JPH0284193A - 抗体調製物からのプロテインａの除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に生物学的に活性な蛋白質の精製Ｉこ関
し、特に治療学的抗体調製物中のプロティンＡ汚染物の
低減に関する。

要するに本発明によれば、プロティンＡは抗体−プロチ
インＡの混合物から、この混合物を両成分を吸着させる
のに十分な条件下にアニオン交換材料に露呈し、次いで
抗体及びプロティンＡをイオン強度の増大する条件下に
連続して流出させることにより、選択的に単離される。

得られる抗体調製物は抗体ｍｇ当り約１５ｎｇ以下のプ
ロティン八を有する。

プロティンＡは黄色ブドウ球菌（Ｓ　ｔａｐｂｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　、コラワン種（Ｃｏｖａ
ｎ　Ｓ　ｔｒａｉｎ）　Ｉから得られる良く知られた物
質である。これは高度の抗体特異性を有し、そしてその
蛋白質は抗体と複合体を作るために長い間使用されてき
た。プロティンＡは種々の水に不溶な支持体材料に結合
させることにより固定化形で通常使用される。次いでこ
の固定化されたプロティンＡを用いて可溶性抗体と複合
体化し、続いて該抗体を抗体−固定化プロチインＡ複合
体から流出させる。従ってプロチインＡクロマトグラフ
ィーは、その簡便さ及び高度の抗体特異性のために、腹
水又は組織培養流体に由来するモノクローナル抗体を均
質にまで精製するのに優秀な方法である。

しかしながらこの精製されたモノクローナル抗体を治療
学的に使用する場合には、精製した治療学的生成物に可
溶化されたプロティンＡが存在することの可能性が大き
く安全性に心配がある。そのように可溶化されたプロテ
ィ／Ａは、精製工程中にプロティンＡがその担体材料か
ら意図されずに脱離することに起因すると思われる。

多くの刊行物が動物モデル及び人間に関してプロティン
Ａを毒性並びに変異性と関連づけている［参照、例えば
ペンシンガー（Ｂ　ｅｎｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｊ、パイオ
ル・レスプ・モデイフ（Ｂ　ｉｏｌ、　Ｒｅｓｐ。

Ｍｏｄｉ（、）３，３４７　（１９８４）；メツサーシ
ュミット（Ｍ　ｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄｔ）ら、Ｊ、パ
イオル・レスプ・モディフ３．３２５　（１９８４）；
ターマン（Ｔ　ｅｒｍａｎ）及びパートラム（Ｂ　ｅｒ
ｔｒａｍ）　、ニール（Ｅｕｒ−）Ｊ−キャンサー・タ
リフ・オンコル（Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１１ｎ、　０ｎｃｏ
１．）　２１％１１１５　（１９８５）；及びベンチュ
ラ（Ｖ　ｅｎＬｕｒａ）ら、ホードパジル・キャンサー
・トリート・レプ（Ｈｏｒｔ−ｏｂａｇｙｌ、　Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ　Ｒｅｐ−）　７１．４１１（１９
８７）］。

悪いことに今日まで、治療学的用途の抗体調製物中に望
しくなく存在しているかも知れない非常に低量のプロテ
ィンＡ（即ち蛋白質ｌＩＩｇ当り約１５ｐｇ以下のプロ
ティンＡ）を測定するだめの分析法が存在してなかった
。驚くことに本明細者はそのような分析が今や可能であ
ることを発見した。

本発明の分析は抗体調製物中のプロティンＡ汚染物を非
常に低量まで減する方法を誘導する。斯くして本方法は
プロティンＡによる汚染を低度に保証しつつ固定化プロ
ティンＡを用いるという治療学的抗体調整物の製造を可
能にする。本発明の分析及び精製法の詳細を以下に示す
。

