JPS63267281A - 修正されたプロテインａ - Google Patents

修正されたプロテインａ

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JPS63267281A
JPS63267281A JP63073060A JP7306088A JPS63267281A JP S63267281 A JPS63267281 A JP S63267281A JP 63073060 A JP63073060 A JP 63073060A JP 7306088 A JP7306088 A JP 7306088A JP S63267281 A JPS63267281 A JP S63267281A
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protein
region
regions
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cysteinyl
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JP63073060A
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アルバート　エィー．プロフィー
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Repligen Corp
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S436/828—Protein A
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 プロティンＡは、スタフィロコッカス　オーレウス（５
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、）中に見
出される細胞表面蛋白質である。これはクラス１８Ｇの
哺乳類抗体のＦｃ領域を結合する性質を持つが、親和性
は宿主の種および抗体サブクラスによって変化する（徹
底的に吟味するにはランゴーン、ジエイ。
ジェイ（＋９８２）アドバンシズ　イン　イミュノロジ
ー　（Ａｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ　　１ｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ）　　３２：１５７−２５２を参照）。プロティン
Ａは、スタフィロコッカス細胞壁から直接単離できるか
またはプロティンＡを分泌する突然変異菌株の成育培地
から単離できる。
さらに、プロティンＡに対する遺伝子は、大腸菌中でク
ローン化され表現されている（ロフダール。
ニス０．ガス、ビー９．ウーレン、エム１．フィリップ
ソン、エル、およびリンドバーグ、エム。
（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：　６９７−７０１；コルバー
ト、ディー１．アニリオニス、ニー。
、ゲレップ、ビー０．ファーレー、ジェイ、およびプレ
イヤー、アール、（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＲｅｓｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ　３：　
２５５−２５９）　ｅこれは、大量の組み替えプロティ
ンＡの製造を可能とした。
プロティンＡのＩｇＧ結合性に基づいた幾つかの応用が
開発された。これらには以下のものが含まれる： 抗体の分画および精製 プロティンＡは、血清から抗体を分画するのに、そして
モノクローナル抗体を精製するのに使用されてきた。こ
れらの目的には、プロティンＡは架橋されたアガロース
、トリサクリルＴＰ″（ＴＲＩＳＡＣＲＹＬＴＭ）　　
（エルケービー　インストラメンツにより分配されてい
る、メリーランド州ガイサースバーグ）、または珪素に
、基づいた物質（ランボーン。
ジエイ、ジェイ−（１９８２）　Ｊ、　Ｉｎ＋１Ｉｕｎ
ｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ５５　：　２７７−２９６）等
の固体マトリックスに結合される。
治療的な血漿交換（ＴＰＥ） 血漿から循環している免疫複合体を、プロティンＡに対
する結合によフて除去することは、ある種の自己免疫疾
患および悪性疾患に治療効果を有する、という証拠があ
る（サリナス、エフ、ニー。
およびハンナ、エム、ジー、　　（１９８５）コンテン
ポラリー　トピックス　イン　イミュノロジー（Ｃ。
ｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ）　、ブレナムプレス、ニューヨーク、１
５巻、免疫複合体および人のガン）。これを達成する為
には、血漿は不活性の無毒性の支持体に取り付けられた
プロティンＡからなる装置上を通過させられる。
免疫化学手順 プロティンＡは、酵素とリンクさせた免疫吸着検定（Ｅ
ＬＩＳＡ）などの免疫化学方法の幾つかにおいてＩｇＧ
のプローブとして使用することができる。
ＥＬＩＳＡは、プロティンＡが他の蛋白質、例えばアル
カリフォスファターゼまたは西洋わさびパーオキシダー
ゼに結合することを要求する（ランゴーン、ジェイ、ジ
ェイ、　　（１９８２）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ
ｅｔｈａｄｓ　５５　：　２７？−２９６）。
組織化学方法 プロティンＡは、細胞表面抗原の研究など、組織化学ま
たは細胞学方法に於いて使用できる。これらの用途には
、プロティンＡは、例えばフルオレスセインイソチオシ
アネートとの反応によるなどしばしば蛍光標識に結合さ
れる。
上記の議論から、はとんどの用途においてプロティンＡ
は他の物質に共有結合によって結合されなければならな
いことが明らかである。多くの結合化学が考え出された
が、はとんどはプロティンＡのアミノ基を通じての結合
に導かれた。しかしながら結合の正確な位置は曖昧であ
る。プロティンＡは、同様な反応性の約５０のアミノ基
