JP2007525412A - プロテインaおよびイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製 - Google Patents
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Abstract
Description
1.プロテインA ELISA
プロテインAまたは組換え型のプロテインAの試験用の多数のELISAが記載されている(US 4983722および本明細書中に記載された参照文献を参照)。以下に記載れた全ての作業のために、平坦底の96穴マイクロタータプレート(NuncTM)上にコーティングされた捕捉用の抗プロテインA抗体がプロテインAを保持する、単純なサンドイッチ型のELISAを使用した。その後、結合したプロテインAを、ストレプトアビジンを抱合したホースラディッシュペルオキシダーゼを結合することができるビオチン化された抗プロテインA検出用抗体で検出した(Amersham ♯RPN 1231)。捕捉用の商業的に利用可能な抗プロテインAウサギ抗体(天然の黄色ブドウ球菌のプロテインAに対して産生された)がSigma-Aldrich (#P-3775)から入手可能である。この抗体はこの研究を通して使用された。検出用ウサギ抗体をSigma-Aldrich(#3775)から同様に購入した。非特異的吸着プロセスによってタンパク質をコーティングした後、コーティングされたタンパク質は、プロテインA−特異的なプロテインA捕捉用抗体を保持するために使用された。捕捉用抗体は、さらにビオチン化されたウサギ抗プロテインAおよびストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼで検出された。テトラメチルベンジンは、色素生産性物質として使用された。未知の濃度のサンプルは、検出を試みるプロテインAまたは汚染物質プロテインAのプロテインA誘導体そのものを使用する標準曲線に対して読取られる。酸性pHでのコーティングおよび標準溶液の適切な調製は重要である。特に、付加的なシステイン残基を有するように加工された組換え型のプロテインA、例えばStreamline protein ATM (Amersham Biosciences, formerly Pharmacia)については、標準溶液は、タンパク質標準溶液の単量体状態を保障するために、スルフヒドリル還元剤での前処理を必要とすることが解った。
StreamlineTMプロテインAアフィニティークロマトグラフィー(Amersham Biosciences)カラム材料中で商業的に使用されるような純粋な組換え型のプロテインA-Cysは、Pharmacia/Amersham Biosciencesから凍結乾燥状態で得られた。20mg/mlまでのタンパク質は、0.5M NaCl、1mM EDTAおよび20mMジチオエリスリトールを含む0.1MトリスpH8中に溶解され、15〜30分間室温でインキュベートされ、使い捨てのPD-10ゲルろ過カラム(Amersham Biosciences)で脱塩化された。コーティング前に標準溶液を操作するために使用される全てのバッファーは、チオール基の酸化を防止するためにN2で処理されるべきである。標準化されたタンパク質の調製は、マイクロタータプレートをコーティングする標準溶液の使用のできるだけ直前に行われた。任意的に、1mg/mlのストック溶液を調製し、冷凍庫中で-65℃に保持した。解凍後、プロテインAの単量体の特性が、非還元SDS-PAGE上にロードされたアリコットから検定された。標準化されたタンパク質の濃度は、ブラッドフォードアッセイ(Bradford et al., 1976, Anal.Biochem. 72:248-254 ; Splittgerber etal., 1989, Anal. Biochem. 179: 198-201)および自動化されたアミノ酸分析によって決定された。このような前処理の結果を、非還元10%SDS-PAGEによって図1中に示した。標準化されたブドウ球菌性のプロテインA(レーン1:天然のプロテインA;レーン2:前処理後)および純粋な未結合のStreamlineTM組換え型のプロテインA(Phamlacia、現在のAmersham-Bioscicnsesの好意によって提供された;レーン4:天然の組換え型のプロテインA;レーン5:前処理後)。レーン1は、相当する分子量が垂直軸上に表示されている分子量マーカーである。付加的なCys残基を有するPhamlaciaからの組換え型プロテインAは、還元後により低分子量にシフトする。約34kDでの単量体のバンドが保存され、かつより一層強くなっている。これがジスルフィド架橋ダイマーの解離に由来していることは明らかで
