WO1991016448A1 - Anticorps monoclonal humain dirige contre la glycoproteine gp iii de l'herpesvirus varicellae - Google Patents

Anticorps monoclonal humain dirige contre la glycoproteine gp iii de l'herpesvirus varicellae Download PDF

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WO1991016448A1
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cell
human
humab
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Yasuhiko Masuho
Toru Sugano
Takami Tomiyama
Satoshi Sasaki
Tsuyoshi Kimura
Takashi Kawamura
Yoh-Ichi Matsumoto
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Teijin Limited
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/088—Varicella-zoster virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to a human / monoclonal antibody (HuMAb) against gpffi glycoprotein of varicella-zoster virus (VZV) and a cell line producing the same.
  • the aim is to provide VZV-specific HuMAbs that are useful for the diagnosis and prevention of VZV-mediated viral infections and for their treatment.
  • VZV is a virus that causes chickenpox, encephalitis, hepatitis, etc. due to primary infection and sometimes reappears as shingles even after it has sunk into the body.
  • Chickenpox under immunosuppressive conditions is sometimes fatal, and when it recurs as shingles, postherpetic neuralgia is known to remain after healing.
  • Drugs used for these diseases include acyclovir ( ⁇ Elkham, UK), live varicella vaccine (Osaka Univ., Japan)
  • VZIG Varicella-Zoster Immune Globulin
  • VZIG has a neutralizing antibody titer against VZV several times to several tens of times stronger than a normal human immunoglobulin preparation, and a preparation with a higher neutralizing antibody titer has been desired.
  • VZIG has difficulty in f-sharing, and has difficulty in price and stable supply.
  • unknown infectious agents such as the AIDS virus are basically mixed into human serum.
  • MAb for VZV was developed.
  • VZV and a glycoprotein called gpltt or gA of oral dalton present in VZV-infected cells (hereinafter abbreviated as gpffi, Davison, AJ et al. J. virol. 57, 1195-1197
  • Mouse monoclonal antibodies (mouse MAbs) that specifically bind have already been produced by several groups. (Friedrichs, WE, and Grose, CJ viroi 49, 992—996, 1984, Keller, PM, et al. J.virol 52, 293—297, 1984, Forghani, B. et al., J.virol 52, 55—62 1984)
  • mouse / monoclonal antibody when administered to humans, it is recognized as a heterologous protein and may cause anaphylactic shock-like side effects.
  • human antibodies to mouse MAb generated in the body MAb disappears quickly from the blood. This offsets the advantages of antibodies with low toxicity and high stability.
  • Human MAb has been desired for the treatment of VZV infection.
  • VZV glycoprotein called gp ⁇ or gB (hereinafter abbreviated as gpll; see Davison, AJ, et al., J. virol 57 vol. 1195-1197, 1986) HuMAfa (Foung SK, et al., J. Infect. Dis. 152, 280-285, 1985) and a glycoprotein called gpI or gC of VZV (hereinafter abbreviated as gpl; Davison AJ, et al. J) Humor M Sugano, T. et al. Eur. J. Immunol. 17 359-364 (1987) and published patent publication Sho 62 42933, and European patent 0198086 and li. S. Patent 4950595) is known.
  • MAb against gpDI of VZV is known to have the activity of inhibiting the transmission of VZV from cells infected with VZV to uninfected cells (inhibition of cell-to-cell infection or inhibition of infection spread). (Keller, PM, etc.
  • Antibodies to gpDI have also been shown to be important in preventing and curing varicella. According to Dubey L. et al. (Dubey L. et al. J. Infect. Dis. 157: 882-888, 1988), among leukemia patients who received raw varicella vaccine, those with varicella were gpI and gpll. Had an antibody to gpll, but not to gpll. Healing of these patients had elevated antibodies to gpHI.
  • HuMAb against VZV gpH which has a high virus neutralizing activity regardless of the presence or absence of complement and has an activity to suppress the spread of infection, can be used for prevention and treatment of VZV infection.
  • its development was desired.
  • HuMAbs against VZV gpIII have not yet been obtained.
  • HuMAb for gp! E HuMAb for gp I or gp ⁇ ⁇ ⁇ in VZV
  • HuMAb for gp I or gp ⁇ ⁇ ⁇ in VZV Low antibody production against gpDI when guinea pigs are immunized with an antigen (Keller, PM, et al., J. viro 1 Methods 14, 177-188, 1986).
  • HuMAb against gpffi Another reason that it is difficult to obtain HuMAb against gpffi is that it is very difficult to detect antibodies against gpDI by the ELISA method using an antigen obtained by disrupting VZV-infected cells, which is currently used. (Grose et a 1. J. Inf ec t. D is.
  • antigens obtained by crushing VZV-infected cells contain only a very small amount of gpffi as compared to gpI and gpn, and a screening system using such antigens has no effect on gpIII.
  • the probability of selecting an antibody is extremely low, and most of the MAbs selected by such a screening method were those that recognize gpI or gpII (Sugano et al., Eur. J. Immunol. : ⁇ , 359 -364, 1987). Disclosure of the invention
  • the present inventors provide the present invention by solving the various difficulties as described above by a method described in detail below.
  • the present invention provides HuMAbs against the VZV glycoprotein gpEI.
  • the present invention further provides a hybridoma that produces the Hu «Ab. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 shows the fractionation of antigens for in vitro stimulation.
  • VZV was subjected to sucrose density gradient centrifugation to fractionate and immobilize the fraction, and reacted with an anti-gpHI mouse monoclonal antibody.
  • Fraction No. 10 is a fraction containing a lot of gp DI antigen, and this was used as an in vitro stimulation antigen.
  • Fig. 2 shows the screening by ELISA using the cell homogenate plate and the cell monolayable abrasion, respectively.
  • a hole was selected that responded and reacted only weakly to the cell homogenate plate. It is indicated by an arrow.
  • the hybridoma in this hole was producing anti-gpffi HuMAb.
  • FIGS. 3A and 3B show anti-gp I-Hu MAb (V2) anti-gp ⁇ HuMAb (Vl) Serumono Ray Apure preparative ⁇ beauty Seruhomojine Topure c anti gpBI ⁇ HuMAb showing the reactivity of EL ISA for preparative anti gp III ⁇ HuMAb (V3) reacted strongly to Serumono ray ablation one DOO but Seruhomojine Topure DOO Responded only weakly.
  • FIGS. 4A and 4B show 96-well culture plates used for screening by V-SIMA.
  • FIG. 4B is a schematic diagram of FIG. 4A, in which the white circles indicate holes having an activity of suppressing the spread of virus infection.
  • Figure 5 shows the identification of the recognition antigen by immunoprecipitation SDS-PAGE.
  • Anti-gpBI. HuMAb (V3) immunoprecipitated 1 ⁇ 8,000 dalton gpDI antigen in VZV infected cells.
  • FIG. 6 shows the activity of various MAbs to suppress the spread of infection.
  • Anti-gpffl ⁇ HuMAb (V3) showed a 50% inhibitory effect on infection spread at a concentration of 1 fflg.
  • FIG. 7 shows ADCC activity of anti-gpIH HuMAb, V3.
  • V 3 showed about 10% infectious cytotoxicity at 20 ⁇ .
  • the present inventors have recognized that there are three reasons why it is difficult to produce HuMAb against gpDI glycoprotein of VZV, and as a result of intensive research, overcame this problem and developed HuMAb against gpID glycoprotein of VZV. We have established a hybridoma that produces sustainably.
  • Human lymphocytes are isolated from human peripheral blood, tonsils, adenoids, bone marrow, spleen, etc., and preferably cells isolated from spleen.
  • VZV, VZV-infected cells, VZV gpDI glycoprotein and the like are used as antigens, and purified VZV or gpBI glycoprotein is preferred.
  • Mitogen is used to promote the differentiation and proliferation of lymphocytes, such as pork mitogen (PWM), phytohemagglutin (PHA), concanapalin A, and brotin A.
  • PWM phytohemagglutin
  • PWM is used.
  • B cell proliferation factor (BCGF) B cell differentiation factor
  • BCDF B cell differentiation factor
  • IL-2 interleukin 2
  • IL-4 interleukin 4
  • I-6 interleukin 6
  • the concentration of the antigen is 1 ng / fflg to 10ffg /) R £, preferably 1 to 10 ng, /, and the concentration of the lymphocyte is 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cells.
  • Is 35-40'C and incubation time is 4-14 days, preferably 6 to 8 days.
  • the culture solution is preferably a culture solution containing 5 to 20% of fetal calf serum (FCS), such as RPMI1640 or GIT (GIT, Nippon Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan) medium.
  • FCS fetal calf serum
  • the in vitro stimulated human lymphocytes obtained in this way are transformed into cell lines with infinite proliferative potential by known methods, for example mouse myeloma cells, or human myeloma cells or heterologous cells.
  • the cells can be transformed into hybridoma cells by the cell fusion method with midroma cells (Publication No. 61-124380), or transformed into a cell line with infinite proliferation by infection with the Ebstein-Barr virus (EBV).
  • EBV Ebstein-Barr virus
  • the cell line producing the HuMAb against gpDI of VZV thus obtained is selected by the following method (means for solving the problems b) and c), cloned, and stably converted to a HuMAb against gpIH of VZV. It is established as a producing cell line.
  • the present inventors have established a new screening system as follows.
  • the present inventors show that mouse MAb binding to gplE of VZV strongly reacts with an ELISA plate (monolayer plate) in which VZV-infected cells are directly fixed with formalin or Daltal aldehyde.
  • an ELISA plate homogenate plate
  • MAbs that responded to VZV gpI or ⁇ strongly reacted to both ELISA plates were detected and selected. .
  • dispensed cells susceptible to VZV for example, first generation monkey kidney cell line, the human Tome Ranoma cells or human fetal O ⁇ bud cells at a concentration of IX 10 4 ⁇ 1 X10 6 pieces Roh minute Incubate at 35-40C for 1-5 days to form monolayer cells.
  • the cells used may be cells infected with VZV, and preferably, human fetal lung fibroblasts (HEL), MRC-5 or WI-38 are used.
  • the culture solution may be a culture solution in which the above-mentioned cells are grown, and preferably Eagles 'MEM (Eagles' Minimum Essential Medium) or DMEM (Dulbecco's Medium) containing 2 to 20% fetal calf or calf serum. Minimal essential medium is used.
  • the culture medium is removed by suction, and the cells infected with VZV suspended in the culture medium are dispensed at a concentration of 2 ⁇ 10 2 to 2 ⁇ 10 5 cells.