を含んでおり、これらの任意の一つまたは幾つかが結合
に関与し得る。この不明瞭さが以下の実際的な欠点とな
り得る。
（１）プロティンＡの抗体結合機能に要求され名アミノ
基を通じて、結合が起こり得ること、その基が直接関与
しないとしても、それを通じての固定はＦｃ結合領域の
構造を混乱し得る。
（２）プロティンＡが幾つかの場所で結合し得ること。
個々の位置が、抗体結合に要求されないとしても幾つか
の場所を通じた結合は、プロティン八分子の柔軟性を制
限することがあり得、それによフて抗体に結合する能力
を減少させる。
（３）結合した生成物が均一でないこと、従って、固体
支持体に結合した時に、異なる分子が固定の場所に依存
して抗体に体する違った親和性を有し得る。この事は、
抗体が汚染物質から分離されるアフィニティークロマト
グラフィーなどの用途に於いて欠点となる。同様に、プ
ロティンＡの蛍光標識は、生成物の混合物を与え得る。
このことは、免疫検定に於いて再現性の無い結果に導き
得る。
〔課題を解決する手段〕
本発明は、プロティン八分子上の単一の定義された場所
を通じて他の物質に結合できる新規なプロティンＡ、ま
たはプロティンＡ様の分子に間するものである。このプ
ロティンＡまたはプロティンＡ様の分子は、アミノ酸配
列における決められた場所に於いて、単一のシスティン
アミノ酸残基を含有する蛋白質を表現するように修飾さ
れた組み替えプロティンＡ遺伝子の生成物である。本明
細書で例示される新規なプロティンＡ様の分子は、シス
テイニル−ｔプロテインＡ　”　（Ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ
−ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ”）　　（マサチューセッツ州
ケンブリッジのレブリゲンコーポレーションの商標）（
式Ａ）と呼ばれる。システイニル−ｔプロテインＡＴＭ
をコードするヌクレオチド配列は、式Ｂに示される。
プロティンＡの遺伝子は５つの抗体結合領域（Ｅ、　Ａ
、　８．　Ｃ５およびＤ）および抗体と結合しないＣ−
末端領域（又は”Ｘ”領域）に対してコードを有してい
る（コルバート、ディーら上記）、ｘ領域はアミノ酸Ｇ
ｌｕ−３１０および式Ａの全てのそれに続くアミノ酸を
含んでいる。本発明は、システィン残基がＣ−末端ＸＭ
域において表現されている様に遺伝子を修飾することか
らなる。抗体結合領域またはそれらの領域の組み合わせ
のいずれの一つも修飾されたＣ−末＃ｌ領域と共に表現
でき、独特のシスティン残基を含有しているプロティン
Ａ様の分子を与える。
〔式の説明〕
式ＡニジステイニルーｔプロテインＡＴＶのアミノ酸配
列。
式ＢニジステイニルーｔプロテインＡ１”のヌクレオチ
ド配列。
式Ｃ：２６塩基対挿入物の配列。
式Ｄ　：　Ｂｓ５ＨＩＩで制限されたｐＢＧ３−２ΔＮ
に挿入された新しいオリゴヌクレオチドデユーブレック
ス。
プロティンＡは、そのアミノ酸配列中にシスティン残基
を含有しない。コルバート　ディーら（＋９８４）ジャ
ーナル　オブ　バイオロジカル　レスポンス　モディフ
ァイアーズ　３：　２５５−２５９を参照、システイニ
ル−ｔプロテインＡＴ“は、組替えプロティンＡ遺伝子
を変更し、大腸菌宿主中でその遺伝子を表現し鞘み替え
生成物を精製することによって製造された。変更された
プロティンＡ遺伝子を構築するのに使用する手順は、第
１図に概略が示される。プラスミド９８Ｇ３−２ΔＮは
、大Ｉｌｌ菌蛋白質からの３２３の塩基対（ｂｐ）配列
、スタフィロコツ力スオーレウスプロテインＡ遺伝子か
らの１＋６１ｂｐ配列、プロティンＡ遺伝子に対するス
トップコドンを含有している２６ｂｐの合成りＮＡ配列
、および良く知られたプラスミドｐＢＲ３２５からの３
７２２ｂｐ配列を含んでいる。合成の挿入物は、ｐＢＧ
３−２ΔＮの他のどこにも見出されない二つのａｓｓ）
ｔ　ＩＩ制限位置を含有している。この遺伝子は、ａｓ
ｓ）Ｉ　ＩＩでプラスミドｐＢＧ３−２ΔＮを制限し、
切取った挿入物をシスティン残基に対するコドンを含有
している新たな合成挿入物と置き換えることによって修
飾される。
大腸菌宿主中のプラスミドｐＢＧ３−２ΔＮは、アメリ
カ合衆国　６１６０４　　イリノイ州　ベオリア　ノー
スユニバーシティ−ストリート　１８１５の米国農務省
ノーザン　リージョナル　リサーチ　センターにあるア
グリカルチュラル　リサーチ　カルチャー　コレクショ
ン（ＮＲＲＬ）に寄託されている。
その寄託番号はＮＲＲＬ　Ｂ−１５９１０である。この
プラスミドはこの宿主から標準の手順、例えば透明にし
た溶菌物密度勾配平衡方法によってその宿主から除去す
ることができる。
新たな合成挿入物の配列は、以下の様にして選択された
。ｐＢＧ３−２ΔＮ中の２６ｂｐ挿入物の配列は式Ｃに
示され、ここでＢｓ５Ｈ■の制限位置および対応するア
ミノ酸配列が示されている。ｐＢＧ３−２ΔＮから表現
された組み替えプロティンＡのＣ−末端アミノ酸残基は
セリンである。この残基はシステイニル−ｔプロテイン
Ａ”中でシスティン残基に置き換えられた。Ｃ−末端シ
スティン残基のスルフヒドリル基のｐ１４ＦＬは、内部
システィン残基のｐＫａよりも高いので末端基は反応性
がより低い、従って、システイニル−ｔプロテインＡ”
に対して、システィンに対するＣ−末端に新たなグリシ
ン残基が挿入された。しかしながら、グリシン残基は臨
界的なものとは考えられない、更に、他のアミノ酸は、
システィンと隣接することができる。Ｃ・末端領域の望
ましいアミノ酸配列、及びこれを表現する一つのＤＮＡ
配列は式りに示されている。示されているＤＮＡ配列は
、Ｂｓ５ＨＩＩ−制限ブラスミドρＢＧ３−２ΔＮ中に
挿入され、そして従って式Ｃに示されている１６ｂｐの
８ｓｓＨＩＩ断片を置き換えた０式りにおけるＤＮＡ配
列は、パリンドローム（右から呼んでも左から呼んでも
同じ）であることに注目されたい。これは次の利点を有
する。ＤＮＡは自己相補性である、従って挿入されたデ
ユーブレックス二本鎖の一つの鎖のみが合成される必要
があるだけである。
そして、合成二本鎖は二つの方向の可能性のいずれにも
挿入でき、所望のＤＮＡ配列を与える。さらに、式りに
示されるＤＮＡ配列は二つのｓｐｈ　Ｉ制限位置を含ん
