KR20110021723A

KR20110021723A - 단백질 정제 방법 및 단백질 정제용 친화성 컬럼

Info

Publication number: KR20110021723A
Application number: KR1020107022371A
Authority: KR
Inventors: 이재일; 이영선
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2011-03-04
Also published as: WO2009139601A3; CN102027002A; EP2276776B1; JP2011520443A; US20090286283A1; EP2276776A2; WO2009139601A2; EP2276776A4

Abstract

본 발명은 펩티드 태그와 프로테아제 저해제 사이에 특이적 친화성을 사용하여 샘플로부터 단백질을 정제하는 방법을 개시한다. 또한, 단백질 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 매질과 지지체 상에 고정된 프로테아제 저해제를 가지는 지지체 및 친화성 크로마토그래피 매질을 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼을 개시한다.

Description

단백질 정제 방법 및 단백질 정제용 친화성 컬럼{METHOD AND AFFINITY COLUMN FOR PURIFYING PROTEINS}

본 출원은 단백질을 정제하는 방법 및 단백질을 정제하는 데에 사용하는 친화성 컬럼에 관한 것이다.

최근에 단백질을 질병의 치료 및 진단에 사용하고자 하는 시도가 많이 있다. 특히, 치료용 항체 시장이 비약적으로 성장하고 있고 많은 생명공학 기업이 항체 개발에 뛰어들고 있다. 재조합 항체 공학 분야는 초기의 키메릭 항체나 인간화 항체의 개발 단계를 거쳐 최근에는 항체의 탈면역화 기술이나 형질전환 생쥐 및 파지 디스플레이 기술을 이용한 완전 인간 항체 개발 단계까지 발전하고 있다.

종종 질병의 치료 또는 진단용 단백질은 이를 발현하는 벡터로 형질전환된 세포를 배양하여 원하는 단백질을 발현시켜 생산될 수 있다. 경우에 따라서, 이러한 단백질은 재조합 식물 또는 동물에서 과발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 젖을 분비하는 재조합 동물에서 발현되어, 원하는 단백질을 생산하는 형질전환 동물의 우유를 통해 얻는 방법 등으로 생산될 수 있다. 이 경우, 세포 배양물 또는 우유로부터 원하는 단백질을 분리 및 정제하여야 한다. 식물이나 미생물에서 단백질을 발현시키는 경우에는 우선 저장기관이나 세포 내부로부터 단백질을 추출하는 과정이 필요하게 된다. 이러한 소스로부터 발현된 단백질을 분리해내는 작업 또한 결코 용이하지 않다. 숙주세포 단백질이나 DNA를 제거 또는 분리해내야 하고, 인체에 감염 가능한 바이러스를 제거해야 하고, 식물의 경우 렉틴을, 그람 음성균의 경우 내독소를 제거해야 한다.

포유동물 세포 배양물 상층액(e.g., CHO 또는 NSO 세포 배양물) 또는 조 단백질 혼합물(crude protein mixture) 예를 들어 혈청 또는 복수액으로부터 항체의 정제 공정에 가장 널리 쓰이는 방법은 단백질 A 크로마토그래피법이다. 단백질 A는 많은 포유동물 종 유래의 단백질에 결합한다. 특히, 이는 헤비 체인과의 상호작용을 통해 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 결합한다. 단백질 A는 이뮤노글로불린 IgG에 높은 친화성으로 결합한다.

본 명세서에 개시된 내용은 샘플로부터 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

하나의 실시예에서, 상기 방법은 프로테아제 저해제와 상기 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 활성을 보유한 펩티드 태그를 연결(coupling)시키는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 프로테아제 저해제와 상기 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 활성을 보유한 펩티드 태그를 연결시키는 것을 포함하고, 상기 프로테아제 저해제는 지지체에 고정되어 있으며, 상기 펩티드 태그는 정제될 단백질에 결합되어 있는 것일 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 방법은 태깅된 단백질을 포함하는 샘플을 프로테아제 저해제가 고정된 지지체에 접촉(contact)시키는 것을 포함하고, 상기 태깅된 단백질은 펩티드 태그에 공유결합으로 연결된 단백질이고, 펩티드 태그는 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 활성을 가지며, 상기 접촉은 프로테아제 저해제가 펩티드 태그에 결합하는 조건하에서 이루어지고, 결합되지 않은 성분들은 제거하는 것 및 지지체로부터 단백질을 제거하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 지지체 및 프로테아제 저해제를 포함하는 친화성 크로마토그래피 매질이 개시된다. 친화성 크로마토그래피 매질로 팩킹(pack)된 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼 또한 개시된다.

