 세파로스 크로마토그래피 (결합) 단계로 이루어지는 두개의 크로마토그래피 단계를 포함한다. L0 9007 및 L0 9375 를 참조.
MabSelect 단백질 A 크로마토그래피:
컬럼 매트릭스 Mab Select 재조합 단백질 A (단일점 결합 rPA)
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 15 cm 층 높이
컬럼 부피 30 mL
조작 유속 500 cm/hr (16.80mL/min)
세정 6M 구아니딘 HCL (2 컬럼 부피)
로딩 용량 35 mg /ml 매트릭스
평형 50mM 글리신/글리시네이트 pH 8.0/250mM NaCL (8 컬럼 부피)
로딩 후 세척 50mM 글리신/글리시네 pH 8.0/250 mM NaCL (8 컬럼 부피)
용출 완충용액 100mM 글리신 pH 3.50 (6 컬럼 부피)
세척 100mM 시트르산 pH 2.1 (2 컬럼 부피)
6A1 항체를 포함하는 상기 배양 상층액을 AKTA FPLC 시스템에 연결된, MabSelect 컬럼 (30ml) 상에서 정제하였다. 상기 사용된 조건은 상기 표에 기재된 바와 같았다. 항체를 0.1M 글리신 pH 3.5 을 사용하여 용출하였다. 용출에 이어, 용출물 pH 를 pH 7.0 으로 조정하고, 이어서 상기 용출물 샘플을 5 분취물(aliquots)로 나누었다; 이어서, 각 분취물을 상이한 음이온 교환 크로마토그래피용 완충용액 내로 투석여과하였다.
제 1 분취물은 Q-세파로스 크로마토그래피 런(run) 1 용 50 mM 트리스HCl pH 8 / 75 mM NaCl 내로 투석여과 하였다. 제 2 분취물은 Q-세파로스 크로마토그래피 런 2 용 50 mM 트리스HCl pH 8 / 100 mM NaCl 내로 투석여과 하였다. 제 3 분취물은 Q-세파로스 크로마토그래피 런 3 용 20 mM 인산나트륨 pH 6.5 / 80 mM NaCl 내로 투석여과 하였다. 분취물 4 및 5 는 Miles 특허에 기재된 결합 DEAE 세파로스 방법의 평가용 25 mM 트리스HCl pH 8.0 / 0.25 mM NaCl 내로 교환된 완충용액였다. 런 4 및 5 사이의 차이는, 런 4 에서 있어서 주된 피크는 1 분획으로서 수집되며, 분석 전 표준 인산 완충용액 염수 내로 투석여과되는 반면, 런 5 에서는, 상기 용출 피크가 분획화되어, Miles 특허 내 기재된 바와 같이 제조된 인산 완충용액 내로 투석된다는 점이다.