でいる。そのような位置は、ｐＢＧ３−２ΔＮのどこに
も見出せないので、組み替え分子中の挿入物の存在は、
分子を解裂する制限エンドヌクレアーゼＳｐｈ　ｉの能
力によって試験され得る。
システイニル−ｔプロテインＡ”を表現する組み替えプ
ラスミドの構築、システイニル−ｔプロテインＡ′ｒＭ
の精製、およびシステイニル−ｔプロテインＡ”の使用
について詳細に記す前に、使用された一般方法を述べる
。
（１）大腸菌菌株 全ての大腸菌菌株は、大腸菌に一１２誘導菌である。
菌株大腸菌Ｊ旧０５、大腸菌ＪＭ１０３、および大腸菌
ＰＲ＋３（Ｆ−１ｌ］ｎｌ＋３、ｒｎａ−１９、ｔｈｒ
−１，ＩｅｕＲ−６、ｔｈｉ−１゜１ａｃＹＩ、　ｘｙ
ｌ−７、ｍｔ１２、ａ＋ａｌＡ１．５ｔｒＡｔ３２）は
、この技術でよく知られており、既知の培養基保存機関
または市販の給源から得ることが出来る０例えば、大腸
菌ＪＭＩ０５は寄託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０６７、そ
して大腸菌Ｊ旧０３は寄託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−３９４０
３を有している。
培養基寄託 次の本出願に開示される培養基の寄託は、アメリカ合衆
国　６１６０４　　イリノイ州　ベオリアノースユニバ
ーシティーストリート　１８１５米国農務省のノーザン
リージョナル　リサーチセンター、アグリカルチュラル
　リサーチ　カルチャー　コレクション（ＮＲＲＬ）中
で行なわれた。
この培養基は３７　ＣＦＲ１，１４および３５　ｕｓｃ
　１２２のもとに特許商標庁長官によって権限があると
決定された人に対し、本特許出願の継続中に培養基を入
手することが保証されている、という条件下で寄託され
ている。この寄託物は、この出願、またはその子孫に対
応するものが出願されている国々の外国特許法によって
要求されるならば入手できる。しかしながら、寄託物を
入手することが出来ることは、行政行為によって与えら
れた特許権を侵害して本発明を実施する実施権を構成す
るものではないことを理解されるべきである。
更に、この培養基寄託は微生物の寄託に対するブタペス
ト条約の条項に従って保存され、そして一般に入手可能
とされる。即ち、寄託物の試料を提出することが最も最
近要求された後、少なくとも５年間の期間、どのような
場合においても少なくとも寄託後３０年間または培養基
を開示している発行され得るどんな特許の権利行使可能
な寿命の閏、生きたままモして汚染されずに保つのに必
要な全ての注意をもって保存される。寄託者は、寄託物
の状態の為に寄託所が要求された時に試料を提供するこ
とが出来ないならば寄託物を置き換える任務があること
を認める。この培養基寄託の一般への人手可能性に間す
る全ての制限は、開示した特許の付与によって非可逆的
に取除かれる。
（２）大腸菌培養基 培養基は、ＹＴ培地（リットル当り８グラムのトリプト
ン、５グラムの酵母抽出物、および５グラムのＮａＣ１
）中で成育された。要求される時は３０μν１の濃度に
クロラムフェニコールを加えた。プレートの調製につい
ては、寒天を培地に１．５ｚの濃度に加えた。
（３）プラスミドＤＮＡの調製 プラスミドは、ホルメス及びクイグレー（ホルメス　デ
ィー　ニス及びクイグレー　エム　［１９８１コアナリ
テイ力ル　バイオケミストリー　１１４：１９３−１９
７）の急速沸騰方法の変法を用いて大腸菌培養基から製
造された。５１の培養基を３７’Ｃで一夜成育させそし
てペレット化した。ペレット化した細胞を０．４１の５
ＴＥＴ緩衝液（８％庶糖、５χトライ）　ン（ＴＲＩＴ
ＯＮ）　Ｘ−１００［ペンシルバニア州フィアラデルフ
ィアのロームアンドハースカンパニー製］、　５０ｎ＋
Ｍ　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＭＣＩ
、ｐ）１８．０．５０＋ｍＭエチレンジアミンテトラ酢
酸［ＥＤＴＡ］　）中に再懸濁した。３０μｍのリゾチ
ーム（１０ｍｇ／水１）を加え、混合物を沸騰水浴中に
２分装置いた。混合物を次に遠心分離しく　１００００
ｇ　ｉｏ分）、固体を除去し、そして上澄みを等しい容
量のイソプロパツールで処理した。−１０６Ｃで１０分
間放置後、固体を遠心によってペレット化しく１０００
０ｇ　１５分）そして上澄みを捨てた。ペレットを７５
μｍのＴＥ緩衝液（１０ｗＭ　　）リス−ＭＣＩ、ｐＨ
８，０，０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に溶解し、そして７
５μｍ０７．５酢酸アンモニウムで処理した。　４’Ｃ
で１０分間放置後、固体を遠心によりペレット化しく１
００００ｇ　１５分）そして上澄みを除去し３容量のエ
タノールで処理した。−ｉｏ”ｃで１０分間放置後、沈
殿したプラスミドＤＮＡを遠心によってペレット化しく
１００００ｇ　１５分）エタノールで洗浄し、空気乾燥
した。ペレットを５０μｍのＴＥ中に溶解し、−２０”
Ｃで冷凍貯蔵した。
（４）制限エンドヌクレアーゼ消化 制限エンドヌクレアーゼ消化は、装填業者によって推奨
される方法を用いて実施した。使用した＊衝液は１０ｍ
Ｍ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１０＋ｎＭ　ＭｇＣ
ｌ２．７５ｍＭ　ＮａＣｌ、および１００．ｕｇ／ｍｌ
牛血清アルブミンであった。
（５）　　ＤＮＡ断片の電気泳動分離 制限断片を０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有し
ているＴＯＥ緩衝液（９０ａＭ　）リス塩基、０．８９
Ｍホウ酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中の１ｚアガロースゲル
上で電気泳動することによって分離した。断片を紫外線
を照射することによって見ることができるようにし、そ
れらの寸法を既知の寸法の断片と参照することによって
測定した。
（６）コンピテント大腸菌細胞の製造 大腸菌の培養基を、６００ｎｍにおける吸光度が０．３
になるまで攪拌しなから３７°Ｃで成育させた。細胞を
次に氷の上で冷却し、遠心によりペレット化しく４１０
０ｇ　１０分間）、氷冷５０ｍＭ　ＣａＣｌ２の最初の