固定化されたプロティンＡを用いて精製したモノクロー
ナル抗体中にプロティンＡの漏出があるならばその量を
評価するために、本発明者は、ｌ）準ナノグラム範囲ま
で感度のあるプロティンＡエライザ（ＥＬＩＳＡ）を開
発し；２）このエライザを、プロティンＡクロマトグラ
フィーで精製しｔ二モノクローナル抗体中のプロティン
Ａの量を定量するために使用し；そして３）抗体Ａ調製
物を汚染していることの見出された可溶化プロティンＡ
を減するための方法を工夫した。１本発明の高感度プロ
ティンＡエリザは、ビオチニル化されたプロティンＡを
免疫分析標識として用いることによって、抗体ｆｆ１ｇ
当り１５ｎｇ以下のプロティンＡを測定することを可能
にした。抗体−プロチインＡ混合物中のプロティンＡの
量を減する、本方法は、この混合物を混合物の同成分を
アニオン交換材料上に複合体化させるのに十分な条件下
にアニオン交換カラムと接触させ、次いで蛋白質を実質
的に含まない（即ち抗体ｍｇ当りプロティンＡ１５ｎ＋
？以下）抗体調製物の流出を保証するのに十分な条件下
にイオン強度を注意深く変えることによって成分を選択
的に流出させることを含んでなる。好ましくはプロティ
ンＡの含量は抗体ｍｇ当り約１ｒ＋ｇ以下であり、その
精製工程は混合物をイオン交換カラム例えばＤＥＡＥ　
ｌ−リスアクリルＭ又はＤＥＡＥセファローズのカラム
に適用し、次いで抗体を、後述するように約０．０２５
Ｍから０．２５ＭＡのＮａＣＩ溶液の濃度勾配で流出さ
せることによって達成される。

第１図はＯ−０２ｍｇ／ｍ（２から約ＬＯｎｇ／ｍＱの
範囲の濃度におけるプロティンＡに体するエライザを示
すグラフである。

第２図は０゜０２ｎｇ／ｍ（２から１　、３ｍｇ／ｍＱ
までの標準曲線の再度引かれた部分を示すグラフである
。

第３図はイオ・ン強度を増加させるという条件下に抗体
及びプロティンＡの双方を流出させるためのカラムの様
子を示すグラフである。

低量のプロティンＡに対する酵素の標識された免疫吸着
分析［エライザ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）］　を、抗プロティ
ンＡＩｇＧを次のようにビオチニル化することにより工
夫した。

試薬：ＢＢＬ、クミロバイオロジー・システムズ（Ｍ　
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓ　ｙｓｔｅｍｓ、　Ｃｏｃ
ｋｅｙｓｖ目ｌｅ、ＭＤ）からＰＴＡ血球凝集反応緩衝
液（ＰＢＳ）を得た。

ＴＢＭ　（Ｐトラメチルベンジジン）マイクロウェル・
ベメオキシダーゼ・サブストレート（Ｍｉｃｒ。

ｗｅｌｌ　Ｐ　ｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓ　ｕｂｓｔｒａ
ｔｅ）及びペルオキシダーゼ・サブストレート溶液Ｂは
カーケガード・アンド・ベリー・ラブズ社（Ｋ　ｉｒｋ
ｅｇａａｒｄ　＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、、
　Ｇａｉｔｈｓｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）から入手した。

ウサギの抗プロティンＡＩｇＧ（４５Ｆ−８８０６号）
及び牛のアルブミンはシグマ（Ｓｉｇｍａ、　　Ｓｔ、
　　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から得た。ＨＲＰ−ストレプ
タビジン（Ｓ　ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）はザイムド０
ラボラトリーズ社（Ｚ　ｙｍｅｄ　Ｌ　ａｂｏｒａＬｃ
ｒｉｅｓ。

Ｉ　ｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｆ　ｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ
）及びビオチン−Ｘ−ＮＨ３はカルビオケム（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ　ａＪｏｌｌａ、　ＣＡ）から購入
した。天然のプロティンＡアビドゲル（Ａ　ｖｉｄＧ　
ｅｌ）　Ｆはバイオプローブ・インターナショナル社（
Ｂ　ｉｏＰ　ｒｏｂｅ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉ−ｏｎａ
ｌ、　　Ｉ　ｎｃ、、　Ｔｕｓｆｉｎ、　ＣＡ）から得
た。組換えプロティンＡはレプリケン社（Ｒｅｐｌ　ｉ
ｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、　。