5 컬럼 런 각각에 대한 조건은 하기에 기재되어 있다:
Q- 세파로스 크로마토그래피: 런 1
컬럼 매트릭스 Q-세파로스 패스트 플로우
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 층 높이
컬럼 부피 16 mL
컬럼 제조 150 cm/hr 로 0.1 M 수산화나트륨 내 채움
조작 유속 100 cm/hr (3.35mL/분)
세정 0.1M 수산화나트륨 (2 컬럼 부피)
로딩 용량 15 mg /ml 매트릭스
평형 50mM 트리스HCl pH 8.0/75mM NaCl (8 컬럼 부피)
로딩 후 세척 50mM 트리스HCl pH 8.0/75mM NaCl (5 컬럼 부피)
스트립 완충용액 2 M 염화나트륨 (2 컬럼 부피)
세척 0.1M 수산화나트륨 (2 컬럼 부피)
Q- 세파로스 크로마토그래피: 런 2
컬럼 매트릭스 Q-세파로스 패스트 플로우
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 층 높이
컬럼 부피 16 mL
컬럼 제조 150 cm/hr 에서 0.1 M 수산화나트륨 내 채움
조작 유속 100 cm/hr (3.35mL/분)
세정 0.1M 수산화나트륨 (2 컬럼 부피)
로딩 용량 7.5 mg /ml 매트릭스
평형 50mM 트리스HCl pH 8.0/100mM NaCl (8 컬럼 부피)
로딩후 세척 50mM 트리스HCl pH 8.0/100mM NaCl (5 컬럼 부피)
스트립 완충용액 2 M 염화나트륨 (2 컬럼 부피)
세척 0.1M 수산화나트륨 (2 컬럼 부피)
Q- 세파로스 크로마토그래피: 런 3
컬럼 매트릭스 Q-세파로스 패스트 플로우
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 층 높이
컬럼 부피 16 mL
컬럼 제조 150 cm/hr 로 0.1 M 수산화나트륨 내 채움
조작 유속 100 cm/hr (3.35mL/분)
세정 0.1M 수산화나트륨 (2 컬럼 부피)
로딩 용량 7.5 mg /ml 매트릭스
평형 20mM 인산나트륨 pH 6.5/80mM NaCl
로딩후 세척 20mM 인산나트륨 pH 6.5/80mM NaCl (5 컬럼 부피)
스트립 완충용액 2M 염화나트륨 (2 컬럼 부피)
세척 0.1M 수산화나트륨 (2 컬럼 부피)
DEAE 세파로스 : 런 4
컬럼 매트릭스 DEAE 세파로스
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 층 높이
컬럼 부피 16 mL
컬럼 제조 150 cm/hr 로 평형 완충용액 내에 채움
조작 유속 100 cm/hr (3.35mL/분)
세정 0.1M 수산화나트륨 (2 컬럼 부피)
로딩 용량 7.5 mg /ml 매트릭스
평형 25mM 트리스HCl pH 8.6/25mM NaCl (8 컬럼 부피)
로딩후 세척 25mM 트리스HCl pH 8.6/25mM NaCl (5 컬럼 부피)
용출 완충용액 25mM 트리스HCl pH 8.6/25mM NaCl 내지 25mM TrisHCl pH 8.6/250mM NaCl (10 컬럼 부피)
세척 2M 염화나트륨 (2 컬럼 부피)
DEAE 세파로스 결합법: 런 5 ( 마일스(Miles)법 )
컬럼 매트릭스 DEAE 세파로스
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 층높이
컬럼 부피 16 mL
컬럼 제조 평형 완충용액 내에 150 cm/시간으로 채움
조작 유속 100 cm/시간 (3.35mL/분)
세정 0.1M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)
로딩 용량 7.5 mg /ml 매트릭스
평형 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25 mM NaCl (8 컬럼 부피)
로딩 후 세척 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25 mM NaCl (5 컬럼 부피)
용출 완충용액 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25 mM NaCl 내지 25 mM 트리스HCl pH 8.6/250 mM NaCl (10 컬럼 부피)
세척 2M 염화 나트륨 (2 컬럼 부피)
본 연구에 사용된 여러가지 완충용액들의 특성은 표 3에 나타낸다.
음이온 교환 크로마토그래피 시험들의 각각에 대한 용출 프로필(profile)은 도 2-5에 나타낸다.
5 이온 교환 시험들로부터 산출된 용출액 시료들은 rPA 엘리자(ELISA)로 단백질 A 수준을 검정하였다. 결과는 표 4에 나타낸다.