  • VZV-infected cells should be mixed and inoculated with cells not infected with VZV at a ratio of 1: 5 to 1:20, and cultured and passaged for 1 to 3 days.
  • a suspension of 4 to 40% fetal calf or calf serum at a concentration of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cells / and a 5 to 10% dimethyl sulfoxide in a freezing medium is better to keep frozen.
  • Sensitivity towards or V-SIMA infected cells less the VZV is raised, 4 X10 3 ⁇ 2 X10 4 pieces Roh concentration is preferred arbitrarily to 25 to dispensing per each well of.
  • the primary antibody reacts to the VZV antigen and can be any antibody with low non-specific reactivity, preferably MAb against gpI or gp ⁇ , Polyclonal antibodies and the like are used.
  • the primary antibody After the primary antibody is reacted at room temperature, it is washed and removed, and an enzyme-labeled secondary antibody that reacts with the primary antibody is added and reacted.
  • an enzyme-labeled secondary antibody that reacts with the primary antibody is added and reacted.
  • the enzyme oxidase, alkaline phosphatase, / 91-galactosidase and the like are used, but preferably horseradish oxidase is used.
  • the substrate using H z 0 2 As a color-developing agent TMBZ- HC1 (Tetra-methyl Bentizine- HC1 ) and 4 one black port -. 1 - naphthoquinone Torr is used.
  • TMBZ-HC1 develops color in the substrate solution and can be quantified by absorbance at a wavelength of 650 nm.
  • the reaction can be stopped by adding 1N sulfuric acid and quantified by absorbance at a wavelength of 450 nm. 4
  • the color-developed dye becomes insoluble and deposits on the fixed VZV-infected cells, which can be visually judged.
  • Staining by the enzyme antibody method is not limited to a specific method, and any method can be used as long as it can specifically stain cells infected with VZV or can be quantified by coloring the substrate reflecting the number of cells infected with VZV.
  • the primary antibody may be directly labeled with an enzyme, or a biotinylated primary antibody and an azidinated enzyme may be used.
  • the substrate should also be selected by the enzyme, and there is no restriction on its type or concentration.
  • VZ ⁇ infected cells The amount of VZ ⁇ infected cells is determined by staining or developing the substrate, and the antibody is You can see how much you could stop the spread of the infection.
  • human lymphocytes producing antibodies against gp of VZV are proliferated by in vitro stimulation, infinitely proliferated by the cell fusion method or the EBV transformation method, and the cell monolayer and the cell homogenate are grown.
  • a cell line producing a HuMAb that binds specifically to the gp IE of VZV, and preferably a human IgG, is selected using a plate, and further subjected to the V-SIMA method.
  • a cell line producing HuMAb having a strong activity of inhibiting the spread of VZV infection could be selected and established.
  • the established cell line is a medium suitable for cell growth, such as RPMI 1640 medium supplemented with fetal calf serum or calf serum, a medium such as DMEM, HAM, GIT, or a serum-free medium and stably grown in the culture medium. Releases HuMAb.
  • the cell line of the present invention can be frozen, or it can be cultured in a large amount by an appropriate method. Such cell lines or replicated cells are also within the scope of the present invention. In addition, as long as it produces Hub against gplll of VZV which is substantially the same as this cell line, regardless of whether it is a cell line established by the present inventors' method or not, the cell line and its production HuMAbs are also within the scope of the present invention.
  • HuMAb against gpffi of VZV is useful for prevention, treatment and the like of VZV infection, a cell line producing the same has not yet been established.
  • VZV gpBI HuMAb-producing cell line for VZV gpBI was due to VZV gp IE in human lymphocytes. This is because there are few specific antibody-producing cells and no effective screening method for the antibody has been established.
  • a method for producing gpDI-specific antibody-producing lymphocytes by an in vitro stimulation method of lymphocytes establishing a method for effectively screening the antibodies, and producing cells that produce HuMAbs against gpBI of the desired VZV Established a strain.
  • the established cell line proliferated while producing HuMAb stably, and was able to produce large amounts of anti-gpBI human 'monoclonal antibodies.
  • HuMAb against gpDI of VZV By culturing the cell line of the present invention in a large amount by an appropriate method, a large amount of HuMAb against gpDI of VZV can be produced in the culture supernatant.
  • This HuMAb is enriched and purified by methods such as Yin exchange chromatography, Yang exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, etc. It is expected to be effective as a preventive and remedy for the disease.
  • Advantages of using the HuMAb of the present invention as a prophylactic / therapeutic agent for VZV infection are high safety, a long half-life in blood, and a high anti-virus antibody titer.
  • HEL cells human fetal lung fibroblasts cultured in a monolayer in a culture flask (CORNING NY 14831 USA) with a bottom area of 150 oi were added with 1/5 amount of HEL cells infected with VZV, and 37 CC was added.
  • the cells were cultured under 5% CO 2 (the culture conditions were 37 unless otherwise specified, in the presence of 5% CO 2 ).
  • the monolayer cells are washed once with PBS, and 1 ⁇ of EDTA is added. The cells were removed with PBS.
  • the cells were disrupted by sonication at 50W 23KHz for 1 minute in Ultrasonics INC. NY, USA). Cell debris was removed by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes, and further centrifugation at 12500 rpm (Hitachi RPR20-2) for 15 minutes to remove intracellular granules. Supernatant from step 8 is overlaid on a 20% to 60% sucrose density gradient column (25) made of 20m! 1 Tris-HC1 PH 7. Buffer containing lmMEDTA at 27,000 rotations (Hitachi SRP28A). And centrifuged for 1 hour.
  • Figure 1 shows the reactivity of anti-gpIH mice and monoclonal antibodies with each fraction (fraction).
  • the fraction NalO was used as an antigen for in vitro stimulation.
  • VZV Oka strain
  • PWM Pork Wheat Might-Gen ⁇ GIBC0 Laboratories Grand Island N. Y. 14072 USA
  • HAT-GIT medium 95 hypoxanthine, 0.4 aminopterin, 1.6 ⁇ 1 thymidine, 5% fetal calf serum, 80 ⁇ g grZffl £ GIT medium containing gentamicin (Nippon Pharmaceutical, Tokyo), and 2 minutes later
  • HAT-GIT was added to make a final cell suspension of 50 cells in HAT-GIT medium. This refers to one per hole 10 4 mouse peritoneal exudate cells or married but a 96-well culture plates (Falcon 3075, Becton Dickinson and CO . 0XNARD CA93030 USA 1) minute. Every week Half
  • the anti-gpBI antibody produced in the culture supernatant of the obtained hybridoma was obtained by ELISA using two antigen plates (monolayer plate and homogenate plate). Screened by.
  • the monolayer plate was prepared as follows using a 96-well plate in which VZV-infected cells were fixed with Daltar aldehyde.
  • HEL cells Human Embryonic Lung celK or HEL cells cultured in Eagle's MEM medium (hereinafter abbreviated as MEM) containing 10% fetal calf serum (FCS) in 0.25% trypsin solution in advance. and it was dispensed one by one minute 0.1 to 96 well culture plates is adjusted to 10 5 cells / in MEM containing 10% FCS.
  • MEM Eagle's MEM medium
  • FCS fetal calf serum
  • CPE cytopathic effect
  • the homogenate plate was prepared as follows using a 96-well plate on which a homogenate antigen obtained by sonication of VZV-infected cells was immobilized.
  • HEL cells cultured in a culture flask bottom area 150Cii culture flask 1 Hontori about 10 7
  • culture flasks 1 Hontori 2 X10 6 pieces of VZV (0 kA Co.) infected cells was added 2 days 37'C 5% C0 2 were cultured under. Two days later, when CPE appeared in all cells, the infected cells were collected with PBS containing 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and washed three times with PBS (+) at 1500 rpm for 5 minutes.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the infected cell lysate was centrifuged 3000 r Pm 10 minutes, the supernatant was used as a homogenate Ichito antigen.
  • the antigen thus obtained was suspended in PBS (+) at a protein concentration of 4 ⁇ grZ.isn.
  • the suspension was dispensed into a 96-well plate for ELISA (Falcon 3912), 50 parts per well. 'C at 1
  • the reaction was allowed to proceed for a time to immobilize the antigen on the plate. 1% for each hole
  • the culture solution of the hybridoma obtained in c) above was withdrawn from each well, and added to each well of the monolayer plate and the homogenate plate, and reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times with the washing buffer, the secondary antibody was added at 50 per well. If the secondary antibody is a monolayer, goat anti-human
  • IgG IgG sliver oxidase-labeled antibody (TAGO IC BURLINGAME CA.94010 USA) diluted 1000 times with PBS containing 1% BSA.
  • Phosphatase goat anti-human IgG (TAGO) diluted 2000-fold with PBS containing 1% BSA was used. After reacting at room temperature for 1 hour, the substrate was washed three times with a washing buffer, and a substrate solution was added to each well.
  • the substrate solution is 5 mM hydrogen peroxide in the case of a mono-ray acrylate, 0.4 mgrZfflg TMBZ (Tetramethyltilbenzidine hydrochloride: Dojin Chemical Laboratory, Kumamoto, Japan) 0.1 M citrate Phosphoric acid buffer solution pH 4.3, in the case of a homogenate plate, 0.25 mM magnesium chloride with 0.1 mg of SmgZ fflfi as a substrate of P-ditrophenylphosphoric acid 2-sodium salt. 0.5 M diethanoamine-hydrochloric acid buffer pH 9.5.
  • the absorbance was measured using a microplate reader (UVmax Molecular Devices Palo-fllta CA94304 USA). Mo
  • 0.1 N sulfuric acid was added per each hole to stop the color development, and then the absorbance at a light wavelength of 450 nm was measured.
  • the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured.
  • Anti-gpI and anti-gpll antibodies have the ability to react strongly to both monolayer and homogenate plates, and anti-gpHI antibodies have the advantage of reacting only weakly to the monolayer. Color development is seen in the ray ablate, and holes with weak color development are selected with the homogenate plate, and a crossing is performed.
  • V-SIMA method Micro-Tsui, which suppresses the spread of viral infection
  • the anti-gpDIHuMAb produced in the culture supernatant of the hybridoma obtained as in c) above was also screened by the V-SIMA method together with the ELISA method in d) above.
  • HEL cell monolayers were cultured in a 96-well culture plate, and 200 VZV (0ka strain) were infected per well.