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ　Ａ　）から得た。ＤＥＡＥ
−）リスアクリルＭはＬＫＢインストルメンツ社（ＬＫ
ＢＩ　ｎｓＬｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉ　ｎｃ、、　Ｇａｉ
Ｌｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）がら入手した。

方法：ウサギの抗プロティンＡＴｇＧを、供給会社の教
示に従ってビオチニル化した。この方法は２０　ｍｇ／
ｍ（２のビオチン−Ｘ−ＮＨ５２０μ＋２を、０．１Ｍ
炭酸水素塩緩衝液中１ｍｇ／ｍ（２抗体溶液に添加し、
次いで装置で１時間穏やかに撹拌することからなった。

次いで過剰のビオチン−Ｘ−ＮＨＳをＰＢＳ緩衝液に対
する透析によって除去した。

プロティンＡ・基準の濃度は２７５ｎｍにおいて１％溶
液に対して１．４６の吸光係数を用いて決定した［参照
、スジョキスト（Ｓ　ｊｏｑｉｓＬ）ら、ニール−Ｊ、
バイオケム（Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｅｈｅｍ、）
、旦、５７２　（１９７２）］。

本発明のエリザ（酵素標識免疫吸着分析）は次の如く行
なった：ナンク・イミュノ・プレート（Ｎｕｎｃ　Ｉｏ
＋ｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ、　Ｎｏ、４−３９４５．　　
ｒｎｔｅｒＬａｂ、　Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、　
ＣＡ）の９６ウエル（ｗｅｌｌ）の平底エリザ・プレー
トを、０．０５Ｍカーボネート（ｐＨ９，６）中に希釈
した５ｐｇ／ｍ（：ｔ　Ｏ）抗７’ｏティ”／Ａ　　Ｉ
　ｇＧ　ｌ　００ｐＱ　Ｔコーティングし、５℃に終夜
保温した。次いでこのプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ−
０，０５％ツウィーン２０）で洗浄し、ウェル当り洗浄
緩衝液２００、ｕ（２＋１．５％ＢＳＡ−Ｃ’プａツク
し、３７℃に１時間保温した。次いでプレートを洗浄し
た。

試料及び洗浄緩衝液中に希釈した標準物をＩｏ。

ｐａずつプレートに添加し、３７°Ｃで１時間培養した
。ブランクとして役立つ希釈剤１００１２だけを含有す
るウェルをわきに作った。試料を捨て、プレートを再び
洗浄緩衝液で再洗浄した。各ウエルニ、洗浄緩衝液中Ｂ
ＳＡ　（約１／１６．０００）中に希釈したビオチニル
化抗プロティンＡ　　ＩｇＧ１００μｆ２を適用し、３
７°Ｏｉ、：１時間保温シタ。

抗体をすて、プレートを洗浄した。最後に、ウェル当す
ストレブタビジンーＨＲＰｌｏｏＩＩＱを添加し２、プ
レートを３７℃に１時間保温した。プレートを洗浄し、
モしてＴＭＢマイクロウェル・ペルオキシダーゼ・サブ
ストレート及びペルオキシダーゼ・サブストレート溶液
Ｂのｌ：ｌ溶液１００μＱをウェル当りに添加し、室温
で約５分間培養した。反応を停止させるためにＩＮ　　
ＨＣＩ　　１００μａを添加した。生じた黄色の強度は
存在するプロティンＡの量に比例し、ダイナチク（Ｑｙ
ｎａｔｅｃｈ）　Ｍ　Ｒ６００ミクロカ価プレート読み
とり機（ダイナチク、Ｂ　ｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、　Ｍ　
Ａ　）により４５０ｎｒＤでの吸光度を測定することに
よって定量化した。各ウェルの読みを、５７０ｎｍでの
吸光度で割ることにより非特異性の寄与を相殺した。ブ
ランクの平均値を差引いてバックグランドを排除した。