본 연구에 사용된 완충용액
평형 완충용액 시험 번호 전도도 (ms/cm) 수지 pH
50mM 트리스HCl pH 8.0 / 75mM NaCl 1 10.74 Q-세파로스(비결합) 8.00
50mM 트리스HCl pH 8.0 / 100mM NaCl 2 12.85 Q-세파로스(비결합) 8.01
20mM 인산 나트륨 pH 6.5 / 80mM NaCl 3 10.20 Q-세파로스(비결합) 6.50
25mM 트리스HCl pH 8.6/25mM NaCl 4/5 3.35 DEAE-세파로스(결합) 8.60
25mM 트리스HCl pH 8.6/250 mM NaCl* 4/5 24.54 DEAE-세파로스(결합) 8.61
*기울기 용출 완충용액
DEAE-세파로스 런 5 (마일스법)의 용출 프로필에 따라 분획들을 수집하였고 r단백질 A 엘리자로 분석하였다; 결과는 표 5에 나타낸다.
r단백질 A 엘리자 결과:
시료 ID r단백질 A 수준 (ng/mg) 항체 농도 (mg /ml) % 회수율 용출 부피 ( CV's ) *
Q-세파로스 용출액 런 1 < 0.4 1.42 82 4.5
Q-세파로스 용출액 런 2 2.94 1.49 70 3.5
Q-세파로스 용출액 런 3 0.73 1.86 85 3.4
DEAE 세파로스 용출액 풀(pool) 런 4 (모든 분획들의 풀) 1.72 2.16 75 2.5
DEAE 세파로스 용출액 풀(마일스법) 런 5 (분획 2 내지 6의 풀) 1.55 1.83 73 3
*상기 CV's는 컬럼 부피를 표시한다.
결합 DEAE - 세파로스 분리 ( 마일스법 ) 동안 수득된 용출 피크(peak)에 따른 용출액 분획들 내 r단백질 A 의 수준; 시험 5.
분획 번호 r단백질 A 수준 (ng/mg) 흡광도 (A 280 )
1 3.33 0.018
2 0.4 0.108
3 0.4 0.22
4 0.4 0.169
5 2.01 0.092
6 16.7 0.042
7 6.38 0.016
상기 항체(6A1; pI 6.5 - 7.5)에 대한 최고 회수율(85%) 및 r단백질 A의 최대 제거는 20 mM 인산 나트륨 pH 6.5 / 80 mM NaCl 완충용액을 사용한 Q-세파로스 상 비결합 조건 하에서 수득되었다(런 3에 부합). 런 1 또한 양호한 회수율 (82%) 및 r단백질 A 제거를 나타내었으나, 상기 시험에서의 용출 부피는 비결합법에 대해 예상되는 것보다 상당히 높았고; 이는 상기 완충용액계에서 상기 컬럼 상 항체의 부분적 지연을 암시한다. NaCl 농도의 증가(런 2)는 r단백질 A 제거를 낮추는 결과를 가져왔고, 따라서 런 3에 사용된 완충용액계가 상기 항체에 더욱 적당했다. 런 1에 사용된 고 pI 항체에 더욱 적당하고, 런 3에 사용된 완충용액 시스템은 특히 중성 또는 약산성 항체에 유용함을 우리는 이전에 관찰하였다. 이러한 실험들은 유사한 용량(7.5 mg/ml 수지)으로 행해졌고 우리는 더욱 고용량(>30 mg/ml)에서 상기 비결합법을 사용할 수 있음을 예상하였다. 우리는 상기 비결합법을 음이온 교환막 흡착제(예를 들어 무스탕(Mustang) Q , 인터셉트(Intercept) Q 및 살토빈드(Sartobind) Q)에 부가하여 다수의 음이온 교환제, 예를 들어 Q-하이퍼(Hyper) D에 적용할 수 있음을 예상하였다. 우리는 또한 고용량 등이 적용가능하기 때문에 상기 방법이 마일스법에 비하여 대규모의 생산에 더욱 적절함을 예상하였다.
런 5 (마일스법)의 경우, r단백질 A의 분획화는 표 5에 나타낸 주된 용출 피크에 따라 관찰되었다. 따라서 r단백질 A의 양호한 제거를 보증하기 위해 분획들의 조심스러운 수집이 요구된다. 이는 회수율(73%)의 효과가 있으나, 상기 경우에도 비결합법으로 수득된 만큼의 양호한 제거를 제공하지는 않았다. 따라서 마일스법에서는 매우 고누출이 관찰되는 경우(단일 점 부착 매트릭스와 함께 통상적으로 얻어지는 것) 세포 라인/항체에 대한 양호한 제거 및 고회수율을 달성하기가 더욱 어렵다.
