TWI325428B - Protein a chromatography - Google Patents

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TWI325428B
TWI325428B TW093106464A TW93106464A TWI325428B TW I325428 B TWI325428 B TW I325428B TW 093106464 A TW093106464 A TW 093106464A TW 93106464 A TW93106464 A TW 93106464A TW I325428 B TWI325428 B TW I325428B
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Julian Bonnerjea
Anna Preneta
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Description

1325428 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於生物技術生產中的抗體純化領域。本發 明的一項目標是要說明純化此種抗體的新穎方法。 【先前技術】 蛋白質A色層分析法廣泛用於抗體的工業製造，因為 它容許以單一步驟從細胞培養上澄液中將抗體亦即通常為 IgG幾近於完全純化。蛋白質A的親和性管柱無可避免的 在重複流洗時會有某種程度之配體從管柱流失。這有部分 可能是因為蛋白質A從管柱中被蛋白質分解作用修短；而 在工業製造用於醫藥應用的抗體中，卻不可能因為調節的 理由添加蛋白質抑制劑之混合物。不幸的是，這種蛋白質 A或蛋白質A的片段污染物保留了它們對lg(；的親和性， 並且因為形成複合物而難以從純化的抗體之"多除。移除 是絕對必須的，因；^蛋白# A s ' ' 兩蛋白貝A疋一種細菌蛋白質，它會誘 導一種不被希望的免痏及雍. „ , _ J兄/又夂應，而且，添加蛋白質A到單株 ¥所形成的模型複合物已被報導會在體外活化帶有的 白血球和輔助系統而產生氧化和過敏毒素活性⑽—等 人’《癌症研究》’第44期，第734頁，1 984年）。 把US6, 399, 750中所列之重組|白質 , 一曰負Α物種商品化能 仔到較高容量的蛋白質A4 文曰貝Λ S柱，4重組物種係藉由單一硫 醋鍵連接到管柱基質上β 1 本 ^ A ^ 八所伴匕的缺點是此種重組蛋白 質A基質的漏失速率經常會 霄矛。f夕傳統的、藉由CNBr偶合 所仔到的多點連接的天麸蛋 穴…、蛋白貝A基質相對比地激烈增加
Xi25428 。因此蛋白質A汙染物的移除應在沒有複合的IgG伴隨移 除的狀況下進行。
Balint等人（lbd.)證明此種IgG_蛋白質複合物可藉由 膠體色層分析法與未複合的IgG>開。低流出量與抗體產 率的減損是此方法的缺點。 US4’983’722教示藉著讓混合物吸附到陰離子交換劑 ::枓上並且連續在增加離子強度的條件下溶離抗體和蛋白 貝A以分開兩個成分’而使造成污染的蛋白質a從蛋白質 純化的抗體製備物中選擇性地分開。 依媚：f娜άΑ τ 解析方法向度 賴抗肢的Pi，ρΙ對於給定抗體 變性。而且，流。疋特'具高.度可 。 出Μ限於獲付分離所需的鹽梯度的斜率 【發明内容】 本發明的一項目的是要設計另—種 質Α片段盥枋雕处 ，蛋白貝A或蛋白 乃杈”抗體（較佳是IgG)分離 先前技藝的缺點。根據本發明，此種目二f方法要避免 請專利範圍第i項和楚q 肖目#疋根據獨立項申 和丄負和弟9項解決的。 根據本發明，五人执4 ^ 包括以下步驟：…。Γδ純化抗體的方法，該方法
4, ^ 百免，藉由蛋白質Α親和性色；S八;^ U 化抗體，其中蛋 征巴層为析法純 物。 貝的蛋白質Α或其功能性衍生 下，將純化的:二1:質A或其功能性衍生物結合的條件 抗幾，較佳是::離:到離子交換劑村料上，其三是收集 在切子交換劑的流出物中收集至少、70%， 1325428 更佳是收集至少80%，最佳是收集至少9〇%之裝載到離子交 換材料上之杬體量，而任何污染物蛋白質A或蛋白質A衍 生物係被結合至該離子交換材料上。 蛋白貝A疋一種在金黃色葡萄球菌（介即此 的細胞表面發現之蛋白質。它具有與哺乳動物的抗 體尤其疋分類為IgG的抗體之Fc區結合的性質。在一給定 類別之抗體中，親和性稍微因物種的起源和抗體亞系 (subclass)或同種異型性（all〇type)而異（在Sur〇Ha A.等 人，1982年，〈蛋白質A :自然的共同抗體〉，《丁丨於》 ，第7期，第74-76頁；Langone等人，1982年〈金黃色 葡萄球菌之蛋白質A及相關的免疫球蛋白受體〉，《免疫 學之進展》，第32期：第157-252頁有評論）。蛋白質a 可以直接從能分泌出蛋白質A的金黃色葡萄球菌培養物中 分離出來或更方便地重組表現於大腸桿菌之中（L〇fdahl等 人，1 983年，《美國國家科學院誌（pNAS)》，第8〇期： 第697-70 1頁）。其純化抗體尤其是單株IgG的用途被充分 地在先前技藝中說明過（例如：Lang〇ne等人，同前；
Hj elm等人’1972年，《FEBS通信》，第28期，第73-76 頁）°對在蛋白質A親和性色層分析法的用途而言，係將 蛋白質A與一種固態基質偶合’如與交聯、沒有電荷的瓊 脂（Sepharose ’不含天然瓊脂之有電荷的部分），參丙烯醯 基’父聯的葡聚糖、或以石夕為基礎的物質。這項用途的方 法在本技藝中是普遍已知的’例如經由將蛋白質的—級胺 基官能連接到一種CNBr活化的基質上。蛋白質a以高度親 1325428 和性和高度專-性結合i Ig“"c部分，也就是㈣的 Q2-Cy3介面區，如Lang〇ne等人，1982年，同上所說明 的尤，、其強力的結合至人類之同種異型性或亞系的 IgGl、 IgG2、IgG3和老鼠之同種異型性或亞系的igG2a、 IgG2b、IgG3。蛋白質A也展現對於免疫球蛋白之^區的 親和力’該區係由vH基因家族，νπ編碼（⑽。等人， 1991年，《免疫學期刊》，第61期：3〇26_3〇31頁； Hi Ison等人，《實驗醫學期刊》，第178期：33卜336頁 ( 1 993年））。編碼蛋白質a的基因序列透露兩種功能迴異 的區域（Uhlen等人，《生物化學期刊》，第259期： 1695-1702頁（1984年）；Lofdahl等人，《美國國家科學 院誌（PNAS)》，第80期：697-701頁（1983年））。該胺基 立而區域包含五個咼度同源的I gG結合區位（稱之為e、d、a 、B和C )，且羧基端區使該蛋白質固定在細胞壁和細胞膜 上所有五個蛋白貝A的IgG結合區位藉由Fc區結合至
IgG ’其涉及例如人類的igG-Fc殘基252-254、433-435和 311 ’如在蛋白質A的B-區位的情形中於Deisenhofer等 人的晶體結構（1 9 81年，《生物化學期刊》，第2〇期： 2361-2370 頁）以及於 Sauer-Eriksson 等人（1995 年，《結 構》，第3期：265-278頁）所示。在Fc部分的兩個基本 上鄰接的主要結合位置已經在Gouda等人，1998年，《生 物化學期刊》，第37期：1 29-1 36頁的NMR解答研究中被 禮認。原則上，蛋白質A之IgG結合區位A到E的每一者 即足以與一個！ gG的Fc部分結合。 中 纟人類VH3家族的某些對偶基因已被發現能視 :要錯由蛋白！ A與人類的Ig結合（Ibrahim，i 993年， ，疫予期刊》’帛151期：咖卜36〇3胃；〈v_區調節 2的1§與蛋白質A結合>)。在本申請案的上下文中， 勒月的3項分開的目標中，每件被提到適用於抗體的 A人蛋白貝A結合的事物同樣適用於經由此種vh3家族 的蛋白質A-結合對偶基因之抗體結合—倘若此種抗體的 區不容許其本身達到高親和性的蛋白f a結合。