実験を同一のエライザ・プレートで複数回行ない、そし
て平均値をデータ分析法に利用した。

エリザの感度： 精製シタプロティンＡを０　、０２ｎｙ　／ｍＱ　＝　
１０ｎｇ／ｍＱの範囲の濃度でエライザにより試験した
。第１図に示す結果は、約１０ｎｇ／ｍＱでの飽和を示
す。０　、０２Ｂ　／’ｍＱがら１．３ｎｇ／ｍｆｆま
での標準曲線の部分を、延長した尺度で第２図に再び引
いた。これは曲線の直線部分が凡そ０゜０５ｎｇ／ｍｆ
ｆないし０　、６　ｎｙ　／ｍＱの範囲にあることを示
す。

エライザの有効性ニ プロティンＡのエライザを発展させて、モノクローナル
抗体の存在下にプロティンＡを定量化り。

た。モノクローナル抗体の化学量論的過剰量での存在が
分析を妨害するかどうかを決定するために、次の実験を
行なった。イオン交換クロマトグラフィーで均質まで精
製したモノクローナル抗体の１ｍｇ／ＩＩＩＱ溶液を、
精製したプロティンＡの１０μｇ／ｍＱで無効（ｓｐｉ
ｋｉｎｇ）にした。対照及び基準として、エライザ希釈
緩衝液もプロティンＡの１０μｇ／ｒｎＱで無効にした
。この混合物を室温で％時間培養し、次いで分析のため
に分析希釈緩衝液中で２０ｎｇ／ｍβまで希釈した。結
果を第２図に示す。２つの曲線は殆んど重ねることがで
きた。標準と無効にしたモノクローナル抗体に対する結
果はそれぞれ２０ｎｇ／ｍＱ及び１８．３ｎｇ／ｍＱで
あった。９％の差は実験誤差に帰すことができる。これ
らの結果は過剰量のモノクローナル抗体の存在が有意な
ほどエライザを妨害しないことを示す。

プロティンＡの漏出 プロティンＡクロマトグラフィーで精製したいくつかの
モノクローナル抗体の調製物のプロティンＡによる汚染
度を決定した（第１表）。流出物ｌａ”ｌｆは実験間に
０．２Ｍグリシン、ｐＨ２゜８のカラム容量の３倍量で
パージしたバック・ツー・バック（ｂａｃｋ　−ｔｏ　
−ｂａｃｋ）　０　、８　ＱプロティンＡカラム実験を
表わす。約３００ｎｇ／ｍＱの初期のプロティンＡ量は
続く実験において凡そ４０〜Ｉ　ＯＯｎｇ／ｍＱまで低
下した。

流出画分２及び３は、画分１流出物を得るために用いた
固定化プロティンＡと新しく固定化したプロティンＡの
混合物を含む１．５１２のプロティンＡカラムを表わす
。画分２流出物のプロティンＡ値は画分ｌと同様であっ
たが、画分３流出物の値はかなり低かった。プロティン
Ａの漏出の量はカラムの使用と共に減少するように見え
た。

第　　Ｉ　　表 八で無効にした。カラムの様子を第３図に示す。

プロティンＡはＩｇＧより高ＮａＣｌ濃度で流出し、そ
して蛋白質流出ピークの良好な分離が達成された。

ＤＥＡＥクロマトグラフィーの、プロティンＡカラムで
精製したモノクローナル抗体中、のプロティンＡ汚染物
を減少する能力を更に評価するために、プロティンＡ流
出物をＤＥＡＥでのクロマトグラフィーにかけた（参照
第２表）。

実施例 （モノクローナル抗体の精製） 固定化プロティンＡによって精製したモノクローナル抗
体には測定しうる量のプロティンＡが存在したので、プ
ロティンＡ汚染物量を減する方法を探究した。最初の実
験において、プロティンＡクロマトグラフィーで予じめ
精製したモノクローナル抗体を、モノクローナル抗体ｍ
ｇ当りプロティンＡ０．５９μｇの濃度まで精製したプ
ロテインさム ｐ艷 ＠お 褒 無効実験を確認して、プロティンＡのモノクローナルか
らのかなりの分離が観察された。代表的な精製工程の詳
細を次の実施例で示す。