런 5로부터의 자료는 마일스 특허에 기재된 조건들을 대표한다. 방법 비교의 개관 및 수득한 자료는 하기 표 6에 나타낸다.
* 모든 실시예들은 교환제의 7.5 mg/㎖ 로딩 또는 15 mg/㎖ 로딩 용량으로 실시하였다:
농축 및 여과
(50 mM 트리스Hcl/75 mM NaCl pH 8.00)
&
음이온 교환 Q(<0.4)
(50 mM 트리스Hcl/75 mM NaCl pH 8.00)
주의: r단백질 A의 수준은 괄호 안에 ng/mg로 나타낸다; 모든 NSO 클론 세포 상층액이 단백질 A의 유사한 혼합 수준을 제공하는 것은 아님을 주의한다.
6. 고 pI 항체의 정제
고 pI 항체 (pI 9.0-9.3)를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect- 단일 점 부착 재조합 단백질 A 매트릭스), 그 다음 Q-세파로스 음이온 교환 크로마토그래피 (비결합 조건 하; 미량의 불순물 제거를 위해), 그 다음 SP-세파로스 양이온 교환 크로마토그래피 (결합 조건 하 응집체 제거를 위해)를 사용하여 정제하였다.
실험 재료 및 방법
MabSelect 단백질 A 크로마토그래피:
컬럼 매트릭스 Mab 선택 재조합 단백질 A(단일 점 부착 rPA )
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 15 cm 층높이
컬럼 부피 30 mL
조작 유속 500 cm/시간 (16.80mL/분)
세정 6M 구아니딘 HCL (2 컬럼 부피)
로딩 용량 35 mg /ml 매트릭스
평형 50 mM 글리신/ 글리시네이트 pH 8.0/250 mM NaCL (8 컬럼 부피)
로딩 후 세척 50 mM 글리신/ 글리시네이트 pH 8.0/250 mM NaCL (8 컬럼 부피)
용출 완충용액 100 mM 글리신 pH 3.50 (6 컬럼 부피)
세척 100 mM 시트르산 pH 2.1 (2 컬럼 부피)
고 pI 항체를 포함한 배양 상청액을 AKTA FPLC 시스템에 연결된 MabSelect 단백질 A 친화성 컬럼 (30ml)으로 정제하였다. 사용된 조건은 상기 표에 기재한 것과 같다. 상기 항체는 0.1M 글리신 pH 3.5를 사용하여 용출하였다. 용출 후, 상기 용출액을 pH 3.69 (조정 불필요)에서 60 분 동안 유지하고(저 pH 바이러스 불활성화 단계), 그 다음 2 M 트리스 염기를 사용하여 pH 8로 중화하였다. 단백질 A에 대해 3 사이클을 수행하였다; 생성물 회수율은 A280nm에 의해 결정되었고 각각의 사이클에 대해 표 7에 나타내었다.
Mab Select 단백질 A 컬럼에서 % 회수율
사이클 번호 % 회수율
1 81
2 81
3 80
MabSelect 단백질 A 크로마토그래피 후 각각의 3 사이클로부터의 용출액들을 함께 모았고 10kDa 밀리포어(Millipore) 막이 장치된 아미콘 교반 셀 농축기를 사용하여 완충용액을 25mM 트리스 pH 8.0 (Q-세파로스 평형 완충용액)로 교환하였다.