其可視為 與亡發明之主要的、以Fc ^基礎之本發明方法的均等具 體貝例’後者將在緊接的部分中進一步做說明。 根據本發明的IgG抗體被吾人瞭解為屬於此種能與蛋 白質A以问親和性方式結合的同種異型體的一種抗體。而 且’除了抗體的Fc部分與結合至蛋白質“目關之外，此種 ㈣絕對不能相當於天然抗體。尤其是在其可變區域的部 伤中，其可為如同本技藝中例行設計之經改造的嵌合或 CDR-移植抗體。簡言之’根據本發明# igG抗體應被瞭解 為一種IgG型式的抗體。 據本毛明之蛋白負A的功能性衍生物經以結合係數 鑑認，對老鼠的igG2a或人的IgGi之Fc部分而言，至少 K = l〇 8M，較佳是K = 1〇-9M。具有此種結合係數值的交互作 用在本說明書的上下文中以「高親和性結合」稱之。較佳 疋此種蛋白質A的功能性衍生物至少包含野生型蛋白質a 的功此性1 gG結合區位的部分，該區位係選自天然區位E 、D A、β、c或其經改造仍保留I g(j結合功能性的變異體 對此之一項實施例為蛋白質A的區位B之具功能的59個 胺基酸之「7, H ea t 月奴，該區位如US601 3763所提出可用於純 化抗妝。然而，較佳是根據本發明的抗體結合片段包含至 少：個，本段所定義之完㈣Fc結合區位。關於此的一 項貫例是揭示在例％ EP-282 308 * EP-284 368的重組蛋 貝A序歹j這兩項序列都出自Rep 1 igeil公司。 可單獨或與蛋白質A或功能性的蛋白質A片段或如以 上部分所定義的衍生物組合，更佳的是經修改而能單點連 接的蛋白質A片段。擔點接觸意指蛋白質分子部分經由單 一的共價鍵連接到蛋白質A親和性色層分析法之色層分析 擔體材料上。此種利用適當之反應性殘基進行的單點連接 進一步在理想的狀況下被放在一個暴露的胺基酸位置上， 即疋在個小環中，靠近N端或C端或在蛋白質摺疊之外 側環境上的他處。適當之反應性基團為例如巯基或胺基官 能。更較佳的是，此種重組蛋白質A或其功能性片段在其 胺基酸序列上包含了 一個半胱胺酸。最佳的是，該半胱胺 酸被包含在含有重組蛋白質A或其功能性片段之胺基酸序 列的C端表後3 0個胺基酸的小段上。在此種型式的更佳具 體貫例中，重組蛋白質A或其功能性片段至少50%經由硫 謎硫鍵連接到蛋白質A色層分析法基質的色層分析擔體或 基質材料上。此一具體實例的一項實施例描述於如 Pharmacia 公司的 US 6399750 中並且可以 StreamlineTM 或 品牌名稱購自Amersham-Biosciences公司， 視所使用擔體基質的本性而定。在本說明書的上下文中， 11 硫醚應被狹義地瞭解為一個 興化學結構無關的_s_鍵結圖形 ，在此方面偏離常用的化學狂+ 干DO 5，例如可能根據本發明的 -S-硫it橋接是一個較大官 土的一部份，如例如硫酯或混 合的縮醛’這方面在本申往 奉甲吻案的上下文中偏離化學家之以 反應活性為基礎的常用芦古。 β ,, ° 較佳疋，該硫謎橋接是其平 常使用的狹義的化學Μ。此種作為橋接的硫喊團可為 〗由蛋白貝I Α的半胱胺酸殘基之疏基與位在被活化的色 層分析擔體材料上的環氧基團反應所產生。用一個末端的 +胱胺酸殘基，此種反應可以在適合的條件下進行，該條 件只容許—種蛋白質之暴露的獨特疏基偶合以僅只和此種 蛋白質做單點的連接。 / —項尤佳的具體實例中，根據本發明之蛋白質A或 :此性的蛋白質A衍生物是揭示於US 6399750之重組蛋白 貝^，其包含一個末端並列之經改造的半胱胺酸殘基，並 且較=疋至少5〇%，更佳是至少7〇%經由該半胱胺酸的硫原 子以單點連接方式偶合到色層分析之擔體材料上。更佳的 疋這種偶口作用已經被環氧化物所調節的活化作用達成， f仏是利用1，4-雙-(2, 3-環氧丙氧基）丁烷活化例如一種 复月曰基貝如Sepharose Fast Flow(與氯甲代氧丙環交聯的 朱粒英國Amersham-Biosciences公司），或藉由氣 甲代氧丙環活化例如一種瓊脂基質如Sephar〇se 。更佳 疋/、根據本&落前述較佳具體實例結合的該第一離子交 換d為一種陰離子交換劑，特別是以四級胺為基礎之陰離 '、、釦1 例如 Sepharose QTM FF (Amersham- 12 1325428
Biosciences/Pharmacia公司），最佳是其為一種具有偶合 至基質擔體之官能性交換劑基團Q之陰離子交換劑，該基 團Q是N，N，N-三曱基胺-曱基，最佳是該陰離子交換劑為 蹲自 Pharmacia/Amersham-Biosciences 公司的 Sepharose QTMFF。該四級胺基是一種很強的交換劑，且其不易受裝載 /沖洗用緩衝液的pH值影響。快速流動的交換劑基質是以 高度交聯以求較高物理穩定性之45-1 65微米的璦脂珠粒； 而且sepharose不含天然瓊脂帶電荷的硫酸化分子部分且 不容許非專—性的基質吸附抗體，甚至是在高抗體裝載量 的條件下亦如此。此一具體實例的一項實施例可在實驗部 分中找到。 根據本發明的污染物蛋白質A是任何型式的功能性之 蛋白質A與IgG結合的子代或如以上所定義之其功能性衍 生物，其乃將結合之抗體從蛋白質A親和性色層分析管柱 溶離時所得。此種污染物蛋白f A物種可能得自例如狀鍵 7水解，這極可能藉由酵素作用，尤其是在工業製造當中 發生。當粗略純化的新鮮產物溶液仍存在有相當的蛋白酶 :性時’蛋白f A色層分析法在下游加卫過程中被應用為 -項早期步驟。細胞培.養肉汁中的死細胞或在最初離心或 過濾=驟中被破壞的細胞很容易有被釋放出的蛋白酶；為 二=:的目的，在下游加工過程之前或期間補充蛋白酶抑 =常未能達成目的，這與生物化學研究的實行相違。 苯基—甲[硫醯-氣瓣…'己酸。此種化學用劑 生物醫藥的生產上為不欲之添加劑。另有可能蛋白質a 13 丄奶428 之重組的功能性衍生物或片段要比野生型的蛋白質A較不 能對抗蛋白酶，視其蛋白質擅疊的三級結構而$…旦沾 合區位的總數減少時，與㈣IgG結合區位連接的胺基: 小段可能會被暴露出來。區位間的接觸可能會對區位指属 的穩定性有幫助。也有可能抗體被蛋白質A或其功能性： 生物結合會因為抗體結合時所誘導的構形變化而影響或輔 =蛋白酶作用易於進行。再說，野生型或完整長度的蛋白 質A或其具功能性之經修改片段可能表現不同。較佳是， 根據本發明之污染物蛋白質A仍然具有功能性之能：合 ¥的蛋白質，因此當被裝載到根據本發明之緊接的離子 交換分離基質上時，會與經蛋白f A純化的抗體結合。高 親和性為基礎的污染物蛋白冑A與經純化之抗體的結合就 是為什麼難以將污染物蛋白f A與純化的抗體分開的原因 車乂釭疋根據本發明之待純化的抗體在用蛋白質A親和 色層分析法純化抗體前，先從細胞培養物中收獲。更佳 是，該細胞培養物是哺乳動物的細胞培養物。哺乳動物細 有稱為浴小體的大空間，包含在細胞死亡或收穫時瓦 解之分'解㈣素。尤其’該細胞培養物可為骨髓瘤細胞培 =物，例如NSO細胞（Galfre G.和Milstein C.，《酵素 :方法期刊》，1981年，第73期，第3頁）。骨髓瘤細胞 疋種漿細胞瘤的細胞，亦即淋巴樣細胞譜系的細胞。一 種作為範例的NS〇細胞系是例如ecacc 8511〇5〇3號細胞系 可自由得自歐洲細胞培養收集（ECACC)，應用微生物與研 1325428 究中心，Salisbury.，Wiltshire SP4 0JG ,英國。NS〇 已被 發現能造成非常高的產率，尤其是若用於生產重組抗體。 於是，NS0細胞已被發現具再現性地將污染物蛋白質a提 高至遠比其他宿主細胞型式為高的的濃度，至少用某種採 用重組修短的野生型蛋白質A而重組蛋白f A可能是單點 連接的蛋白質A之蛋白f A親和性色層分析系統是如此。 這樣的-項實例是StreainlineTM r蛋白質A親和性色層分 析樹脂umerSham-Bi〇science;本質上是如 us 6,399,75〇 中說明的硫醋單點連接的重組蛋白質A)。大約ι〇〇〇毫微 克污染物蛋白f A/毫克抗體或超過此量的濃度可以用 St—« r蛋白質a親和性管柱獲得。