ある。
1.2.1 サンプルの調製
2つの希釈工程によって、1mg/mlプロテインA標準ストック溶液の1:200.000希釈溶液を調製し、50ng/mlの1番上の標準溶液を提供した。その後直ちに、0.2ng/mlまで低下させた希釈液を、標準曲線を検定するために調製した。さらに、この標準化(「スパイキング溶液」)の希釈液を、サンプル中の妨害物質の存在を排除するために、試験対象の二重の生成物サンプルのスパイキングのために使用した。
1.59g/L Na2CO3, 2.93g/L NaHC03および0.20g/Lアジ化ナトリウムからコーティングバッファーを調整した。バッファーのpHをpH9.6に調整した。ウェル当たり100μlの添加された抗体溶液は、標準化されたプロテインAが飽和状態を示さないように十分な量の抗体を含んでいる。プラスチックフィルムでプレートを覆い、湿潤容器中に置いた。37℃で終夜およそ18時間にわたってインキュベートした。全てのウェルを少なくとも300μlの洗浄バッファー[NaCl 5.8g/L,Na2HPO4 1.15 g/L, NaH2PO.H20 0.26g/L, EDTA 3.7g/L, Tween-20 0.2 g/L, ブタノール 10 ml/L, pH 7.2]で3回すすぎ、軽く叩いて乾燥させた。250μlブロッキングバッファー[0.5%カゼインハマルステンを含むコーティングバッファー]を各ウェルに加え、ベンチトップの回転振盪機(速度120rpm)上で外界温度で2時間にわたってインキュベートした。全てのウェルを少なくとも300μlの洗浄バッファーで3回すすぎ、軽く叩いて乾燥させた。
任意のスパイクされたサンプルを含む標準溶液およびサンプルを100μl/ウェルでプレートアウトした。プラスチックフィルムでプレートを覆い、ベンチトップの回転振盪機上で外界温度で90分間にわたってインキュベートした。全てのウェルを少なくとも300μlの洗浄バッファーで3回すすぎ、軽く叩いて乾燥させた。ビオチン化されたウサギ抗プロテインAを予め決定された最適な希釈率で希釈した。100μl/ウェルを加え、プレートをプラスチックフィルムで覆い、回転振盪機上で外界温度で90分間にわたってインキュベートした。すすぎを繰り返した。
2.1 StreamlineTMのプロテインAアフィニティークロマトグラフィー
NSOミエローマ細胞培養物からの細胞培養物上清を、遠心分離によって大ざっぱに精製し、深層ろ過を行い、限外ろ過によって濃縮した。限外ろ過を使用して培養液をpH7.5のPBSで交換した。細胞によって生成された抗体#5の力価は0.2mg/mlであり、1L バッファーで交換された上清の全てをロードした。モノクローナル抗体#5のpIは8.5であった。プロテインAStreamlineTMカラム(5.0ml 体積)を、50mMグリシン/グリシン酸塩pH 8.8, 4.3M NaClの10カラム体積で予め平衡化した。流速を200cm/hにした。ローディングのために、カラムを50cm/hの流速で操作した。ローディング容量は、約20mg/mlマトリックス材料であった。溶出を行う前に、カラムを追加の200mM NaClおよび0.1%Tween-20で補充されたグリシン平衡バッファーの少なくとも10カラム体積で洗浄した。溶出を0.1Mグリシン/HCl pH4.0バッファーで調製された溶出バッファーで達成した。
セクション2.1からの精製された抗体を上述したようにさらに処理した。5.0ml Q-セファロースFFカラム(Amersham-Biosciences)を10mlの0.1M NaOHでパックし、0.1M トリスpH8の2カラム体積によって追従され、10mMトリスpH8/50mM NaClの10カラム体積で、75cm/hの流速で平衡化した。平衡化の後、流速を50cm/hまで減速した。6mlのダイアフィルトレートされた抗体溶液をカラム上にロードし、貫流をさらなるプロセッシングのために収集した。前記最初の6mlでカラムをロードし、その後に純粋なローディングまたは平衡バッファー10mMトリスpH8, 50mM NaClで継続した後、280nmでモニターされた前記貫流の吸収がベースラインに戻るまで、前記貫流の収集を継続した。貫流中の抗体の合計の回収量は23mg抗体(87%)であった。汚染物質プロテインAのレベルの測定結果は<3ng/mg抗体であった。