Q- 세파로스 크로마토그래피:
컬럼 매트릭스 Q- 세파로스 패스트 플로우
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 15 cm 층높이
컬럼 부피 30 mL
컬럼 제조 0.1 M 수산화 나트륨 내에 225 cm/시간으로 채움
조작 유속 150 cm/시간 (5.0 mL/분)
세정 0.1M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)
로딩 용량 40 mg /ml 매트릭스
평형 20 mM 트리스 pH 8.0 (8 컬럼 부피)
로딩 후 세척 20 mM 트리스 pH 8.0 (5 컬럼 부피)
탈거 완충용액 20 mM 트리스 pH 8.0 /2M NaCl (2 컬럼 부피)
세척 0.1M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)
40ml의 농축/여과된 MabSelect 단백질 A 용출액을 40mg/ml 매트릭스의 로딩 용량으로 Q-세파로스 컬럼 위에 로딩하였다. 상기 컬럼을 비결합 방식으로 조작하고 항체를 함유하는 비결합 분획을 수집하였다. 상기 단계에서의 회수율은 A280에 의해 69%였다. 이는 상기 항체에 대해 상기 조건 하에서 수득된 것보다 약간 낮고 이는 FPLC 시료 펌프 내에서 지연되는 부피 때문에 로딩 부피의 추정이 부정확하기 때문일 수 있다.
Q-세파로스 크로마토그래피 후, 비결합 분획을 13.98 mg/ml로 농축시키고 10kDa 밀리포어 초여과 막이 장치된 아미콘 교반 셀을 사용하여 SP-세파로스 평형 완충용액(25mM 아세트산 나트륨 pH5.0/25mM NaCl) 내로 여과하였다.
SP - 세파로스 크로마토그래피:
컬럼 매트릭스 Q- 세파로스 패스트 플로우
컬럼 용적 1.6 cm 내부 직경 x 15 cm 층높이
컬럼 부피 30 mL
컬럼 제조 0.1 M 수산화 나트륨 내에 150 cm/시간으로 채움
조작 유속 100 cm/시간 (3.35mL/분)
세정 0.1M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)
로딩 용량 10 mg /ml 매트릭스
평형 25 mM 아세트산 나트륨 pH 5.00 /25 mM NaCl (8 컬럼 부피)
로딩 후 세척 25 mM 아세트산 나트륨 pH 5.00/25 mM NaCl ( 6컬럼 부피)
용출 25 mM 아세트산 나트륨 pH 5.00/186 mM NaCl ( 25컬럼 부피)
탈거 완충용액 25 mM 아세트산 나트륨 pH 5.00/2M NaCl ( 2컬럼 부피)
세척 0.1M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)
24ml의 완충용액 교환 Q-세파로스 용출액을 10mg/ml 매트릭스의 로딩 용량으로 SP-세파로스 컬럼 위에 로딩하였다. 상기 컬럼은 결합 방식으로 조작하였다; 상기 용출액을 분획들로서 수집하였다. 용출 프로필에 따른 분획들을 GP-HPLC에 의해 분석하여 응집체 수준 결과를 결정하고 표 8에 나타내었다. 각 크로마토그래피 단계 후 시료들을 수집하고 r단백질 A 잔류물에 대해 분석하여, 결과를 표 9에 나타내었다.
각 크로마토그래피 단계 후 r단백질 A 엘리자 결과
시료 ID r단백질 A 수준(ng/mg) 항체 농도 (mg/ml)
Mab선택단백질 A 용출액 (농축/여과 후) 2.64 46.7
Q- 세파로스 용출액 <4 8.10
SP - 세파로스 용출액 풀 F(1-16) <4 1.79
SP - 세파로스 분획들의 GP - HPLC 분석
시료 ID % 응집율 흡광도 (A 280 )
SP 용출액 풀 F(1-3) 0.57 11.2
SP 용출액 풀 F(4-6) 1.10 2.7
SP 용출액 풀 F(7-9) 2.07 0.655
SP 용출액 풀 F(10-12) 2.12 0.351
SP 용출액 풀 F(13-15) 2.56 0.208
결론: 응집체의 분획화는 항체 피크의 단계 용출 중에 관찰되었다; 표 4 참조. 응집체가 풍부한 분획들은 비응집체 포함 분획들에 비하여 더 늦게 용출되었다(용출 피크의 꼬리 끝에서). 상기 꼬리 분획을 주요 풀로부터 생략하여 99 %의 단량체 풀을 수득할 수 있고 여전히 고 회수율(>95%)을 갖는다.