프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 활성을 지닌 펩티드 태그 및 단백질을 포함하는 융합 단백질이 개시된다. 융합 단백질을 발현하는 재조합 세포 또한 개시된다.

본 명세서에 개시된 방법 및 컬럼을 통해 항체와 같은 단백질을 효율적으로 정제할 수 있다.

도 1은 본 명세서에 개시된 하나의 실시예에 따른 단백질 정제 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 정제된 에코틴을 전기영동한 후의 단백질 겔 사진이다.
도 3은 에코틴 친화성 컬럼을 이용하여 정제된 트립시노겐(human cationic trypsinogen: PRSS1)을 전기영동한 후의 단백질 겔 사진이다.
도 4는 단백질 A 친화성 컬럼 또는 에코틴 친화성 컬럼 중 어느 하나를 각각 이용한 항-에코틴 항체의 친화성 정제 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 단백질 A 친화성 컬럼 또는 에코틴 친화성 컬럼 중 어느 하나를 각각 이용하여 정제된 항-에코틴 항체의 전기영동 후 단백질 겔 사진이다.
도 6은 폴리펩티드 서열(서열번호 13) 및 이의 구조적 특징을 보여주는 트립시노겐(human cationic trypsinogen: PRSS1)에 대한 스위츠-플랏 엔트리 P07477(Swiss-Prot entry P07477)의 일부를 재생한 것이다.
도 7은 HEK293 세포에서 돌연변이 트립신 태그가 태깅되고, TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제 절단 자리 또한 삽입되도록 돌연변이된 헤비체인을 포함하는 재조합 항-EGFR 항체의 발현을 확인한 전기영동 후의 단백질 겔 사진이다.
도 8은 CHO-DG44(DHFR-) 세포에서 발현된 후 에코틴 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 돌연변이 트립신 태그로 태깅된 항-EGFR 항체를 전기영동한 후의 단백질 겔 사진이다.

