TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft menschliche monoklonale
Antikörper (HuMAb) gegen das gpIII-Protein des Varicella-Zoster-
Virus (VZV) sowie diese produzierende Zellinien.
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Eine ihrer Aufgaben ist die Schaffung von VZV-spezifischen
HuMAb, welche zur Diagnose und Prophylaxe sowie zur Behandlung
von viralen Infektionskrankheiten, welche von VZV verursacht
werden, von Nutzen ist.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Der VZV ist ein Virus, welches Varicella (Windpocken),
Enzephalitis (Entzündung des Gehirns), Hepatitis oder dergleichen
durch eine Primärinfektion verursacht und nach dem Eintreten
einer symptomfreien Zeit manchmal als Zoster (Gürtelrose)
rezidiviert.
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Bekanntlicherweise können Varicella bei einem immungeschwächten
Wirt tödlich wirken, und Zoster verursacht manchmal eine Post-
Herpes-Neuralgie nach der Genesung von der Erkrankung.
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Als Medikamente gegen diese Krankheiten werden Aciclovir
(Wellcome, England), Varicella-Lebendimpfstoff (Research Institute
for Microbial Diseases Osaka University, Japan), BV-Ara U
(Yamasa Shoyu, Japan) und dergleichen erwähnt, doch diese
weisen keine befriedigende Sicherheit und Wirksamkeit auf, und
daher ist die Entwicklung von Medikamenten, welche prophylaktisch
verabreicht werden können und eine hohe Sicherheit und
Wirksamkeit aufweisen, erforderlich.
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Es wurde erkannt, daß eine aus dem menschlichen Serum nach
einer durch den Varicella-Zoster-Virus ausgelösten Erkrankung
gewonnene Humanimmunoglobulin-Zubereitung (Varicella-Zoster
Immune Globulin: VZIG, Warenzeichen Varitect, etc.) zu einem
gewissen Grad wirksam ist (Zaia, J.A. et al, J. Infect. Dis. Band
147, Seiten 737 - 743, 1983), doch ein Neutralisationstiter von
VZIG gegen VZV ist nur um ein Mehrfaches oder um ein mehrfach
Zehnfaches größer als eine herkömmliche
Humanimmunoglobulin-Zubereitung, und daher werden Medikamente mit einem höheren
Neutralisationstiter benötigt. Desweiteren ist die Beschaffung von
VZIG schwierig und es gibt Probleme hinsichtlich der Kosten und
einer konstanten Versorgung. Außerdem besteht bei menschlichem
Serum die intrinsische Gefahr einer Kontamination mit
unbekannten Faktoren wie etwa dem AIDS-Virus oder dergleichen. Um diese
Probleme zu lösen, sind Mabs gegen VZV entwickelt worden.
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Einige Gruppen (Friedrichs, W.E. und Grose, C., J. Virol. Band
49, Seiten 992 - 996, 1984; Keller, P.M. et al, J. Virol. Band
52, Seiten 293 - 297, 1984); Forghani, B. et al, J. Virol. Band
52, Seiten 55 - 62, 1984) stellten monoklonale Antikörper der
Maus (Maus MAb) her, welche spezifisch an VZV oder ein
Glycoprotein von 105 - 118 Kilo-Dalton (kD) binden, welches in einer
mit VZV infizierten Zelle vorhanden ist und als gpIII oder gA
bezeichnet wird (in dieser Beschreibung im folgenden zu gpIII
abggekürzt; siehe Davison, A.J. et al, J. Virol. Band 57,
Seiten 1195 - 1197, 1986).
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Wenn jedoch ein monoklonaler Mausantikörper einem Menschen
verabreicht wird, wird er als ein heterologes Protein erkannt und
kann Nebenwirkungen wie etwa einen anaphylaktischen Schock
verursachen. Desweiteren ist bekannt, daß der Maus-MAb aufgrund
von invivo gegen den Maus-MAb produzierten menschlichen
Antikörpern rasch aus dem Blut verschwindet. Dies macht die
Vorteile eines Proteins mit geringer Toxizität und hoher
Stabilität wieder wett.
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Daher ist für die Behandlung von VZV-Infektionskrankheiten ein
menschlicher MAb (HuMAb) vonnöten.
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Als HuMAb gegen VZV bekannt sind HuMAb (Foung, S.K. et al,
J. Infect. Dis., Band 152, Seiten 280 - 285, 1985) gegen ein
Glycoprotein von VZV, welches als gpII oder gB bezeichnet wird
(im folgenden als gpII abgekürzt; siehe Davison, A.J. et al,
J. Virol. Band 57, Seiten 1195 - 1197, 1986), und HuMAb (siehe
Sugano, T. et al, Eur. J. Immunol., Band 17, Seiten 359 - 364
und die japanische Offenlegungsschrift Nr. 62-42933, und EP
Nr. 0 198 086 und USP Nr. 4950594) gegen ein Glycoprotein von
VZV, welches als gpI oder gC (im folgenden als gpI abgekürzt;
siehe Davison, A.J. et al, J. Virol. Band 57, Seiten
1195 - 1197, 1986).
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Die neutralisierende Aktivität von HuMAb gegen gpI hängt jedoch
von einem Komplement ab und daher ist die neutralisierende
Aktivität beträchtlich verringert, wenn das Komplement nicht
zugegeben wird. Desweiteren benötigt HuMAb gegen gpII für eine
neutralisierende Aktivität zwar nicht die Zugabe eines
Komplements, doch ist sein Neutralisationstiter (dargestellt als eine
Menge eines Antikörpers, der 50 % eines Virus neutralisiert)
geringer als der von HuMAb gegen gpI in Gegenwart eines
Komplements.
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Untersuchungen sind durchgeführt worden, bei welchen Maus-MAb
verwendet wurde, von welchem ein VZV-Antigen für das Verhindern
einer Infektion mit VZV am geeignetsten ist. Gemäß Keller et al
(Keller, P.M. et al, J. Virol., Band 52, Seiten 293 - 297,
1984) zeigte zwar ein Antikörper gegen gpIII eine hohe
neutralisierende Aktivität ungeachtet der Gegenwart oder Abwesenheit
eines Komplements, doch ein Antikörper gegen gpI neutralisierte
ein Virus nur mit der Zugabe eines Komplements und viele der
Antikörper gegen gpII neutralisierten das Virus nicht,
ungeachtet der Gegenwart oder Abwesenheit des Komplements. Ähnliche
Ergebnisse wurden von Grose, CH. et al (Grose, CH. et al, Inf.
Immun., Band 40, Seiten 381 - 388, 1983) und Forghani B. et al
enthüllt (Forghani B. et al, J. Virol., Band 52, Seiten
55 - 62, 1984). Desweiteren ist bekannt, daß ein MAb gegen das gpIII
von VZV das Ausbreiten von VZV von einer infizierten Zelle zu
einer nichtinfizierten Zelle inhibiert (Aktivität zur
Inhibierung von interzellulärer Infektion oder Aktivität zur
Inhibierung der Virus-Ausbreitung). Diese Aktivität wurde für MAb
gegen gpI oder gpII nicht gefunden.
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Es hat sich erwiesen, daß ein Antikörper gegen gpIII für eine
Prophylaxe und Behandlung von Varicella wichtig ist. Gemäß
Dubey L. et al (Dubey L. et al, J. Inf. Dis., Band 157, Seiten
882 - 888, 1988) wiesen bei Leukämiepatienten, welchen ein
Varicella-Impfstoff verabreicht wurde, die an Varicella leidenden
Patienten Antikörper gegen gpI und gpII, jedoch keine
Antikörper gegen gpIII auf. Von diesen Patienten wiesen diejenigen
Patienten, welche sich erholt hatten, einen erhöhten
Antikörpertiter gegen gpIII auf.
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Wie aus dem voranstehenden ersichtlich ist, ist versucht
worden, für die Prophylaxe und Behandlung von
VZV-Infektionskrankheiten einen HuMAb gegen das gpIII von VZV zu entwickeln,
welcher eine hohe virusneutralisierende Aktivität und eine
inhibierende Aktivität gegen das Ausbreiten des Virus aufweist,
doch der HuMAb gegen das gpIII von VZV wurde nicht erhalten.