本發明的方法 得以與先前技藝區別之處在於能以單_快速得純化步驟將 污染物蛋白質A從此種高濃度有效率的降低f,j<ing/mg抗 體，亦即以大約1 000倍的純化係數進行之。 還有較佳的是’單獨或者與前段合併，待以蛋白質A 親和性色層分析法純化的抗體並未經處理以使蛋白酶在收 穫當時或收穫後失活，更佳的是不在收穫以後盘至少一種 外源補充的蛋白酶抑制劑混合。最佳是該蛋白酶抑制劑選 自包含腳-如Usk⑽skl等人，年〈蛋白酶的蛋白 負抑制劑〉所說明的特定蛋白酶抑⑽，《生物化 》，第49期’第593-626頁，以及ε_己酸，。 ^ 蛋白質Α親和性色層分折法沾4 析/去的插作已經被廣泛的說明 於技術文獻之中且不需要進一步說明。除了以上所引用的 之外另-個實施例是例…_等人在《免疫學方法期 15 刊》，第3!期（簡年），第21卜爪頁，〈 蛋白皙Acu ^ ^ ^ ^七咖贿對人類丨心⑽和㈣進行溶離 / ° 較佳是在第一離子交換劑的流出物中將污染物蛋白質 A T低到<l〇ng/mg抗體的濃度，更佳是<4叩/邶抗體，最 疋〈Ing/mg抗體，其中抗體較佳是被瞭解為指的是。 用於證實這些閾㈣EUSA分析法詳細說明在實驗部分； 尤左思到喊樣被酸化至啦4，較佳在溫和的清潔劑存在下 :行’對於正確測量漏失的蛋白f A量很重要。當然間值 ?被瞭解為其使蛋白質A結合的第一離子交換劑之裝載容 I決不能過量而不可避免的導致污染物蛋白質A通過。一 項適當之以ELISA為基礎的蛋白質A或蛋白質A片段的檢 ㈣法說明在⑽4,983, 722之中。適當的抗蛋白質A抗體 疋可商業賭得的’例如肖Sigma-Aldrich公司購買。尤直 是當使用蛋白質A的衍生物而該衍生物已經被改造以包2 其他的疏基時，適當地維持蛋白質標準是重要的。對於此 種用做為定量試驗樣品之標準物的純蛋白質A衍生物確認 其單體特徵可能很重要，因為共價的二聚體或經由ϋ橋 接所形成的多聚體可能會導致錯誤的結果。相可以很容 易的藉由還原和非還原條件下進行咖_隱分析來達成， 士本技蟄中十貝常使用的方式進行。因此利肖dtt或卜魏基 乙醇對此種蛋白λ A &生物標準溶液進行還原對於阻遏 ELISA技術中的測量誤差有所幫助。 更佳的是在根據本發明的方法中至少7〇%，更佳是至 16 交換劑的抗體可在 少m’最佳是至少嶋載到第一離 該離子交換劑的流出物中被回收。 r 發明的第一離子交換劑是一種陰離子交換劑樹 二 貝A與E卜289 1 29 Bi戶斤說明的兩種型式的樹腊 、二結合：第-離子交換劑或陰離子交換劑可以在一定的 :速下以“主的方式操作或以批次方式操作，藉著把離子 乂換樹月曰反到溫和授掉的試樣溶液中，並且藉著接著的過 j作用進-步交換液體介質。根據本發明並且考慮給定抗 體的π值’則可能定義出適當的pH值和離子強度條件以 裝載第离隹子父換劑，該條件能使抗體保留在流過的物質 中而蛋白貝A /亏染物則與之結合而從抗體中被移除。如之 月'J发過的根據本發明的方法容許較快速地將抗體與蛋白 質Α π染物分離。此種連接到基質擔體上的第一陰離子交 換劑的官能基實例為例如：一級、二級和尤其是三級或四 級的胺基，如胺基乙基、二乙基胺基乙基、三甲基胺基乙 基、二甲基月女基甲基和二曱基_(2_羥丙基胺基乙基。適 §的陰離子父換劑之色層分析擔體基質在本技藝中為已知 者。以瓊月曰為基礎的樹脂及珠粒、葡聚糖珠粒、聚苯乙烯 珠粒和聚苯乙烯/二乙烯苯樹脂。最佳是該離子交換劑是 四級胺為基礎的陰離子交換劑，裝設在一種瓊脂基質，例 如購自 Amersham-Biosciences/Pharmacia 公司的 SepharoseCL-6B 或 Sepharose Fast Flow (FF)上。此種 之實例為購自 Amersham-Biosciences/Pharmacia 公司的 Sephar〇seQTM。更佳而與第一離子交換劑之使用有關的是 17 根據本發明的抗體是一種單株抗體，其等電點（pi )至少高 於用於先前蛋白質A親和性色層分析步驟的蛋白質A的ρι 兩個pH單位，也就是較其更為鹼性；例如當天然蛋白質a 的Pi大約為5.0時，Streamline重組蛋白質A的pI大約 為4. 5。較佳是根據本發明的抗體是一種單株抗體，其等 ‘”MpI)至J/疋6.5或更高，更佳是7〇或更高，最佳其 ^ f少是7·5或更高。吾人應注意這是實際收獲和純化過 的抗體之pi值，而不是僅由胺基酸序列簡單預測的Η值 。確實純化過的抗體分子可進一步進行多肽骨架的修飾如 醣化作用，該修飾可添加帶電荷的分子部分從而可改變分 ▲ t PI在使用等電聚焦法（IEF )測定產物抗體的p I時， ^ k組蛋白吳（例如一種單株抗體蛋白質）的轉譯後加工的 :U不均質性會導致個別產物抗體醣蛋白分子有較寬的pI 2圍在IEF膠體中像是一片污跡而不是單—條帶和對於 ^少主要產物的特定數值。根據本發明，在這樣一個先前 ::過的較佳具體實例中，「抗體的pI」係指抗體產物分 的PI在以上指明的較佳範圍以内者之部分。所有於此 項纟兄明;佳^.十一 y 〇 進步疋義，如在某個純化步驟之後回收的抗體 之/ΰ比率僅係指該抗體之p I依從部分而已。 據本％明之第一離子交換劑的操作方式需要用一 离择 了 、- j 、、Μ的平衡緩衝液將酸的或中和的溶離液從蛋白質 Α中親和&色層分析步驟上緩衝交換下來。在本發明的方法 渦平衡緩衝液和裝載緩衝液是完全相同的。常被採用的超 慮裝置如Amicon或MiUip〇re公司所售者可以方便地用 18 丄 於達成該目的；那此护里 子量的多孔月71其 釋效應而使用例如低分 十里的多孔過慮基皙士 e s Sephadex G-25。根據本發明的平 衡緩衝液較佳是具有置換鹽例如氣化 150mM的範圍，較佳θ c , /辰度在1到 疋5到ii〇mM的範圍，最佳 l〇〇mM的鹽濃度範圍。 十衡緩衝液的pH值較佳是在H6 5
到PH9.0的範圍，更伟θ产U7 n . PH θ 更佳疋在ΡΗ7.〇到ΡΗ8.5的範圍，最佳 疋在ΡΗ7.9到ΡΗ8.4的範圍。五人續今尸恭占紐 基官能具有大約”5的κ / 付蛋白質的N-端胺 .5的PKs值，因而污染物蛋白質a和任 何其他已帶負電:孩的疋人μ μ 貝-、一種陰離子交換劑結合在較 Μ性的PH 了會變得較強；對於某項應用而言，裝載用 綾衝液的pH需要微調以對於某一對抗體和污染物蛋白質a 有最佳的結合與非結合性之區分，該污染物蛋白質A具有 不同的pi值和不同含量的半脱胺酸與組織胺酸側鍵，其 可月b在所挑選# pH範圍内造成電荷的改變。而且，一種 更為鹼性# PH會干擾蛋白質A-抗體的交互作用，而且會 成4何離子強度的增加；同樣的，離子強度需要微調以 使抗體結合的防止與阻制污染物蛋白f A結合的需求平衡 。對於热習本技藝者而言，不用說緩衝液的離子強度通常 與:Η值成反比關係、，蛋白質A結合到陰離子交換劑視汕 阳疋的私度愈強，則防止抗體結合和干擾可能的蛋白質A_ 抗體父互作用的鹽耐受之程度就愈大。因而，以上給定範 圍的PH和置換鹽應被瞭解與「愈低則發現在以上給 疋進行本發明的較佳範圍内能容許的鹽愈少」有關連。以 pH緩衝物被添加的鹽愈多，則溶液的離子強度愈增加。離 19 1325428 子強度可藉由測量平衡緩衝液的導電性來 a _ 、!疋》 導電性 二ί:在兩極！間水溶液傳導電流的能力，其係測量 離子的總i且將電荷與離子的移動性列入 L ， ’愿。因此，拋 加水溶液中存在的離子量’該溶液會具有較高的曰 測量導電性的單位是mS/cm(毫西門斯/公 刀J ’且可利用古 售例如購自T〇pac公司（美國麻州 T, , ningham 市）肖