  • 150 portions of the hybridoma culture obtained in c) above was added. 37 Te, and cultured for 2 days under 5% C0 2, after two surfaces washed with PBS (+), 0. 1% grayed. Retaruarudehi de the ⁇ Mu PBS (+) for 10 min, fixed with 37'C did.
  • Fig. 4 shows a 96-well culture plate of V-SIMA used for Screen Jung.
  • the V-SIMA-positive hybridomas are C5, F9 and G7.
  • the hybridomas obtained in d) and e) above were cloned by the limiting dilution method.
  • Peritoneal exudate cells from 8-10 week old ICR mice are added as feeders, 10 * per well in a 96-well culture plate.
  • Screened high pre-doma cells Each well was diluted with GIT-HT medium containing 5% FCS to 1 to 10 holes and added. After culturing for 2 to 3 weeks, the cloned hybridoma grows. Therefore, screening was performed again by the methods d) and e) described above, and recloning was performed in the same manner.
  • a hybridoma (V 3) producing anti-gpIE Z ⁇ HuMAb was established.
  • the hybridoma thus obtained is RPMI 1640 medium containing 10% FCS, GIT medium, serum-free medium ITES (RPMI1640 1 solution,
  • Antibodies contained in the resulting culture supernatant are adsorbed to Protein A Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals AB Uppsala Sweden) and contain a low PH buffer, for example, 0.5 M sodium chloride. It could be purified by eluting with 0. 1 M ⁇ buffer P H3. 0. For example, when cultured overnight in a GIT medium at a density of 5 ⁇ 10 5 cells, the supernatant contains 3 antibodies, and 5 £ of the culture supernatant is purified using Protein A Sepharose 4B. , About lOmg
  • HuMAb could be obtained.
  • the H-protein subclass of the obtained HuMAb was determined using the SRID method (Serotec Ltd. Oxford OX 51BR, England), and the L-chain type was determined by using the anti-alkaline anti-human antibody Lambda (alkaline phosphatase-labeled antibody). TAGO) and ELISA using a phosphophosphate-labeled goat anti-human Kappa antibody (TAG0). As a result, V 3 is IgGl, K (kappa) was found to be.
  • the HuMAb recognition antigen obtained as in g) above was identified by immunoprecipitation SDS-page (sodium sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis).
  • HP79LL England HP79LL England was further cultured for 18 hours in the culture medium containing virus antigen to label the virus antigens.
  • As the culture solution 1/10 methionine M EM containing 2% transparent FCS was used.
  • the infected cells were washed twice with PBS and suspended in 2 mM EDTA-PBS. The cells were further washed once with PBS (+), and pelleted by centrifugation at 100 rpm for 5 minutes.
  • D0C 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.15 M sodium chloride, 1 mM pheninolemethresin 20mM containing mint acetic acid (EDTA)
  • Tris-HCl pH 7.4 Tris-HCl pH 7.4 was added, and the mixture was solubilized by sonication. This was overlaid on RIPA buffer containing 60% sucrose, impurities were removed by ultracentrifugation at 100,000 X g for 1 hour (Hitachi PRS50-2), and the supernatant was used as an isotope-labeled antigen. Using. This antigen (10 7 d pm / 100) and HuMAbUO / 100) were mixed and swollen in advance, and protein A-Sepharose 4B, which had been blocked with unlabeled antigen from uninfected cells, was added in 3 mg by bead powder weight. The reaction was carried out at 'C for 1 hour.
  • Protein A Sepharose 4B to which antigen and antibody complexes are adsorbed is washed 5 times with RIPA buffer and 2 times with 10 mM Tris-HCl pH 6.8. 100% buffer solution (10% glycerol, 5% 5-mercaptan, ethanol, 2.3% SDS, 0.001% bromophenol, 0.0625 M Tris-HCl pH 6.8) and add 100 'C, the antigen was dissolved in 3 minutes. The supernatant from which Protein A Sepharose 4B had been removed by centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute was used as an SDS solubilized sample.
  • Electrophoresis was performed at 100 V for 5 hours using a 10% polyacrylamide gel according to the standard Laemmli method (Laemmli U.K .; Nature 227, 680-685, 1970).
  • HuMAb purified by Protein A Sepharose 4B, 3-fold dilution in MEM medium containing 20% fflfi and 10% FCS 200 W, 4 ⁇ 10 3 pfuZffig VZV solution 100 and 5-fold dilution 100 parts of complement (CH 5 at 5-fold dilution 50) or 100 W of MEM medium containing 10% FCS instead of complement were mixed and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • a mixture of virus HuMAb 200 W was inoculated onto HEL monolayer cells in a 6-well culture plate (Falcon 3046), which had been cultured in advance, and allowed to adsorb at 37'C for 1 hour.
  • 0.5% Agarosu, with 5% FCS was overlaid with ⁇ Mu MEM medium, 37 • and cultured C 5% C0 7 days 2 below.
  • VZV-infected plaques were fixed with 10% formalin solution, stained with 0.15% methylene blue, and counted under a light microscope. The mixed antibody concentration that reduces a 50% the infectivity of VZV was expressed as ED 50.
  • anti-gpID HuMAb V3 has excellent neutralizing activity shown below.
  • anti-VZV ⁇ HuMAbs anti-gpI ⁇ V2, anti-gplH ⁇ VI
  • anti-HCMV ⁇ HuMAb C23
  • flDCC Antibody Dependent Cell mediated Cyto. toxity
  • flDCC Antibody Dependent Cell mediated Cyto. toxity
  • flDCC HEL monolayer cells (5 x 10 6 cells) cultured in an incubator with a bottom area of 75cii. ) to 1/5 volume (106 Z VZV in bottles) (0 kA Ltd.) were inoculated with infected cells. After 24 hours, when 80% or more cytopathic effect (CPE) appeared, the infected cells were suspended with PBS (-) containing 0.1% trypsin 0.02% EDTA. 1 ⁇ 10 6 ZfflU in RPMI 1640 medium containing 20% FCS
  • Human spleen lymphocytes were used as effector cells (effector cells). Human spleen lymphocytes were gently overlaid on Ficall and centrifuged at 1500 rpm for 20 minutes to separate the interface lymphocytes. The resulting lymphocytes were washed twice with RPMI1640 medium containing 20% FCS. 1 10 7 were adjusted to Zifi.
  • target cells To a 96-well round bottom culture plate, target cells, an antibody solution diluted in a step, and effector cells were added, and reacted at 37 ° C for 18 hours.
  • BPMI1640 medium was added.
  • the ADCC activity of each antibody is expressed by the cytotoxicity (Cytotoxicity ⁇ ) against VZV-infected cells according to the following formula.
  • V3 anti-gpBI HuMAb
  • Figure 7 shows the results.
  • the MAb against gp IB of VZV of the present invention is expected to be useful for diagnosis, prevention and treatment of infectious diseases caused by VZV.

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Description

明 細 書 水痘帯状疱疹ゥィルスの糖蛋白 gpfflに対する ヒ ト . モノ ク ローナル抗体
技 術 分 Λ
本発明は水痘帯状疱疹ゥィルス（VZV) の gpffi糖蛋白に対す るヒ ト · モノ クローナル抗体（HuMAb) とその産生細胞株に関 する。
その目的とするところは V Z Vによるウィ ルス感染症の診 断及び予防、 及び治療に役立つ V Z Vに特異的な HuMAbを提 供するこ とにある。 背 景 技 術
V Z Vは初感染によって水痘、 脳炎、 肝炎等をひきおこ し、 体内に潜伏後も時として帯状疱疹として再発するウィルスで ある。
免疫抑制状態下の水痘は時として致命的であり、 帯状疱疹 として再発した時は治癒後も帯状疱疹後神経痛が残ることが 知られている。