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Es wird angenommen, daß ein Grund dafür, daß es im Vergleich
zum Erhalten von HuMAb gegen das gpII schwierig ist, HuMAb
gegen das gpIII zu erhalten, darin liegt, daß eine Menge von
Antikörpern gegen das gpIII, welche im menschlichen Körper
erzeugt werden, aufgrund der geringen Immunogenität des gpIII
gering ist. Bekannt ist, daß beim Immunisieren eines
Meerschweinchens mit einem Antigen die Produktion von Antikörpern gegen
das gpIII gering ist (Keller, P.M. et al, J. Virol. Methods,
Band 14, Seiten 177 - 188, 1986) und daß die Produktion von
Antikörpern gegen das gpIII im menschlichen Körper ebenfalls
gering ist (Brunell, P.A. et al, J. Infect. Dis., Band 156,
Seiten 430 - 435, 1987).
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Die oben erwähnte geringe Produktion des Antikörpers im
menschlichen Körper bedeutet, daß die Anzahl von Lymphozyten, welche
Antikörper gegen gpIII produzieren, klein ist und daß daher die
Wahrscheinlichkeit, Hybridome zu erhalten, welche HuMAb gegen
das gpIII produzieren und welche unter Verwendung dieser
menschlichen Lymphozyten hergestellt werden, gering ist. Dies
wird aus dem in Fig. 2 gezeigten Ergebnis eines von den
betreffenden Erfindern durchgeführten Versuchs klar.
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Desweiteren liegt ein anderer Grund für die Schwierigkeit,
HuMAb gegen das gpIII zu erhalten, darin, daß es sehr schwierig
ist, einen Antikörper gegen das gpIII mittels ELISA oder
dergleichen unter Verwendung von zerrissenen, mit VZV infizierten
Zellen als Antigen zu detektieren, wie sie gegenwärtig
verwendet werden (Grose et al. J. Infect. Dis., Band 157, Seiten 877
- 881, 1988). Dies wird ebenfalls aus dem in Fig. 3B gezeigten
Ergebnis eines von den betreffenden Erfindern durchgeführten
Versuchs klar.
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Im allgemeinen ist im Vergleich mit gpI und gpII nur eine sehr
geringe Menge des gpIII in einem Antigen enthalten, welches
durch Zerreißen von mit VZV infizierten Zellen erhalten wird,
daher war bei einem Screening-System unter Verwendung eines
solchen Antigens die Wahrscheinlichkeit, einen Antikörper gegen
das gpIII zu selektieren, sehr gering und die meisten mittels
eines solchen Screening-Systems selektierten MAbs waren
Antikörper, welche gpI oder gpII erkannten (Sugano et al, Eur. J.
Immunol., 17, 359 - 364, 1987).
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die betreffenden Erfinder schufen die vorliegende Erfindung,
indem sie die obengenannten verschiedenen Probleme anhand der
Verfahren lösten, welche im folgenden ausführlich beschrieben
werden.
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Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung HuMAb gegen das
Glycoprotein gpIII von VZV bereit.
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Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Hybridome bereit,
welche diesen HuMAb produzieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Figur 1 zeigt eine Fraktion von Antigenen, welche bei einer in
vitro-Immunisierung verwendet wurden. Fraktionen, welche
dadurch erhalten wurden, daß VZV einer Sucrose-Dichtegradienten-
Zentrifugation unterworfen worden waren, wurden auf einer
Kunststoffplatte immobilisiert und ein monoklonaler
Maus-Antikörper gegen gpIII wurde damit reagieren gelassen. Die Fraktion
Nr. 10 ist eine Fraktion, welche viel gpIII-Antigen enthält,
und deshalb wurde diese als ein Antigen bei einer Immunisierung
in vitro verwendet.
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Die Figuren 2A und 2B repräsentieren die Ergebnisse eines
Screenings mittels ELISA unter Verwendung einer Zellhomogenat
platte bzw. einer Zellmonolayerplatte. Zwar wurde jeder
Hybridom-Überstand in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen auf das
Reaktidnsvermögen in ELISA unter Verwendung einer
Zellhomogenatplatte und einer Zellmonolayerplatte getestet, doch von den
96 Vertiefungen reagierte nur eine Vertiefung stark mit der
Zellmonolayerplatte und nur schwach mit der Zellhomogenat
platte. Hybridome in dieser Vertiefung produzierten einen
antigpIII-HuMAb.
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Die Figuren 3A und 3B repräsentieren die jeweilige
ELISA-Reaktivität mit einer Zellmonolayerplatte und einer
Zellhomogenatplatte jeweils von anti-gpI-HuMAb (V2), anti-gpII-HuMAb (V1)
und anti-gpIII-HuMAb (V3). Der anti-gpIII-HuMAb reagierte stark
mit der Zellmonolayerplatte, doch nur schwach mit der
Zellhomogenatplatte.
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Die Figuren 4A und 4B zeigen Platten mit 96 Vertiefungen,
welche für das Screening mittels V-SIMA (Virus Spread Inhibition
Micro Assay = Microassay zum Nachweis der Inhibierung der
Virusausbreitung) verwendet wurden. Fig. 4B zeigt Fig. 4A auf
schematische Weise, worin leere Kreise Vertiefungen darstellen,
welche eine die Virusausbreitung inhibierende Aktivität zeigen.
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Fig. 5 repräsentiert eine Identifizierung von Antigenen durch
Immunpräzipitation oder Immunfällung. Anti-gpIII-HuMAb (V3)
immunpräzipitierten ein gpIII-Antigen von 118000 Dalton aus mit
VZV infizierten Zellen.
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Fig. 6 zeigt eine die Virusausbreitung hemmende Aktivität
verschiedener Mabs. Anti-gpIII-HuMAb (V3) zeigte eine 50 %ige
Aktivität zur Hemmung der Virusausbreitung bei einer
Konzentration von 1 µg/ml.
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Fig. 7 zeigt eine ADCC-Aktivität des anti-gpIII-HuMAb (V3). Der
V3 zeigte eine Zytotoxizität von ungefähr 10 % bei 20 ng/ml.
AUSFÜHRUNGSFORMEN ZUM DURCHFÜHREN DER ERFINDUNG
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Die betreffenden Erfinder erkannten, daß die Schwierigkeiten
bei der Herstellung von HuMAb gegen das Glycoprotein gpIII von
VZV in den folgenden drei Punkten begründet liegen, bewältigten
diese Probleme durch intensive Untersuchungen und etablierten
Hybridome, welche kontinuierlich HuMAb gegen das Glycoprotein
gpIII von VZV erzeugen.
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a) Die Anzahl von Zellen (B-Lymphozyten), welche Antikörper
gegen das gpIII von VZV im menschlichen Körper produzieren, ist
klein.
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b) Ein spezifisches und einfaches Verfahren zum Detektieren
von HuMAb, welcher an das gpIII von VZV bindet, ist vonnöten.
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c) Ein einfaches Verfahren zum Nachweisen einer antiviralen
Aktivität von HuMAb gegen das gpIII von VZV ist erforderlich.
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Als ein Mittel zum Lösen des oben erwähnten Problems (a) wurden
aufgrund der Unmöglichkeit, Menschen mit VZV oder mit dem
Glycoprotein gpIII von VZV als Antigen zu immunisieren,
menschliche, aus dem Körper entnommene Lymphozyten invitro mit einem
Antigen und Mitogen stimuliert, um Zellen zu vermehren, welche
einen Antikörper gegen das gpIII von VZV produzieren.
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Menschliche Lymphozyten werden aus menschlichem peripherem
Blut, Mandeln, Adenoiden, Knochenmark, Milz oder dergleichen
isoliert, doch vorzugsweise werden aus der Milz isolierte
Zellen verwendet.
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Als Antigen werden VZV, mit VZV infizierte Zellen, das
Glycoprotein gpIII von VZV oder dergleichen verwendet, und
vorzugsweise werden gereinigtes VZV oder Glycoprotein gpIII verwendet.
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Als Mitogen zum Stimulieren einer Differenzierung und
Vermehrung von Lymphozyten können Kermesbeerenmitogen (PWM),
Phytohämagglutinin (PHA), Concanavalin A, Protein A oder dergleichen
verwendet werden, doch vorzugsweise wird PWM verwendet.