Honeywell公司的導電度計進行測量。在本申請案自 ' 文中，所有數值係關於25。(：的比導電度。較佳：第二： 離子交換步驟所使用的裝載用或平衡用緩衝液疋固陰 -/c…電度，更‘，最佳是"~ 2.—。理想上，其具有大約2mS/cm的導電度。適春' 緩衝鹽的實例可在Good n e (19 田 丁 \玍化期刊》，篦 :'HC…476頁)找到。舉例而言，慣常被採用的 Tns.HCl㈣液或伽氫納緩衝液即是適當的緩衝 該緩衝物質的濃度慣常是在例如叫㈣緩衝鹽的範圍。° 二：計一種緩衝液的可能陰離子物種當中，與氯化物 相比陰離子溶離的比強度較低者，其低溶離強度性質 與離子的電荷密度成反比且大約與離子大小成正比者為較 佳。陰離^容離強度依據經驗的比較則表列在生物化學的 私準教科晉中。更佳的是根據本發明的緩衝物質是一種磷 酸鹽緩衝液。碌酸氫越且右彻 — 蛳虹双風具有低的溶離強纟，尤其示若採用 於_或低# PH8時如此，且更因其尤低的促溶 (chaotropic)性質而勝出。 雖然成批的操作方式可行，但是對第一陰離子交換步 20 丄 +厶〇 驟而5管柱操作方式卻較。 10至6。毫升/小時的流速為有：形之中’以採用大約 季乂隹疋在10到30毫券抬髀/丄， 說如熟習本技藝者所=用!交換樹脂的範圍。自不用 ^極端稀釋試樣會造成抗體的產 的’，二待純化的抗體是在裝載操作的低流出物中被收集 液!同樣的平衡緩衝液冲洗之一根管柱體積的沖洗 二值可調整至中…增進穩定性和防止 犰體蛋白質的聚集及/或沉澱。 在第—陰離子交換齋丨夕未μ 或可視為需要進-步使用rif’抗體可用於應用用途 更佳的具體實例中，第法加以精製。.在-項 步驟換步驟接在第一離子交換 換介〜A 〜驟中抗體經裝载並且與第二種離子交 趟貝〜’且以農载緩衝液之外的其他緩衝液，用增加 :及/或PH的方法進行溶離，溶離出基本 集抗體。「美太卜,, 非1 ,θ . _ "」在本說明書上下文中意指少於5%。較 二—離子交換劑是一種單獨或與先前章節說明過的且 肢貫例組合的陽離子交換劑。這種蛋白質“見和性色層； 析步驟接著第一離子交換和第二離子交換步驟的組合是新 顆的二吾人已詳知來自細胞培養肉汁的大多數微量污染物 蛋白貝具有較抗體尤其1 IgG抗體遠為低的W值；因此陽 離子:換旎有效率的移除聚集的抗體和可能的傳染性試劑 ^病毒的蛋白殼以及抗體以外的蛋白質污染物。因為快速 ，作’在裝載、結合和從管柱溶離之後高度有效率的抗體 口收以及尚的裝载容量，其亦容許用單一批抗體進行重複 21 1325428 的猶環操# _ , 卞作，而對於用單回結合 有加成的作田^ /谷離所達成的純化係數 ㈣作用。較佳是裝載緩衝液 是PH4. 〇1到6 、力為PH4到7，更佳 b最佳疋PH4. 02到5 ς * 〇. 1至1 2Μ臨从《 』5。更佳是使用範圍從 鹽的鹽梯度將該抗體 出來，其中哕gi γ β 知離子交換劑中出溶離 Τ 4鹽較佳是一種鹼金眉踏s 或鈉鹽。較佳β/ 现更佳疋一種經、鉀 几 疋在邱7到8進行溶離以使聚隼物福…畀士 化和使因酸性條件造成的抗吏承集物移除最大 溶離在“"的酸性ΡΗ進行，更佳?:。:視需要較佳是 物蛋…的移除最大化，由此方二到6以使污染 ά ^ ^ ± 1 方式可達到至低如<0 4紊 镟克/¾克抗體的濃度。此第_ U.4毫 # ^ ^ ^ 弟—％離子交換劑的步驟勝過 =的：，而容許高容量和對離子交換劑而言典型的 的二Γ子交換劑能支持1〇,毫克抗體7毫升樹脂 的裝載里。在一項尤佳的具體 只丨7』τ ’在蛋白質A色層公 析法之後的第一陰離子交換劑 u π女、土姑〃曰， 第一 ％離子父換劑步驟的 純化方法使传到未經過進—步最終大小篩除色 (SEC)步驟處理的臨床等級抗 B ^ 將抗體聚集物及/或抗體…:=步驟需具備適用於 胆蛋白貝A複合物與單體的抗體如 一般的I gG分離之分子量切分點。 -般而5 ’本發明的方法不能使用於被抗蛋白質A所 帶抗原決定基所培養出的抗體。此種抗體是被放辛 管這對熟習本技藝者而言是-項顯然可見的限制：、★ 本發明方法之最為吸引人之特色在於經由陰離子交換 劑以非結合性或直接流經的方式純化抗體’管柱的容旦」 全不會限制物質的流出量，該容量只對少量污染物蛋= 22 Α的保留具有決定性。這樣節省了許多加χ時間和材料資 源而容許非常有效率的移除蛋白質Α污染物。 【實施方式】 實驗
1.蛋白質A ELISA 午夕種蛋白質A或重組蛋白質A的ELISA業已被說明 過（請參4 US 4983722和在其中所說明的參考文獻）。對於 說月的所有研究而言，吾人使用—種簡單的三明治 ELISA. ’其捕捉用的抗蛋白質A抗體被塗覆在平底的％孔 微滴盤（NUnC TM)中，其能保有蛋白質A。然後使用-種與 生物素連接的抗蛋白f A _用抗體_結合的蛋白質A ’其容許進—步與鏈狀抗生物素蛋白（办eptavidirO連接 的辣根過氧化（Amersham#RPN 1231)結合。用於捕捉的市 售抗蛋白質A兔子抗體(對抗天然金黃色葡萄糖菌蛋白質A 所=月的）係購自Sigma_Aldrich公司（#卜3775卜本研究 通貫前後就是使用這種抗體。偵測用的兔子抗體同樣是從 Sigrna-Aldrich公司購得的（#p_3775)。以非專一性吸附過 :包覆蛋白質之後’用包覆過的蛋白質來保留住對於蛋白 質A具有專一性的蛋白w a捕捉用抗體，進一步用生物素 :合的兔子抗蛋白f A和鏈狀抗生物素蛋白_辣根過氧化 酶伯測該捕捉用抗體。四甲基聯苯胺被用做產生顏色的受 質。未知濃度的試樣是用待偵測污染物蛋白質A之最原= 蛋白質A或蛋白質衍生物所製作的標準曲線來讀取其濃产 。在酸性pH值進行包覆和正確製備標準物的重要性已被 23 1325428 證明。尤其是對於修改使其攜帶其他的半胱胺酸殘基的重 組蛋白質A例如Streamllne蛋白質AT„(Amersham
Biosciences公司，先前為Pharmacia公司），吾人發現標 準溶液需要預先用具還原性的巯基用劑處理以確保蛋白質 標準溶液的單體狀態。 相反的，野生型蛋白質A標準物可購自數家公司，例 如 Sigma-Aldrich 公司 /瑞典（朴6〇31)或 pharmacia(#i7 — 0770-01 )並且不需要此種預先處理。對於以下說明之觀察 得自Streamline η基質之污染物蛋白質A漏失的實驗而言 ’吾人使用得自製造商的未連接重組蛋白f A試樣做為標 準物。 1_1飽含半胱胺酸的蛋白質A標準物之預先處理 存在於Streamline tm蛋白質A親和性色層分析法 (Amersham Bi〇Sciences公司）的管柱材料中銷售之純的重 組蛋白質A-Cys是以冷凍乾燥的形式從
Pharmacia/Amersham Biosciences 公司購得的。把高達 2〇 毫克/毫升蛋白質溶解在含有〇· 5M NaC1、lmM EDTa和 20mM二硫赤藻糖醇的〇· 1M Tris pH 8中，在室溫下培育 15-30分鐘並且用可拋棄式pD_1〇膠體過濾管柱（Amersham Biosciences公司）去鹽。在包覆之前用於處理標準溶液的 所有緩衝液應先用心處理以防止硫醇基團被氧化。蛋白質 標準物的處理最佳是緊接在使用該標準物包覆微滴盤之前 進行。視需要製備1毫克/毫升的貯備溶液並保持在-6 的冷來庫中；解凍之後，從裝載到非還原性SDS-PAGE的一 24 1325428 小部份檢驗蛋白質的單體特徵。蛋白質標準物的濃度是藉 -由Bradf〇rd檢驗（Bradford等人，1976年，《分析生物化 學》’第 72 期：第 248_254 頁；splittgerber 等人， I989年，《分析生物化學》，第179期：第198_2〇1頁） 以及藉由自動化胺基酸分析測定的。此種預先處理的結果 顯不在圖1之中，利用非還原性1〇%SDS_pAGE做為葡萄球 囷蛋白質A標準物（第1欄：天然蛋白質A ;第2攔：在預 先處理之後）和純的未經偶合的Sfreami ine tm重組蛋白質 A(由 Pharmacia 公司提供，現在是 Amersham Biosciences 籲 公司；第4攔：天然的重組蛋白質a ;第5攔：在預先處 理之後）。第1攔是分子量的標記物，具有,對應的分子質 量標註在縱軸上。得自Pharmacia公司之具有多一個Cys 殘基的重組蛋白質A在還原之後偏移到低分子量；在大約 34kD處保留一個單體的條帶並且更為密集，顯然是從二硫 · 化物橋接的二聚體分離所產生的。 .