これらの疾患に用いられる薬剤としてはァシクロビル （ゥ エルカム社、 イギリ ス） 、 水痘生ワクチン （阪大微研、 日本）
B V —ァラ U (ャマサ醤油、 日本） 等があるが、 安全性、 有 効性の点でいまだ充分でな く、 予防投与の可能な安全性と有 効性の高い薬剤の開発が望まれていた。 水痘—帯状疱疹罹患後のヒ ト血清から得られたヒ ト免疫グ ロブひ ン製剤（Varicella - Zoster Immune Globulin ： VZIG. 製品名 Varitect他） はこれらの疾患にある程度の有効性が認 められていた。 （Zaia, J. A 他、 J. Infect. Dis.147卷 737— 743 ページ 1983年）
しかしながら VZIGは V Z Vに対する中和抗体価が通常のヒ ト免疫グロプリ ン製剤の数倍〜数 10倍の強さしかな く、 より 中和抗体価の高い製剤が望まれていた。 また VZIGは f共給が困 難であり、 価格と安定供給の点で難があった。 またヒ ト血清 中には、 基本的にエイズウイルス等、 未知の感染因子が混入 する危険性がある。 これらの問題点を解決するために、 V Z Vに対する M A bが開発された。
V Z V及び V Z Vに感染した細胞に存在する 105— 118キ 口ダル ト ンの gplttまたは g Aと称される糖蛋白 （以下 gpffi と 略する、 Davison, A.J. 他 J . v irol .57巻 1195— 1197ページ 1986年を参照のこと） を特異的に結合するマウスモノ ク ロ一 ナル抗体 （マウス MAb)はすでにい く つかのグループによって 作製されている。 （Friedrichs, W.E. , and Grose, C. J. viroi 49巻 992— 996 ページ 1984年、 Keller, P.M. , 他 J.virol 52 巻 293— 297 ページ 1984年、 Forghani, B.他 J.virol 52巻 55 —62ページ 1984年）
しかしながら、 マウス · モノ ク ローナル抗体を人間に投与 した場合は異種蛋白として認識され、 アナフ ィ ラキシーショ ック様の副作用をひきおこすことがある。 また体内に生じた マウス M A bに対するヒ ト抗体によって、 これらのマウス MA b はすみやかに血液中から消失してしまう。 これにより 抗体がもつ毒性が低く、 安定性の高い蛋白であるという長所 が相殺されてしまう。
従って V Z V感染症の治療のためにはヒ ト型の MAb(HuMAb) が望まれていた。
V Z Vに対する HuMAbとしては、 V Z Vのgp Πまたは g B と称される糖蛋白 （以下 gp ll と略す。 Davison, A.J.,他 J.virol 57卷 1195— 1197ページ 1986年を参照のこと） に対す る HuMAfa(Foung S.K, 他 J. Infect. Dis.152巻 280 - 285 ぺ一 ジ 1985年） 及び V Z Vの gp I または g Cと称される糖蛋白 (以下 gp l と略する。 Davison A.J. , 他 J.virol 57巻 1195— 1197ページ 1986年を参照のこ と） に対する HuMAMSugano, T. 他 Eur. J. Immunol.17巻 359— 364 ページ 1987年及び公開特許 公報昭 62 42933、 及びヨーロ ッパパテン ト 0198086及び li. S. パテン ト 4950595参照のこと） が知られている。
しかしながら gp ίに対する HuMbの中和活性は補体依存性 であり、 補体を添加しない場合は著しく 中和活性が減退する- また gpllに対する HuMAbは補体を添加しない場合でも中和す る力く、 その中和価 （ウィ ルスの 50%を中保する抗体量で表わ される） は補体存在下の gp I に対する HuMAbに劣っていた。
V Z Vのどの抗原に対する MA bが V Z Vの感染を抑制す るのに最も適しているかは、 マウス M A bを用いて既に調べ られている。 Kellerら（Keller, P. M. ,他 J. virol 52巻 293 - 297 ページ 1984年） によると gp IIに対する抗体は補体の有無 にかかわらず高い中和活性をもつが gp I に対する抗体は補体 の添加によってはじめてウ ィ ルスを中和した。 gp llに対する 抗体は、 補体の有無にかかわらず、 ウ ィ ルスを中和しないも のが多かった。 同様の結果は Grose, CH.ら（Grose, CH. 他
Inf . Immun.40巻 381— 388 ページ 1983年） や Forghani B.ら ' (Forghani B.他 J. νί rol .52巻 55— 62ページ 1984年） によって も明らかにされている。 さらに V Z Vの gpDIに対する M A b は V Z Vに感染した細胞から感染していない細胞へ V Z Vが 伝搬するのを抑制する活性 （細胞一細胞間感染抑制活性、 ま たは感染拡大抑制活性） も知られている（Keller, P.M. ,他
Virology 157巻 526— 533 ページ 1987年） 。 8 1 ゃ 11に対 する M A bにはこの活性はみられなかった。
gpDIに対する抗体が水痘の発症予防と治癒に重要であるこ とも明らかにされている。 Dubey L.ら（Dubey L. 他 J. Infect. Dis. 157巻 882— 888 ページ 1988年） によると、 水痘生ワク チ ンを投与した白血病患者のうち、 水痘に罹患した者は gp I 及び gpllに対する抗体は持っていたが、 gpllに対する抗体は 持っていなかった。 これらの患者のうち治癒した者は gp HIに 対する抗体が上昇した。
以上のことから明らかなように V Z Vの gpHに対する HuMAb であって補体の有無にかかわらず高いゥィルス中和活性をも ち、 感染拡大抑制活性をもつ HuMAbは、 V Z V感染症の予防、 治療のために、 その開発が望まれていた。 しかしながら V Z Vの gpIIIに対する HuMAbはいまだ得られていない。
V Z Vの gp I または gp Πに対する HuMAbに比べ gp!Eに対す る HuMAbを得ることが困難であるひとつの理由は gpfflの抗原 性が低く ヒ ト体内での gpDIに対する抗体の産生量が少ないた めであると考えられる。 モルモ ッ トに抗原を免疫したときに gpDIに対する抗体産生が低いこと（Keller, P . M . , ら J . v i ro 1 Methods 14巻 177— 188ページ 1986年）、 ヒ トの体内でも gplE に対する抗体産生が低いこと（Brunell, P. ら J. Infect. Dis. 156卷 430— 435 ページ 1987年） が知られている。
このようにヒ ト体内での抗体産生量が少ないこ とは gpfflに 対する抗体を産生する リ ンパ球が少ないこ とであり、 こ の ヒ ト · リ ンバ球を用いて作られる gpIIIに対する HuMAbを産生す るハイ ブリ ドーマを得ることができる確率が低いことを意味 する。 このこ.とは、 図 2に示す本発明者らの実験結果からも 明らかである。
また、 gpffiに対する HuMAbを得るのが困難であるもうひと つの理由は、 現在用いられている V Z V感染細胞を破砕した 抗原を用いた ELISA法等では gpDIに対する抗体を検出するこ とが非常に困難なためである （Grose et a 1. J . I nf ec t . D i s .
157巻 877— 881 ページ 1988年） 。 このことは、 図 3 Bに示 す本発明者らの実験結果からも明らかである。
一般に V Z V感染細胞を破砕して得られた抗原中には gp I 及び gp n と比べて極めて微量の gpffi しか含まれておらず、 こ のような抗原を用いたスク リー二ング系では gpIIIに対する抗 体を選び出す確率は極めて低く、 こ のよ う なスク リーニ ング 方法で選び出される M A bのほとんどは gp I あるいは gp IIを 認識する M A bであった（Sugano 他、 Eur . J. Immunol . : Π, 359 -364, 1987)。 発 明 の 開 示
本発明者らは、 上記のごとき種々の困難を後に詳細に説明 する方法により解決するこ とにより本発明を提供するもので ある。
従って、 本発明は V Z Vの糖蛋白質 gp EIに対する HuMAbを 提供するものである。
本発明はさらに、 該 Hu«Abを生産するハイプリ ドーマを提 供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 試験管内刺激用抗原の分画について示した。 V Z Vをショ糖密度勾配遠心にかけ分画したものを固相化し、 抗 gp HIマウスモノ クロ ーナル抗体を反応させた。 分画 No.10が gp DI抗原を多く舍む画分で、 これを試験管内刺激用抗原とし て用いた。
図 2 はセルホモジネー トプレー ト及びセルモノ レイ アブレ 一トを用いた EL I SAによるスク リー二ングをそれぞれ図 2 A . 図 2 Bに示した。 96穴培養プレー ト中のそれぞれのハイプリ ドーマ上清をセルホモジネー トプレー ト及びセルモノ レイ ァ プレー トを用いた EL I SAに対する反応性をみたところ、 96穴 中わずかに 1穴のみセルモノ レイアブレ一 卜に強く反応し、 セルホモジネー トプレー トには弱く しか反応しない穴が選び だされた。 それを矢印で示した。 この穴のハイ プリ ドーマは 抗 gp ffi HuMAbを産生していた。
図 3 A及び図 3 Bはそれぞれ、 抗 gp I - Hu MAb (V2) 抗 gp Π HuMAb(Vl) 抗 gp III · HuMAb(V3) のセルモノ レイ ァプレー ト及 びセルホモジネー トプレー トに対する EL I S Aの反応性を示す c 抗 gpBI · HuMAb はセルモノ レイ アブレ一 トには強く反応した がセルホモジネー トプレー トには弱く しか反応しなかった。 図 4 A及び図 4 Bは、 V-SIMAによるスク リ ーニングに用い た 96穴培養プレー トを示す。 図 4 Bは、 図 4 Aを模式的に図' 示したもので、 白丸がウィ ルスの感染拡大を抑制する活性を もつ穴である。 · 図 5 は、 免疫沈降 SDS- PAGEによる認識抗原の同定を示した。 抗 gpBI . HuMAb(V3) は V Z V感染細胞の 1·ί8, 000ダル ト ンの gpDI抗原を免疫沈降した。
図 6 は、 各種 M A bの感染拡体抑制活性を示す。 抗 gpffl · HuMAb(V3) は 1 ノ fflgの濃度で 50%の感染拡大抑制効果を示 した。
図 7 は抗 gpIH · HuMAb, V3の ADCC活性を示す。 V 3 は 20^ノ ^で約 10%の感染細胞傷害性を示した。 発明を実施するための具体的な形態
本発明者らは V Z Vの gpDI糖蛋白に対する HuMAbの作製が 困難である理由が以下の 3点にあることを認識し、 鋭意研究 の結果この問題点を克服し、 V Z Vの gpID糖蛋白に対する HuMAbを持続的に産生するハィ ブリ ドーマを樹立した。
a ) V Z Vの gp HIに対する抗体を産生する細胞 （ B リ ンパ球） がヒ ト体内では少ない。
b ) V Z Vの gpDIに結合する HuMAbを特異的に、 かつ簡便に 検出する方法が必要である。
c ) V Z Vの gpHIに対する HuMAbの抗ウィ ルス活性を簡便に 測定する方法が必要である。
上記課題 a ) を解決する手段として、 V Z Vまたは V Z V の gpIII糖蛋白を抗原としてヒ トに免疫するこ とが不可能であ るため、 体外にとりだしたヒ ト · リ ンバ球を試験管内で抗原 とマイ ト一ジェンで剌激し、 V Z Vの gpDI糖蛋白に対する抗 体産生細胞を増殖させた。
ヒ ト · リ ンバ球は人間の末梢血液、 扁桃腺、 アデノ ィ ド、 骨髄、 脾臓等から分離され、 望ま し く は脾臓から分離された 細胞を用いる。
抗原としては V Z V、 V Z V感染細胞、 V Z Vの gpDI糖蛋 白等が用いられるが、 精製した V Z Vまたは gpBI糖蛋白が好 ましい。
マイ トージェンはリ ンパ球の分化及び増殖を促進させるも のと してポークウ イー トマイ トージェン（PWM) 、 フ ィ トへム ァグルチュン（PHA) 、 コ ンカナパリ ン A、 ブロティ ン A等が 用いられるが、 好ましく は P WMが用いられる。 マイ ト―ジ ェンの代りに、 リ ンバ球の分化増殖因子として B細胞増殖因 子（BCGF)、 B細胞分化因子（BCDF)、 イ ンターロイキ ン 2 (IL-2)、 イ ンターロイ キン 4 (IL-4)、 イ ンターロイ キ ン 6 (Iい 6)等も用いることができる。
抗原の濃度は 1 ng/fflg〜10ffg/)R£、 好まし く は 1 〜10ng,/ 、 リ ンパ球の濃度は 1 X 105 〜 1 X107 個ノ^が適当であ り、 培養温度は 35〜40'Cで培養時間は 4〜14日、 好ま しく は 6〜 8 日である。 培養液は牛胎児血清（FCS) を 5 〜20%舍む 培養液、 例えば RPMI1640又はギッ ト （ G I T、 日本製薬株式 会社、 東京、 日本） 培地が好ま しい。
かく して得られた試験管内で刺激されたヒ ト · リ ンパ球は 公知の方法により無限增殖性をもつ細胞株に形質転換させる, 例えば、 マウス ミエローマ細胞、 またはヒ ト ミエロー マ細胞 またはへテロ ミヱローマ細胞 （公開特許公報昭 61— 124380 ) との細胞融合法によってハイプリ ドーマ細胞としたり、 エブ スタイ ンバーウイルス（EBV) の感染によつて無限増殖性をも つ細胞株に形質転換できる。
Ε Β Vで形質転換した場合には、 HuMAbを安定的に産生し つづける細胞株を得るために、 E B V形質転換細胞とマウス ミエローマ細胞とを細胞融合し、 ハイプリ ドーマを得るのが 適当である。
かく して得られた V Z Vの gpDIに対する HuMAbを産生する 細胞株は以下の方法 〔課題 b ) 、 及び c ) を解決する手段〕 によって選別され、 クロ一ユングされ、 安定に V Z Vの gpIH に対する HuMAbを産生する細胞株として樹立される。
上記課題 b ) を解決すべく、 本発明者らは以下の如く、 新 規なスク リ ーニング系を確立した。 本発明者らは、 V Z Vの gplEに結合するマウス M A bが V Z V感染細胞をそのままホ ルマリ ン又はダルタールアルデヒ ドで固定した EL I S Aプレー ト （モノ レイ ァ一プレー ト ） には強く反応するが、 V Z V感 染細胞を超音波処理した懸濁液を固相化した ELISAプレー ト (ホモジネー トプレー ト） には反応しに く いこ とを見出した。 V Z Vの gp I 又は Πに反応する M A b は両方の ELISAプレー トに強く反応した。 従って、 V Z Vの gpIEに特異的に結合す る HuMAbを選び出すには、 モノ レイ ァ一プレー トに強く反応 するがホモジネー トプレー トにはほとんど反応しない HuMAb' を検出し、 選び出した。.