본 명세서는 단백질 정제를 위한 방법 및 단백질 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 매질을 개시한다. 상기 방법은 프로테아제와 프로테아제 저해제 사이의 높은 결합 특이성을 이점으로 하여, 단백질 예를 들어 항체를 신속하게 정제할 수 있도록 한다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "프로테아제(protease)"라 함은, 단백질분해(proteolysis)를 수행하는 효소를 의미하는 것으로 즉, 폴리펩티드 체인에서 아미노산들을 연결하고 있는 펩티드 결합을 가수분해함으로써 단백질을 분해하는 효소를 의미한다. 프로테아제는 세린 프로테아제(Serine proteases), 트레오닌 프로테아제(Threonine proteases), 시스테인 프로테아제(Cysteine proteases), 아스파르트산 프로테아제(Aspartic acid proteases), 메탈로프로테아제(Metalloproteases) 및 글루탐산 프로테아제(Glutamic acid proteases)를 모두 포함한다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "펩티드 태그"는 프로테아제 저해제에 대한 결합 활성을 보유한 펩티드라면 그 유래나 길이를 불문하고 모두 포함된다. 예를 들어, 펩티드 태그는 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 활성을 보유한 프로테아제, 프로테아제 저해제에 대한 결합 활성을 보유한 그 단편 또는 프로테아제 저해제에 대한 결합 활성을 보유한 그 돌연변이체 등을 포함한다. 프로테아제 단편의 일 예로서 프로테아제 저해제 결합 활성은 보유하지만 전장 프로테아제의 단백질 가수분해 활성은 결여된 펩티드를 들 수 있다. 프로테아제 단편의 일 예로서 프로테아제 저해제에 대한 결합 활성을 보유한 프로테아제로부터 가장 짧은 펩티드일 수 있으며, 가수분해 활성은 결여된 것일 수 있다. 또한, 펩티드 태그의 일 예로서, 프로테아제 돌연변이체를 들 수 있으며, 이는 와일드 타입 프로테아제(wild type protease)의 단백질 가수분해 활성이 예를 들어 단백질 가수 분해 활성 자리의 돌연변이 등에 의해 결여된 것이나, 프로테아제 저해제에 대한 결합 친화성은 보유하고 있는 것이다. 펩티드 태그의 길이는 프로테아제 저해제에 대한 결합 친화도가 유지되고 단백질 가수분해 활성이 없다면, 프로테아제로부터 유래된 6개 이상의 인접 아미노산일 수 있다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "프로테아제 저해제(protease inhibitor)"라 함은, 프로테아제를 저해하는 모든 물질을 의미한다. 프로테아제 저해제는 저분자량 화합물, 예를 들어 비가역적 저해제인 4-(2-아미노에틸) 벤젠설포닐 플로라이드 하이드로클로라이드 또는 페닐메틸설포닐 플로라이드일 수 있으며, 또는 고분자량 화합물 예를 들어 단백질 중 어느 하나일 수 있다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "태깅된 단백질을 포함하는 샘플"이라 함은 원하는 특정 단백질이 포함된 모든 혼합물을 의미하며, 천연으로부터 유래된 것이거나 인공적으로 제조된 것임을 불문하고 모든 혼합물이 포함된다. 서로 다른 액체의 혼합물 뿐 아니라 액체와 고체가 혼합된 혼합물, 서로 다른 고체와 고체가 혼합된 혼합물도 포함한다. 예컨대, 원하는 특정 단백질이 함유된 샘플의 예시에는 혈액, 혈청, 복수액(ascites fluid), 우유, 조직 샘플, 세포 배양물, 세포 용해물 또는 세포 배양의 상층액이 포함될 수 있다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "지지체"는 프로테아제 저해제를 고정하여 친화성 크로마토그래피 매질을 얻을 수 있는 것이라면 형태나 만들어질 재료 등을 불문하고 모두 사용될 수 있다. 예컨대, 친화성 크로마토그래피에서 통상적으로 사용되는 아가로스; 셀룰로오스; 및 폴리아크릴아미드 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "크로마토그래피 매질"은 형태(컬럼 또는 평판), 상태(액체 또는 고체) 또는 만들어진 재료를 불문하고 크로마토그래피 정제를 위해 사용되는 고정상을 의미한다. 통상적으로 단백질 정제를 위해 사용되는 크로마토그래피 매질의 예시에는 이온 교환 크로마토그래피 수지, 친화성 고정상 및 겔 침투 고정상이 포함된다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "연결된(커플링된: Coupled)"은 두 종 이상의 유전자 또는 단백질이 직접 접촉하고 있는 것 뿐만 아니라 사이에 링커 유전자 또는 단백질이 개재되어 있는 것까지도 포함한다. 또한, 공유결합 및 비공유결합으로 연결된 것을 모두 포함한다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "단백질"은 정제를 원하는 대상으로서의 단백질을 의미하며, 정제 대상의 단백질이라면 그 종류를 불문하고 모두 포함될 수 있다. 일 예로서, 항체 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "태깅된 단백질"은 펩티드 태그에 공유결합을 통해 연결된 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 언급된 용어인 "융합 단백질"은 2가지 이상의 별개 폴리펩티드의 모든 조합을 의미한다. 융합 단백질의 예시로는 원래 별개의 폴리펩티드를 코딩하는 2 이상의 핵산을 결합하여 생성된 단백질일 수 있다. 태깅된 단백질은 융합 단백질일 수 있으며, 펩티드 태그를 코딩하는 핵산이 단백질을 코딩하는 핵산에 연결되어 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 얻을 수 있다. 융합 단백질은 2 이상의 폴리펩티드의 조합을 포함하며, 상기 2 이상의 폴리펩티드는 공유결합으로 연결된다. 상기 융합 단백질은 2 이상의 별개의 폴리펩티드의 조합을 포함하며, 상기 2 이상의 별개의 폴리펩티드는 비공유결합으로 연결된 것이다. 상기 2 이상의 별개의 폴리펩티드는 어떠한 매개자 없이 서로 직접적으로 접촉할 수 있다. 상기 2 이상의 별개의 폴리펩티드는 링커 펩티드와 같은 매개자에 의해 매개될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법은 프로테아제와 특이적 프로테아제 저해제 사이의 높은 결합 특이성을 이용하여 단백질을 정제하는 것이다.