1.2 ELISA "·1試樣的製備 · 藉由兩個稀釋步驟，i:製備1毫克/毫升蛋白質Α標準 貯備溶液的200.000倍稀釋液，以提供5〇毫微克/毫升高 標準物1此’製備出㈣〇·2亳微克/毫升的稀釋液以檢 驗標準曲線。而且，將標準物的稀釋液〔「添加溶液」 ^Piking s〇lution)〕用於添加到待試驗的兩個複製產物 试樣以排除試樣中干擾物質的存在。 對於最後的產物試樣試驗而言，把每一試樣分成兩份 25 丄y厶厶ο ，或的^00微升體積。一份用1 000毫微克/毫升添加溶液 質H右適當則使用1〇微克/毫升溶液，以使最終的蛋白 /量為10毫微克蛋白質Α/每毫克抗體。把另外—半 ϋ同樣體積的試樣緩衝液；從*說明因為添加所造 婉產物4樣之稀釋因子。以下把兩種型式的製備物稱為「 二加的《樣」。試樣緩衝液是由7.51公克甘胺酸(驗性） 一 &克NaC1、0. 5毫升Triton Χ-100加去離子水哎 二次蒸餘水達體積1公升製備的。 〆 為了達到最佳正確性的測量，因此用本技藝中以熟知 —LISA法預先測定試樣中的抗體濃度。還有—項標 :液則添加等量已知標準抗體，該抗體之固定區域對蛋白 貝A有可相比的親和力，以便測定酸化步驟的效率，並且 解開本檢驗中任何由於h 7由於抗體結合而使蛋白f A免於被捕捉 所V致的潛在系統誤差。 酸化作用.肖45〇微升經添加的試樣或標準物添加 200微升0.2M檸檬酸鹽/G G5%Trit〇nX_i()Q缓衝液 。對所有的試樣進行三重複製。進而準備試樣的稀釋液並 進行三次重複試驗，因兔枯 因為忒檢驗以1毫克/亳升和0.2毫安 /毫升範圍的抗體濃度作用最佳。在本檢驗中酸化 重要，該:乍用是為了釋放污染物蛋白質…片段，否則 匕們會與试樣溶液中過量的抗體結合。 1.2.2用抗趙包覆微滴盤 用L59公克/公升Na2C03, 2.93公克/公升NaHC〇3和 〇_ 20公克/公升疊氮化鈉製作包覆用緩衝液。將緩衝液的 26 1325428 pH調整到pH9. 6。每孔添加1 〇〇微升的抗體溶液，該溶液 包含充分而不會對蛋白質A標準物顯示出飽和的抗體量。 用塑膠膜把微滴盤蓋住’放在溼度箱中。在37%過夜培育 大約18小時。用至少300微升的沖洗緩衝液[NaC15 8公 克 / 公升 ’ Na2HP041.15 公克 / 公升 ’ NaH2P04. H20 0.26 公 克/公升，EDTA 3.7公克/公升，Tween_2〇 〇·2公克/公升 ，丁醇1 0毫升/公升，pH 7. 2 ]沖洗所有的孔槽三次，輕拍 乾燥（tap dry )。對每孔添加250微升阻滯緩衝液[包覆 用缓衝液加上0.5%酷蛋白hammarsten]並且在常溫下於桌 上型軌道振盪态（速度為12 〇rpm )上培育2小時。用至少 300微升的沖洗緩衝液沖洗所有孔槽三次，並予輕拍乾燥 1 · 2. 3试樣的培育與偵測 將標準物與試樣（包含任何經添加的試樣）以丨〇 〇微升/ 每孔加入盤中。用塑膠膜把微滴盤蓋住，纟常溫下於桌上 型軌道振盪器上培育9G分鐘。重複沖洗。用至少_微升 的沖洗緩衝液沖洗所有的孔槽三次，輕拍乾燥。以先前所 測得的最佳稀釋濃度稀釋生物素連接的兔子抗__蛋白質A。 每孔添加1〇〇微升，用塑夥膜把微滴盤蓋住’在常溫下於 軌道振盪器上培育90分鐘。重複沖洗。 以先前所測得的畏#接_ 、曲 ]敢佳稀釋 >辰度用連接用緩衝液 [Na2HP04l. 15 公克/公并，ΜίΐΓ1 c 、 A 升 NaC15.84 公克/公升，NaH2P〇4 • ¥ 〇.26公克/公升’ EDT".73公克/公升，Trit〇n [ 1〇〇 〇·〇5%(ν/ν)’ pH 7 2]稀釋鏈狀抗生物素蛋白—辣根過 27 1325428 氧化酶。·％孔添加100微升，用塑膠膜把微滴盤蓋住，在 常溫下於桌上型軌道振盪器上培育分鐘。重複沖洗。 添加1〇〇微升新鮮配置的四甲基聯苯胺（TMB，丨cn產品編 號#980502)受質溶液。該受f溶液的製備像這樣：將1〇毫 克TMB溶解在i毫升DMS〇中以製備貯備溶液。把1〇微升
這樣的貯備溶液和10微升1〇2添加到2.05%(w/w)乙酸.鈉 水溶液中，而該乙酸鈉水溶液係以〇 . 5M檸檬酸將邱調整 到6· 0。不用說所有用於製備該檢驗試劑的水都是最高品 質的，也就是去離子的超純水或至少是二次蒸餾水。 將受質溶液在常溫下於振盪器上培育8_u分鐘。藉由 添加50微升/每孔的終止溶液〔13%H2S〇4〕使反應終止。 在添加該終止溶液之後10分鐘以内，在一個平盤讀取式 分光光度計下測定孔槽在45 0nm波長下的吸光值。 此種ELISA的偵測限制是0·2毫微克/毫升蛋白質a 工作酿0.2到50毫微克/毫升。檢驗之間的差異性 於10%。 〆、
圖2顯示從使用以硫醚鍵單點連接蛋白質A
StreamlineTM重組蛋白質A色層公格κ 9刀析法付到的抗體溶離 中漏失的重組蛋白質A濃度。該循頊々童 傾％-人數係指在以1M氯 鈉溶離和再平衡之後重複使用。雖然得自融合瘤細胞诗 物的細胞培養肉汁之漏失典型上是在5〇〇ppm的大小 其他細胞型式卻產生高達iOOOppm的濃度。得自不同= 基質的漏失之比例的總覽請見表]•洛思八』 1，色層分析法是根擄 造商的指引進行的。 28 1325428 表1 基質 供應商 偶合化學 典型的漏失 p. p. m. 工作容量 (毫克/毫升） 流速 (公分/小時） 天然蛋白質A Sepharose 4FF Amersham- Biosciences 多點連接的 CNBr 10-20 5-20 30-300 rmp蛋白質A Sepharose Amersham- Biosciences 多點連接的 10-20 5-20 30-300 Poros A高容 量 Applied Biosystems 多點連接的 10-50 10 500-1000 蛋白質A ceramic Hyper D Biosepra 多點連接的 高達300 10-20 200-500 r蛋白質A Sepharose Amersham- Biosciences 單點連接的硫 酸鍵結 50-1000 20-40 30-300 MabSelect Amersham- Biosciences 單點連接的硫 酿鍵結 50-1000 20-40 500 STREAMLINE r 蛋白質A Amersham- Biosciences 單點連接的硫 驗鍵結 50-1000 20-40 200-400 圖3進一步提供在重複使用相同親和性基質材料的蛋 白質A親和性色層分析法期間，污染物蛋白質A無實質上 地降低漏失的數據：野生型蛋白質 A多點連接的 Sepharose 4FF (Amersham-Biosciences 公司）如以下 2. 1 章節所說明的被重複使用，並且在溶離液被進一步加工之 前，溶離液中的污染物蛋白質A的濃度是用以上說明的 ELISA測定的。 2.蛋白質A和Sepharose Q色層分析法 29 1325428 2·1用Streamline7«進行蛋白質A親和性色層分析法 將得自NSO骨髓瘤細胞培養物的細胞培養物懸浮液用 離心法粗略純化並且深入過濾並以超過濾法予以濃縮；超 過濾法也被用在把培養液交換成PBS ρΗ7· 5 ◊細胞所產生 的抗體#5的效價是0.2毫克/毫升，將總共i公升緩衝液 交換過的懸浮物裝載上去。單株抗體#5的pI是85。蛋白 質A StreamlineTM管柱（體積5〇毫升）先用十支管柱體積 的50mM甘胺酸/甘胺酸鹽，ρΗ 8·8，4·3Μ NaC1予以平衡 ;流速為200公分/小時。對裝載而言，管柱是以5〇公分/ 小時的流速操作的；裝載容量大約為2〇毫克/毫升基質材 料。在溶離之前，將管柱用至少十支管柱體積補充以另外 200mMNaCl和0· l%Tween-20之甘胺酸平衡緩衝液沖洗。溶 離是以0·1Μ甘胺酸/HC1 pH4. 0緩衝液組成的溶離緩衝液 來達成的。緊接在溶離之後，把包含抗體尖峰的溶離液部 分收集物用充足份量的〇· 5MTrisHCl ρΗ7· 5予以中和，並 且用Amicon的透析過濾（diafiltrati〇n)設備進行緩衝液 乂換，使用本發明的裝載用/平衡用緩衝液（丨〇mM Tr i s/HCi pH 8. 0，50mM NaCl )以俾緊接的離子交換劑步驟，預防 更長時間的接觸酸性pH。 抗體濃度與污染物蛋白質A的濃度是用以上說明的方 法測定的。溶離液中污染物蛋白質A的濃度在透析過濾之 月’J達1434 *微克/毫克抗體，而在透析過濾後達165〇毫微 克/宅克抗體。根據緩衝液交換的上澄液的效價之抗體回 收率在裝載前是81%，而在透析過濾溶液中的抗體濃度則 30 1325428 是3. 6毫克/毫升。 乂非結。性方式進行Q-Sepharose FF陰離子交 換步驟 把灰帛2. 1章節純化的抗體進一步如以下說明加工： 將根 5.0 毫升的 Q-Sepharose FF 管柱（Amersham- 用10毫升G.1M罐，接著用兩支管柱體積 的 0.1M Tris όΗ8 ;鱼上士