容量の２分の１の中に再懸濁し、そして氷上で２０分間
培養した。細胞を遠心によって上記の様に集め、氷冷５
０ｍＭ　ＣａＣｌ２の最初の容量の２５分の１の中に再
懸濁した。１１の部分を一８０°Ｃで冷凍保存した。
（７）コンピテント細胞の形質転換 凍結したコンピテント膿胞を解凍し、そして０゜２１を
５ないし２０μＩのＴＥの中のおよそ０．４μｇのプラ
スミドＤＮＡで処理した。３０分間氷上で放置後、混合
物を２分間３７’Ｃの水浴中に入れ、次に１ｍｌのＹＴ
培地で処理し、３７”Ｃで１時間培養した。培養基を次
に３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有している
ＹＴ培地上でプレートにし、３７”Ｃで成育させた。
（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
すｐ− 電気泳動をラエムリ（ラエムリ　ュー　ケイ［＋９７０
１ネイチヤー　［ロンドンコ２２７　：　６８０−６８
５）によって記載されるようにドデシル硫酸ナトリウム
（５ＤＳ）の存在下でポリアクリルアミドゲル上で実施
した。スラブゲルは１．５ｍｍの厚みで１２１の合計ア
クリルアミド濃度を含有していた。試料（２５μｍまで
）を２５μｍの試料緩衝液（６２，５剛門トリス−ＭＣ
Ｉ、ｐ）１６．８．２％　ＳＤＳ、５％　２−メルカプ
トエタノール、ＩＯ！グリセロール、および０．００２
５！ブロモフエノールブルー）と混合し、２分間沸騰水
浴中に入れ、冷却し、そしてゲルに装填した。電気泳動
をホエファー　サイエンティフィック　インストラメン
ツ（カリフォルニア州すンフランシスコ）から購入した
装置中で７５ｍＡにおいて実施した。ゲルを５：５：１
のメタノール／水／酢酸中のクマシーブル−０，５３／
ｌの溶液で染色し、そして７６５ｘ酢酸中で脱染色−し
た。
（９）オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成及オリゴ
ヌクレオチドｄＣＧＣＧＣＡＴＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＧ
ＣＡＴＧをアプライド　バイオシステムズ（カリフォル
ニア州フォスターシティ−）モデル３８０Ａ　ＤＮＡシ
ンセサイザーを用いて製造業者によって推奨されるホス
ホルアミダイト手順を用いて合成した。脱保護したオリ
ゴマーを７トキンソン及びスミス（アトキンソン　ティ
ー及びスミス　エム　［１９８４］オリゴヌクレオチド
　シンセシス：実際的な方法、ゲイト　エム　ジエイ編
、アイアールエルブレス、バージニア州アーリントン、
３５−８１頁）の電気泳動方法を用いて精製した。精製
したオリゴマー（２９μｇ）を３０μｍの５０＋ｗＭ　
）リス−）ＩＣＩ、ｐＨ７，６，１０ｗ＋Ｍ　ＭｇＣｌ
２．５ｍＭヂチオスレイトール（ＤＴＴ）　、０．１ｍ
Ｍスペルミジン、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．１５Ｍ
アデノシン三燐酸（ＡＴＰ）中のＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ１０単位で処理した。溶液を３０分間３７°Ｃ
で培養し、次にＤＮＡを１０分の１容量の３Ｍ酢酸ナト
リウム、ｐＨ４，７、および３容量のエタノール（−１
Ｏ°Ｃ１１０分閏）で沈殿させた。このＤＮＡを遠心に
よりペレット化しく１００００ｇ、　１５分間）、エタ
ノールで洗浄し乾燥した。ベレットを３０μｍのＴＥ中
で再溶解し、６０°Ｃに加熱し、そしてＤＮＡデユーブ
レックスを形成する為にゆっくりと室温で冷却した。
以下は、本発明の実施の手順を説明する実施例である。
これらの実施例は制限するものと解釈すべきでない。全
てのパーセントは重量により、全ての溶媒混合物割合は
、別に記載されてなければ容量による。
１μ８のｐＢＧ３−２ΔＮを（４）で記載した緩衝液中
で１２０分間３７’Ｃで１２単位のＢｓ５ＨＩＩと培養
した。１μｍ（２０単位）のアルカリフォスファターゼ
（子牛のこう丸）を加え、溶液を更に１時間３７°Ｃで
培養した。溶液を次に１００μｍにＴＥで希釈し、フェ
ノール５０μｍ部分２回で抽出し、ジエチルエーテル１
００μｍ部分２回で抽出し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ）
１４．７）　１０分の１容量で処理し、３容量のエタノ
ールで沈殿させた。制限されたホスホリル化したＤＮＡ
を遠心によってペレット化しくｔｏｏｏｏｇ、　１５分
間）、エタノールで洗浄し、乾燥し３０μｍのＴＥ中で
溶解した。
実施例２−一−−オリゴヌクレオチド挿入物の連結１１
ＢＧ３−２ΔＮ（０，５μｇ）の脱ホルホリル化された
Ｂｓ５ＨＩＩ制限断片、（９）中で記載した合成オリゴ
ヌクレオチド二本鎖（デユーブレックス）（５μｇ）、
及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ（４００単位）を５０ｍＭ　
）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８，６＋＋Ｍ　ＭｇＣｌ２、
Ｉｎ＋Ｍ　ＡＴＰを含有している２０ｍＭ　ＤＴＴ中で
１５時間１６°Ｃで培養した。反応混合物をコンピテン
ト大ＩＩ菌ＪＭ１０５ｍ胞を（７）に記載したように、
形質転換するのに使用した。
プラスミドＤＮＡを実施例２からの形質転換物の１０個
のコロニーから単離した。このＤＮＡをｓｐｈ　Ｉ及び
ＥｃｏＲＩの混合物によって制限した。アガロース電気
泳動は、式りに示されるＤＮＡ配列のｐＢＧ３−２ΔＮ
のＢｓ５ＨＩｆ制限断片への挿入から期待される断片を
表した。即ち、１．２ｋｂｌ）の一つ及び４．０ｋｂｐ
の一つである。試験された全ての１０個の形質転換物か
らのプラスミドＤＮＡは、消化するとこれらの断片を与
えた。対照的に、プラスミドｐＢＧ３−２ΔＮは期待さ
れるように５．２ｋｂｐの単一断片しか与えなかった。
形質転換物から単離されたプラスミドは消化されたｐＢ
Ｇ３−Ｃｙｓである。
実施例４　−−−−　ｐＢＧ３−Ｃｓによる大腸菌ＰＲ
１３の形質転換 実施例３に記載された形質転換物の一つからのプラスミ
ドｐＢＧ３−Ｃｙｓを、コンピテント大腸ｉＪＭ１０３