さらなる実験において、Q-セファロース陰イオン交換による非結合モードで精製された例2.2からの抗体を使用した。さらなる最終SEC精製工程を試験する代わりに、セファロースQカラムの貫流中に収集された抗体を、Amersham-BiosciencesからのSP-セファロースFF(SP=スルホプロピル-)マトリックスでの第2の陽イオン交換工程にさらす。SP-セファロースFFは、100cm/hの流速で、ローディング、洗浄および陽イオン交換体からの抗体の溶出後に再現性のある93%抗体の収量を可能にした。ローディングのために、セファロースQ精製工程後に得られた抗体溶液のpHは、50mM酢酸塩バッファーpH4.5でpH4.5〜5.0に調整した。ローディング容量を10mg/mlのマトリックス材料で17mS/cmのローディング溶液の導電率にセットした。50mMの酢酸塩バッファーをベースラインまで洗浄するためにさらに使用した。50mMの酢酸ナトリウムpH4.5、1M NaCl高濃度の塩バッファーを抗体の溶出のために使用した。単量体の抗体が最初に溶出し、凝集塊が高イオン強度での最後の方の画分に溶出した。カラム上でポンピングする前の溶出液バッファー中の塩勾配の実行によるゆるやかな塩勾配の使用は、同等に可能である。高濃度の塩バッファーの直接的な適用は、あまり希釈されていない抗体を生じ、より正確なサンプリングおよび酸性溶液中でのより短時間の滞留を得る。溶出後、酸性バッファーをPBS pH7.5に素早く交換した。貯留された溶出液中の汚染物質プロテインAのレベルは、<0.4ng/mg抗体と測定され、抗体はサイズ排除HPLCによって>99%が単量体となることが示された。
この多点付着のStreamlineTMプロテインA親和性マトリックスを注文して製造した。Pharmacia Biotech (現在Amersham-Pharmacia)によって提供された。これは製造業者によって製造され、末端Cys残基を有する同じ34kD StreamlineTMタイプの組換え型プロテインAを、同じセファロースマトリックス材料に結合させることによって製造された。但し、エポキシド仲介活性および−SH基が単独で結合するための選択的反応条件の代わりに活性についての伝統的なCNBr化学現象を使用した(製造業者からの生成情報を参照)。例2.1の方法を繰り返し、汚染物質プロテインAのレベルは353ng/mg抗体と測定された。これは、前記結合の様式が高容量で単一点で付着した組換え型プロテインA親和性マトリックスからのタンパク質の漏出が増加することを部分的に明らかにすることを意味する。このような組換え型プロテインAに導入されたアミノ酸配列中の修飾は、完全長の野生型のプロテインAと比較したときに、増加したタンパク質の漏出量の大きな一因となる。
Miles特許(No:4,983,722)は、溶出のための塩勾配(0.025M〜0.25M NaCl)を伴う第2のクロマトグラフィー工程として使用される結合DEAEセファロースは、溶出液中のプロテインA含量を15ng/mg抗体未満(プロテインAの範囲は抗体当たり0.9〜14ng/mgであった)まで減少できることを主張している。
6A1抗体(pI 6.5〜7.5)の精製は、Q-セファロース陰イオン交換クロマトグラフィー(非結合)またはDEAEセファロースクロマトグラフィー(結合)工程によって追従されたMabSelectプロテインA工程からなる2つのクロマトグラフィー工程を含めた。
カラムマトリックス Mab Select 組換え型プロテインA(単一点で付着されたrPA)
カラム寸法 1.6cm 内径×15cm ベッド高さ
カラム容積 30mL
操作流速 500cm/hr(16.80mL/min)
洗浄液 6MグアニジンHCL(2カラム容積)
ローディング容量 35mg/mlマトリックス
平衡溶液 50mgグリシン/グリシン酸塩pH 8.0/250mM NaCL
(8カラム容積)
ローディング後の洗浄液 50mgグリシン/グリシン酸塩pH 8.0/250mM NaCL
(8カラム容積)
溶出バッファー 100mM グリシン pH 3.50(6カラム容積)
洗浄液 100mM クエン酸 pH 2.1(2カラム容積)
6A1抗体を含む細胞上清を、AKTA FPLCシステムに接続されたMabSelectカラム(30ml)上で精製した。使用された条件は上記の表に記載された通りである。抗体を0.1MグリシンpH3.5を使用して溶出した。溶出後、溶出液のpHをpH7.0に調整し、その後、溶出サンプルを5つのアリコットに分けた。その後、各アリコットを、陰イオン交換クロマトグラフィーのための異なるバッファーにダイアフィルトレートした。
Q−セファロースクロマトグラフィー:Run1
カラムマトリックス Q-Sepharose Fast Flow
カラム寸法 1.6cm 内径×8cm ベッド高さ
カラム容積 16mL
カラム調製 150cm/hrの0.1M水酸化ナトリウム中でパッキング
操作流速 100cm/hr(3.35mL/min)
洗浄液 0.1M水酸化ナトリウム(2カラム容積)
ローディング容量 15mg/mlマトリックス
平衡溶液 50mM トリスHCl pH 8.0/75mM NaCl(8カラム容積)