ρ训進仃充填，並且以十支管柱體積的i〇mM
Tns PH8/5W NaCl以流速75公分/小時平衡之。平衡之 後把抓速降低成5〇公分/小時。把6毫升透析過遽的抗 體溶液裝載到管柱上並且收集直接流出物以供進一步加工 ;繼續收集流出物，直到在用起初的6毫升裝載管柱並在 其後持續使I純的裝載或平衡緩衝液lGmM Tris pH8 〇, 5〇mMNaC1’在波長所監測到之流出物吸光值回到 基底線為止。流出物中回收到的總抗體量是Μ毫克抗體 (87%)。；亏染物蛋白f “農度的測定得到<3毫微克/毫克抗 體。 進-步用膠體過遽法（大小篩除色層分析法）對這種q_ Sepharose純化的批次抗體，使用Sephacryi s_3〇〇在 10_磷酸鹽PH7‘〇, 14〇mM NaCl緩衝液，以流速1〇公分/ 小時用15 $克抗體/每毫升凝膠的裝載比率進行加工Λ，刀結 果發現基本上並未再對這種微量蛋白質Α污染物的濃度= 實質上的改變。藉著經驗，SEC可用於進一步將大約 1 00毫微克/毫克濃度之污染物蛋白質A降低到大約1_5毫 微克/毫克。因此，SEC對於微量蛋白質A具有非常低的純 31 1325428 的親和力作用 工使得抗體蛋 載的抗體量做 化係數，這或許解釋了抗體與污染物A之間 。然而，由於試樣無可避免的稀釋與緩慢加 白質發生相同的衰敗’因此SEC只能對所裝 7議回收。這意味著儘管SEC需要許多時間，但卻無可避 免的造成物質的損失。 Q-Sepharose管柱乃藉著在2M NaC1中分別溶離和進 一步如以上說明予以平衡進行再循環使用。 r、 3.用隨後的陽離子交換步驟進行蛋白質A和 Sepharose Q純化 卜 使用Q-Sephar〇se陰離子交換 在進一步的實驗當中 以非結合性方式從實驗2· 2純化的抗體。：以另一最終的 SEC純化步驟取代試驗，將Sephar〇se Q管柱中的流出物 所收獲的抗體用第二陽離子交換步驟以購自 Biosciences 公司的 SP-Sephar〇se FF(sp =磺酸基丙基）基 質處理。SP-Sepharose FF容許100公分/小時的流速，而 在裝载、沖洗和將抗體從陽離子交換劑上溶離下來之後具 有93%抗體之可複現產率。對裝載而言，將化灿打的/' 純化步驟之後得到的抗體溶液的pH用50mM乙酸鹽緩衝液 ρΗ4· 5予以！周整為ρΗ4· 5-5. 0。裝載容量被設定在^ 的裝載導電性下使用1〇毫克/毫升基質材料❶進一步使用 50mM乙酸鹽緩衝液將之沖洗到基底線。用5〇mM乙酸鈉 邱15，1M NaCl高鹽緩衝液溶離抗體，單體型式的抗體先 被溶離出，而聚集物常常是在末尾的部分收集物中以高離 子強度，谷離出來。在唧筒推送到管柱之前於溶離緩衝液中 32 1325428 使用較不陡直的鹽梯度來實施鹽梯度是同樣可行的；直接 使用高鹽度緩衝液會得到較未被稀釋的抗體和結果更為精 確的取樣以及在酸溶液中較短的駐留時間。在溶離之後， 迅速用PBS ρΗ7· 5交換酸性緩衝液。在匯集的溶離液中污 染物蛋白質Α的濃度係以<〇. 4毫微克/毫克抗體測定，藉 由以大小排除之HPLC方法顯示出抗體有>99%是單體。 4. 用慣常製造的多點連接蛋白質a進行StreamlineTM 蛋白質A親和性色層分析法 迠種多點連接Stream 1 ineTM蛋白質A親和性基質是慣 常製造且由Pharmacia Biotech公司（現為Amersham-
Pharmacia公司）供應的。其乃由製造商將末端具有Cys殘 基之相同的34kD Stre.amlineTM型重組蛋白質A偶合到相同 的Sepharose基質材料上，但是使用傳統的⑶計化學進行 活化和偶合而不用環氧化物調節的活化作用和僅將_sh基 團偶合的選擇性反應條件來製造的（請參考製造商的產品 資訊）。重複實驗2.1的方法並且用353毫微克/毫克抗體 測定污染物蛋白質A的濃度。這意味著偶合的方式部分地 解釋何以來自高容量、輩戥；鱼# 一 令里早點連接的重組蛋白質a親和性基 貞之资白質漏失增加；^ ii: E tte / <- 凡正長度的野生型蛋白質A相比 ，導入此種重組蛋白皙A少 負A之私基酸序列的修飾對於增加的 蛋白質漏失也有相當大的影響。 5. 方法的平行比較：與密勒氏法（Miles Method, US 4, 983, 722)比較 在，勒氏的專利幸（第4 7〇〇 弟4, 983, 722號）請求：使用結合的 33 1325428 DEAE Sepharose作為第二色層分析法步驟而用鹽梯戶 (0.025M到0.25M NaCl)進行溶離可降低溶離液中漏失的= 白質A含量到少於15毫微克/毫克抗體(蛋白質A的範圍θ 〇. 9到1 4毫微克/毫克抗體）。 疋 表2 : 溶 在單-或多點連接的蛋白質Α親和性基質上純化的6Μ抗體的 離液試樣中蛋白質A的殘留物比較 基質 r蛋白質 A Spharose (單點連接的） rmp蛋白質A / Sepharose (多點連接的） 天然蛋白質A Sepharose (多點連接的） 試樣 蛋白質A溶離液 蛋白質A溶離液 蛋白質A的濃度 (毫微克/毫支k 20.2 2.16 以二貝1«的目標是要確認這些利用1 at (新的單 點連接之r蛋白f A基質）與較低Pi的抗體（ΡΙ 6.5-7·5) 的結果，並且直接比較非結合性的Q_Sephar〇se法（利用不 同的平衡/裝載緩衝液)與密勒氏專利案之方法。 應用的方法 6A1 抗體c、 • 〔 5)的純化包括兩個色層分析的步驟 其包含 MabSelect 蛋白質A步驟，接著Q-Sepharose陰 離子交換色層分析法Γ (非、、。合性），或是 DEAE Sepharose 色 曰分析法（結合的）步^。i 。请參考 L〇 90 07 和 L0 9375。 34 1325428
MabSelect蛋白質A色層分 管柱基質MabSlect重組蛋白質A(單點連接的rpA) 管柱規格 1. 6公分内徑xl5公分基床高度 管柱體積 30毫升 操作流速 500公分/小時（16_ 80毫升/分鐘） 清潔 6M鹽酸胍(2支管柱體積） 裝載容量 35毫克/毫升基質 平衡 50mM甘胺酸/甘胺酸鹽pH8. 0/250mM NaCl(8支管柱體積） 裝載後沖洗50mM甘胺酸/甘胺酸鹽pH8.0/250mM NaCl(8支管柱體積） 溶離缓衝液l〇〇mM甘胺酸pH 3. 50 (6支管柱體積） 沖洗 lOOmM檸檬酸pH 2.1 (2支管柱體積） 把含有6A1抗體的培養物上澄液用MabSelect管柱（3〇 毫升）純化，該管柱連接到一個AKTA FPLC系統。所使用的 條件說明在以上的表中。用0 · 1Μ甘胺酸pH3· 5把抗體溶離 出來。溶離之後，把溶離液的pH調整到ρΗ7· 0，然後把溶 離液的試樣分成五個小部份；然後將每一小部份透析過濾 到用於陰離子交換色層分析法的不同的緩衝液中。 將第一小部份透析過爐到50mM TrisHCl ’ pH8/75mM NaCl之中以供第一輪的Q-Sepharose色層分析法。將第二 個小部份透析過遽到50mM TrisHCl，pH8/lOOmM NaCl之中 以供第二輪的Q-Sepharose色層分析法。將第三個小部份 透析過濾到20mM磷酸鈉，pH6. 5/80mM NaCl之中以供第三 輪的Q-Sepharose色層分析法。將第四和苐五小部份以緩 衝液交換成25mM TrisHCl，pH8.0/25mM NaCl以供評估說 35 1325428 明在密勒氏專利案中的結合的DEAE Sepharose法β > 弟四 和第五輪之間的差異在於第四輪的主要尖峰被收集成—個 部分收集物且在分析之前經透析過濾到標準的磷酸鹽緩衝 鹽溶液中’而第五輪中溶離尖峰被部分收集並且經過透析 到如密勒氏專利案之說明所製備的磷酸鹽緩衝液之中。 該五輪管柱之每一者的條件說明如下： fcgepharose色層分柄法：竿一始 管柱基質 Q_Sepharose Fast Flow 官柱規格 1. 6公分内徑χ8公分基床高度 管柱體積 16毫升 管柱製備 以150公分/小時在〇. 1Μ氫氧化鈉中裝填 操作流速 1〇〇公分/小時(3. 35毫升/分鐘） 清潔 〇·1Μ氫氧化鈉(2支管柱體積） 裝載容量 15毫克/毫升基質 平衡 50mM TrisHCl pH8. 0/75mM NaCl(8支管柱體積） 裝載後沖洗 50mM TrisHCl pH8. 0/75mM NaCl(5支管检體積） 剝離用緩衝液2M氯化鈉（2支管柱體積） 冲洗 〇. 1M氫氧化納（2支管柱體積）