細胞の形質転換に使用した。大腸菌ＪＭ１０３　（ｐＢ
Ｇ３−Ｃｙｓ）形質転換物の４つから単離されたプラス
ミドを、実施例３に記載されるようにｓｐｈ　Ｉの位置
に対してスクリーニングし、全てがそれを含んでいるこ
とがわかった。これらの形質転換物の１からのプラスミ
ドを、コンピテント大腸菌ＰＲ１３＋ＩＩ胞を形質転換
するのに使用した。プラスミドを大腸菌ＰＲ＋３　（Ｐ
ＯＣ３−Ｃｙｓ）形質転換物の４つから単離し、Ｓｐｈ
　１位置の存在に対してスクリーニングした。
全て４つがその位置を含有しているのがわかった。
実施例５−−−一大腸ＨＰＲ＋３　（ｐＢＧ３−Ｃｙｓ
）によるシ大腸菌ＰＲ１３（ｐＢＧ３−Ｃｙｓ）及び大
腸菌ＰＲ１３（ｐＢＧ３−２ΔＮ）の培養基を一夜３７
℃で成育させ、そして各々の５０μｍをペレット化した
。ペレットを２５μｍの試料緩衝液中に懸濁し、モして
（８）で記載されるように５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
脱染色したゲルは、大腸菌ＰＲ１３（ｐＢＧ３−Ｃｙｓ
）培養基が大腸ＭＰＲ＋３（ｐＢＧ３−２ΔＮ）によっ
て表現されることが知られている組み替えプロティンＡ
と同じ外見分子量、及び同じ量の蛋白質を表現した。
実施例６−一一一大腸菌ＰＲ１３（、８Ｇ３−Ｃｙｓ）
の大規模＆！ 大ＩＩ　Ｍ　ＰＲ＋３　（ｐＢＧ３−Ｃｙｓ）の３０ｇ
ｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＹＴ中の一夜
培養基の１０１を２０１ケマペツクフアーメンターにュ
ーヨーク州ウッドベリーのケマペックインコーボレーテ
ッド）中の１０ｍｇ／Ｉのクロラムフェニコールを含有
している１０１の修飾された２ｘ培地（２０ｇ／Ｉの酵
母抽出物、２０ｇ／　Ｉのカサミノ酸、２０ｇ／Ｉのカ
ゼインペプトン、２ｇ／ｌのに２ＨＰＯ，，２ｇ／Ｉの
ＫＨ２ＰＯ４，２ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４”７Ｈ２０〉
を接種するのに使用した０組み替え細胞を３７゜Ｃ１５
０！（７）溶解した０２と共ニ３７″Ｃテ成育した。　
ｐＨを８５χ乳酸及び５０Ｘ　Ｎａ０）１で６．８１に
保持した０発泡はアンチフオーム８（プラウエア州つィ
ルミントンのイー　アイ　デュポン　デ　ネモアーズ　
アンド　カンパニー　インコーホレーテッド製）の添加
によって抑制した。細胞を遠心によって、後期対数相に
おいて収穫した（　３５００Ｘ　ｇ、２０分間）。
細胞収量は、リットル当り３０ｇの湿潤細胞重量（ｗＣ
讐）であった。
実施例７−一一一組み替え細胞の溶菌 収穫した大腸菌ＰＲ１３（ｐＢＧ３−Ｃｙｓ）細胞（１
５０ｇ）を１１の溶菌緩？Ｉｊｔ１１（ｆＯｍＭ　）リ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，５ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡ、　１
ｍＭ　ＤＴＴ、　０．１ｍＭフェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド［ＰＭＳＦ］　、及び０．５Ｘ　）ライ
）　ン（ＴＲＩＴＯＮ）　Ｘ−１００）中に懸濁した。
溶菌を懸濁液を２回、１．２１のガラスビード（直径０
．５−０．７ｎｍ＋）で充填したダイノミルモデルにＯ
Ｌ−パイロットにュージャージー州メイウッドのインパ
デックス）を通過させることによって行なった。溶菌物
を遠心によって透明にした（７３１０ｇ、　４５分間）
。
実施例８−一一一システイニルーｔプロテインＡＴＭの
精製 ＤＥＡＥ−セファロース高速流にュージャージー州ビス
力タウエイのファルマシア　ファイン　ケミカルス！り
の１１Ｘ１３ｃｍＯカラムを洗浄緩衝液（３５ｎ＋Ｍ　
）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１
ｍＭ　ＤＴＴ。
０．１ｗＭ　ＰＭＳＦ）で平衡化し、そして１．５１の
透明にした溶菌物（実施例７）を流速１００ｍ１／分に
おいてカラムを通過させた。洗浄緩衝液（３１）を次に
１００ｍ１／分においてカラムを通過させた。流速を次
に１０ｍ１／分に減少させ、そしてシステイニル−ｔプ
ロテインＡ”を４１の洗浄緩衝液及び４１の溶離緩衝液
（洗浄緩衝液は２００ｍＭのにＣ１を含有している）か
ら形成された線形勾配によって溶離した。２００ｍ　ｌ
のフラクションを集め、各フラクションからの試料を５
ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。４０キロダルトン（
ｋｄ）のみかけ分子ｍ＜システイニル−ｔプロテインＡ
ＴＭ）の部分を含有しているフラクションを集め、モし
て８５°Ｃで１０分間加熱した。沈殿した汚染物を遠心
によってベレット化しく７３１０ｇ、３０分間）、そし
て上澄みを０．４５−ミクロンフィルターを通過させた
。濾液を３容量のエタノールで処理し、そして３０分間
室温で攪拌した。生じる沈殿を遠心で集め（７３１０ｇ
、３０分間）そしそ乾燥させた。
ベレットを滅ＩＴＥ中で溶解させ、４″Ｃでｌｆｆ１Ｍ
　ＤＴＴの存在下で保存した。４０ｋｄの生成物は５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥによって９０１より純度が大であると判断
された。２７５　ｒｍにおける吸光度によって測定され
た収率は、５Ｂ／ｇの冒Ｃνであった。
実施例９−一一一フルオレスセイン標識プロティンへ 試薬のフルオレスセイン−５−マレイミド（オレゴン州
ニージーンのモレキュラーブローブインコーボレーテッ
ドから入手可能）は、蛋白質のスルフヒドリル基と反応
し安定な共有結合を形成する。
システイニル−ｔプロテインＡ　”　（２８μｇ）及び
フルオレスセイン−５−マレイミド（１６μｇ）を、部
μｍの０゜団燐酸ナトリウムｐＨ７，５，０，５ａ＋Ｍ
　ＥＤＴＡ中で３０分間３７°Ｃで培養した。溶液を上
の（８）に記載１ノだように、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
蛍光発生する生成物を、詳しい染色前に紫外線の照射に