Anstelle eines Mitogens können auch ein B-Zell-Wachstumsfaktor
(BCGF), ein B-Zell-Differenzierungsfaktor (BCDF), Interleukin 2
(IL-2), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 6 (IL-6) oder
dergleichen als ein Differenzierungs-/Wachstumsfaktor für
Lymphozyten verwendet werden.
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Eine Konzentration von Antigen beträgt 1 ng/ml bis 10 µg/ml,
vorzugsweise 1 bis 10 ng/ml; eine Konzentration von Lymphozyten
beträgt zweckmäßigerweise 1 x 10&sup5; bis 1 x 10&sup7;/ml; eine
Kulturtemperatur beträgt 35 bis 40 ºC; und ein Kulturzeitraum beträgt
4 bis 14 Tage, vorzugsweise 6 bis 8 Tage. Das Kulturmedium ist
vorzugsweise ein Medium, welches 5 bis 20% fötales Kalbsserum
enthält, beispielsweise RPMI 1640 oder GIT (Nippon Seiyaku
K.K., Tokyo, Japan).
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Solchermaßen erhaltene, in vitro stimulierte menschliche
Lymphozyten werden mittels eines bekannten Verfahrens in Zellinien
mit einer Fähigkeit des endlosen Wachstums transformiert.
Beispielweise werden sie mittels Zellfusion mit Maus-Myelomzellen
oder menschlichen Myelomzellen, oder mit Heteromyelomzellen
(japanische Öffenlegungsschrift Nr. 61-124380) in Hybridzellen
umgewandelt oder sie werden in Zellinien transformiert, welche
durch Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) die Fähigkeit
des endlosen Wachstums aufweisen.
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Bei der Transformation mit EBV zum Erhalten einer Zellinie,
welche kontinuierlich und stabil HuMAb produziert, werden die
EBV-transformierten Zellen vorzugsweise mit Maus-Myelomzellen
verschmolzen.
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Die solchermaßen erhaltenen Zellinien, welche HuMAb gegen das
gpIII von VZV produzieren, werden durch im folgenden
beschriebene Verfahren (Mittel zum Lösen der Probleme b) und c)) einem
Screening unterworfen, kloniert und als eine Zellinie
etabliert, welche stabil HuMAb gegen das gpIII von VZV produziert.
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Zum Lösen des oben erwähnten Problems b) richteten die
betreffenden Erfinder das folgende neuartige Screening-System ein.
Die betreffenden Erfinder fanden, daß ein Maus-MAb, welcher an
das gpIII von VZV bindet, auch stark an eine ELISA-Platte
bindet, auf welcher intakte, mit VZV infizierte Zellen mit
Formaldehyd oder Glutaraldehyd immobilisiert worden sind (Monolayer
platte), während er nur gering an eine ELISA-Platte bindet, auf
welcher eine Suspension aus durch Ultraschall zertrümmerten,
mit VZV infizierten Zellen immobilisiert worden war
(Homogenatplatte). Andererseits reagierte ein MAb, welcher sowohl mit gpI
als auch mit gpII von VZV reagiert, stark mit beiden ELISA-
Platten. Demgemäß wurde zum Auswählen eines HuMAb, welcher
spezifisch an das gpIII von VZV bindet, ein HuMAb ausgewählt,
welcher mit einer Monolayerplatte stark reagiert, jedoch mit einer
Homogenatplatte nicht reagiert.
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Diese ELISAs werden in den Beispielen ausführlich beschrieben.
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Als ein Mittel zum Lösen des obengenannten Punkts c) bemerkten
die betreffenden Erfinder, daß ein MAb gegen gpIII von VZV im
Gegensatz zu anti-gpI-MAb und anti-gpII-MAb die Zelle-zu-Zelle-
Infektion eines Virus inhibiert, wie von Keller P.M. et al
gezeigt (Keller P.M. et al, Virology Band 157, Seiten 526 - 533,
1987), sie erhöhten die Empfindlichkeit, so daß diese Aktivität
für eine winzige Menge von in einem Hybridom-Überstand
enthaltenen Antikörper detektiert werden kann, und sie entwickelten
ein Verfahren, mittels welchem eine winzige Menge eines
Antikörpers rasch, einfach und quantitativ gemessen werden kann (V-
SIMA, Virus Spread Inhibition Micro Assay). Dieses Verfahren
wird nicht beschrieben.
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VZV-empfindliche Zellen wie etwa primäre Affennierenzellen,
menschliche Myelomzellen oder menschliche fötale
Fibroblastzellen wurden auf einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen in
einer Konzentration von 1 x 10&sup4; bis 1 x 10&sup6; Zellen/ml verteilt
und bei 35 bis 40 ºC einen bis fünf Tage lang kultiviert, um
eine Zell-Monoschicht zu bilden. Alle mit VZV infizierten
Zellen können verwendet werden, doch vorzugsweise werden
menschliche Embryo-Lungenfibroblastzellen (HEL), MRC-5 oder WI-38
verwendet. Auch kann jedes Kulturmedium, in welchem die
obengenannten Zellen gezüchtet werden, verwendet werden, doch
vorzugsweise wird Eagle's Minimum Essential Medium (Eagle's MEM)
oder DMEM (Dulbecco's Minimum Essential Medium) verwendet.
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Als nächstes wird das Kulturmedium abgesaugt und in dem
Kulturmedium suspendierte, mit VZV infizierte Zellen werden mit einer
Konzentration von 2 x 10² bis 2 x 10&sup5; Zellen/ml verteilt. Die
Zellen werden durch Kultivieren von mit VZV infizierten Zellen
zusammen mit nicht mit VZV infizierten Zellen bei einem
Verhältnis von 1:5 bis 1:20 hergestellt und 1 bis 3 Tage lang
kultiviert. Vorzugsweise werden die Zellen bei einer Konzentration
von 1 x 10&sup5; bis 1 x 10&sup7; Zellen/ml in einem zum Gefrieren
geeigneten
Medium suspendiert, welches 4 bis 40 % fötales
Rinderserum oder Kalbsserum und 5 bis 10% Dimethylsulfoxid enthielt,
verteilt und gefriergetrocknet. Je geringer die Anzahl von mit
VZV infizierten Zellen, desto höher ist die
V-SIMA-Empfindlichkeit, und daher werden die Zellen vorzugsweise in einer Menge
von 25 bis 100 µl pro Vertiefung bei einer Konzentration von
4 x 10³ bis 2 x 10&sup4; Zellen/ml aufgeimpft.
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Als nächstes werden 100 bis 200 µl/Vertiefung einer einen
Antikörper enthaltenden Nährlösung zugegeben und 1 bis 3 Tage lang
bei 35 bis 40 ºC inkubiert. Vorzugsweise wird die Inkubation
weitergeführt, bis ein zytopathischer Effekt bei 30 bis 80 %
der Zellen in einer Vertiefung, in welcher nur mit VZV
infizierte Zellen aufgeimpft worden waren, auftritt. Als nächstes
wird jede Vertiefung mehrere Male mit 0,01 M
Phosphatpufferlösung (pH 6,5 bis 7,5) (PBS), welche 0,15 M Natriumchlorid
enthält, gewaschen und mit PBS, welche 0,05 bis 0,2 %
Glutaraldehyd oder 0,1 bis 10% Formaldehyd enthält, fixiert.
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Nach weiterem Waschen mit PBS wird eine 1 bis 5%
Rinderserumalbumin enthaltende PBS (Blocklösung) verteilt, um bei 37 ºC
mehr als eine Stunde lang zu blocken. Falls erforderlich, kann
die Platte mit der Blocklösung bei 4 ºC einen Monat lang
aufbewahrt werden. Nachdem jede Vertiefung mit 1%
Rinderserumalbumin enthaltender PBS (Waschlösung) gewaschen worden ist, werden
infizierte Zellen mittels eines Enzymimmunoassays gemäß dem
folgenden Verfahren angefärbt. Beispielsweise kann als erster
Antikörper jeder mit einem VZV-Antigen spezifisch reaktiver
Antikörper verwendet werden, doch vorzugsweise werden ein MAb,
polyklonale Kaninchenantikörper oder dergleichen gegen gpI oder
gpII verwendet. Nach dem Reagierenlassen des ersten Antikörpers
bei Raumtemperatur wird er durch Waschen entfernt und ein mit
Enzym markierter zweiter Antikörper, welcher mit dem ersten
Antikörper reagiert, wird für eine Reaktion dazugegeben. Als
Enzym werden Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase
oder dergleichen verwendet, doch vorzugsweise wird
Meerrettichperoxidase
verwendet. Der zweite Antikörper wird bei
Raumtemperatur reagieren gelassen und durch Waschen entfernt, und eine
durch die Enzymreaktion anzufärbende Substratlösung wird
zugegeben.