モノクローナル抗体の精製：ＩｇＧ１の組織培養に由来
する抗凝集因子■モノクローナル抗体（Ｃ７Ｆ７と表示
）を次の方法で精製した：ｌ）組織培養流体を濾過によ
り清澄させた、２）上澄溶液にポリエチレングリコール
（１７ｗ／ｙ％）を添加し、そして溶解した。沈殿を分
離し、溶液を捨てた。この沈殿を、元の組織培養流体の
２．５％の容量まで０．０５Ｍトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８
，００に溶解した。溶解しＩ；沈殿は一２０℃又はそれ
以下で凍結貯蔵することができる；３）新しい又は融解
した溶解沈殿を遠心分離及び／又は濾過によって清澄さ
せた；４）この溶液を、溶解緩衝液で平衡化させたプロ
ティンＡアビドゲルＦ（Ｒ）（又は同等の固定化された
プロティンＡ）と接触させ、同一の溶液で洗浄した。次
いで０゜０５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム、ｐＨ４，００を用いる流出によりＣ７Ｆ７を除去
した：５）この流出液をＤＥＡＥ平衡緩衝液（０，０２
５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２５Ｍトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン、ｐＨ８−６０）の少くとも６倍
容量に対して透析した；６）この溶液を（予じめ平衡化
した）ＤＥＡＥセファローズ（Ｒ）又は同等のアニオン
交換樹脂と接解させ、そしてＤＥＡＥ平衡緩衝液で洗浄
した。Ｃ７Ｆ７を０．０２５Ｍから０．２５Ｍへの塩化
ナトリウムグラジェントにより流出させた。流出物をＡ
２８０に基づいて集めた。テーリングしている端は捨て
た。このテーリング端は最大ビークＡ２８０の２０％以
下として定義される；７）燐酸塩緩衝食塩水（８，９ｍ
Ｍ燐酸燐酸トナトリウム。

７ｍＭ燐酸モノナトリウム、１．６ｍＭ燐酸モノカリウ
ム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）の少くとも６倍容量に
対して溶液を透析した。上述の方法を用いることにより
、抗体調製物のプロティンＡ含量は抗体に対して１５ｎ
ｇ／ｍ９以下まで減ぜられた（即ちプロティンＡの範囲
は０．９〜１４ｎｇ／抗体ｍｇであった）。

プロティン八で精製し、更にＤＥＡＥクロマトグラフィ
ーで精製したいくつかのモノクローナル抗体中のプロテ
ィンＡ値は０．９〜ｌ　４　ｎｙ　／ｍｇの範囲である
ことがわかった。

プロティンＡをナノグラムの範囲の感度で検出するため
に多くのエライザが開発されてきた［マキシム（Ｍａｘ
ｉｍ）ら、Ｊ、タリフ・ミクロパイオル（Ｃｌｉｎ、　
Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．）　４．４１８（１９７６）；
ランボーン（Ｌ　ａｎｇｏｎｅ）ら、Ｊ、イミュノル・
メソッズ（Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）上８
，２８１（１９７７）；フエイ（Ｆ　ｅｙ）及びバーク
／１−ド（Ｂｕｒｋｈａｒｄ）、Ｊ、イミュノル・メソ
ツズ、４７．９９　（１９８１）；ロフダール（Ｌ　ｏ
ｆｄａｈｌ）ら、ブロク・ナト・アカド・サイ（Ｐ　ｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）　、ＩＪ、　　Ｓ、　Ａ、、
旦」−１６９７（１９８３）；オルスウィク（Ｏ１ｓｖ
ｉｋ）及びベルダル（Ｂｅｒｄａｌ）　、アクタ・パソ
ル・ミクロ／くイオル・イミュノル・スカンド・セクト
Ｂ・ミクロパイオル（Ａｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ。

５ｃａｎｄ、　　５ｅｃｔ、　　Ｂ　、　　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、）　　８９−１２８９（１９８１）；デルツ
ポウ（Ｄ　ｅｒＬｚｂａｕｇｈ）ら、Ｊ。