하나의 실시예에서, 상기 방법은 태깅된 단백질을 포함하는 샘플을 고정된 프로테아제 저해제를 가지는 지지체에 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 태깅된 단백질은 펩티드 태그에 공유결합으로 연결된 단백질이고, 펩티드 태그는 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 활성을 가지며, 상기 접촉은 프로테아제 저해제가 펩티드 태그에 결합하는 조건하에서 이루어지고, 결합되지 않은 성분들은 제거하는 것; 및 지지체로부터 단백질을 제거하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 샘플은 세포 용해물, 세포 배양물, 세포 배양의 상층액 또는 단백질을 포함하는 생물액(biological fluid)이다. 몇몇 실시예에서, 지지체 상에 고정된 프로테아제 저해제를 가지는 지지체는 친화성 크로마토그래피 컬럼인 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 언급된 단백질 정제에 사용되는 방법 및 컬럼에서, 일회용 컬럼이 사용될 수 있다. 일회용 컬럼은 약 0.1 내지 약 1.0 mm, 약 0.3 내지 약 0.7 mm 또는 약 0.5 mm의 직경을 가질 수 있다. 컬럼은 약 16 x 125 mm 사이즈의 글라스 테스트 튜브에 위치할 수 있다. 하나의 실시예에서, 약 0.5 mm의 직경을 가지는 일회용 컬럼이 16 x 125 mm의 글라스 테스트 튜브에 위치한다. 크로마토그래피 매질, 예를 들어 아가로스 겔은 업계에 알려져 있는 어떠한 방법에 따라 컬럼 내에 팩킹된다. 하나의 실시예에서, 충분한 부피의 탈기된 버퍼/물을 컬럼에 첨가하여 저수 부분(넓은 개구)까지 채운 다음, 컬럼 내의 모든 공기 버블이 제거되도록 할 수 있다. 이후, 겔은 실온에서 탈기된 50% 겔 슬러리 및 탈기된 버퍼 용액(또는 물)과 함께 컬럼에 팩킹될 수 있다. 충분한 부피의 탈기된 겔 슬러리를 첨가하여 목적하는 안정적인 겔 부피를 얻을 수 있다. 겔은 컬럼 내에서 30분 이상 정치되도록 할 수 있다. 팩킹된 컬럼은 4℃ 에서 보관하여 사용될 수 있다.

태깅된 단백질을 지지체로부터 제거하는 것은 태깅된 단백질을 지지체로부터 용출시킨 다음, 태깅된 단백질로부터 펩티드 태그를 분리하여 단백질을 얻는 것을 포함할 수 있다. 태깅된 단백질을 지지체로부터 용출시키는 것은 펩티드 태그와 프로테아제 저해제 사이에 결합 친화성을 저하시키는 pH에서 용출을 수행하여 태깅된 단백질이 지지체로부터 제거되는 것일 수 있다. 태깅된 단백질로부터 펩티드 태그를 분리하는 것은 용출된 태깅 단백질을 프로테아제, 예를 들어 TEV 프로테아제, 파파인 또는 펩신으로 처리하는 것일 수 있다.

경우에 따라서, 컬럼 상에서 단백질과 결합된 펩티드 태그를 효소로 절단하여 단백질을 컬럼으로부터 제거할 수 있으며, 컬럼에 결합된 펩티드 태그는 남기고, 단백질은 컬럼으로부터 자유롭게 용출된다.

도 1에는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 단백질을 정제하는 과정이 개략적으로 도시되어 있다. 보여지는 하나의 실시예에서, 단백질은 이뮤노글로불린 헤비 체인의 C-말단에 공유결합으로 결합된 펩티드 태그를 포함하는 항체이다. 보여지는 실시예에서, 특이적으로 펩티드 태그에 결합하는 프로테아제 저해제가 지지체 상에 고정되어 친화성 크로마토그래피 매질을 얻게 된다. 만약 단백질을 포함하는 샘플이 친화성 크로마토그래피 매질을 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통해 흐른다면, 단백질은 펩티드 태그와 프로테아제 저해제 사이의 특이적 결합에 의해 컬럼 상에 잔류할 것이고, 기타 샘플의 다른 성분은 컬럼 상에 잔류하지 않을 것이다. 이후 결합 단백질은 컬럼으로부터 제거될 수 있다.