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Wenn zum Beispiel eine Peroxidase als Enzym verwendet wird,
wird H&sub2;O&sub2; als Substrat und TMBZ-HCl (Tetramethylbenzydin-HCl)
oder 4-Chloro-1-naphthol als Färbemittel verwendet.
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Die Substratlösung wird durch TBMZ-HCl gefärbt und die
Absorption bei einer Wellenlänge von 650 nm wird quantitativ
bestimmt. Die Reaktion kann auch durch die Zugabe von 1 N
Schwefelsäure beendet werden und eine Absorption bei einer
Wellenlänge von 450 nm kann gemessen werden. Wenn 4-Chloro-1-naphthol
zugegeben wird, wird das Farbpigment unlöslich und wird auf
fixierten, mit VZV infizierten Zellen abgelagert, und daher ist
eine Bestimmung mit dem bloßen Auge möglich. Die Färbung
mittels eines Enzymimmunoassays ist nicht auf eine besondere
Methode beschränkt und jede Methode kann verwendet werden, durch
welche spezifisch mit VZV infizierte Zellen angefärbt werden,
oder das Färben eines Substrats, wodurch die Anzahl der mit VZV
infizierten Zellen dargestellt wird. Beispielsweise können ein
mit einem Enzym direkt markierter erster Antikörper oder ein
mit Biotin gekoppelter erster Antikörper und ein mit Avidin
gekoppeltes Enzym verwendet werden.
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Ein Substrat sollte in Übereinstimmung mit einem bestimmten
Enzym gewählt werden und die Art und Konzentration hiervon
unterliegen keinen Beschränkungen.
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So kann durch Anfärben oder Färben eines Substrats eine Menge
von mit VZV infizierten Zellen bestimmt werden und das Ausmaß,
in welchem ein Antikörper die Ausbreitung von VZV von Zelle zu
Zelle inhibiert, kann bestimmt werden.
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Wie oben beschrieben, ist es möglich, menschliche Lymphozyten,
welche einen Antikörper gegen das gpIII von VZV produzieren,
durch Stimulieren in vitro zu vermehren, die Zellen unbegrenzt
durch Zellfusion oder EBV-Transformation zu vermehren, eine
Zellinie zu selektieren, welche HuMAb produziert, vorzugsweise
menschliches IgG, welches spezifisch an das gpIII von VZV
bindet, indem eine Zellmonolayerplatte und eine
Zellhomolayerplatte verwendet werden, und eine Zellinie, welche HuMAb mit
einer hohen Aktivität zum Verhindern der Ausbreitung von VZV
von Zelle zu Zelle produziert, mittels eines V-SIMA-Verfahrens
zu selektieren und zu etablieren.
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Die etablierte Zellinie wird stabil in einem für das
Zellwachstum geeigneten Medium gezüchtet, beispielsweise in einem mit
Rinderserum oder Kalbssserum angereicherten RPMI 1640, DMEM,
HAM, GIT oder dergleichen, oder in einem serumfreien Medium, um
HuMAb in das Medium abzuscheiden.
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Die betreffende Zellinie kann eingefroren werden und kann durch
ein geeignetes Verfahren in großen Mengen gezüchtet werden.
Eine solche Zellinie oder die Replikationsform solcher Zellen
fallen in den Bereich der vorliegenden Erfindung. Desweiteren
sind Zellinien, welche HuMAb gegen das gpIII von VZV
produzieren und im wesentlichen gleich sind wie die zuvor erwähnte
Zellinie und produzierten HuMAbs, ebenfalls in dem Bereich der
vorliegenden Erfindung eingeschlossen, ungeachtet des
Verfahrens zu ihrer Herstellung.
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Zwar ist HuMAb gegen gpIII von VZV für die Prophylaxe und
Behandlung von VZV-Infektionskrankheiten und dergleichen von
Nutzen, doch ist dies noch nicht belegt worden.
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Der Grund für die Schwierigkeit, eine Zellinie zu etablieren,
welche HuMAb gegen das gpIII von VZV produziert, liegt darin,
daß die Anzahl der Zellen, welche einen gegen das gpIII von VZV
spezifischen Antikörper produzieren, bei den menschlichen
Lymphozyten klein ist und noch keine effektive Methode zum
Screening des Antikörpers etabliert worden ist.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Vermehren von Lymphozyten, welche einen gegen gpIII spezifischen
Antikörper durch eine in vitro-Stimulierung von Lymphozyten
produzieren, und zum effektiven screening des Antikörpers erreicht
worden und Zellinien, welche einen abgeleiteten HuMAb gegen das
gpIII von VZV produzieren, sind etabliert worden. Die
etablierten Zellinien können gezüchtet werden, während sie stabil HuMAb
produzieren, und eine große Menge menschlicher monoklonaler
anti-gpIII-Antikörper kann produziert werden.
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Zellinien der vorliegenden Erfindung können in einer großen
Menge gezüchtet werden, um eine große Menge an HuMAb gegen das
gpIII von VZV in einem Kulturüberstand zu produzieren. Der
HuMAb wird konzentriert und mittels
Anionenaustauschchromatographie, Kationenaustauschchromatographie,
Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und dergleichen
gereinigt, und berechtigt zu Hoffnungen als wirksame Pharmazeutika
für die Prophylaxe oder die Behandlung von
VZV-Infektionskrankheiten. Vorteile des als Pharmazeutika für die Prophylaxe oder
die Behandlung von VZV-Infektionskrankheiten verwendeten
vorliegenden HuMAb sind eine hohe Sicherheit, eine lange
Halbwertszeit im Blut und ein hoher antiviraler Titer.
Beispiele
a) Herstellung eines VZV-Antigens für die Stimulierung in
vitro
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Zu als Monolayer in einem Kulturkolben mit einer Bodenfläche
von 150 cm² (CORNING N.Y. 14831, U.S.A.) kultivierten
HEL-Zellen (menschliche Embryolungenfibroblastzellen) wurde 1/5
Volumen mit VZV infizierte HEL-Zellen zugegeben und eine Inkubation
bei 37 ºC in 5% CO&sub2; durchgeführt (im folgenden sind die
Kulturbedingungen 37ºC und 5% CO&sub2;, wenn nicht anders angegeben).
Zu einem Zeitpunkt, an welchem der zytopathische Effekt bei
ungefähr 80% der Zellen auftrat, wurden die Monolayerzellen
einmal mit PBS gewaschen und mit PBS, welche 1 mM EDTA enthielt,
abgelöst, um die Zellen zu gewinnen. Die Zellen wurden zweimal
mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gewaschen, in 1 ml
SPGA-Lösung/1 x 107 Zellen (10 mM Kaliumphosphatpufferlösung,
pH 7,4, welche 0,218 M Sucrose, 0,0049 M Natriumglutamat und
1% BSA enthielt) suspendiert und unter Verwendung eines
Ultraschallgeräts (MS-50 HEAT SYSTEMS, Ultrasonics INC. N.Y.,
U.S.A.) bei 50 W, 23 kHz, eine Minute lang mit Ultraschall
behandelt, um die Zellen zu zerreißen. Zelltrümmer wurden durch
Zentrifugation bei 3000 U/min über 15 Minuten entfernt und
intrazelluläre Partikel wurden durch Zentrifugation bei
12500 U/min (Hitachi RPR20-2) entfernt. Dann wurde ein 20
% - 80% Sucrosedichtegradient (25 ml) in 20 mM
Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4), welche 1 mM EDTA enthielt, mit 8 ml des
Überstands überschichtet und bei 27000 U/min (Hitachi SPR28A) bei
4 ºC eine Stunde lang zentrifugiert.