イミュノル・メソッズ、８３．１６９（１９８５）；コ
ンシジン（Ｃｏｎｓｉｄｉｎｅ）ら、パイオス・レプ（
Ｂｉｏｓ、　Ｒａｐ、）　６．９３３　（１９８６）；
ワー不ス（Ｗａｒｎｅｓ）ら、Ｊ、イミュノル・メソッ
ズ、９３．６３（１９８６）］。本明細書は過剰量のＩ
ｇＧの存在下におけるプロティンＡの分析を含むから、
この分析は遊離のプロティンＡ及びＩｇＧのＦｃ領域の
複合体化したプロティンへの双方を検出しえねばならな
かった。斯くしてエライザに用いる抗体はプロティン八
分子上のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対して特異的
でなければならない。

刊行されたプロティンＡエリザ技術の多くは分析におい
てプロティンＡのＦｃ結合能力を利用するから上述の適
用に不適当である［マキシムら（１９７６）；ランボー
ンら（１９７７）；フエイ及びパークハード（１９８１
）；口７ダールら（１９８３）；オルスウィク及びベル
ダル（１９８１）；コンシジンら（１９８６）；ワルネ
スら（１９８６）］。本発明者は抗プロティンＡコーテ
ィング抗体及びビオチニル化抗プロティンＡを検出抗体
として用いるエリザを開発した。ビオチニル化２次抗体
エリサは、アルカリ性ホスファターゼ標識の試薬を用い
る同様の分析［デルツポウ（１９８５）］よりも約１０
０倍大きい分析感度を有した。更にＯ−１ｎｇ／ｒｎＱ
より低い感度の場合の、本エライザは最近公開された最
大感度のプロティンＡ系［ワーネスら（１９８６）］よ
りも５〜ｌＯ倍高感度である。ウサギのプロティンへ−
ビオチンの、ウサギのプロティンＡ１続くヤギの抗つサ
ギＩｇＧ−ビオチンでの代替は更に分析感度を改善しう
る［ワ、−ネスら（１９８６）］。

親和性カラムで精製したモノクローナル抗体のプロティ
ンＡ汚染は従来報告されており［デルツポウら、Ｊ、イ
ミュノル・メソッズ、８３，１６９（１９８５）］、そ
してプロティンＡ値はここに報告されているものと同様
であるように見える。

本研究においてプロティンＡを結合させるために用いる
２−フルオル−１−メチルピリジニウムトルエン−４−
スルホネート（ＦＭＰ）活性化ゲルはデルツボウらの用
いるシアノケンプロマイド活性化ゲル［ンゴ（Ｎｇｏ）
、バイオ（Ｂｉｏ）／テクノロジー（Ｔ　ｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）　４．１３４（１９８６）］よりも安定な結合
であると報告されている。２つのプロティンＡマトリッ
クスの漏れ速度が同様であり、またその使用が結合を減
するように見えるという観察は、カラムから洗い出され
るプロティンＡの大部分がマトリックスに非共有結合し
ているという仮説［デルツポウら、Ｊ、イミュノル・メ
ソッズ（１９８５）］　を支持する。

ＤＥＡＥクロマトグラフィーはマウスのモノクローナル
抗体の製造においてプロティンＡ汚染物の量を効果的に
減することが示された。過剰なウサギ又は人間のＩｇＧ
の存在下において、プロティンＡは分子式［ＩｇＧ２プ
ロティンＡ］又は２量体構造式［（ＩｇＧ）２プロテイ
ンＡ］２を有する複合体を形成することが示された［バ
リツド（ＥａｌｉｎＬ）ら、キャンサー・レス（Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４４．７３４　（１９８４）；ダス
（Ｄ　ａｓ）ら、アナル・バイオヘム（Ａ　ｎａｌ、　
Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、１４５．２７（１９８５）］。

これらの複合体はセファローズＣＬ−６Ｂ　　［バリツ
ドら、キャンサー・レス、土１．７３４（１９８４）］
により又はゲル濾過ＨＰＬＣによりＩｇＧから分離する
ことができた。