よフて見ることが出来るようにした。これは、システイ
ニル−ｒプロテインＡ”に対応する４０ｋｄ分子量の強
度に蛍光発生性の蛋白質を表した。同じ条件下で、大腸
菌ＰＲ＋３　（、ｐＢＧ３−２ΔＮ）からの組み替えプ
ロティンＡは、はとんど蛍光を有しないか又は蛍光を発
生しない生成物を示した。
システイニル−ｔプロテインＡＴＭ及びフルオレスセイ
ン−５−マレイミドの反応生成物を、アガロースに固定
された人ＩｇＧＯカラム上を通過させたくマイニス　イ
ー　エル　ブイ［＋９８４］メソツズインモレキユラー
　バイオロジー、１巻、プロテインズ、ウォルカー　ジ
エイ　エム編、フマナブレス、ニューシャーシ−Ｈりリ
フトン、１３−２０頁）、蛍光性の生成物はカラムに結
合され、そして燐酸塩緩衝液塩水（ＰＢＳ）で充分に洗
浄しても溶離しなかった。蛍光発生性の蛋白質を０．２
Ｍグリシン、ｐＨ２，０，によってプロティンＡ様の物
質に対して期待されるように、溶離した。カラム溶履物
の５Ｏ５−ＰＡＧＥによって４０ｋｄの蛍光性の蛋白質
が出現した。
アクティベイテッドチオールセファロース４Ｂ（ファル
マシア　ファイン　ケミカルス）は還元されたスルフヒ
ドリル基と反応し、安定な共有ジスルフィド結合を形成
するゲルである。０．５１の０゜１燐酸ナトリウム、ｐ
）１７．５．０．５ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ中のシステイニル
−ｔプロテインＡ　ＴＴ（２ｍｇ）を０．５１の膨潤さ
せたアクティベイテッドチオールセファロース４Ｂと混
合し、２時間室温で調整した。ゲルを蛋白質が洗液中に
観測されなくなるまでＰＢＳで洗浄した。ゲルを次にジ
スルフィド結合を還元し、それによって結合された蛋白
質を放出する為に１０ｍＭＤＴＴで処理した。５ＤＳ−
ＰＡＧＥによって測定されるように、およそＩＢの４０
ｋｄ蛋白質がゲル１当り遊離された。実験を大腸菌ＰＲ
１３（＋）８Ｇ３−２ΔＮ）によって表現される組み替
えプロティンＡを用いて実施した時、ＤＴＴ処理によっ
てゲルから蛋白質は放出されなかった。
システイニル−ｔプロテインＡＴＭをコードしているヌ
クレオチド配列は、この技術で良く知られた遺伝子機械
によって製造することが出来る。これは、ヌクレオチド
配列が開示されているので可能となる。
システイニル−ｔプロテインＡＴＭはＢＯＣ及びＦＭＯ
Ｃ（メリフィールド　アール　ビー［＋９６３コＪ、Ａ
ｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　８５：　２１４９；
チャング　シー及びマイネンホーファー　ジエイ［１９
７８］　１ｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ｒｅｓ、　＋１　：　２４６）等の固相ペプチド
合成技術によって化学的に合成することが出来る。
この技術で良くしられているように、蛋白質のアミノ酸
配列はＤＮＡのヌクレオチド配列によって決定される。
遺伝子コードの冗長性のために、即ち蛋白質を作るのに
使用されるアミノ酸配列の殆どに、一つ以上のコード化
ヌクレオチドトリブレット（コドン）が使用できるので
、特定のアミノ酸配列に対し異なるヌクレオチド配列が
コートし得る。従って、遺伝子コードは以下の様に描か
れる。
キー：　各々の３つの文字のデオキシヌクレオチドトリ
ブレットが５１−末端を左側に、そして３′−を右側に
有するｍＲＮＡのトリヌクレオチドに相当する。
本明細書に与えられる全てのＤＮＡ配列は、その配列が
、チミンがウラシルに置き換えられているｒａＲＮＡ配
列に対応するものの鎖である０文字は、デオキシヌクレ
オチド配列を形成しているプリン又はピリミジン塩基を
表している。
Ａ＝アデニン Ｇ＝ニブアニ ン＝シトシン Ｔ＝チミン ＹがＡ又はＧ（７）時、Ｘ＝Ｔ又はＣ ＹがＣ又はＴの時、Ｘ＝Ｃ ｘがＣの時、Ｙ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ ＸがＴの時、Ｙ＝Ａ又はＧ ｚがＡ又はＧの時、Ｗ＝Ｃ又はＡ ＺがＣ又はＴの時、Ｗ＝Ｃ ＷがＣの時、Ｚ＝Ａ、Ｇ％Ｃ又はＴ Ｗがへの時、Ｚ＝Ａ又はＧ ＳがＴ又はＣの時、ＱＲ＝ＡＧ Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ Ｍ＝組Ｃ又はＴ 上記は新規な本発明のアミノ酸配列が、ここに開示され
たヌクレオチド配列以外によって製造できることを示し
ている。システイニル−ｔプロテインＡ”、又はプロテ
ィンＡ様の活性を有するその断片の新規なアミノ酸配列
をコードしている機能的に同等なヌクレオチド配列は、
既知の合成手順によって製造することができる。従って
、本発明はそのような機能的に同等のヌクレオチド配列
も含んでいる。
更に、同定された構造及び機能の蛋白質は、変化が蛋白
質の二次構造を変化しないならば、アミノ酸配列を変化
することによって同じ構造及び機能の蛋白質を製造する
ことができることも示されている（カイザー　イー　テ
ィー及びケラディーエフ　ジエイ［１９８４］サイエン
ス　２２３　：　２４９・２５５）。従って本発明は、
蛋白質の二次構造を変化させない本明細書に記載された
アミノ酸配列の変異物も含むか、又は構造が変化されて
いるならば、生物活性がある程度保持されている変異物
も含む。
上に示されているように、微生物的方法によって蛋白質
を製造する為に、本発明のシステイニル−ｔプロテイン
ＡＴ”活性をコード化しているヌクレオチド配列を使用
することは、遺伝子工学における当業者の成し得ること
である。そのような配列を表現ベクター中に融合させ、
真核宿主（酵母又は哺乳類の細胞）又は原核宿主（微生
物細胞）のいずれかの宿主中に形質転換又はトランスフ
ェクションさせることは、他の良く知られた蛋白質、例
えばインシュリン、インターフェロン、人の成長ホルモ
ン、その他を製造するのに使用される標準の手順である
。同様な方法又は自明なその修正は、微生物手段又は哺
乳類組織培養技術によって本発明のシステイニル−ｔプ
ロテインＡ”を製造するのに使用できる。更に、プロテ
ィンＡの抗体結合領域は標準の遺伝子機械手順によって
製造できる。これらの領域は、独立に又はそれに融合さ
れた本明細書に開示されるＸ領域と種々組み合わせて使