Qzg印harose色屠分析法：第二輪 管柱基質 Q-Sepharose Fast Flow 管柱規格 1. 6公分内徑χ8公分基床高度 管柱體積 16毫升 管柱製備 以150公分/小時在0· 1Μ氫氧化鈉中裝填 操作流速 100公分/小時(3. 35毫升/分鐘） 36 1325428 清潔 〇. 1M氫氧化鈉（2支管柱體積） 裝載容量 7.5毫克/毫^基質 平衡 SOmM TrisHCl pH8,0/lOOmM NaCl(8支管板錯積) 裝載後沖洗 5(kM TrisHCl pH8.0/100mM NaCl(5支管杜體積) 剝離用緩衝液2M氣化鈉(2支管柱體積） 沖洗 〇· 1M氫氧化鈉（2支管柱體積） Q-Sepharose色層分析法：笫三輪 管柱基質 Q-Sepharose Fast Flow 管柱規格 1. 6公分内徑χ8公分基床高度 管柱體積 16毫升 ® 管柱製備 以150公分/小時在0.1Μ氫氧化鈉中裝填 操作流速 100公分/小時(3. 35毫升/分鐘） 清潔 0.1Μ氫氧化鈉（2支管柱體積） 裝載容量 7. 5毫克/毫升基質 平衡 20mM磷酸納 pH6. 5/80mM MaCl 裝載後沖洗 20mM填酸鈉pH6. 5/80mM MaCl(5支管杈體積） 剝離用緩衝液2M氯化鈉（2支管柱體積） 沖洗 0.1M氫氧化鈉（2支管柱體積） 盡 述AE-Sepharose :第四輪 管 4主基質 DEAE-Sepharose 管柱規格 管柱體積 管杈製備 操作流速 1. 6公分内徑x8公分基床高度 16毫升 以150公分/小時在平衡緩衝液中裝填 100公分/小時（3. 35¾升/分鐘） 37 1325428 清潔 〇. 1M氫氧化鈉(2支管柱體積） ^ 裝載容量 7. 5毫克/毫升基質 平衡 25mM TrisHa，pH8· 6/25mM NaCl(8支管柱體積） 裝載後沖洗 25mM TrisHCl，pH8. 6/25mM NaCl(5支管柱體積） 溶離用緩衝液 25m MTrisHCl ’ pH8.6/25mM NaCl到25mM Tris HC1， pH8.6/250mM NaCl(10支管柱體積） 沖洗 2M氣化鈉（2支管柱體積） 連AE-Seuharose結合方法：第五輪（密勒氏法) · 管柱基質 DEAE-Sepharose f柱規格 1. 6公分内徑χ8公分基床高度 管柱體積 16毫升 管柱製備 以150公分/小時在平衡緩衝液中裝填 操作流速 100公分/小時(3· 35毫升/分鐘） 清潔 〇. 1Μ氫氧化鈉（2支管柱體積） 裝載容量 7. 5毫克/毫升基質 · 平衡 25mM TrisHCl，pH8. 6/25mM NaCl(8支管柱體積） · 裝載後沖洗25mM TrisHCl，pH8. 6/25mM NaCl(5支管柱體積） 溶離用緩衝液 25mM Tris HC1，pH8.6/25mM NaCl到25mM Tris HC1， pH8.6/250mM NaCl(10支管柱體積） 沖洗 2M氣化鈉（2支管柱體積） 在本研究中所使用之不同緩衝液的性質顯示於表3之中。 從五輪離子交換所產生的溶離液試樣以rPA ELISA檢 知·蛋白質A的濃度。結果顯示於表4之中。 38 1325428 表3 : 本研究中所使用的緩衝液 平衡 輪次 導電性 樹脂 pH 緩衝液 (ms/cm) 50mMTrisHCl » 1 10.74 Q-Sepharose 8.00 pH8. 0/75mM NaCl (非結合性） 50mMTrisHCl ， 2 12. 85 Q-Sepharose 8.01 pH8. O/lOOmM NaCl (非結合性） 20mM構酸鈉， 3 10.20 Q-Sepharose 6. 50 pH6. 5/80mM NaCl (非結合性） 25mMTrisHCl > 4/5 3.35 DEAE-Sepharose 8.60 pH8. 6/25mM NaCl (結合性） 25mMTrisHCl ， 4/5 24. 54 DEAE-Sepharose 8.61 pH8. 6/250mM NaCl* (結合性） *梯度溶離緩衝液 收集跨過第五輪DEAE-Sepharose (密勒氏法）的溶離過程之 部分收集物，並且以r蛋白質A EL ISA分析；結果顯示在 表5之中。 表4 ·' r蛋白質A ELISA的結果 *其中CV’s係指管柱體積 試樣ID r蛋白質A的濃 度（毫微克/毫 克） 抗體濃度 (毫克/毫升） % 回收率 溶離體積 (CV，s)木 Q-Sepharose 溶 離液第一輪 <0.4 1.42 82 4.5 Q-Sepharose 溶 離液第二輪 2. 94 1.49 70 3.5 Q-Sepharose 溶 離液第三輪 0. 73 1.86 85 3.4 39 1325428 DEAE-Sepharose 溶離液匯集物 第四輪 (所有部分收集 换之匯集） 1.72 2.16 75 2.5 DEAE-Sepharose 溶離液匯集物（ 密勒氏法） 第五輪 (部分收集物2至 6之匯集） 1.55 1.83 73 3 表5 :在結合的DEAE-Sepharose分離作用期間（密勒氏法)所得到跨過溶離尖
峰的溶離部分收集物中r蛋白質A的濃度；第5輪 部分收集物 r蛋白質A的濃度 吸光值 編號 (毫微克/毫克） (A哪） 1 3. 33 0.018 2 0.4 0.108 3 0.4 0. 22 4 0.4 0.169 5 2.01 0.092 6 16.7 0. 042 7 6. 38 0016
對此種抗體（6A1 ; pI6. 5-7. 5)之最高的回收率（85%)與 最佳的r蛋白質A清除是在非結合條件下於Q-Sepharose 用20mM磷酸鈉，pH6.5/80mM NaCl缓衝液（即等同於第三 輪）得到的。第一輪也顯示佳的回收率（82%)與蛋白質A清 除，然而這一輪的溶離體積顯著高於吾人對於非結合法所 期望的；這種結果建議在此缓衝液系統中抗體在管柱中有 40 1325428 部分被阻滞。增加的NaCU農度（第二輪）造成較低的扩蛋白 h清除’因此在第三輪中所使用的緩衝液系統較適用於 此種抗體。吾人先前觀察到在第一 社弟輪使用的緩衝液系統較 適用於高pi的抗體，而用於第= 乐—輪的綾衝液系統尤其有 用於中，或微酸性的抗體。這些實驗是以相似的容量(7.5 毫克/宅升樹脂）進行的，吾人希贫· At夕 山 人希望施夠在更高的容量（>30 毫克/宅升）下使料種非結合方法。吾人期望這種非^ 方法除了陰離子交換膜的吸附劑（如—、·二
Intercept SartQbindQ)之㈣可應用於許多陰離子 交換劑例如Q-Hyper D。吾人亦期望ρ s A d望k種方法較諸密勒氏 法更適用於大規模生產，如可施用更高的容量等。 在第五輪的情形中（密勒氏法），觀察到^蛋白質 部分收集物跨過主要溶離尖峰， 衣b所不。因此需要小 心的將部分收集物匯集以確認良好清除掉^蛋白冑A。、士 會對回收率（73%)有影響，並且甚至在 貝。故 a从人Α 王仕此〖月形中並不能給予 妒非'纟。s法所得到的良好清除。因此對於密 Η觀察到有非常高的漏失’則對細胞系/抗體而錢難 Ξ=Γ清除和高的回收率(就如以單點連接基質常得 從第五輪得到的數據代表密勒氏專利案中說明的條件 〇 方法比較與所得數據的全覽顯示在以下的表6之中。 41 1325428 表6 抗體純化之不同階段的r蛋白質a濃度摘錄 NSO acc·到 Ex.S 培養物上澄液
r蛋白質 A Sepharose(130)
濃縮/透析過濾 (50mM Tris HCI/lOOmM NaCI ，pH8.00) (71.40) ψ 濃縮/透析過濾 (20mM填酸鈉/SOmMNaCl， pH6.50) (50.80)
(46.70)
陰離子交換DEAE(2.94) (50mMTrisHCl/100mMNaCl > PH8.00) 陰離子交換Q (0.73) (20mM 峨酸鈉/80mM NaCI -pH6.50) DEAE Sepharose(1.55) 密勒氏梯度溶離 (50mM TrisHCl/25mM NaCI，pH8.60到 25mM TrisHCl/250mM NaCI * pH8.60 非結合 非結合 結合 *所有實例均使用7,5毫克/毫升的交換劑裝載來進行或者15毫克/毫升的裝載容量：濃縮與透析過渡(50mM TrisHCl/75mM NaCI · pH8.00)及陰離子交換Q(<0.4)(50mM TrisHCl/75mM NaCI > pH8.00)
往：蛋白質A的濃度顯示在括弧中（毫微克/毫克）；請注意並不是所有的NSO選殖細胞系上澄液都會產生相似的蛋白質A污染 濃度。 42 1325428 6.高dI抗體的純化 利用蛋白質A親和性色層分析法（MabSelect-單點連接 的重組蛋白質A基質），接著用Q-Sepharose陰離子交換色 層分析法（在非結合條件下；用以移除微量污染物），接著 用SP-Sepharose陽離子交換色層分析法（在結合條件下； 用以移除聚集物）來純化高pl(pl 9. 0-9. 3)的抗體。 抗體X (pl>8. 00) φ