Claims (20)

  1. 하기의 단계를 포함하는 항체, 바람직하게는 IgG 항체의 정제 방법:
    · 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는 단계 (여기서 단백질 A 는 본래의 단백질 A 또는 이의 기능적 유도체임),
    · 단백질 A 또는 그 유도체의 결합을 가능케 하는 조건 하에서, 정제된 항체를 이온 교환 물질 상에 로드시키는 단계, 및
    · 오염물질 단백질 A 가 이온 교환 물질에 결합하는 동안, 이온 교환기의 플로우-스루(flow-through) 내에서, 이온 교환 물질 상에 로드된 항체 양의, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 항체를 수집하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 단백질 A 가, 컬럼 물질에의 단일-지점 부착을 가능케하도록 가공된 재조합 단백질 A 인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 재조합 단백질 A 가 그 아미노산 서열에 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 시스테인이 재조합 단백질 A 의 아미노산 서열의 C-말단의 최후의 30 개 아미노산으로 이루어진 세그먼트(segment) 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 재조합 단백질 A 가, 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 크로마토그래피 지지체 물질에 대한 티오에테르 황 결합을 통하여 50 % 이상 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 또는 그 기능적 유도체가 이온-교환기의 플로우-스루 내에서 1 ng/mg IgG 미만의 농도로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 교환기가 음이온 교환기인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 pI 가 6.5 이상임을 특징으로 하는 방법.
  9. 하기의 단계를 포함하는 항체 정제 방법:
    · 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는 단계 (여기서 단백질 A 는 본래의 단백질 A 또는 이의 기능적 유도체임),
    · 단백질 A 또는 그 유도체의 결합을 가능케 하는 조건 하에서, 정제된 항체를 1 차 이온 교환 물질 상에 로드시키는 단계,
    · 오염물질 단백질 A 가 이온 교환 물질에 결합하는 동안, 이온 교환기의 플로우-스루(flow-through) 내에서, 이온 교환 물질 상에 로드된 항체 양의, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 항체를 수집하는 단계, 및
    · 2차 이온 교환기 상의 로딩, 그에의 결합 및 그로부터의 용출에 의하여, 항체를 추가로 정제시키는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 1 차 이온 교환기가 음이온 교환기인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 항체의 pI 가 7.5 이상임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 2 차 이온 교환기가 양이온 교환기인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 정제된 항체가 필수적으로 단량체성(monomeric), 비-응집 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단일클론 항체, 바람직하게는 IgG 항체이며, 여기서 IgG 항체는 키메릭(chimeric) 또는 CDR-이식(CDR-grafted) IgG 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, IgG 항체가 적어도, 단백질 A 에 대한 높은 친화성을 가능케 하는 상기 종들 기원 및 IgG 서브클래스 기원의, 단백질 A 에 대한 결합과 관련되는 항체의 상기 부분(portion) 내, 바람직하게는 단백질 A 에 대한 결합과 관련되는 그 Fc 부분 내, 더욱 바람직하게는 단백질 A 를 위한 결합자리를 포함하는 IgG 의 Cγ2-Cy3 인터페이스(interface) 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 항체의 Fc 부분(portion)에 관하여, IgG 항체가 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의하여 항체를 정제하기에 앞서, 항체가 세포 배양으로부터 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 항체가 포유동물 세포 배양으로부터 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되는 항체가, 프로테아제(protease)를 불활성시키도록 처리되지 않거나, 바람직하게는 하나 이상의 프로테아제 저해제와의 혼합물 내에 있지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 프로테아제 저해제가 PMSF, 프로테이나제(proteinase) 저해 펩티드, ε-카프로산 및 환원 설프히드릴 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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