도 1에서 보여지는 바와 같이, 펩티드 태그가 결합된 단백질은 펩티드 태그가 프로테아제 저해제와 더 이상 결합하지 않는 조건에서 용출에 의해, 예를 들어 더 낮은 pH의 버퍼에서 용출하여 컬럼에서 제거될 수 있다. 용출된 단백질은 이후, 펩티드 태그로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 도 1에서와 같이, 태깅된 항체를 효소, 예를 들어 펩신 또는 파파인으로 처리하여 F(ab)2 또는 Fab 단편을 제조할 수 있다. 또한, 항체 헤비 체인을 돌연변이 시켜 파파인 절단 자리를 파괴하고, 펩티드 태그와 항체 사이에 새로운 파파인 절단자리를 삽입한 다음, 컬럼으로부터 방출된 융합 단백질을 파파인으로 처리하여 태깅된 항체로부터 펩티드 태그를 제거할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 방법에서 펩티드 태그를 사용할 수 있으며, 하기 프로테아제 군 중 어느 것에 대한 돌연변이 프로테아제로부터 유래된 펩티드 태그가 포함된다: 세린 프로테아제(Serine proteases), 트레오닌 프로테아제(Threonine proteases), 시스테인 프로테아제(Cysteine proteases), 아스파르트산 프로테아제(Aspartic acid proteases), 메탈로프로테아제(Metalloproteases) 및 글루탐산 프로테아제(Glutamic acid proteases). 구체적으로, 펩티드 태그는 파파인, 트립신, 펩신, 키모트립신, 레닌, 카텝신 D (Cathepsin D), 써몰리신(Thermolysin), 엘라스타아제(Elastase), 플라스민(plasmin), 트롬빈, 유로키나아제(Urokinase) 또는 콜라게나아제(Collagenase) 등의 돌연변이로부터 유래된 펩티드 태그를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

펩티드 태그는 알려진 어떠한 방법에 의해서라도 제조될 수 있다. 가수분해 활성을 저해하는데 필요한 최소 레벨에서 돌연변이가 일어날 수 있다. 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 또는 단일 아미노산의 치환만으로도 펩티드 태그로 사용될 수 있는 프로테아제 돌연변이가 제조될 수 있다. 이와 관련하여, 통상 알려진 방법으로 사이트-다이렉트 돌연변이(site-direct mutagenesis)가 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 가수분해 활성 자리 전체가 펩티드 태그에서 제거된다. 제거는 통상 알려진 어떠한 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법 또는 친화성 크로마토그래피 매질에서 사용될 수 있는 프로테아제 저해제로는 에코틴(ecotin), 파파야 쿠니쯔 트립신 저해제(papaya Kunitz-type trypsin inhibitor), 펩스타틴 A(pepstatin A), 루펩틴(leupeptin), Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린(bdellin), 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 및 디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸)-Ala-Ala 아미드 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 프로테아제 저해제의 예를 들면 하기 표 1 또는 표 2와 같다.

프로테아제 저해제	구체적인 예
a2-안티플라스민(a2-Antiplasmin)	Product Code A0914 (Sigma)
아프로티닌(Aprotinin)	Product Code A1153 (Sigma)
안티트롬빈 III 휴먼(Antithrombin III, Human)	Product Code A2221 (Sigma)
a1-안티트립신(a1-Antitrypsin)	Product Code A6150 (Sigma)
안티파인(Antipain)	Product Code A6191 (Sigma)
안티트롬빈 III 소(Antithrombin III, Bovine)	Product Code A9141 (Sigma)
브델린(Bdellin)	Product Code B3906 (Sigma)
에코틴(Ecotin)	Product Code B3910 (Sigma) 또는 manual 정제
루펩틴(Leupeptin)	Product Code B3912, L2023 (Sigma)
a2-마크로글로불린(a2-Macroglobulin)	Product Code B3913, M6159 (Sigma)
N- a-p-토실-L-라이신 클로로메틸 케톤 하이드로클로라이드(N- a-p-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone hydrochloride)	Product Code B3918, T7254 (Sigma)
트립신-키모트립신 저해제(Trypsin-chymotrypsin inhibitor)	Product Code B3923 (Sigma)
키모스타틴(Chymostatin)	Product Code C7268 (Sigma)
시스타틴(Cystatin)	Product Code C8917 (Sigma)
E-64	Product Code E3132 (Sigma)
엡셀렌(Ebselen)	Product Code E3520 (Sigma)
Gly-Gly-Tyr-Arg	Product Code G5386 (Sigma)
N- a-p-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤 하이드로클로라이드(N- a-p-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone hydrochloride)	Product Code A0917 (Sigma)
글리신 맥스 유래 트립신 저해제(Trypsin Inhibitor from Glycine max) (soybean)	Product Code T1021, T9767 (Sigma)
papaya Kunitz-type trypsin inhibitor	Mannual 정제

또한, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 프로테아제-프로테아제 저해제의 조합의 예를 들면 하기 표 2와 같다.