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Von den erhaltenen 2 ml-Fraktionen wurden 10 µl jeder Fraktion
mit 40 µl 0,05 M Carbonatpufferlösung (pH 9,5) verdünnt; die
verdünnte Lösung wurde in die Vertiefungen einer Platte mit
96 Vertiefungen (Falcon 3912, Becton Dickinson and Co., Oxnard,
CA 93030, U.S.A.) zum Reagieren gegeben und das Protein in
jeder Vertiefung wurde fixiert. Nach dem Blocken der Vertiefungen
mit PBS, welche 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, wurden
50 µl eines 1 µg/ml Maus-Antikörpers gegen gpIII in jede
Vertiefung zugegeben und bei 37 ºC eine Stunde lang reagieren
gelassen. Nachdem die Vertiefungen dreimal mit 1% BSA
enthaltender PBS gewaschen worden waren, wurden 50 µl eines mit
alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegenantikörpers gegen Maus-IgG
(TAGO INC. Burlingame, CA 94010, U.S.A.) in jede Vertiefung
dazugegeben und wieder bei 37 ºC eine Stunde lang reagieren
gelassen. Nachdem die Vertiefungen dreimal mit 1% BSA
enthaltender PBS gewaschen worden waren, wurden 100 µl 0,5 M
Diethanolamin-HCl (pH 9,5), welches 1 mg/ml
p-Nitrophenylphosphat-2-natriumsalz enthielt, in jede Vertiefung zugegeben und bei
Raumtemperatur 46 Minuten lang reagieren gelassen. Die einer gelben
Farbe entsprechende Absorption bei 405 nm wurde mittels eines
Mikroplattenauswertegeräts (Molecular Devices, U.S.A.)
gemessen, eine die größte Menge an gpIII enthaltende Fraktion wurde
mittels Ultraviolettstrahlung sterilisiert und als Antigen für
eine Stimulierung invitro verwendet. Figur 1 zeigt die
Reaktionsfreudigkeit jeder Fraktion gegenüber monoklonalen
antigpIII-Mausantikörpern. In diesem Fall wurde die Fraktion Nr. 10
als ein Antigen für die Stimulierung in vitro verwendet.
b) Immunisierung von Lymphozyten mit gpIII
-
Menschliche Milzlymphozyten wurden in mit 10 FCS angereichertem
RPMI 1640-Medium (welches 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat,
0,02 mg/ml Serin, 80 µg/ml Gentamicin enthielt) suspendiert und
Ficoll (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., New Jersey 08855,
U.S.A.) wurde vorsichtig mit der Suspension überschichtet und
bei 1500 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert, um an der
Grenzfläche vorhandene Lymphozyten abzutrennen. Die solchermaßen
erhaltenen Lymphozyten wurden durch Zentrifugation zweimal mit
10% FCS enthaltendem RPMI 1640 gewaschen und auf 3 X 10&sup6;
Zellen/ml eingestellt. Antigen für die Stimulation invitro (VZV
Oka) und PWM (Kermesbeerenmitogen, GIBCO Laboratories Grand
Island, N.Y. 14072, U.S.A.) wurden zu Mengen von 50 ng/ml bzw.
20 µg/ml dazugegeben und eine Inkubation wurde 7 Tage lang
durchgeführt.
c) Erzeugung von Hybridomen durch Zellfusion
-
Zuerst wurden 10&sup7; der wie oben unter b) beschrieben
stimulierten menschlichen Lymphozyten und 2 x 10&sup7; Mausmyelomzellen P3 x
63 Ag8U1 (P3U-1) gemischt und die Mischung wurde dann durch
Zentrifugieren einmal mit RPMI 1640 gewaschen und bei
1500 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert, um ein Zellpellet zu
erhalten. Dann wurde 1 ml 35 %ige Polyethylenglycollösung
(5,75 ml RPMI. 1640 + 3,5 ml Polyethylenglycol #1000 + 0,75
Dimethylsulfoxid) dazugegeben und die Zellen wurden vorsichtig
suspendiert. Nach einer Minute wurde 1 ml RPMI 1640
dazugegeben, nach 2 Minuten wurden 2 ml RPMI 1640 dazugegeben, nach
weiteren 2 Minuten wurden 4 ml HAT-GIT-Medium (GIT-Medium
(Nippon Seiyaku, Tokyo), welches 95 µm Hypoxanthin, 0,4 µm
Aminopterin, 1,6 pM Thymidin, 5% fötales Rinderserum, 80 µg/ml
Gentamicin enthielt), dazugegeben und nach weiteren 2 Minuten
wurden 8 ml HAT-GIT-Medium dazugegeben, um schließlich 50 ml
Zellsuspension mit HAT-GIT-Medium herzustellen. Diese
Suspension wurde auf eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (Falcon
3075, Becton Dickinson and Co., Oxnard, CA 93030, U.S.A.)
verteilt, auf welche Zellen des Exsudats aus dem Bauchraum von
Mäusen in einer Menge von 10&sup4;/Vertiefung geimpft worden waren,
und eine Inkubation wurde bei 37 ºC in 5% CO&sub2; durchgeführt,
während eine Hälfte des Mediums mit frischem HT-GIT (Medium,
bei welchem Aminopterin aus dem HAT-GIT weggelassen wurde) in
einwöchigen Abständen ausgetauscht wurde. Nach ungefähr 3
Wochen wurden mehrere Kolonien von Hybridomzellen pro Vertiefung
erhalten.
d) Screening von anti-gpIII-Antikörpern: ELISA
-
Anti-gpIII-Antikörper, welche in Kulturüberständen von
Hybridomen hergestellt wurden, welche wie oben unter c) beschrieben
erhalten worden waren, wurden mittels ELISA unter Verwendung
von 2 Antigenplatten (Monolayerplatte und Homolayerplatte)
gescreent.
-
Die Monolayerplatte war eine Platte mit 96 Vertiefungen, auf
welcher mit VZV infizierte Zellen mit Glutaraldehyd fixiert
waren, und wurde wie folgt präpariert.
-
Menschliche Embryolungenzellen (im folgenden auf HEL-Zellen
abgekürzt), welche in Eagle's MEM (im folgenden auf MEM
abgekürzt),
das 10% fötales Kalbsserum (FCS) enthielt, kultiviert
worden waren, wurden mit 0,25 %iger Trypsinlösung dispergiert,
mit 10% FCS enthaltendem MEM auf 10&sup5; Zellen/ml eingestellt und
auf einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von
0,1 ml/Vertiefung verteilt. Nach Kultivieren bei 37 ºC in 5%
CO&sub2; über 2 Tage wurde ein HEL-Zell-Monolayer durch Zugeben von
mit VZV (Oka-Stamm) infizierten HEL-Zellen in einer Menge von
10³/Vertiefung infiziert. Nach weiterem zweitägigen Kultivieren
wurden beim Auftreten eines zytopathischen Effekts (CPE) in
allen Zellen die Zellen zweimal mit PBS (+) (PBS, welche
1 mM CaCl&sub2;, 1mM MgCl&sub2; enthielt) gewaschen und mit 0,1%
Glutaraldehyd enthaltender PBS (+) bei 37 ºC 10 Minuten lang
fixiert. Nach dem Fixieren wurden die Zellen dreimal mit PBS (-)
gewaschen, 200 µl/Vertiefung von 1% Rinderserumalbumin (BSA)
enthaltender PBS (+) wurden verteilt und die Platte wurde eine
Stunde lang stehengelassen und bei 4 ºC bis zur Verwendung
aufbewahrt.
-
Die Homogenatplatte war eine Platte mit 96 Vertiefungen, welche
mit einem Antigen-Homogenat überzogen worden war, welches durch
Ultraschallbehandlung von mit VZV infizierten Zellen
hergestellt worden war, und wurde wie folgt präpariert.
-
Zu HEL-Zellen, welche in einem Kulturkolben mit einer
Bodenfläche von 150 cm² (ungefähr 10&sup7; Zellen/Kulturkolben) gezüchtet
worden waren, wurden mit VZV (Oka-Stamm) infizierte Zellen in
einer Menge von 2 x 106 Zellen pro Kolben zugegeben und eine
Inkubation bei 37 ºC in 5% CO&sub2; über 2 Tage hinweg
durchgeführt. Nach 2 Tagen, als der CPE in allen Zellen auftrat,
wurden die infizierten Zellen mit PBS, welche 1 mM
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielt, gesammelt, dreimal mit PBS (+)
durch fünfminütiges Zentrifugieren bei 1500 U/min gewaschen.