プロティンＡを血清に又は単量体ＩｇＧに添加すること
によって生成せしめられるモデル複合体はＦｅ含有白血
球及び補体系を活性化して試験管内でオキシダント及び
アナフィラトキシン活性を生じさせることが報告されｔ
；［バリツドら、キャンサー・レス、±１．７３４　（
１９８４）］。汚染物のプロティンＡを減するために設
計された精製工程例えばり、ＥＡＥ又はゲル濾過クロマ
トグラフィーは治療学的モノクローナル抗体を受は入れ
る場合に毒性効果の可能性を最小にするであろう。

上記開示及び実施例に関して、同業者には多くの変化が
想起されると思われる。従って上記実施例は例示と見な
すべきであり且つ本明細書に開示される本発明の範囲は
特許請求の範囲によってだけ限定されるべきであるとい
うことが意図される。

本発明の特徴及び態様は以下の通りである。

■、抗体及びプロティンＡの混合物を、抗体及びプロテ
ィンＡの双方を吸着させるのに十分な条件下にアニオン
交換材料と接触させ、そして次いで抗体及びプロティン
Ａをイオン強度の増大する条件下に連続して流出させる
該混合物からプロティンＡの量を抗体ｍｇ当りプロティ
ンＡ約１５ｎｇ以下まで減する方法。

２、イオン強度を増大させる条件が抗体及びプロティン
Ａを、約０．０２５Ｍ−０，２５Ｍの濃度勾配を有する
ＮａＣｌ溶液で流出させることを含んでなり、またプロ
ティンへの量を抗体ｌｌ１ｇ当り約１ｎｇ以下まで減す
る上記ｌの方法。

３、アニオン交換材料がジエチルアミノエチル（ＤＥＡ
Ｅ）トリスアクリルＭ又はＤＥＡＥセファローズを含ん
でなる上記ｌの方法。

４、上記ｌに従って製造され且つ実質的にプロティンＡ
を含まない抗体調製物。

５、プロティンＡの量が抗体ｍｇ当り約１５ｎｇ以下で
ある上記４の調製物。

６、プロティンＡの量が抗体ｍｇ当り約Ｉｎｇ以下であ
る上記５の調製物。

７、抗体調製物が少くとも１種のモノクローナル抗体を
含んでなる上記４の調製物。

８、抗体調製物が血液凝固因子■に対するモノクローナ
ル抗体を含んでなり、そしてプロティンＡの含量が抗体
ｍｙ当り約１５ｎｇ以下である上記４の調製物。

９、プロティンＡの含量が抗体ｍｇ当り約１ｎｇ以下で
ある上記８の調製物。

１０、抗体溶液中のプロティンＡの濃度を定量するＩ；
めのエライザにおいて、ビオチニル化抗プロティンＡを
免疫分析の標識として用い、これによりτ分析感度を、
抗体当りプロティンＡ約１５ｎｇ以下まで増大させる該
エライザ。

【図面の簡単な説明】

第１図は０　、０２ｒｎｇ　／ＩａＱから約１０ｎｇ／
ｍＱの範囲の濃度におけるプロティンＡに体するエライ
ザを示すグラフであり、 第２図は０　、０２ｎｇ／ｍＱから１．３Ｂ／ｍＱまで
の標準曲線の再度引かれた部分を示すグラフであり、 第３図はイオン強度を増加させるという条件下に抗体及
びプロティンへの双方を流出させるためのカラムの様子
を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗体及びプロテインＡの混合物を、抗体及びプロテ
   インＡの双方を吸着させるのに十分な条件下にアニオン
   交換材料と接触させ、そして次いで抗体及びプロテイン
   Ａをイオン強度の増大する条件下に連続して流出させる
   、該混合物からプロテインＡの量を抗体ｍｇ当りプロテ
   インＡ約１５ｎｇ以下まで減する方法。 ２、特許請求の範囲第１項に従って製造され且つ実質的
   にプロテインＡを含まない抗体調製物。 ３、抗体溶液中のプロテインＡの濃度を定量するための
   エライザにおいて、ビオチニル化抗プロテインＡを免疫
   分析の標識として用い、これによって分析感度を、抗体
   ｍｇ当りプロテインＡ約１５ｎｇ以下まで増大させる該
   エライザ。