これらの ELISAの詳細な記述は実施例に記載した。
上記項目 c ) を解決する手段として、 本発明者らは V Z V の gplに対する MA bが Keller P.M.ら（Keller P.M.他
virology 157巻 526— 533 ページ 1987年） の示したように、 抗 gp I - MAb ゃ抗 gpll - MAb と異なり、 V Z Vの感染拡大を 阻止するこ とに注目し、 この活性をハイプリ ドーマ上清液中 に含まれる微量の抗体でも検出できるように感度を上昇させ、 微量の検体で迅速で、 簡便に、 かつ定量的に測定する方法を 発し 7こ ( V-SIMA, virus-spread Inhibition Micro Assay) c 以下にその方法を述べる。
培養用 96穴プレー トに、 V Z Vに感受性の細胞、 例えば初 代サル腎細胞株、 ヒ トメ ラノーマ細胞あるいはヒ ト胎児織維 芽細胞を I X 104 〜 1 X106 個ノ の濃度で分注し、 35〜40 •Cで 1 〜 5 日間培養し、 単層細胞を形成させる。 用いる細胞 は V Z Vが感染する細胞ならばよ く、 好ましく はヒ ト胎児肺 織維芽細胞（HEL) 、 MRC-5又は WI-38が用いられる。 培養液 は上記の細胞が増殖する培養液ならばよ く、 好ましく は 2〜 20%の牛胎児、 または仔牛血清を舍む Eagles' MEM (イ ーグル ス ミ ニマムエ ッ セ ンシャル培地） または DMEM (ダルベッコ ミ ニマムエ ッ セ ンシャル培地） が用いられる。 次に培養液を吸引除去し、 上記の培養液で懸濁した V Z V に感染した細胞を 2 X102 〜 2 X105 個ノ^の濃度で分注す る。 V Z Vに感染した細胞は V Z Vに感染していない細胞と 1 ： 5 〜 1 ： 20の割合で混合接種し、 1 〜 3 日間培養して継 代したものを用いる。 望まし く は 1 X105 〜 1 X107 個/ の濃度で 4〜40%の牛胎児または仔牛血清と、 5〜： 10%のジ メ チルスルホキシ ドを舍む凍結用培地で懸濁し、 分注、 凍結 保存しておく のがよい。 V Z Vに感染した細胞は少ない方か V-SIMAの感度は上昇し、 4 X103 〜 2 X104 個ノ の濃度で 各穴当り 25〜 分注するのが好ま しい。
次に抗体を含む培養液 （検体） を各穴当り 100〜 200 加 え、 1 〜 3 日間、 35〜40'Cで培養する。 V Z V感染細胞のみ を加えた穴の細胞の 30〜80%に細胞変性効果が表われるまで 培養するのがよい。 次に各穴を 0.15Mの塩化ナ ト リ ウムを舍 む 0.01 Mリ ン酸緩衝液 PH 6. 5〜 7. 5 (PBS) で数回洗浄し、 0.05〜 0. 2 %のグルタールアルデヒ ドまたは 0. 1 〜； 10 %のホ ルマリ ンを舍む P B Sで 10〜60分間固定する。
さ らに P B Sで数回洗浄し、 1 〜 5 %牛血清アルブミ ンを 舍む P B S (ブロ ッキング液） を分注し、 37てで 1時間以上 ブロ ッキングする。 必要ならば、 ブロ ッキング液を入れたま ま 4 てで 1 力月間保存することができる。 各穴を 1 %牛血清 アルブミ ンを舍む P B S (洗浄液） で洗浄後、 以下の方法に 従って感染細胞を酵素抗体法で染色する。 例えば、 一次抗体 は V Z V抗原に反応し、 非特異的反応の低い抗体ならば何で もよ く、 望まし く は gp I又は gp Πに対する M A b、 ゥサギ ' ボリ ク ローナル抗体等が用いられる。 一次抗体を室温で反応 させた後洗浄除去し、 一次抗体に反応する酵素ラベルした二 次抗体を加えて反応させる。 酵素はパ一ォキシダ一ゼ、 アル カリホスファターゼ、 /9一ガラク トシダーゼ等が用いられる が、 望ま しく はホースラディ シュバ一ォキシダ一ゼが用いら れる。 二次抗体を室温で反応させた後、 洗浄除去し、 酵素に よって発色する基質溶液を加える。
例えば酵素として、 パーォキシダーゼを用いた.場合、 基質 は Hz02を用い、 発色剤として TMBZ- HC1 (Tetra-methyl Bentizine- HC1)や 4 一クロ口— 1 —ナフ トールが用いられる。
TMBZ-HC1は基質溶液が発色し、 波長 650nmの吸光度で定量 できる。 1規定硫酸を加えることによって反応を停止させ、 波長 450nmの吸光度で定量することもできる。 4 一ク ロ口—
1 一ナフ トールを加えると、 発色した色素は不溶性となり固 定された V Z V感染細胞に沈着し、 可視的に判定することが できる。 酵素抗体法による染色は定められた特定の方法だけ でなく、 V Z Vに感染した細胞を特異的に染色するか V Z V に感染した細胞数を反映した基質の発色によって定量できる ものなら何でもよい。 例えば、 一次抗体に直接酵素を標識し たり、 ビォチン化した一次抗体とァヒジン化した酵素を用い てもよい。
基質も酵素によって選ばれるべきであってその種類や濃度 の制限はない。
かく して染色または基質を発色させることによって V Z \ の感染細胞の量を判定し、 抗体が V Z Vの細胞から細胞への 感染の拡大をどの程度阻止し得たかを知ることができる。
以上のように V Z Vの gp に対する抗体を産生する ヒ ト · リ ンパ球を試験管内刺激によって増殖させ、 細胞融合法また は E B V ト ラ ンスフォーメ ーショ ン法によって無限増殖させ、 細胞モノ レイァプレー トと細胞ホモジネ一 トブレー トを用い て V Z Vの gp IEに特異的に結合する HuMAb、 望まし く はヒ ト ' IgGを産生する細胞株を選別し、 さらに V-SIMA法によって
V Z Vの感染拡大阻止活性の強い HuMAbを産生する細胞株を 選別し、 樹立するこ とができた。
樹立した細胞株は細胞増殖に適した培地、 · '例えば牛胎児血 清または仔牛血清を加えた RPMI1640培地、 DMEM, HAM, GIT等 の培地、 または無血清培地中で安定に増殖し培養液中に HuMAb を放出する。
本発明の細胞株は凍結することもでき、 またこれを適当な 方法で大量に培養することもできる。 かかる細胞株または複 製された細胞も本発明の範囲に舍まれるものである。 またこ の細胞株と実質的に同一の V Z Vの gplllに対する Hu bを産 生する限り、 本発明者らの方法によって樹立された細胞株で あるとないにかかわらず、 その細胞株とその産生される HuMAb も本発明の範囲に舍まれる。
V Z Vの gpffiに対する HuMAbは V Z V感染症の予防、 治療 等に有用であるにもかかわらず、 いまだその産生細胞株は樹 立されていなかった。
V Z Vの gpBIに対する HuMAbを産生する細胞株を樹立する のが困難であった理由はヒ ト · リ ンパ球中に V Z Vの gp IEに 特異的な抗体産生細胞が少なく、 かつその抗体の有効なスク リ ー二ング方法が確立されていなかったためである。
本発明ではリ ンパ球の試験管内刺激法で gpDI特異抗体産生 リ ンパ球を増殖させ、 その抗体を有効にスク リ ーニングでき る方法を確立させ、 目的とする V Z Vの gpBIに対する HuMAb を産生する細胞株を樹立した。 樹立した細胞株は安定に HuMAb を産生しつづけながら増殖し、 大量の抗 gpBI ヒ ト ' モノ ク ロ ーナル抗体を生産することが可能となった。
本発明の細胞株は適当な方法で大量に培養する.ことによつ て培養上清中に大量の V Z Vの gpDIに対する HuMAbを産生さ せるこ とができる。 この HuMAbは、 陰ィォン交換クロマ トグ ラフィー、 陽ィォン交換ク 口マ トグラフィ一、 ァフ ィ 二ティ ク ロマ トグラフィー、 ゲル濾過ク ロマ トグラフ ィ一等の方法 によって、 濃縮、 精製され、 V Z V感染症の予防、 治療薬と して有効性が期待される。 本発明の HuMAbが V Z V感染症の 予防、 治療薬として用いられる利点は、 安全性が高く、 血中 半滅期が長く、 抗ウィ ルス抗体価が高いことである。
実施例
a ) V Z Vの試験管内刺激用抗原の調整
底面積 150oiの培養用フラスコ （CORNING N. Y. 14831 USA) 中で単層に培養した H E L細胞 （ヒ ト胎児肺繊維芽細胞） に 1/5量の V Z Vに感染した H E L細胞を加え、 37 'Cで 5 % CO 2 下で培養した （以下培養条件は特記なき場合以外は 37て、 5 % C02存在下） 。 約 80%の細胞に細胞変性効果があらわれた 時点で、 単層細胞を P B Sで 1回洗浄し、 1 ηιΜの EDTAを舍む P B Sではがして回収した。 ノヽンクスバラ ンス ドサル ト ソル —ショ ン（HBSS)で 2画洗浄遠心後、 1 X107 個の細胞当り 1 fflfiの SPGA液 （0.218M Sucrose, 0.0049Mグルタ ミ ン酸ナ ト リ ゥム、 1 % BSAを舍む lOmM potasium phosphate buffer pH 7. 4 ) で懸濁し、 超音波破砕器（MS- 50 HEAT SYSTEMS,
Ultrasonics INC.N. Y. , USA) で 50W 23KHzで 1 分間超音波 処理して細胞を破砕した。 3000回転で 15分間遠心して細胞残 渣を除去し、 さ らに 12500回転 （日立 RPR20-2)で 15分間遠心 して細胞内顆粒を除去した。 8 の上清を 20m!1 Tris- HC1 PH 7. lmMEDTAを舍む緩衝液で作つた 20 %から 60 %までのショ 糖密度勾配カラム （25 ） に重層し、 27000回転（日立 SRP28A) 4 てで 1·時間遠心した。
2 βώづっ分取し、 各分画の を 40； ^の 0.05Μ炭酸緩衝液 ρΗ9. 5で稀釈し、 96穴プレー ト（Falcon 3912, Becton
Dickinson and Co.OXNARD CA 93030 USA) の各穴に入れ 37 'C 1時間反応させ、 各画分中のタ ンパクを固相化させた。 1 % の牛血清アルブミ ン（BS を舍む P B Sでブロ ッキング後、 1 a gr/ffl£の抗 gpDIマウス ' モノ ク ローナル抗体 を各穴 へ加え、 37ΐで 1時間反応させた。 1 % BSAを含む P B Sで 3回洗浄後、 アルカ リ フォスファ ターゼ標識抗マウス Gャ ギ抗体（TAGO INC. BURLINGAME CA94010 US/O50 を各穴に加 え、 さらに 37てで 1時間反応させた。 1 % BSAを含む P B S で 3回洗浄後 l mgr/mfiの P —二 ト ロフユ二ルリ ン酸 2 —ナ ト リ ウム塩を舍む 0. 5 Mジエタノ ールァ ミ ン一塩酸 PH 9. 5