ローディング後の洗浄液 50mM トリスHCl pH 8.0/75mM NaCl(5カラム容積)
溶出バッファー 2M 塩化ナトリウム(2カラム容積)
洗浄液 0.1M 水酸化ナトリウム(2カラム容積)
Q−セファロースクロマトグラフィー:Run2
カラムマトリックス Q-Sepharose Fast Flow
カラム寸法 1.6cm 内径×8cm ベッド高さ
カラム容積 16mL
カラム調製 150cm/hrの0.1M水酸化ナトリウム中でパッキング
操作流速 100cm/hr(3.35mL/min)
洗浄液 0.1M水酸化ナトリウム(2カラム容積)
ローディング容量 7.5mg/mlマトリックス
平衡溶液 50mM トリスHCl pH 8.0/100mM NaCl(8カラム容積)
ローディング後の洗浄液 50mM トリスHCl pH 8.0/100mM NaCl(5カラム容積)
溶出バッファー 2M 塩化ナトリウム(2カラム容積)
洗浄液 0.1M 水酸化ナトリウム(2カラム容積)
Q−セファロースクロマトグラフィー:Run3
カラムマトリックス Q-Sepharose Fast Flow
カラム寸法 1.6cm 内径×8cm ベッド高さ
カラム容積 16mL
カラム調製 150cm/hrの0.1M水酸化ナトリウム中でパッキング
操作流速 100cm/hr(3.35mL/min)
洗浄液 0.1M水酸化ナトリウム(2カラム容積)
ローディング容量 7.5mg/mlマトリックス
平衡溶液 20mM トリスHCl pH 6.5/80mM NaCl
ローディング後の洗浄液 20mM トリスHCl pH 6.5/80mM NaCl
(5カラム容積)
溶出バッファー 2M 塩化ナトリウム(2カラム容積)
洗浄液 0.1M 水酸化ナトリウム(2カラム容積)
DEAEセファロース:Run4
カラムマトリックス DEAE Sepharose
カラム寸法 1.6cm 内径×8cm ベッド高さ
カラム容積 16mL
カラム調製 150cm/hrの平衡バッファー中でパッキング
操作流速 100cm/hr(3.35mL/min)
洗浄液 0.1M水酸化ナトリウム(2カラム容積)
ローディング容量 7.5mg/mlマトリックス
平衡溶液 25mM トリスHCl pH 8.6/25mM NaCl(8カラム容積)
ローディング後の洗浄液 25mM トリスHCl pH 8.6/25mM NaCl(5カラム容積)
溶出バッファー 25mM トリスHCl pH 8.6/25mM NaClから25mM トリスHCl pH 8.6/250mM NaClまで(10カラム容積)
洗浄液 2M 塩化ナトリウム(2カラム容積)
DEAEセファロース結合方法:Run5(Miles方法)
カラムマトリックス Q-Sepharose Fast Flow
カラム寸法 1.6cm 内径×8cm ベッド高さ
カラム容積 16mL
カラム調製 150cm/hrの平衡バッファー中でパッキング
操作流速 100cm/hr(3.35mL/min)
洗浄液 0.1M水酸化ナトリウム(2カラム容積)
ローディング容量 7.5mg/mlマトリックス
平衡溶液 25mM トリスHCl pH 8.0/25mM NaCl(8カラム容積)
ローディング後の洗浄液 25mM トリスHCl pH 8.0/25mM NaCl(5カラム容積)
溶出バッファー 25mM トリスHCl pH 8.6/25mM NaClから25mM トリスHCl pH 8.6/250mM NaClまで(10カラム容積)
洗浄液 2M 塩化ナトリウム(2カラム容積)
この研究において使用された異なるバッファーの性質を表3に示した。陰イオン交換クロマトグラフィー操作の各々の溶出結果を図2〜5に示した。
Q−セファロース陰イオン交換クロマトグラフィー(非結合条件下;微量な汚染物質の除去のために)、SP-セファロース陽イオン交換クロマトグラフィー(凝集塊の除去のための結合条件下)によって追従されたプロテインAアフィニティークロマトグラフィー(MabSelect-単一点で付着した組換え型のプロテインAマトリックス)を使用して高pI抗体(pI9.0〜9.3)を精製した。
MabSelect プロテインAクロマトグラフィー:
カラムマトリックス Mab Select組換え型プロテインA(単一点で付着されたrPA)
カラム寸法 1.6cm 内径×8cm ベッド高さ
カラム容積 30mL
操作流速 500cm/hr(16.80mL/min)
洗浄液 6M グアニジン HCL(2カラム容積)
ローディング容量 35mg/mlマトリックス
平衡溶液 50mgグリシン/グリシン酸塩pH 8.0/250mM NaCL
(8カラム容積)
ローディング後の洗浄液 50mgグリシン/グリシン酸塩pH 8.0/250mM NaCL