用することができる。Ｘ領域をシスティン残基に対し、
コードするように修正することは、標準の手順によって
その領域に融合させる前か、又はさせた後に行なうこと
が出来る。
プロティンＡ遺伝子はまたＩｇＧ結合領域（単数又は複
数）の前に、Ｎ末端コーディング配列中においてシステ
ィンを入れるように修正することができる。別の方法と
して、Ｎ末端システィンはプロティンＡ遺伝子の５′末
端に於いて、合成りＮＡ配列を挿入することによってシ
スティンとＩｇＧ結合領域の間にポリペプチドスペーサ
ーを作ることによってＩｇＧ結合領域からさらに取除く
ことができる。このスペーサーは長さが約１ないし約１
００個のアミノ酸であり得る。本明細書に開示されるよ
うに、この修正は、任意のプロティンＡ領域に対し行な
うことができ、そしてその領域は独立に又はそれに融合
された修飾された領域と種々組み合わせて使用すること
が出来る。システィン残基が１００結合領域の外側であ
るこれらの修正は、標準の手順を用いて当業者によって
容易になし得ることである。
式　　Ａ システイニル−ｔプロテインＡ領域のアミノ酸配夕１１
０：ｅｒ”：ｔ’ｒ’　　づ　＞ｒ＞ｒ’＞　　０　ω
　〉　づ　ｉ　ＩＳｌ、、１．＜ビＱべωにφΦωヒΦ
ｄグのＯりφωΦｃＯコφ”ｔｉ　ｃ　”ｃ＋　Ｄべ（
５）Φ〔自り　ｔ−’　　−ｃｃ＞ｒ’ｔ−”＞＞　　
○　＞＞＞＋＞ｒ’ｒｏｒｏ　　ゴ【　（φ　火　■　
ω　切　−ヒ　ヒ　φ　×　ψ　Ｏへ仁　　Φ　φ　ω
　口　ω　仁　℃　ロ　コ　印　郷　ｐ　べ　°ＣＣｒ
＞ｒ’ｔ”＞＞００φＧ〕ωｉくづ＜ｔ−”ａ＜ω＜Φ
φ硝Ｐビｌ’Ｄ＋Ｑｌ冥銅ゴΦＯべω　コ　ψ　α　℃
　ロ　ロ　Ｃべ　Ｃべ　ψ　ヒ　ｆｆｉ＋・（０＞　＞
　００　ω　○　〉　○　ｃｎ＞”ｃｓ＞ｃ’＋　　０
　＞　　ＯＯωω？−’　）−’　ＩＤビωビΦベゴφ
ＰＰωヒＰ℃　　コ　　コ　　Ｇ　　Ｉ　　Ｇ　　コ　
　コ　　−ＯＱ　　　ｌ’Ｄ　　’Ｃ＋　　＜　　　コ
　　コ　　ロ　　ロ＋ｔ　　○　の　Ｃｎ　００　＞：
ｅ’Ｈ＞Ｓ＞Ｏｃｎ：ｌ：　　工　日ぺ？−’　ｌ−’
　ＩｔＩ＋−’　）−１１−’　）−’ゴω＜　＋　ｔ
−’Φｒｏｔ−Ｊ・γＯＬ：＝ｊＭ　　口　５　印　−
弓　口　Ｈｍ　仁　べ　自　ω　べＣＡ　Ｏ＞　　の　
Ｃ／）＞　　？ｃｌ　　Ｙ　　＞　　Ｇ；”）　　Ｏに
’）＞　Ｔ＝　　ｍ　　＞　　ｍのＳのｌ−Ｉυ目ゴぺ
ω）−’　）−’　）−１）−’Φｄωべｒ　　仁　：
ｊ　　巨　Ｈ（５）　Φ　０　り　冥　仁　ロ　郷　Ｃ
Ｏ・ｏＯのの＞＞＞＞ｓｒ−”＜ｍＨｏｏｔ”＞０日１
−Ｉ　　＋　　）−’　）−’　　＋−’　　φ　＜　
×　Φ　グ　Ｐ　ビ　−【　ω　ビ　ゴ：Ｉクー印郷口
ｄリビＯＯづ口ωコＣ１ｔｎ　　：＞　　ｍ　Ｗｅ　　
＞　　００＞ｒ’＋ｒ’＞ｔ”＞ｒ’＞＞Ｏべ　０＋１
　　い　Ｐ　ヒ　ヒ　Ｏビ　Ｑ　ω　【　ω　Ｏ−べ弓
　ｏｑ　　ｏ　　ｏ　　口　【　仁　郷　仁　ｒｏ（コ
　ψ　℃　仁　Φ　図＞　＞　＠　ｔ”　ｒ’　ｍ　ｓ
　＞　００＞ｔ’ｔ−’＞＞○ＯＳの＜＜Φゴビωヒビ
φ塁ＱωいＰビ ー　　ロ　　ベ　　ψ　　口　　ｒｏｒｏ　　℃　【　
　コ　　コ　　ψ　　仁　℃　　＝　　琶　　ＧシＳＳ
二「＝げけＳＴＩ謬シマ＝Ｓ＝ コ＜α…ｅｒｏｃコ（：ｌ−１１−１（Ｄり０郷口Ｏ＊
　Ｘ領域はＧｌｕ−３１０及びそれに続く全てのアミノ
酸から成っている。
式　　Ｂ システイニル−ｔプロテインＡ”のヌクレオチド配列 式　　Ｃ ２６の塩基対挿入物の配列 式　　Ｄ Ｏｓｓ）ｌ　ＩＩで制限されたｐＢＧ３−２ΔＮに挿入
された新規なオリゴヌクレオチドデユーブレックスＡｒ
ｇ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　５ｔｏｐ５’　　ＣＧＣ
ＧＣＡ　ＴＧＣＧＧＣＴＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　Ｇ　　
　　３’３’　　　　ＧＴ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＡＴＣＧ
ＧＣＧＴＡ　ＣＧＣＧＣ５’Ｓｐｈ　Ｉ　　　　　　　
　Ｓｐｈ　１
【図面の簡単な説明】
第１図はシステイニル−ｔプロテインＡＴＩ″を表現す
る新規なプラスミド（ｐＢＧ３−Ｃｙｓ）を構築するの
に使用する手順を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、修飾が単一のシステイン残基を有するプロテインＡ
    の表現を生じ、その修飾がＩｇＧ結合領域の外側である
    修正されたプロテインＡ遺伝子。 ２、修飾が単一システイン残基を有するプロテインＡの
    表現を生じ、その修飾がＣ−末端Ｘ領域中である特許請
    求の範囲第１項に記載の修飾されたプロテインＡ遺伝子
    。 ３、式Ａに示されるアミノ酸配列を有する特許請求の範
    囲第２項のシステイニル−ｒプロテインＡ＾Ｔ＾Ｍに対
    するコードを有するＤＮＡ。 ４、修飾が、単一のシステイン残基を有するプロテイン
    Ａの領域またはプロテインＡ領域の組み合わせの表現を
    生じ、その修飾がＩｇＧ結合領域の外側である領域Ｅ、
    Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤから選ばれる修飾されたプロテイ
    ンＡ遺伝子領域。 ５、修飾が単一システイン残基を有するプロテインＡ領
    域またはプロテインＡ領域の組み合わせの表現を生じ、
    上記修飾がＣ−末端Ｘ領域中である領域Ｅ、Ａ、Ｂ、Ｃ
    、またはＤから選ばれる特許請求の範囲第４項に記載の
    修飾されたプロテインＡ遺伝子領域。 ６、ＩｇＧ結合領域の外側にシステイン残基を有するプ
    ロテインＡ分子からなる修飾されたプロテインＡ。 ７、Ｘ領域中にシステイン残基を有するプロテインＡ分
    子からなる特許請求の範囲第６項に記載の修飾されたプ
    ロテインＡ。 ８、特許請求の範囲第７項に記載のシステイニル−ｒプ
    ロテインＡ＾Ｔ＾Ｍ。 ９、ＩｇＧ結合領域の外側にシステイン残基を有する領
    域Ｅ、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ、またはこれらの領域の組