を各穴へ加え、 室温で 40分間反応させた。 黄色の呈色 の 405nmの吸光度をマィ ク口プレー ト リーダ一（Mo 1 ecu 1 ar Devices USA)で測定し、 gp ΠΙが最も多い画分を紫外線照射に より滅菌し、 試験管内剌激用抗原として用いた。 図 1 に各画 分 （フラク ショ ン） への抗 gpIHマウス . モノ ク ロ一ナル抗体 · の反応性を示した。 こ こではフラク ショ ン NalOを試験管内剌 激用抗原として用いた。
b ) gp Iff による リ ンバ球感作
ヒ トの脾臓リ ンパ球を 10% FCSを舍む RPMI1640培地 （ 2 mM グルタ ミ ン、 1 mMビルビン酸ナ ト リ ウム、 0.02mgノ セ リ ン、 80 " ゲンタマィ シンを舍む） に浮遊させ Ficall (Pharmacia
LKB Biotechnology Inc. ew Jersey 08855 USA)に静カヽに重 層し、 1500rPm 20分間遠心し、 界面のリ ンバ球を分離した。 得られたリ ンパ球を 10% FCSを舍む RPMI1640培地で 2回洗浄 遠心し、 3 X106 個ノ^に調整した。 試験管内刺激用抗原
(VZV, Oka株） を 5 ngZ«£に、 P WM (ポーク ウイ ー トマイ 卜—ジェンヽ GIBC0 Laboratories Grand Island N. Y.14072 USA)を 20 《£になるように加えて 7 日間培養した。
c ) 細胞融合によるハイ プリ ドーマの作製
上記 b ) の抗原刺激されたヒ ト · リ ンバ球の 107個と 2 X 107 個のマウスミエローマ細胞 P 3 X63 Ag8Ul株（P3U- 1) と 混合し RPMI1640培地で 1 面洗浄遠心し、 1500rpmで 5分間遠 心して、 細胞ペレ ツ トにした。 これに 1 の 35 %ポリ エチレ ングリ コール液（RPMI1640 5.75 +ボリ エチレングリ コール #1000 3. 5 ジメ チルスルホキサイ ド 0.75 ） を加え、 細 胞をゆるやかに浮遊させた。 1分後に 1 H£、 2分後に の RPMI1640培地を加え、 さ らに 2分後に 4 ^の HAT-GIT培地 (95 ヒボキサンチン、 0. 4 ア ミ ノ プテリ ン、 1. 6 ^1チ ミ ジン、 5 %牛胎児血清、 80 μ grZffl£ゲンタマイ シンを舍む G I T培地 （日本製薬、 東京））、 さらに 2分後に の
HAT-GIT を加え、 最終的に HAT-GIT培地で 50 の細胞浮遊液 とした。 これを、 1穴当り 104個のマウス腹腔浸出細胞をま きこんだ 96穴培養プレー ト （Falcon 3075, Becton Dickinson and CO. 0XNARD CA93030 USA 1) 1枚に分注し、. 1週間毎に半
7
量づっ HT-G IT (HAT-GITよりア ミノ プテリ ンを除いた培地） で 交換しながら、 37て 5 % C02下で培養した。 約 3週間後に各 穴当り数個の イ ブリ ドーマ細胞のコロニーが得られた。 d ) 抗 gp BI抗体のスク リ ーニング ： ELISA法
上記 c ) のごと く、 得られたハイ プリ ドーマの培養上清に 産生される抗 gp BI抗体は 2種類の抗原プレー ト （モノ レイ ァ 一プレー ト及びホモジネー トプレー ト ） を用いた EL ISA法に よってスク リーニングされた。
モノ レイ ァープレー トは V Z V感染細胞をダルタールアル デヒ ドで固定した 96穴プレー トで以下のようにして調整され た。
あらかじめ 10%の牛胎児血清（FCS) を舍むイーグル M E M 培地 （以下 M E Mと略す） で培養したヒ ト胎児肺細胞（Human Embryonic Lung celK 以下 H E L細胞と略す） を 0.25% ト リ ブシン溶液で分散し、 10% FCSを含む M E Mで 105個/ に調整して 96穴培養プレー トに 0. 1 づつ分注した。 2 日間 7 5 % C02下で培養し、 H E L細胞単層 （モノ レイ ァー） を形成したところに、 VZV(0ka株） に感染した H E L細胞を 103細胞 Z穴だけ加えて感染させた。 さらに 2 日間培養し、 全細胞に細胞変性効果（Cytopathic Effect, CPE)が出現した 時点で、 PBS( + ) ( 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2を舍む P B S ) で 2回洗浄し、 0. 1 %ダルタールアルデヒ ドを舍む PBS( + )で 10 分間 37てで固定した。 固定後 PBS (-)で 3回洗浄し、 各穴当り 1 %牛血清アルブミ ン（BSA) を舍む PBS( + )を 200 f づっ分注 し、 37'Cで 1時間放置し、 使用まで 4てで保存した.。
ホモジネー トプレー トは V Z V感染細胞を超音波破碎して 得たホモジネー ト抗原を固相化した 96穴プレー トで以下のよ うにして調整された。
底面積 150ciiの培養フラスコ中に培養した H E L細胞 （培 養フラスコ 1本当り約 107個） に、 培養フラスコ 1本当り 2 X106 個の VZV(0Ka株） 感染細胞を加え 2日間 37'C 5 % C02 下で培養した。 2 日後全細胞に C P Eが出現した時点で 1 mM エチレンジア ミ ンテ トラ齚酸（EDTA)を舍む P B Sで感染細胞 を集め、 PBS( + )で 3回 1500rpm、 5分遠心で洗浄した。 107 個の感染細胞を 1 の 1 PMSF (フヱニルメ チルスルホニル フルオラィ ト） を含む PBS( + )で懸濁し、 50Wで 1分間超音波 破碎した（Microson Ultrasonic cell disrupter MS - 50 23KHz HEAT SYSTEMS-ULTRASONICS INC.NY.USA)。
感染細胞破砕液を 3000rPm 10分間遠心し、 上清をホモジネ 一ト抗原として用いた。 かく して得られた抗原を PBS( + )でタ ンパク濃度 4 μ grZ.isnこなるように懸濁し、 ELISA用 96穴プ レー ト（Falcon 3912) に各穴当り 50 づっ分注し、 37'Cで 1 時間反応させて抗原をプレー トに固相化させた。 各穴は 1 %
BSAを舍む PBS( + ) (洗浄用緩衝液） で洗浄後、 1 % BSAを舍 む PBS(+) を加え、 37'C 1時間放置し （ブロ ッキング） 使用 まで 4 てで保存した。 このようにして調整した 2種のプレー トを用いて以下のようにして ELISAを行った。
前記 c ) で得られたハイ プリ ドーマの培養液を各穴当り 、 づっ抜き取り、 モノ レイァプレー ト及びホモジネー ト · プレー トの各穴へ 50 づっ加えて室温で 1時間反応させた。 洗浄用緩衝液で 3回洗浄後、 二次抗体を各穴当り 50 づっ加 えた。 二次抗体はモノ レイ ァープレー トの場合、 ャギ抗ヒ ト
IgGホ一スラディ シュバーオキシデ一ス標識抗体（TAGO I C. BURLINGAME CA.94010 USA)を 1 % BSAを舍む P B Sで 1000倍 に稀釈したものを用い、 ホモジネー トプレー トの場合 a 1 ka 1 i ne
Phosphataseャギ抗ヒ ト IgG(TAGO) を 1 % BSAを含む P B S で 2000倍に稀釈したものを用いた。 室温で 1 時間反応させた 後、 洗浄用緩衝液で 3回洗浄後各穴 づっ基質溶液を加 えた。 基質溶液はモノ レイ アブレ一 トの場合 5 mM過酸化水素、 0. 4 mgrZfflgの TMBZ (テ ト ラメ チルベンチジン塩酸塩 ： 同仁 化学研究所、 熊本、 日本） を舍む 0. 1 Mクェ ン酸一リ ン酸緩 衝液 pH 4. 3であり、 ホモジネー トプレー トの場合、 0. S mgZ fflfiの P —二 ト ロフエニルリ ン酸 2 —ナ ト リ ウム塩を基質とし て舍む 0.25mMの塩化マグネシゥムを舍む 0. 5 Mジエタノ 一ル ァ ミ ン—塩酸緩衝液 PH 9. 5であった。
基質溶液添加後マイ ク 口プレー ト リーダー（UVmax Molecular Devices Palo-fllta CA94304 USA)にて吸光度を測定した。 モ ノ レイ アブレー トの場合、 0. 1 N硫酸を各穴当り づっ 加え、 発色を停止させた後、 光波長 450nmの吸光度を測定し、 ホモジネー トプレー トの場合には波長 405nmの吸光度を測定 した。
抗 gp I抗体、 抗 gpll抗体はモノ レイ アブレ一ト及びホモジ ネー トプレー トのいずれにも強く反応する力、 抗 gp HI抗体は モノ レイ アブレ一 トには弱く しか反応しない性質を利用して モノ レイ アブレー トに発色が見られ、 ホモジネ一 ト.ブレー ト で発色が弱い穴を選び出し、 クロ一ユングを行つ 。
96穴プレー トの各穴のハイプリ ドーマ上清をホモジネー ト プレー ト （図 2 の A側） 及びモノ レイ アブレー ト （図 2の B 側） を用いてスク リーニングしたところ、 gp に対する抗体 を産生する穴は 96穴のうちわずかに 1穴であった （矢印） 。 このことは、 通常の ELISA法によるスク リーニングでは抗 gpIHuMAb を選びだすのが困難であることを示している。
抗 gp I HuMAb(V2) 、 抗 gp Π HuMAb (VI) 、 抗 gp IE HuMAb (本発 明によって得られたヒ ト MA bである V 3 ) のモノ レイ ァプ レー ト及びホモジネー トプレー トに対する反応性を図 3 A及 び図 3 Bにそれぞれ示した。
e ) 抗ウイルス活性によるスク リーニング ： V-SIMA法 （ゥィ ルス感染拡大抑制マイ クロア ツセィ ）