본 명세서에 개시된 방법의 일실시예에서 프로테아제 저해제는 에코틴이고, 대장균(E. coli) 유래의 세린 프로테아제 저해제로서, 트립신과 다른 췌장 프로테아제를 저해하는 활성을 갖는다. 에코틴은 100℃ 및 pH 1.0의 조건 하에서도 30분 이상 안정된 상태를 유지할 수 있다. 에코틴의 분자량은 18kD이며, 등전점(Pi)는 6.1이다. 에코틴은 트립신, 키모트립신, 췌장 엘라스타아제, 래트 마스트 셀, 카이마아제, 및 인간의 세로살 유로키나아제(serosal urokinase)에 의해 분해되지 않는다. 또한, 에코틴은 인간의 폐 트립타아제(human pulmonary tryptase), 칼리크리엔(kallikrein), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 프로테아제(Staphylococcus aureu8 V8 protease), 서브틸리신(subtilisin) 및 써몰리신(thermolysin)은 저해하지 않는다. 더욱이, 대장균으로부터 분리된 여덟가지의 가용성 엔도프로테아제인 Do, Re, Mi, Fa, So, La, Ci 및 Pi를 저해하지 않으며, 키모트립신 유사 에스테라아제(protease I) 및 트립신-유사 에스테라아제(protease 11)를 저해하지 않는다. 본 발명의 방법에 따른 하나의 실시예에서, 프로테아제 저해제는 에코틴이고, 프로테아제는 트립신이다. 트립신은 소화계에서 발견되는 세린 프로테아제로서, 단백질을 분해한다. 예를 들어, 트립신은 우유 중 카제인을 분해한다. 트립신은 프롤린이 뒤따르지 않는 한 라이신과 아르기닌의 카르복실 사이드의 펩티드 체인을 주로 절단한다. 트립신은 췌장에 다량 존재하며, 쉽게 정제될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법의 또 다른 일실시예에서 프로테아제 저해제는 카리카 파파야(Carica papaya)에서 유래된 파파야 프로테이나아제 저해제(Papaya proteinase inhibitor, PPI)의 일종인 파파야 쿠니쯔-타입 트립신 저해제이다. 파파야 쿠니쯔-타입 트립신 저해제는 소의 트립신을 1:1 몰비로 저해한다. 파파야 쿠니쯔-타입 트립신 저해제는 매우 넓은 pH 범위(1.5-11.0)와 80℃까지의 고온에서도 완전한 저해 활성을 보유하는 저해제이다. 그 뿐 아니라, 강한 화학적 변성제(예컨대, 5.5M 구아니딘 하이드로클로라이드)가 고농도인 경우에도 안정하다. 파파야 쿠니쯔-타입 트립신 저해제는 또한 펩신에 대해 현저히 우수한 단백질 분해 저항성을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시예에서, 프로테아제 저해제는 파파야 쿠니쯔-타입 트립신 저해제이고, 프로테아제는 트립신이다.

단백질을 코딩하는 핵산은 펩티드 태그를 포함하여 설계 즉, 유전자가 단백질 및 펩티드 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하도록 설계될 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 유전자는 그 다음 벡터에 도입되고, 이후 벡터는 적합한 숙주 세포를 변형시키는 데 사용된다. 앞서 언급한 바와 같이, 만약 단백질이 펩티드 태그가 유래된 프로테아제에 민감한 서열을 포함한다면, 펩티드 태그 프로테아제에 의해 단백질의 단백질 가수분해 활성을 막는 것이 중요하다. 이는 예를 들어, 단백질 가수분해 활성 자리 부분에서 프로테아제의 유전자 돌연변이에 의해 막을 수 있다. 돌연변이, 융합 단백질(태깅된 단백질)을 코딩하는 재조합 핵산의 형성, 재조합 발현 벡터의 형성 및 숙주 세포의 형질전환은 관련 기술 분야에서 알려진 어떠한 방법에 의해서라도 수행될 수 있다.