Dann wurden 10&sup7; infizierte Zellen in 1 ml PBS (+), welche 1 mM
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) enthielt, suspendiert und
bei 50 W eine Minute lang mit Ultraschall behandelt (Microson
Ultrasonics Cell Disrupter MS 50, 23 kHz, HEAT
SYSTEMS-ULTRASONICS INC. N.Y., U.S.A.).
-
Die zerrissenen infizierten Zellen wurden 10 Minuten lang bei
3000 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde als Antigen-
Homogenat verwendet. Das solchermaßen erhaltene Antigen wurde
in PBS (+) mit einer Proteinkonzentration von 4 µg/ml
suspendiert und die Suspension wurde in Mengen von 50 µl/Vertiefung
auf einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen (Falcon 3912)
verteilt und bei 37 ºC eine Stunde lang reagieren gelassen, um die
Platte mit dem Antigen zu beschichten. Nachdem jede Vertiefung
mit 1% BSA enthaltender PBS (+) (Waschpufferlösung) gewaschen
worden war, wurde 1% BSA enthaltende PBS (+) dazugegeben und
die Platte wurde bei 37 ºC eine Stunde lang stehengelassen
(Blocking) und bei 4 ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Zwei
Arten von solchermaßen präparierten Platten wurden verwendet, um
ELISA wie folgt durchzuführen. Zuerst wurden 150 µl/Vertiefung
des Kulturüberstands der wie oben unter c) beschrieben
erhaltenen Hybridome genommen und dann wurden jeweils 50 ml des
Kulturüberstands in die Vertiefungen der Monolayerplatte und der
Homogenatplatte gegeben und bei Raumtemperatur eine Stunde lang
reagieren gelassen. Nachdem die Vertiefungen dreimal mit der
Waschpufferlösung gewaschen worden waren, wurden 50
µl/Vertiefung eines zweiten Antikörpers zugegeben. Als der zweite
Antikörper wurden ein mit Meerrettichperoxidase konjugierter
Ziegenantikörper gegen menschliches IGG (TAGO INC. Burlingame,
CA 94010, U.S.A.), welcher tausendfach mit 1% BSA enthaltender
PBS verdünnt worden war, für die Monolayerplatte und ein mit
alkalischer Phosphatase konjugierter Ziegenantikörper gegen
menschliches IGG (TAGO), welcher zweitausendfach mit 1% BSA
enthaltender PBS verdünnt worden war, für die Homogenatplatte
verwendet. Nach einer einstündigen Reaktion bei Raumtemperatur
und dreimaligem Waschen der Vertiefungen mit der
Waschpufferlösung wurden 100 Ml/Vertiefung einer Substratlösung zugegeben.
Die Substratlösung war eine 0,1 M Citrat-phosphatpufferlösung
(pH 9,5), welche 5 mM Wasserstoffperoxid und 0,4 mg/ml TMBZ
(Tetramethylbenzidinhydrochlorid: Dojin Kagaku Kenkyusho,
Kumamoto, Japan) enthielt, für die Monolayerplatte bzw. 0,5 M
Diethanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 9,5), welche 0,6 mg/ml
p-Nitrophenylphosphat-2-natriumsalz enthielt, als ein Substrat
und 0,25 mM Magnesiumchlorid für die Homogenatplatte.
-
Nach der Zugabe des Substrats wurde die Absorption mittels
eines Mikroplattenauswertegeräts gemessen (UV max Molecular
Devices, Palo Alto, CA 94304, U.S.A.). Im Fall der Monolayerplatte
wurde nach dem Zugeben von 0,1 N Schwefelsäure in einer Menge
von 100 µl/Vertiefung zum Beenden des Anfärbens die Absorption
bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, und im Fall der
Homogenatplatte wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von
405 nm gemessen.
-
Ein Screening wurde durchgeführt, indem Vertiefungen ausgewählt
wurden, welche auf der Monolayerplatte stark gefärbt, auf der
Homogenatplatte jedoch nur schwach gefärbt waren, in Anbetracht
von Eigenschaften wie etwa derjenigen, daß der
anti-gpI-Antikörper und der anti-gpII-Antikörper zwar stark sowohl mit der
Monolayerplatte als auch der Homogenatplatte reagieren, daß
aber der anti-gpIII-Antikörper nur schwach mit der
Monolayerplatte reagiert.
-
Wenn Hybridom-Überstände in der Platte mit 96 Vertiefungen
unter Verwendung einer Homogenatplatte (A-Seite von Fig. 2) und
einer Monolayerplatte (B-Seite von Fig. 2) gescreent wurden,
lieferte nur eine Vertiefung (Pfeil) einen Antikörper gegen das
gpIII. Dies zeigt, daß es schwierig ist, einen anti-gpIII-HuMAb
durch ein eine herkömmliche ELISA-Methode verwendendes
Screening zu selektieren.
-
Die Reaktionsfreudigkeit von anti-gpl-HuMAb (V2), anti-gpII-
HuMAb (V1) und anti-gpIII-HuMAb (durch die vorliegende
Erfindung erhaltener menschlicher MAb V3) mit einer Monolayerplatte
und einer Homogenatplatte ist in den Figuren 3A bzw. 3B
gezeigt.
e) Screening durch antivirale Aktivität: V-SIMA-Methode (Virus
Spread Inhibition Microassay)
-
Anti-gpIII-HuMAb, welche in unter c) erhaltenen
Hybridomkulturüberständen produziert worden waren, wurden zusätzlich zu ELISA
durch das V-SIMA-Verfahren gescreent. Die HEL-Zell-Monoschicht
wurde in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen kultiviert,
welcher mit VZV (Oka-Stamm) infizierte Zellen (50 µl/Vertiefung
von 4000/ml infizierten Zellen) in einer Menge von
200/Vertiefung zugegeben worden waren, und sofort wurden 150
µl/Vertiefung des unter c) erhaltenen Hybridomkulturüberstands
zugegeben. Die Zellen wurden bei 37 ºC in 5% CO&sub2; 2 Tage lang
kultiviert, zweimal mit PBS (+) gewaschen und mit 0,1%
Glutaraldehyd enthaltender PBS (+) bei 37 ºC 10 Minuten lang fixiert.
Nach dem Fixieren wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS (+),
200 µl/Vertiefung von 1% BSA enthaltender PBS (+) wurden
zugegeben und die Platte wurde bei 37 ºC eine Stunde lang zum
Blokken stehengelassen. Nach Absaugen des Überstands wurden 50 µl/
Vertiefung eines 1 µg/ml V2 (anti-gpI-HuMAb) zugegeben und bei
37 ºC eine Stunde lang reagieren gelassen. Nachdem die
Vertiefungen dreimal mit der unter d) verwendeten Waschpufferlösung
gewaschen worden waren, wurden 50 µg/Vertiefung 200fach
verdünnter, mit Meerrettichperoxidase markierter Ziegenantikörper
gegen menschliches IgG zugegeben und bei 37 ºC eine Stunde lang
reagieren gelassen. Nach dreimaligem Waschen der Vertiefungen
mit der Waschpufferlösung wurden 100 µl/Vertiefung einer
Substratlösung, umfassend 0,05 M Tris-HCl (pH 7,4), welche 5 mM
Wasserstoffperoxid und 0,2 mg/ml 4-Chloro-1-naphthol (HRP
Farbentwicklungsreagens, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804,
U.S.A.) enthielt, zur Farbbildung zugegeben.
-
Hybridome in Vertiefungen, welche eine die Ausbreitung von
Viren inhibierende Aktivität zeigten (schwach gefärbte
Vertiefungen) wurden selektiert und kloniert. Eine Kulturplatte mit
96 Vertiefungen für V-SIMA, welche für das Screening verwendet
wurde, ist in Fig. 4 gezeigt. Hier sind die V-SIMA-positiven
Hybridome C5, F9 und G7.
f) Klonieren
-
Unter d) und e) erhaltene Hybridome wurden mittels eines
Verfahrens der begrenzten Ausdünnung kloniert, wobei aus dem
Bauchraum exsudierte Zellen von 8 bis 10 Wochen alten
ICR-Mäusen in einer Menge von 10&sup4;/Vertiefung als Feeder-Zellen auf
eine Platte mit 96 Vertiefungen aufgeimpft wurden. Gescreente
Zellen wurden mit 5% FCS enthaltendem GIT-HAT verdünnt und
dazugegeben, so daß jede Vertiefung 1 bis 10 Zellen enthielt.