前記 c ) のごと く得られたハイプリ ドーマ培養上清に産生 された抗 gpDIHuMAb は上記 d ) の ELISA法と共に V-SIMA法に よってもスク リーニングが行われた。 H E L細胞単層を 96穴 培養プレー トで培養し、 各穴当り 200個の VZV(0ka株） 感染 細胞を加え （各穴当り 4000個 の感染細胞を 50 づっ加え） 直後に前記 c ) で得られたハイプリ ドーマ培養液を 150 づ つ加えた。 37て、 5 % C02下で 2 日間培養し、 PBS ( + )で 2 面 洗浄後、 0. 1 %グ.レタールアルデヒ ドを舍む PBS ( + )で 10分間、 37'Cで固定した。 固定後 PBS( + )で 3回洗浄し、 各穴当り 1 % BSAを舍む PBS( + )を 200 づっ加え、 37 で 1時間放置して ブロ ッキングした。 上清を吸引除去後、 1 tig/ の V 2 (抗 gp I · HuMAb)を各穴 づっ加え、 37てで 1時間反応させた。 上記 d ) で用いた洗浄用緩衝液で 3回洗浄後、 200倍稀釈し たャギ抗ヒ ト I gG ホースラディ ッ シュバーオキシデ一ス標識 抗体（TAG0)を 50 づっ加え、 37'Cで 1時間反応させた。 洗浄 用緩衝液で 3回洗浄後、 5 mM過酸化水素、 0.2 m Zffieの 4一 ク ロロー 1一ナフ 卜一ノレ (HRP colordevelopment reagent, Bio-Rad Laboratories Richmond CA.94804 USA) を舍む 0.05 M Tris-HCl pH 7.4の基質溶液を各穴 づっ加え発色さ せた。 ウ ィ ルス感染阻止活性のある穴 （発色の弱い穴） のハ イブリ ドーマを選び出し、 ク ローニングを行った。 スク リ ー ユングに用いた V-SIMAの 96穴培養プレー トを図 4 に例示した。 ここでは V-SIMA陽性のハイブリ ドーマは C 5 , F 9 と G 7で ある。
f ) ク ローユング
上記 d ) , e ) で得られたハイ プリ ドーマは限界稀釈法によ つてク ローユングした。 8 〜10週令の I C Rマウスの腹腔浸 出細胞を 96穴培養プレー トの各穴当り 10*個づっフ ィ ーダ一 として加える。 スク リーニングされたハイ プリ ドーマ細胞は 各穴 1 〜10個になるように 5 % FCSを含む GIT- HT培地で稀釈 して加えた。 2〜 3週間培養するとクローン化ハイプリ ドー マが成育するので再び上記の d ), e ) の方法でスク リーニン グし、 同様にして再クローユングした。 かく して抗 gpIE Z · HuMAb を産生するハイブリ ドーマ （ V 3 ) が樹立された。
g ) ハイプリ ドーマ培養及び抗体調整
かく して得られたハイ ブリ ドーマは 10% FCSを舍む RPMI 1640培地、 G I T培地、 無血清培地 ITES(RPMI1640 1溶、
DMBM 1溶、 F 12 1溶、 イ ンシュ リ ン 8. 5 ^ノ 、 トラ ン スフエ リ ン 2 /«/Ββ、 エタノ ールァ ミ ン 20ifM、 セ レナイ ト 2. 5 X10"3M) で培養することができ、 5力月間以上の長期 にわたつて安定的に抗体を産生することがわかった。
得られた培養上清中に舍まれる抗体はプロティ ン Aセファ ロース 4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB Uppsala Sweden) に吸着させ、 低 PH緩衝液、 例えば 0. 5 M塩化ナ ト リ ウムを舍 む 0. 1 M齚酸緩衝液 PH3. 0で溶出することで精製することが できた。 例えば G I T培地で 5 X105 個ノ ^の密度で 1晩培 養したとき上清には 3 ノ^の抗体が舍まれ、 5 £の培養上 清をプロティ ン Aセファ ロース 4 Bで精製して、 約 lOmgの
HuMAbを得ることができた。
得られた HuMAbの H鎮サブク ラスは SRID法（Serotec Ltd. Oxford OX 51BR, England)を用いて決定し、 L鎖タイ プはァ ルカ リ フ ォ スフ ュー ト標識抗体ャギ抗ヒ ト Lambda(TAGO)及び アルカ リ フォ スフ ヱー ト標識ャギ抗ヒ ト Kappa 抗体（TAG0)を 用いた ELISA法で決定した。 その結果、 V 3 は IgGl,K(kappa) である こ とが判つた。
) 認識抗原の同定
上記 g ) のごと く得られた HuMAbの認識抗原は免疫沈降 SDS-page ( ドデシル硫酸ナ ト リ ウム一ポリ アク リ ルア ミ ドゲ ル電気泳動） によって同定された。
底面積 75 δの培養器に培養した H E L単層細胞 （ 5 X106 個ノボ ト ル） に 1/5量（106個 ボ ト ル） の VZV(0ka株） 感染 細胞を接種し、 24時間後に 80%以上の細胞変性効果（CPE) か 表われた時点で 18.5MBqの 〔 35 S〕 一、 メ チォニ ン （ 〉48TBq / mmol mersham international pic Buckinghamshire
HP79LL England) を舍む培養液でさらに 18時間培養してウイ ルス抗原をァイ ソ ト ープ標識した。 培養液は 2 %透折 F C S を舍む 1/10メチォニン M E Mを用いた。
感染細胞は P B Sで 2回洗浄し、 2 mMEDTA- PBSで浮遊させ. さらに PBS(+)で 1 回洗浄し、 lOOOrpm 5分の遠心でペ レ ツ ト にした。
この細胞ペレ ツ 卜に 5 X106 個の細胞当り 3 s£の RIPA緩衝 液 （ 1 %Triton X-100、 1 %ソディ ウムデォキ シコ リ ン酸
(D0C)、 0. 1 % ドデシル硫酸ナ ト リ ウム（SDS) 、 0.15M塩化 ナ ト リ ウ ム、 1 mMフ エ ニノレメ チ レスノレホニノレフノレオ ラ イ ド (PMSF)、 1 mMェチレンジア ミ ンテ トラ酢酸（EDTA)を舍む 20mM
Tris-HCl pH7. 4 ) を加え、 超音波処理によって可溶化した。 これを 60%ショ糖を舍む RIPA緩衝液に重層し、 100, 000 X g で 1時間 （日立 PRS50- 2)の超遠心によつて不純物を除去し、 上清をアイ ソ トープ標識抗原として用いた。 この抗原 （107d pm/ 100 ） と HuMAbUO / 100 ） を混合し前もって膨潤 させ、 非感染細胞の非標識抗原でプロ ツキングしておいたプ ロティ ン A—セファ ロース 4 Bをビーズ粉末重量で 3 mgづっ 加え、 4 'Cで 1時間反応させた。
抗原、 抗体複合体を吸着させたプロティ ン Aセファ ロース 4 Bは RIPA緩衝液で 5回、 10mM Tris-HCl pH 6. 8で 2回 lO.OOOrpra 1分間の遠心で洗浄し、 の S D S —サンプ ル緩衝液 （10%グリ セロール、 5 % 5—メ ルカブ.トエタノー ル、 2. 3 % SDS、 0.001%ブロモフエノルブル.一 ¾舍む 0.0625 M Tris-HCl pH 6. 8 ) を加え、 100'C、 3分間で抗原を溶解 させた。 10,000rpm 1分間の遠心でプロテイ ン Aセファ ロー ス 4 Bを除いた上清を S D S可溶化試料として用いた。
電気泳動は標準的な Laemmliの方法（Laemmli U.K.； Nature 227巻、 680— 685ページ 1970年） に従って 10%ポリアク リ ルアミ ドゲルを用いて 100 Vで 5時間泳動した。
泳動の終了したゲルは 50%メ タノ一ル、 10%酢酸溶液に 1 時間浸し固定した後で 1 Mサルチル酸ナ ト リ ウム溶液に 30分 間浸し、 濾紙上で吸引、 加熱乾燥させた。 乾燥させたゲルは — 70'Cで 1〜 2 日間 KODAK X-0MATフィルムに感光させた。 結果を第 5図に示す。 HuMAb · V3は 118, 000ダルト ンのゥ ィルス抗原を免疫沈降した。 この抗原は gpDIである。 なお、 gp l に対する HuMAb · V2及び gp Πに対する HuMAb ' VIは、 そ れぞれ分子量 90, 000と 55, 000及び 108， 000と 62, 000を免疫沈 降した。 i ) 抗 VZVgpHI · HuMAb のウイ ルス中和活性
プロティ ン Aセファ ロース 4 Bで精製した HuMAbを 20 fflfiから 10% FCSを舍む M E M培地で 3倍段階稀釈した溶液 200 Wと 4 X 103pfuZffigの V Z V溶液 100 及び 5倍稀釈したモ ルモッ ト補体 （ 5倍稀釈時の CH5。 = 50) 100 または補体の代 りに 10% FCSを舍む M E M培地 100 Wを混合し、 37てで 1時' 間反応させた。
反応後、 ウィ ルス HuMAbの混合液（200W ) を、 前もって培 養しておいた 6穴培養プレー ト （フアルコ ン 3046 ) 中の H E L単層細胞上に接種し、 37'Cで 1時間吸着させた。 吸着後、 0. 5 %ァガロース、 5 % FCSを舍む M E M培地を重層し、 37 •C 5 % C02下で 7 日間培養した。 V Z V感染プラークは 10 %ホルマリ ン液で固定後 0.15%メ チレンブルーで染色して光 顕下で計測した。 混合した V Z Vの感染価を 50%減少させる 抗体濃度を ED50として表わした。
その結果抗 gpIDノ HuMAb(V3) は、 以下に示す優れた中和活 性を有することが判った。
' 正常ヒ ト血清免疫グロブリ ン（NHIgG) の 1700倍から 14000 倍の高い中和活性を有する。
• 捕体非依存性の中和活性をもつ。
• 他の抗 VZVZHuMAb 、 抗 gp I (V2)、 抗 gp Π (VI)と比較した 場合さ らに高い中和活性をもつ。
• 4種の V Ζ V株 （実験室内継代株 3株、 臨床分離株 1株） いずれに対しても高い中和活性をもつ。 結果を表 1 に示す。 第 1 表
ED50値 (ftg/wH) 補蹄加
ウィルス株 Kawaguchi Oka CaQu obayashi Kawaguchi Oka CaQu Kobayashi
V I 3.5 1.9 3.5 1.4 0.33 0.22 0.33 0.63
V2 >10 >10 >10 >10 0.036 0.18 0.070 0.082
V3 0.027 0.15 0,10 0,043 0,029 0,036 0,044 0,041
NHIgG 380 460 630 230 49 140 ' 140 74
j ) 抗 VZVgp HI · HuMAb の感染拡大抑制活性（V-SIMA)
上記 g ) のごと く、 精製された抗 gp DI · HuMAb の感染拡大 抑制活性を調べた。