용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자이며, 이에 연결되어 작동되는 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 지정한다. 더욱이, 벡터는 적절한 마커를 가져 형질전환된 숙주 세포를 스크리닝 할 수 있다. 사용 가능한 벡터로는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피좀, 바이러스 및 삽입 가능한 DNA 단편(상동성 재조합에 의해 숙주 세포 게놈으로 삽입 가능한 단편)이 포함될 수 있다.

용어 "연결되어 작동되는"은 단일 핵산 상의 핵산 서열 연관성으로 하나의 기능이 다른 것에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있는 경우) 프로모터는 코딩 서열과 연결되어 작동되거나, 리보좀 결합 자리가 번역을 촉진시킬 수 있도록 위치하고 있다면, 리보좀 결합 자리는 코딩 서열에 연결되어 작동되는 것이다. 코딩 서열은 센스 방향 또는 안티센스 방향에서 조절 서열에 연결되어 작동될 수 있다.

벡터는 숙주세포에 도입되어, 융합 단백질 또는 앞서 언급한 핵산에 의해 코딩되는 펩티드를 생산할 수 있다. 몇몇 경우에, 벡터는 숙주세포에 의해 인식되는 프로모터를 포함할 수 있다. "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는 데 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 보존적 프로모토 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다. 숙주세포-숙주 중 목적하는 정도의 핵산 발현을 위한 적합한 프로모터 활성을 가지는 양립적 프로모터를 선택하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다.

벡터는 추가적 발현 조절 서열을 가질 수 있다. "조절 서열"은 소정의 숙주 개체 내에서 연결되어 작동되는 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 조절 서열은 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence) 유래일 수 있다. 예를 들어, 샤인-달가노 서열은 MS-2상의 레플리케이스 유전자(replicase gene) 또는 박테리오파지 1의 cII 유전자 유래일 수 있다. 숙주의 형질 전환은 잘 알려진 다양한 기술 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 프로테아제 저해제 친화성 컬럼은 프로테아제 저해제를 알데히드에 의해 활성화된 아가로스 비드 및 소디움 시아노보로하이드라이드(NaBH3CN)를 사용하여 환원적 아미노화(reductive amination)에 의해 고정화킴으로써 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 프로테아제 저해제 친화성 컬럼은 하기 과정을 통해 제작될 수 있다:

1. 지지체의 제조:

프로테아제 저해제가 커플링될 수 있는 지지체가 제조될 수 있다. 지지체로서는 아가로스 젤을 사용할 수 있다. 예컨대, 동결건조된 아가로스 비드를 용매에 현탁하여 사용할 수 있다. 동결건조된 아가로스 비드로는 시아노겐 브로마이드(CNBr)-활성화된 세파로오스(Sepharose) 4B (GE Health care)를 들 수 있다. 시아노겐 브로마이드(CNBr)-활성화된 세파로오스(Sepharose) 4B를 첨가제의 존재하에 동결건조시킴으로써 제조될 수 있다. 반응기의 활성을 보존하여야 하기 때문에 세파로오스(Sepharose) 4B에 프로테아제 저해제를 커플링하기 전에, 첨가제는 낮은 pH에서 시아노겐 브로마이드(CNBr)-활성화된 세파로오스(Sepharose) 4B를 세척하여 제거된다. 이를 위해 바람직한 pH는 약 3 이하일 수 있으며, 이는 만일 높은 pH로 하는 경우 가수분해를 유발할 수 있기 때문이다. 동결건조된 아가로스 비드는 용매 예를 들어 1mM HCl 중에 현탁시킨다. 보통 1g의 동결건조된 용매 중 현탁된 시아노겐 브로마이드(CNBr)-활성화된 세파로오스 4B 비드가 부풀어 오른 후 약 3.5 ml의 최종 지지체 부피를 생성한다. 상기 현탁 직후 지지체가 올랐을 때, 예를 들면, porosity가 G3인 소결 글래스 필터 상에서 1mM HCl로 15분간 세척하는 것을 들 수 있다.