Mab Select 蛋白質A 濃縮/透析過濾 :
I Q-Sepharose色層分析法
I 濃縮/透析過濾 Φ
I SP-Sepharose色層分析法 實驗材料及方法
MabSelect蛋白質A色層分析法： 管柱基質 Mab Select重組蛋白質A(單點連接的rPA) 管柱規格 1. 6公分内徑χ15公分基床高度 43 1325428 管柱體積 30毫升 操作流速 500公分/小時(16.80毫升/分鐘） 清潔 6M鹽酸胍(2支管枉體積） 裝載容量 35毫克/毫升基質 平衡 50mM甘胺酸/甘胺酸鹽’ pH8.〇/250mM NaCl(8支管柱 體積） 裝載後沖洗 50mM甘胺酸/甘胺酸鹽，pH8.0/250mM NaCl(8支管柱 體積） 溶離缓衝液 100mM甘胺酸，ρΗ3· 50(6支管柱體積） 沖洗 100mM檸檬酸，，ρΗ2.1(2支管柱體積） 用連接在AKTA FPLC系統的MabSlect蛋白質A親和性 管柱（30毫升）純化含有高pi抗體的培養物上澄液。所使 用的條件如以上表中所說明。用〇. 甘胺酸，pH3. 5對抗 體進行溶離。在溶離之後，把溶離液保持在pH3. 69(不需 調整）經60分鐘（低pH病毒失活步驟），然後用2M的Tris 驗中和至pH8。對蛋白質a進行三個循環；產物的回收係 以A280nm測定並且每一循環列示在表7之中。 表7 : Mab Select蛋白質a管柱％回收率 循環編號 " —-- %回收率 I 81 2 81 3 80 在Mab Select蛋白質a色層分析法之後，將得自三個 循環之每一者的溶離液匯聚起來，並使用裝有1 〇kDa Millipore滤膜之Amicon公司的攪拌式細胞濃縮機以緩衝 1325428 液交換成25mM Tris pH8. 0(Q_Sepharose平衡緩衝液）。 Q-Sepharose色層分析法 管柱基質 Q-Sepharose Fast Flow 管柱規格 1. 6公分内徑χ15公分基床高度 管柱體積 30毫升 管柱製備 以225公分/小時在0.1Μ氫氧化鈉中裝填 操作流速 150公分/小時(5. 0毫升/分鐘） 清潔 0.1Μ氫氧化鈉（2支管柱體積） 裝載容量 40毫克/毫升基質 平衡 20mM Tris ρΗ8. 0(8支管柱體積） 裝載後沖洗 20mM Tris ρΗ8.0 (5支管柱體積） 剥離用緩衝液20mM Tris ρΗ8. 0 /2Μ氯化鈉（2支管柱體積） 沖洗 0. 1Μ氫氧化鈉（2支管柱體積） 將40毫升濃縮/透析過濾的MabSelect蛋白質Α溶離 液以40毫克/毫升的裝載容量裝載到Q-Sepharose管柱上 。該管柱以非結合方式操作並且收集含有抗體的未結合部 分收集物。此步驟的回收率藉由A280測得是69%。對於此 種抗體而言這要比在這些條件下所得到的回收率稍低，這 可能是由於在FPLC試樣唧筒中留存的體積而未精確的估算 裝載體積所致。 在Q-Sepharose色層分析法之後，未經結合的部分收 集物被濃縮到13. 98毫克/毫升，並且使用裝有10kDa M i 11 i pore濾膜之Ami con公司的攪拌式細胞濃縮機透析過 濾到 SP-Sepharose 平衡緩衝液中（25mM 乙酸鈉 45 1325428 pH5.0/25mM NaCl) 〇 SP-Sepharose色層分析法 官柱基質 Q_Sepharose Fast Flow 管柱規格 1· 6公分内徑xi'5公分基床高度 管柱體積 30毫升 管柱製備 以150公分/小時在〇. 1M氫氧化鈉中裝填 操作流速 公分/小時(3. 35毫升/分鐘） 清潔 〇. 氫氧化鈉（2支管柱體積） 裝載容量 10毫克/毫升基質 平衡 25mM乙酸鈉pH5. 00/25mM NaCl(8支管柱體積） 裝載後沖洗 25mM乙酸鈉pH5.00/25mM NaCl(6支管柱體積） 溶離 25mM乙酸鈉pH5.00/186mM NaCl(25支管柱體積） 剝離用緩衝液25mM乙酸鈉pH5. 00/2M NaCl(2支管柱體積） 沖洗 〇. 1M氫氧化鈉（2支管柱體積） 將24 4升緩衝液交換過的Q-Sepharose溶離液以10 毫克/毫升的裝載容量裝載到SP-Sepharose管柱上。該管 才主是以結合方式操作的；把溶離液收集成部分收集物。用 GP-HPLC分析跨過溶離過程的部分收集物以測定聚集物的 濃度結果’並將結果顯示在表8之中。收集每一色層分析 步驟之後的試樣，並且分析r蛋白質A的殘留物，結果呈 現在表9之中。 表8 :每一色層分析步驟之後的r蛋白質A ELISA結果 試樣ID r蛋白質A的濃度 抗體濃度 (毫微克/毫克） (毫克/毫升） 46 1325428
MabSelect蛋白質A溶 離液（在濃縮/透析過 濾之後） 2.64 46.7 Q-Sephar ose 溶離液 <4 8.10 SP-Sepharose 溶離液 匯集物FC1-16) <4 1.79 表9 : SP-Sepharose部分收集物的GP-HPLC分析 試樣ID %聚集物 吸光值(a280) SP溶離液匯集物F(l-3) 0.57 11.2 SP溶離液匯集物F(4-6) 1 1. 10 2.7 SP溶離液匯集物F(7-9) 2. 07 0.655 SP溶離液匯集物F(10-12) 2.12 0.351 SP溶離液匯集物FC13-15) 2.56 0.208 結論：在抗體尖峰的步驟溶離期間吾人觀察到聚集物之部 分收集物；請參考表4。將稍後溶離出的飽含聚集物之部 分收集物（位在溶離尖峰的尾端）與包含非聚集物的部分收 集物比較。尾端的部分收集物可從主要匯集物中省略掉以 獲得99%的單體匯集物並且仍具有高的回收率（>95%)。 47 1325428 部分收集跨過SP-Sepharose溶離尖.峰之聚集物以獲 得高Pi抗體
【圖示簡單說明】 圖1為非還原性SDS-PAGE所顯示之飽含半胱胺酸的蛋 白質A標準物之預先處理之結果。 圖2顯示從使用以硫醚鍵單點連接蛋白質a的 Streaml ineTM重組蛋白質 a耷厗公挤雀ί曰,, 貝Λ巳層刀析法付到的抗體溶離液 中漏失的重組蛋白質Α濃度。 圖3顯示在重複使用相同親和性基質材料的蛋白質a 親和性色層分析法期間，污达物备&哲 /可，丨、物蛋白貝A無實質上地降低 漏失的數據 48

Claims (1)

  1. 拾、申請專利範圍：@3月y 1. 一種純化抗體的^-* (λη. ύ 击其包括以下步 ⑷從細胞培養物收獲抗體； A親和性色層分析 法純化步驟（a)中所收 (b)用蛋白質 獲的抗體； (c) 在從該蛋白質 體後獲得包含蛋白質 (d) 在容許蛋白質 留在流出物中的條件 載到陰離子交換劑上 A親和性色層 > 析法溶離經結合的抗 A污染物的經純化抗體； A結合到_?交換劑且ϋ成抗體保 下將步驟（c)中所獲得的經純化抗體裝 (e) 在陰離子交換兩| $ . 之出物中收集步驟（d)中所獲得的 k體而巧杂物蛋白皙A总&人丄 如 質Α係結合到該陰離子交換劑，並 (f) 藉由將抗體裝載到為陽触工 秋巧马険離子父換劑的第二離子交換 月叫上、使抗體結合到第-離$ _·_ M t ' 弟一離子父換劑、並將抗體從第二離 父換劑溶離而進—步純化該抗體。 2·根據中請專利範圍第ι項的方法’特徵在於該容許 白質A結合到陰離子交換劑且造成抗體保留在流出物中 的條件包含使用具有置換鹽濃度·福且pH為6别的 袭載緩衝液。 3. 根據申請專利範圍第1或2項的方法，特徵在於該 蛋白質A是天然蛋白質A或重組蛋白質A。 4. 根據申請專利範圍第3項的方法，特徵在於該重組 蛋白質Α在該重組蛋白質厶之胺基酸序列之c端之最後 30個胺基酸中包含半胱胺酸且透過該半胱胺酸殘基之硫原 49 1325428 99年3月修正 A親和 子經由硫醚鍵作為結合之單一點連接到用於蛋白質 性色層分析法的色層分析擔體材料。 ，特徵在於該 聚集的抗體。 ’特徵在於該 5. 根據申請專利範圍第1或2項的方法 經純化的抗體是單體抗體且步驟（|>)允許除去 6. 根據申請專利範圍第丨或2項的方法 抗體具有至少7.5或更高的pI值。 特徵在於該 7.根據申請專利範圍第1或2項的方法 抗體是單株抗體。 項的方法，特徵在於該抗體暑 8.根據申請專利範圍第 是IgG抗體。 •很像甲請專利範圍第 将徵在於該IgG 抗體為嵌合的或CDR_移植的IgG抗體 10.根據申請專利範圍第8或 砂抗體在關於抗體之&冑分的方法’特徵在於該 邮卜賊之和邮”組群。 糸選自包含人類 Π·根據申請專利範圍第i或2項的 抗體是從哺乳動物細胞培養物收獲。、 ，待徵在於該 拾壹、圓式： 如次頁 50
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