(8カラム容積)
溶出バッファー 100mM グリシン pH 3.50(6カラム容積)
洗浄液 100mM クエン酸 pH 2.1(2カラム容積)
高pI抗体を含む培養上清を、AKTA FPLCシステムに接続されたMabSelectプロテインAアフィニティーカラム(30ml)上で精製した。使用された条件は上記の表に記載された通りである。抗体を0.1MグリシンpH3.5を使用して溶出した。溶出後に、溶出液をpH3.69(必要とされる調整はない)で60分間(低pHウイルス不活性化工程)にわたって保持し、その後2Mトリス塩を使用してpH8まで中和した。プロテインA上で3サイクルを行った。生成物の回収率をA280nmによって決定し、各サイクルについて表7に示した。
カラムマトリックス Q-Sepharose Fast Flow
カラム寸法 1.6cm 内径×15cm ベッド高さ
カラム容積 30mL
カラム調製 225cm/hrの0.1M水酸化ナトリウム中でパッキング
操作流速 150cm/hr(5.0mL/min)
洗浄液 0.1M水酸化ナトリウム(2カラム容積)
ローディング容量 40mg/mlマトリックス
平衡溶液 20mM トリスpH 8.0(8カラム容積)
ローディング後の洗浄液 20mM トリスpH 8.0(5カラム容積)
溶出バッファー 20M トリスpH 8.0/2M NaCl(2カラム容積)
洗浄液 0.1M 水酸化ナトリウム(2カラム容積)
40mlの濃縮された/ダイアフィルトレーションされたMabSelectプロテインA溶出液を、40mg/mlマトリックスのローディング容量でQ−セファロースカラム上にロードした。カラムを非結合モード中で操作し、抗体を含む非結合画分を収集した。この工程での回収率はA280で69%であった。これは、この抗体についてのこれらの条件のもとで得られるものよりもわずかに低い。FPLCサンプルポンプ中の容積を保持するために、ロード容積の不正確な概算が原因であるかもしれない。
カラムマトリックス Q-Sepharose Fast Flow
カラム寸法 1.6cm 内径×15cm ベッド高さ
カラム容積 30mL
カラム調製 150cm/hrの0.1M水酸化ナトリウム中でパッキング
操作流速 100cm/hr(3.35mL/min)
洗浄液 0.1M水酸化ナトリウム(2カラム容積)
ローディング容量 10 mg/mlマトリックス
平衡溶液 25mM 酢酸ナトリウム pH5.00/25mM NaCl(8カラム容積)
ローディング後の洗浄液 25mM 酢酸ナトリウム pH5.00/25mM NaCl(6カラム容積)
溶出液 25mM 酢酸ナトリウム pH5.00/186mM NaCl(25カラム容積)
溶出バッファー 25mM 酢酸ナトリウム pH5.00/2M NaCl(2カラム容積)
洗浄液 0.1M 水酸化ナトリウム(2カラム容積)
24mlのバッファーで交換されたQ−セファロース溶出液を、10mg/mlマトリックスのローディング容量でSP−セファロースカラム上にロードした。カラムを結合モードで操作した。溶出液を画分として収集した。溶出結果の端から端までの画分をGP-HPLCによって分析し、凝集塊レベルの結果を測定し、これを表8に示した。各クロマトグラフィー工程後のサンプルを収集し、rプロテインA残留物について分析を行った。結果を表9に示す。
Claims (20)
- 抗体、好ましくはIgG抗体を精製するための方法であって、
・プロテインAが天然のプロテインAまたはその機能的誘導体である、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製する工程と、
・プロテインAまたはその誘導体の結合を可能にする条件下で、前記精製された抗体をイオン交換材料上にロードする工程と、
・汚染物質プロテインAがイオン交換材料に結合している間に、イオン交換材料上にロードされた前記抗体をイオン交換体の貫流中に収集する工程であって、好ましくは前記抗体の量の少なくとも70%を収集し、より好ましくは少なくとも80%を収集し、最も好ましくは少なくとも90%を収集する工程と