Klonierte Hybridome, welche durch Kultivieren über 2 bis 3
Wochen gezüchtet worden waren, wurden nochmals durch das zuvor in
d) und e) beschriebene Verfahren gescreent und auf gleiche
Weise nochmals gescreent. Auf diese Weise wurde das den
antigpIII-HuMAb produzierende Hybridom (V3) etabliert.
g) Züchten von Hybridomen und Antikörperherstellung
-
Es wurde gefunden, daß die solchermaßen erhaltenen Hybridome in
10% FCS enthaltendem RPMI 1640-Medium, GIT-Medium und
serumfreiem Medium ITES (ein Volumenteil RPMI 1640, ein Volumenteil
DMEM, ein Volumenteil F12, 8,5 µg/ml Insulin, 2 µg/ml
Transferrin, 20 pm Ethanolamin, 2,5 x 10&supmin;³ M Selenit) gezüchtet werden
können und einen Antikörper stabil über mindestens 5 Monate
produzieren.
-
Der in dem erhaltenen Kulturüberstand enthaltene Antikörper
konnte durch Adsorption auf Protein A Sepharose 4B (Pharmacia
Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und Eluierung mit einer
Pufferlösung mit niedrigem pH wie etwa 0,1 M Acetatpufferlösung
(pH 3,0), welche 0,5 M Natriumchlorid enthielt, gereinigt
werden. Beispielsweise enthielt ein Überstand, welcher durch
Kultivieren in GIT-Medium bei einer Konzentration von 5 x 10&sup5;
Zellen/ml über Nacht erhalten wurde, 3 µg/ml Antikörper, und 5
Liter des Kulturüberstands wurden mittels Protein A Sepharose 4B
gereinigt, wodurch ungefähr 10 mg HuMAb erhalten wurden.
-
Die solchermaßen erhaltene H-Ketten-Unterklasse des HuMAb wurde
durch ein SRID-Verfahren bestimmt (Serotec Ltd., Oxford, Ox 51
BR, England), und der L-Ketten-Typ wurde mittels ELISA unter
Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten
Ziegenantikörpers gegen menschliches Lambda (TAGO) und eines mit
alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegenantikörpers gegen
Kappa (TAGO) bestimmt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der
V3 IgGl, K (Kappa) ist.
h) Identifikation von erkanntem Antigen
-
Ein von dem wie oben unter g) beschrieben erhaltenen HuMAb
erkanntes Antigen wurde mittels Immunpräzipitation unter
Verwendung einer SDS-PAGE
(Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese) identifiziert.
-
HEL-Monolayerzellen (5 x 10&sup6;/Flasche), welche in einer
Kulturflasche mit einer Bodenfläche von 75 cm² gezüchtet worden
waren, wurden mit 1/5 Menge (106 Zellen/Flasche) von mit VZV
(Oka-Stamm) infizierten Zellen geimpft und nach 24 Stunden,
wenn mindestens bei 80% ein zytopathischer Effekt (CPE)
auftrat, wurde eine weitere Inkubation in einem Medium, welches
18,5 MBq [³&sup5;S]-Methionin (> 48 TBq/mmol Amersham International
plc, Buckinghamshire, HP 79 LL, England) enthielt, 18 Stunden
lang durchgeführt, um das virale Antigen mit Isotopen zu
markieren. Das verwendete Kulturmedium war 1/10 Methionin-MEM,
welches 2% dialysiertes FCS enthielt.
-
Infizierte Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, in 2 mM
EDTA-PBS suspendiert, ein weiteres Mal mit PBS (+) gewaschen
und bei 1000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert, um ein Pellet
zu bilden.
-
Zu diesem Zellpellet wurden 3 ml/5 x 10&sup6; Zellen einer
RIPA-Pufferlösung (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), welche 1% Triton X-100,
1% Natriumdeoxycholsäureester (DOC), 0,1%
Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,15 M Natriumchlorid, 1 mM
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
enthielt) zugegeben und die Zellen wurden durch eine Behandlung
mit Ultraschall löslich gemacht. Die durch Ultraschall
erhaltenen Zelltrümmer wurden auf eine RIPA-Pufferlösung gegeben,
welche 60% Sucrose enthielt, und bei 100 000 g eine Stunde lang
ultrazentrifugiert (Hitachi PRS50-2), um Verunreinigungen zu
entfernen, und der Überstand wurde als ein isotopmarkiertes
Antigen verwendet. Dieses Antigen (10&sup7; dpm/100 µl) und HuMAb
(10 µg/100 µl) wurden gemischt und Protein A-Sepharose 4B,
welches quellen gelassen und mit nicht-markiertem Antigen von
nicht-infizierten Zellen geblockt worden war, wurde in einer
Menge von 3 mg Kügelchenpulver zugegeben und eine Reaktion
wurde bei 4 CC eine Stunde lang durchgeführt.
-
Die Protein A-Sepharose 4B (Warenzeichen), auf welches ein
Antigen-Antikörper-Komplex adsorbiert worden war, wurde
gewaschen, durch Zentrifugieren bei 10000 U/min eine Minute lang,
fünfmal mit RIPA-Pufferlösung und zweimal mit 10 mM Tris-HCl
(pH 6,8), 100 µl SDS-Probenpufferlösung (0,0625 M Tris-HCl
(pH 6,8), welche 10% Glycerin, 5% β-Mercaptoethanol, 2,3%
SDS, 0,001 % Bromphenolblau enthielt), und der
Antigen-Antikörper-Komplex wurde durch dreiminütiges Erhitzen bei 100 ºC
von der Protein A-Sepharose disassozuert. Protein
A-Sepharose 4B wurde durch einminütiges Zentrifugieren bei 10000 U/min
entfernt, wodurch ein Überstand erhalten wurde, welcher als
eine Probe für eine SDS-PAGE verwendet wurde.
-
Eine Elektrophorese wurde gemäß einem üblichen
Laemmli-Verfahren (Laemmli, U.K., Nature, Band 227, Seiten 680 - 685, 1970)
unter Verwendung von 10% Polyacrylamidgel bei 100 V 5 Stunden
lang durchgeführt.
-
Nach Beenden der Elektrophorese wurde das Gel fixiert, indem es
in einer Lösung von 50% Methanol und 10% Essigsäurelösung
eine
Stunde lang eingeweicht, 30 Minuten lang in 1 M
Natriumsalicylsäure eingeweicht und durch Absaugen und Erwärmen auf einem
Filterpapier unter Verwendung eines Geltrockners getrocknet
wurde. Das getrocknete Gel wurde dann 1 bis 2 Tage lang einem
KODAK X-Ray-OMAT-Film bei -70 ºC ausgesetzt.
-
Das Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt. Der HuMAb (V3) setzte ein
Virusantigen von 118000 Dalton frei. Dieses Antigen ist das
gpIII. Zu bemerken ist, daß HuMAb (V2) gegen das gpI und HuMAb
(V1) gegen das gpII die Molekulargewichte 90000 und 55000 bzw.
die Molekulargewichte 108000 und 62000 immunpräzipitierten.
i) Neutralisation von Virus durch anti-VZV-gpIII-HuMAb
-
Zuerst wurden 20 µg/ml HuMAb, welcher durch Protein
A-Sepharose 4B gereinigt worden war, seriell dreifach mit 10% FCS
enthaltendem MEM verdünnt, und 200 µl der verdünnten Lösung,
100 µl von 4 x 10³ pfu/ml VZV-Lösung und 100 µl fünffach
verdünntes Meerschweinchen-Komplement (CH&sub5;&sub0; = 50 nach fünffacher
Verdünnung) oder 100 µl von 10% FCS enthaltendern MEM wurden
gemischt und bei 37 ºC eine Stunde lang reagieren gelassen.