    み合わせから選ばれる修飾されたプロテインＡ領域。 １０、Ｘ領域中にシステイン残基を有する領域Ｅ、Ａ、
    Ｂ、Ｃ、またはＤ、または上記領域の組み合わせから選
    ばれる特許請求の範囲第９項に記載の修飾されたプロテ
    インＡ領域。 １１、ＩｇＧ結合領域の外側にシステイン残基を有する
    プロテインＡ分子からなる修飾されたプロテインＡに対
    してコードしているＤＮＡを含むＤＮＡトランスファー
    ベクター。 １２、Ｃ−末端Ｘ領域中にシステイン残基を有するプロ
    テインＡ分子からなる修飾されたプロテインＡに対して
    コードするＤＮＡを含んでる特許請求の範囲第１１項に
    記載のＤＮＡトランスファーベクター。 １３、ＩｇＧ結合領域の外側にシステイン残基を有する
    領域Ｅ、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ、またはそれらの領域の
    組み合わせから選ばれる修飾されたプロテインＡ領域に
    対してコードするＤＮＡを含んでいるＤＮＡトランスフ
    ァーベクター。 １４、Ｃ−末端Ｘ領域中にシステイン残基を有する領域
    Ｅ、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ、またはそれらの領域の組み
    合わせから選ばれる修飾されたプロテインＡ領域に対し
    てコードを有しているＤＮＡを含んでいる特許請求の範
    囲第１３項に記載のＤＮＡトランスファーベクター。 １５、式Ａに示されるアミノ酸配列のシステイニル−ｒ
    プロテインＡ＾Ｔ＾Ｍに対してコードを有しているＤＮ
    Ａを含む特許請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡトラン
    スファーベクター。 １６、プラスミドｐＢＧ３−Ｃｙｓである特許請求の範
    囲第１５項に記載のトランスファーベクター。 １７、原核宿主または真核宿主中に形質転換され、複製
    された特許請求の範囲１１、１２、１３または１４項に
    記載のＤＮＡトランスファーベクター。 １８、大腸菌ＰＲ１３（ｐＢＧ３−Ｃｙｓ）、ＮＲＲＬ
    　Ｂ−１８１９４である特許請求の範囲第１７項に従っ
    て形質転換された宿主。 １９、システイン残基をＩｇＧ結合領域の外側に有して
    いるプロテインＡ分子からなる修飾されたプロテインＡ
    を共有結合させることからなる （ａ）血清からの抗体の分画方法、または （ｂ）モノクローナル抗体の精製方法、または（ｃ）血
    漿から循環している免疫複合体を除去する方法、または （ｄ）免疫化学方法におけるＩｇＧの探査方法または（
    ｅ）組織化学または細胞学方法。 ２０、Ｘ領域中にシステイン残基を有するプロテインＡ
    分子からなる修飾されたプロテインＡの共有結合からな
    る特許請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１、修飾されたプロテインＡがシステイニル−ｒプロ
    テインＡ＾Ｔ＾Ｍである特許請求の範囲第２０項に記載
    の方法。 ２２、システイニル−ｒプロテインＡ＾Ｔ＾Ｍをフルオ
    レスセイン−５−マレイミドと結合させ、フルオレスセ
    イン標識システイニル−ｒプロテインＡ＾Ｔ＾Ｍを与え
    る特許請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３、システイニル−ｔプロテインＡ＾Ｔ＾Ｍが、チオ
    ール親和性物質に結合される特許請求の範囲第２１項に
    記載の方法。 ２４、上記チオール親和性物質が活性化チオールセファ
    ロース４Ｂである特許請求の範囲第２３項に記載の方法
    。 ２５、ＩｇＧ結合領域の外にシステイン残基を有するプ
    ロテインＡ分子に対してコードするＤＮＡを含んでいる
    ＤＮＡトランスファーベクターで形質転換した微生物宿
    主を培養することからなる修飾したプロテインＡを製造
    する方法。 ２６、Ｘ領域中にシステイン残基を有するプロテインＡ
    分子に対しコードを有するＤＮＡを含んでいるＤＮＡト
    ランスファーベクターで形質転換した微生物宿主を培養
    することからなる修飾されたプロテインＡを製造する特
    許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７、修飾したプロテインＡがシステイニル−ｒプロテ
    インＡ＾Ｔ＾Ｍである特許請求の範囲第２６項に記載の
    方法。 ２８、微生物宿主が大腸菌ＰＲ１３（ｐＢＧ３−Ｃｙｓ
    ）、ＮＲＲＬＢ−１８１９４である特許請求の範囲第２
    ６項に記載の方法。 ２９、ＩｇＧ結合領域の外側にシステイン残基を有する
    修飾されたプロテインＡ領域、またはそれらの領域の組
    合せに対するコードを有するＤＮＡを含んでいるＤＮＡ
    トランスファーベクターで形質転換した微生物宿主を培
    養することからなるＩｇＧ結合領域の外側にシステイン
    残基を有している領域Ｅ、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ、また
    はこれらの領域の組合せから選ばれる修飾されたプロテ
    インＡ領域を製造する方法。 ３０、Ｘ領域にシステイン残基を有する修飾されたプロ
    テインＡ領域またはその領域の組合せに対するコードを
    有しているＤＮＡを含んでいるＤＮＡトランスファーベ
    クターで形質転換された微生物宿主を培養することから
    なるＸ領域中にシステイン残基を有する領域Ｅ、Ａ、Ｂ
    、Ｃ、またはＤ、またはこれらの領域の組合せから選ば
    れる修飾されたプロテインＡ領域を製造する特許請求の
    範囲第２９項に記載の方法。
JP63073060A 1987-03-27 1988-03-25 修正されたプロテインａ Pending JPS63267281A (ja)

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