あらかじめ、 96穴培養ブレー ト上に培養しておいた H E L 細胞単層に各穴当り lOOpfuの VZV(0ka株） を加え、 37てで 2 時間感染させた後、 PBS(+)で 3面洗浄した。 10% FCSを舍む
M E Mで 3倍段階稀釈した HuMAb溶液を各穴 200 づっ加え、 37て、 5 % C02下で 7 日間培養した。 抗体を加えない穴で
C P Eが 100%発現した時点で PBS( + )で 3回洗浄し、 0. 1 % ダルタールアルデヒ ドを舍む PBS(+)を各穴当り 200 加えて 固定した。
以下、 上記 d ) に示されたモノ レイ ァプレー トの ELISA法 と同様の方法で V Z Vの感染の拡がり ぐあいを測定した。 結 果は図 6 に示した。 V Z Vの感染が抑制された場合、 ELISA の吸光値が低く V Z Vの感染が抑制されない場合は高く表わ される。 抗 gpDI · HuMAb · V3は V Z Vの感染拡大を抑制し、 その ED5。値 （ V Z V感染拡大が全く阻害されない場合の吸光 度を 0 %、 V Z V感染拡大が完全に阻害された場合の吸光度 を 100%と して、..50%の吸光度を与える HuMAb濃度を ED50値 と した） は l iig/fflfiであった。 他の抗 VZV · HuMAb (抗 gp I · V2、 抗 gplH · VI) 及び抗 HCMV · HuMAb( C23) では、 lOpg^ の濃度でも V Z V感染拡大を全く抑制しなかった。
k ) 抗 VZVgpEI · HuMAbの抗体依存性細胞介在性細胞.傷害活性 (Antibody Dependent Cell mediated Cy to.toxci ty ； flDCC) 底面積 75ciiの培養器に培養した H E L単層細胞 （ 5 X106 個ノボ トル） に 1/5量（106個 Zボ トル） の VZV(0ka株） 感染 細胞を接種した。 24時間後に 80%以上の細胞変性効果（CPE) が表われた時点で 0. 1 % ト リ プシン 0.02% EDTA を舍む PBS (-)で感染細胞を浮遊させた。 20% FCSを舍む RPMI 1640 培地で 1 X 106 個 ZfflUこなるように再懸濁し、 7. 4 MBq の
〔 51Cr〕 ク ロム酸ナ ト リ ウム （Na 〔 51Cr〕 04 ； 9. 3 — 19GBq / n Cr； Amersham International pic. , Buckinghamshire HP79LL England) を加え 37'Cで 1時間反応させアイ ソ トープ 標識した。 ァイ ソ トーブ標識した感染細胞は 20% FCSを舍む RPM 11640培地で 5回洗浄し、 5 X104 個 /¾Πこなるように再 懸濁し、 標的細胞として用いた。
効果細胞 （エフェクター細胞） と して、 ヒ ト脾臓リ ンパ球 を用いた。 ヒ ト脾臓リ ンパ球を Ficall上に静かに重層 し、 1500rpm 20分間遠心し、 界面のリ ンパ球を分離した。 得られ たリ ンバ球は 20% FCSを含む RPMI1640培地で 2回洗浄し、 1 107 個 Zifiに調整した。
96穴丸底培養プレー トに の標的細胞、 の段階稀 釈した抗体溶液、 の効果細胞を加え、 37てで 18時間反 応させた。
総51 Cr放出値（total 51Cr release)のためには抗体溶液の 代りに 2 %Triton X- 100を加え、 自然51 Cr放出値（spon taneous 5 ICr release) のためには抗体溶液の代りに 20% FCSを舍む
BPMI1640培地を加えた。
反 M、終 後、 Skatron supernatant col lection system
(Skatron, Norway) で上清を回収し、 上清中に放出された
51Cr値（dpm) をガンマシレチレーショ ンカウ ンター（Aroka,
Japan)で測定した。 各抗体の ADCC活性は以下の計箕式によつ て V Z V感染細胞に対する細胞傷害度 （Cytotoxicity^) で 表わされる。
各饥体の Cr release dpm― spontaneous " 1 Cr release dpm
X 100(% ) total 1 Cr release dpm ― spontaneous 51 Cr release dpm
この結果 V 3 (抗 gpBI HuMAb) は ZOngrZagの低濃度で ADCC 活性が見いだされた。 結果を図 7 に示す。
規則第 13規則の 2の寄託された微生物への言及
寄託機関 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号
受託番号及び寄託した日付 ：
細胞株 V3 1F4(抗 VZVgplI - HuMAb を産生する
ハイ ブリ ド一マ V 3 のサブク ローン） 寄託の日付 平成 2年 2月 21曰 寄託番号 微ェ研条寄第 2765号
FERM BP-2765 産業上の利用可能性
本発明の V Z Vの gp IBに対する MA bは V Z Vによる感染 症の診断、 予防及び治療のために有用であると期待される。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 水痘帯状疱疹ウ ィ ルス（VZV) の糖蛋白 gpDIに対するヒ ト ' モノ ク ローナル抗体。
2. V Z Vの感染拡大を抑制する、 請求項 1記載のヒ ト - モノ ク ローナル抗体。
3. ウイルス中和活性をもつ請求項 1記載のヒ ト ' モノ ク ローナル抗体。
4. 抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC)活性をもつ請求 項 1記載のヒ ト ' モノ ク ローナル抗体。
5. 細胞ホモジネ一 ト · ブレー ト ELISA に反応しないか又 はわずかにしか反応せず、 細胞モノ レイ ァ . プレー ト ELISA に反応する請求項 1記載のモノ ク ローナル抗体。
6. 請求項 1 〜 5のいずれか 1項記載のヒ ト . モノ ク ロ一 ナル抗体を産生するハイ プリ ドーマ及びそれに由来する細胞 株。
7. 細胞一細胞間感染拡大抑制活性の微量測定法（V-SIHA) で選びだされたヒ ト モノ ク π—ナル抗体を産生する請求項 6 記載のハイプリ ドーマ及びそれに由来する細胞株。
8. 工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている V 3細胞株及びそれに由来する細胞株。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995031546A1 (en) * 1994-04-28 1995-11-23 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Recombinant human anti-varicella zoster virus antibodies

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506132A (en) * 1993-07-28 1996-04-09 Sandoz Pharmaceuticals Corporation Human antibodies against varicella-zoster virus
GB0304576D0 (en) 2003-02-28 2003-04-02 Lonza Biologics Plc Protein a chromatography
CN104360055B (zh) * 2014-11-07 2016-05-18 山东泰邦生物制品有限公司 测定水痘-带状疱疹病毒中和抗体的试剂盒及生产使用方法
US11147870B2 (en) 2018-04-25 2021-10-19 Emory University Specific binding agents to varicella-zoster virus and uses related thereto

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6242933A (ja) * 1985-04-10 1987-02-24 Teijin Ltd 水痘帯状疱疹ウイルスに対するヒト型モノクロ−ナル抗体及びその製造法
JPS62112000A (ja) * 1985-08-01 1987-05-22 メルク　エンド　カムパニ−　インコ−ポレ−テツド 水痘・帯状ヘルペスウイルス抗体に関する試験

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3016109B2 (ja) * 1993-02-15 2000-03-06 住友金属工業株式会社 プログラムドキュメント保守装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6242933A (ja) * 1985-04-10 1987-02-24 Teijin Ltd 水痘帯状疱疹ウイルスに対するヒト型モノクロ−ナル抗体及びその製造法
JPS62112000A (ja) * 1985-08-01 1987-05-22 メルク　エンド　カムパニ−　インコ−ポレ−テツド 水痘・帯状ヘルペスウイルス抗体に関する試験

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Virology, Vol.52, No.1, (1984), PAUL MALCOLM KELLER et al. "Three major glycoprotein genes of varicella-zoster virus whose products have neutralization epitopes" p. 293-297. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995031546A1 (en) * 1994-04-28 1995-11-23 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Recombinant human anti-varicella zoster virus antibodies

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