-
Nach der Reaktion wurde die Virus-HuMAb-Mischung (200 µl) auf
HEL-Monolayerzellen geimpft, welche zuvor in einer Kulturplatte
mit 6 Vertiefungen (Falcon 3046) gezüchtet worden waren, und
bei 37 ºC eine Stunde lang adsorbiert. Nach der Adsorption
wurden die Zellen mit einem 0,5% Agarose und 5% FCS enthaltenden
MEM überschichtet, welche sodann bei 37 ºC in 5% CO&sub2; 7 Tage
lang kultiviert wurden. Mit VZV infizierte Plaques wurden mit
einer 10 %igen Formaldehydlösung fixiert, mit 0,15%
Methylenblau angefärbt und unter einem Lichtmikroskop gezählt. Eine
Antikörperkonzentration, welche die Anzahl von Plaques um 50%
verringert, ist als ED&sub5;&sub0; gezeigt.
-
Als Ergebnis wies der anti-gpIII-HuMAb (V3) wie folgt eine gute
neutralisierende Aktivität auf.
-
- Weist eine neutralisierende Aktivität auf, welche um das
1700- bis 14000fache höher ist als die von normalem
menschlichem Serumimmunoglobulin (NH IgG).
-
- Weist eine neutralisierende Aktivität auf, welche
komplementunabhängig ist.
-
- Weist eine hohe neutralisierende Aktivität auf im
Vergleich zu anderen anti-VZV-HuMAbs, d.h. anti-gpI (V2) und
antigpII (V1).
-
- Weist eine hohe neutralisierende Aktivität gegen alle vier
VZV-Stämme auf (3 im Labor entwickelte Stämme und 1 klinisch
isolierter Stamm).
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
j) Aktivität zum Verhindern der Virusausbreitung (V-SIMA) von
HuMAb gegen VZV-gpIII
-
Die Aktivität zum Verhindern der Virusausbreitung des wie oben
unter g) beschrieben gereinigten anti-gpIII-HuMAb wurde
getestet.
-
Zu einem zuvor in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen
gezüchteten HEL-Monolayer wurde VZV (Oka) in einer Menge von
100 pfu pro Vertiefung zugegeben und nach einer zweistündigen
Infektion bei 37 ºC wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS (+)
gewaschen. Dann wurden 200 µl/Vertiefung einer HuMAb-Lösung,
welche seriell dreimal mit 10% FCS enthaltendem MEM verdünnt
worden war, zugegeben und eine Inkubation wurde bei 37 ºC in
5% CO&sub2; 7 Tage lang durchgeführt. Als der CPE in einer
Vertiefung, zu welcher der Antikörper nicht zugegeben worden war,
100% erreichte, wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS (+)
gewaschen und 200 µl/Vertiefung von 0,1% Glutaraldehyd
enthaltender PBS (+) wurden zum Fixieren zugegeben.
-
Als nächstes wurde die Ausbreitung der Infektion mit VZV anhand
einer Methode ähnlich einem ELISA unter Verwendung einer
Monolayerplatte wie unter d) dargestellt gemessen. Das Ergebnis ist
in Fig. 6 gezeigt. Wo die VZV-Infektion inhibiert ist, ist eine
Absorption durch ELISA gering, und wo die VZV-Infektion nicht
inhibiert ist, ist sie hoch. Der anti-gpIII-HuMAb (V3)
inhibierte die Ausbreitung der VZV-Infektion und sein ED&sub5;&sub0;-Wert
betrug 1 µg/ml (der ED&sub5;&sub0;-Wert ist eine HuMAb-Konzentration,
welche eine 50% Absorption ergibt, wobei eine Absorption im
Fall, daß eine Ausbreitung der VZV-Infektion nicht inhibiert
wird, als 0% definiert wird und wobei eine Absorption im Fall,
daß eine Ausbreitung der VZV-Infektion gänzlich inhibiert wird,
als 100% definiert wird). Andere anti-VZV-HuMAb gegen gpI (V2)
und gegen gpII (V1) und andere anti-HCMV-HuMAb (C23)
inhibierten die Ausbreitung der VZV-Infektion bei einer Konzentration
von 10 µg/ml überhaupt nicht.
k) Antikörper-abhängige zellvermittelte zytotoxische Wirkung
(ADCC) von anti-VZV-gpIII-HuMAb
-
Auf HEL-Monolayerzellen (5 x 10&sup6; Zellen/Flasche), welche in
einer Kulturflasche mit einer Bodenfläche von 75 cm² gezüchtet
worden waren, wurden mit VZV (Oka) infizierte Zellen geimpft.
Nach 24 Stunden, als ein zytopathischer Effekt von mindestens
80% auftrat, wurden die infizierten Zellen mittels PBS (-),
welche 0,02% EDTA und 0,1% Trypsin enthielt, an die
Oberfläche geschwemmt. Die Zellen wurden wieder in RPMI 1640, welches
20% FCS enthielt, suspendiert, wodurch eine Zellsuspension von
1 x 10&sup6; Zellen/ml erhalten wurde, und 7,4 M Bq
[&sup5;¹Cr]-Natriumchromat (Na[&sup5;¹Cr]O&sub4;, 9,3 - 19 GBq/mg Cr, Amersharn International
plc., Buckinghamshire HP 79 LL, England) wurden dazugegegen und
bei 37 ºC eine Stunde lang reagieren gelassen, um eine
Isotopenmarkierung zu bewirken. Die isotopmarkierten infizierten
Zellen wurden fünfmal mit einem 20% FCS enthaltenden RPMI-
1640-Medium gewaschen und wieder suspendiert, wodurch eine
Zellsuspension von 5 x 10&sup4; Zellen/ml für die Verwendung als
Targetzellen erhalten wurde.
-
Als Effektorzellen wurden menschliche Milzlymphozyten
verwendet. Däs heißt, Ficoll wurde vorsichtig mit menschlichen
Milzlymphozyten überschichtet und bei 1500 U/min 20 Minuten lang
zentrifugiert, um Lymphozyten an der Grenzfläche auszufällen.
Die erhaltenen Lymphozyten wurden zweimal mit 20% FCS
enthaltendem RPMI 1640 gewaschen und auf 1 x 10&sup7; Zellen/ml
eingestellt.
-
Zu einer Kulturplatte mit rundem Boden und 96 Vertiefungen
wurden 100 ul Targetzellen, 50 µl einer schrittweise verdünnten
Antikörperlösung und 100 µl Effektorzellen zugegeben und bei
37 ºC 18 Stunden lang reagieren gelassen.
-
Für eine völlige &sup5;¹Cr-Freisetzung wurden 2% Triton X-100
(Warenzeichen) anstelle der Antikörperlösung zugegeben, und für
eine spontane &sup5;¹Cr-Freisetzung wurde das 20% FCS enthaltende
RPMI 1640-Medium anstelle der Antikörperlösung zugegeben.
-
Nach Beenden der Reaktion wurde der Überstand mit einem Skatron
System zum Sammeln von Überständen (Skatron, Norway) gesammelt
und der Wert (dpm) des in den Überstand freigesetzten &sup5;¹Cr
wurde mittels eines Gammastrahlungsintensitätsmessers (Aloka,
Japan) gemessen. Die ADCC-Aktivität jedes Antikörpers ist in %
der zytotoxischen Wirkung gegen mit VZV infizierte Zellen gemäß
der folgenden Gleichung ausgedrückt:
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&sup5;¹Cr-Freisetzung (dpm) jedes Antiközpers spontane &sup5;¹Cr-Freisetzung (dpm)/
Totale &sup5;¹Cr-Freisetzung (dpm) spontane &sup5;¹Cr-Freisetzung (dpm) x 100 (%)
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Als ein Ergebnis zeigte V3 (anti-gpIII-HuMAb) eine
ADCC-Aktivität bei einer Konzentration von nur 20 ng/ml. Das Ergebnis ist
in Fig. 7 gezeigt.
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Auskunft über hinterlegte Mikroorganismen und
Hinterlegungsbehörde gemäß Regel 13-2:
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Hinterlegungsbehörde: Fermentation Research Institute, Agency
of Industrial Science and Technology
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Adresse: 1-3 Higashi 1-chome, Tukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan
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Hinterlegungsnummer und -datum: Zellinie V3β1F4 (Subklon von
Hybridom V3, welches anti-VZV-gpIII-HuMAb produziert)
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Hinterlegungsdatum: 21. Februar 1990
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Hinterlegungsnummer: FERM BP-2765
INDUSTRIELLE VERWENDBARKEIT
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Der vorliegende MAb gegen VZV wird als nützlich für die
Diagnose, Prophylaxe und Behandlung von VZV-Infektionskrankheiten
betrachtet.