を含む方法。 - 前記プロテインAが、カラム材料に対する単一点での付着を可能にするように加工された組換え型のプロテインAであることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記組換え型のプロテインAが、そのアミノ酸配列においてシステインを含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記システインが、組換え型のプロテインAのアミノ酸配列のC末端の最後の30アミノ酸からなる部分に含まれていることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記組換え型のプロテインAが、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラフ支持材料に対して、チオエーテル硫黄結合を介して少なくとも50%まで付着されることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- プロテインAまたはその機能的誘導体が、イオン交換体の貫流中に<1ng/mg IgGの濃度まで減少することを特徴とする請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン交換体が、陰イオン交換体であることを特徴とする請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体が、少なくとも6.5以上のpIを有することを特徴とする請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体を精製するための方法であって、
・プロテインAが天然のプロテインAまたはその機能的誘導体である、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製する工程と、
・プロテインAまたはその誘導体の結合を可能にする条件下で、前記精製された抗体を第1のイオン交換材料上にロードする工程と、
・汚染物質プロテインAがイオン交換材料に結合している間に、イオン交換材料上にロードされた抗体をイオン交換体の貫流中に収集する工程であって、好ましくは前記抗体の量の少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の抗体を収集する工程と、
・前記抗体を第2のイオン交換体上にローディング、結合、および溶出させることによって前記抗体をさらに精製する工程と
を含む方法。 - 前記第1のイオン交換体が、陰イオン交換体であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記抗体が、少なくとも7.5以上のpIを有することを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記第2のイオン交換体が、陽イオン交換体であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記精製された抗体が、実質的に単量体の非凝集性の抗体であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体、好ましくはIgG抗体であって、前記IgG抗体がキメラまたはCDR移植IgG抗体であることを特徴とする請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記IgG抗体が、プロテインAとの結合に関連性のある抗体の部分において、好ましくはプロテインAとの結合に関連性のあるFc部分において、より好ましくはプロテインAについての結合サイトを含むIgGのCγ2-Cy3境界面領域において少なくとも存在し、このような種起源およびIgGサブクラス起源がプロテインAに対する高い親和性結合を可能にすることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記IgG抗体が、前記抗体のFc部分についてのヒトIgG1、IgG2、およびIgG4を含む群から選択されることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記抗体が、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製する前に細胞培養物から収集されることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記抗体が、哺乳類細胞培養物から収集されることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製される前記抗体が、プロテアーゼを不活性化させるために処理されず、好ましくは少なくとも1つのプロテアーゼ阻害剤との混合物でないことを特徴とする請求項17または18に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤が、PMSF、プロテアーゼ阻害ペプチド、ε-カプロン酸、および還元剤スルフヒドリル化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項19に記載の方法。
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