2. 프로테아제 저해제의 커플링(Coupling)

프로테아제 저해제를 항목 1의 지지체와 커플링시키는 단계이다. 먼저 프로테아제 저해제를 커플링 용액에 용해시킨다. 사용되는 커플링 용액은 상기 동결 건조된 세파로오스 파우더 1g 당 약 3-7ml의 양으로 사용될 수 있다. 또한, 부풀어 오른 지지체 1ml 당 약 5-10mg의 프로테아제 저해제를 사용할 수 있다. 프로테아제 저해제의 분자량이 작은 경우(5kD이하)에는 지지체 1ml 당 1-10μ몰의 농도로 첨가될 수 있다. 커플링 용액의 예로는 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)/0.5M NaCl를 들 수 있다. 이렇게 하여 제조된 프로테아제 저해제 함유 커플링 용액에 항목 1에서 제조된 지지체 현탁물을 첨가하고 교반시킨다. 온화한 교반 방법이라면 그 종류에 제한없이 모두 사용될 수 있으며, 예를 들어 엔드-오버엔드(end-overend)로 샘플을 회전시켜 교반할 수 있다.

단백질 정제 방법 중 하나의 실시예에서, 결합된 단백질의 용출은 프로테아제 저해제 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질의 용출을 허용하는 적합한 용매 중에서 일어날 수 있다. 몇몇 실시예에서, 용출은 pH 용출을 통해서 수행될 수도 있다. 예컨대, pH를 2-5 정도로 조정함으로써 프로테아제 돌연변이 태그가 붙어있는 항체를 용출시킬 수 있다. 예를 들어 프로테아제 저해제로서 에코틴을 사용하는 경우, 에코틴은 강한 산에서도 매우 안정하고 상보적인 펩티드 태그와도 결합력이 매우 강한 단백질이므로 용출은 pH 2-3에서 가능하게 된다. 용출 pH가 낮을수록 (3)단계의 세척이 용이하고 용출 효율을 높일 수 있으므로, 항체 수율과 순도를 더욱 높일 수 있게 된다. 프로테아제 저해제로서 파파야 쿠니쯔-타입 트립신 저해제(papaya Kunitz-type trypsin inhibitor)를 사용하는 경우 파파야 쿠니쯔-타입 트립신 저해제는 산에서는 매우 안정하나 에코틴에 비해 상보적 펩티드 태그와의 결합력이 1/100 정도 낮으므로 용출이 pH 3-4에서 가능하게 된다. 이처럼 프로테아제 돌연변이 태그와 프로테아제 저해제간의 결합력은 매우 다양함으로, 경우에 따라 다른 용출 pH를 다른 프로테아제 저해제 친화성 매질 및 상보적 펩티드 태그의 조합에 대하여 사용할 수 있다. 펩티드 태그가 붙어 있는 단백질을 컬럼에서 분리하는 또 다른 방법으로 활성 프로테아제를 이용할 수 있다. 이 때 사용되는 활성 프로테아제는 컬럼 내의 프로테아제 돌연변이 태그를 분해 하지 못하거나 또는 단백질이 불활성이도록 하는 성질의 것을 선택적으로 사용한다. 예를 들어, 앞서 언급한 바와 같이 이러한 방법이 항체에 사용되는 경우 용출되는 것은 항체 단편(Fab, F(ab)2)이나 항체 전체 분자가 될 수 있다.

단백질로부터 펩티드 태그를 분리하는 것은 특별히 제한되지는 않지만, 효소 처리를 하여 수행될 수 있다. 예컨대, 단백질로 항체를 사용하는 경우 태깅된 항체를 파파인이나 펩신과 같은 효소로 처리하게 되면, 앞서 언급된 바와 같이 F(ab)2 단편이나 Fab 단편이 얻어진다. 파파인으로 단백질 가수분해 하여 이뮤노글로불린 전체를 제공할 수 있는 태깅된 항체를 얻기 위해서는 이뮤노글로불린 헤비 체인 유전자의 파파인 절단자리를 돌연변이 시키고, 펩티드 태그를 코딩하는 핵산과 이뮤노글로불린 헤비 체인 유전자 사이에 파파인 절단자리를 삽입한 후, 얻어진 태그가 붙어있는 항체에 파파인을 처리함으로써 얻을 수 있다. 이는 도 1의 오른쪽 하단부에 도시되어 있다. 경우에 따라서, TEV 프로테아제 절단 자리가 펩티드 태그와 단백질 사이에 삽입될 수 있다. 펩티드 태그는 융합 단백질을 TEV 프로테아제로 처리하여 단백질로부터 분리될 수 있다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 이는 예시를 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<실시예 1: 에코틴의 정제>

1. 에코틴의 준비

서열번호 1의 에코틴을 과발현 벡터에 클로닝하여 대장균에서 과발현시켰다. 발현된 세포는 15분 동안 5,000 x g에서 원심분리하여 수집하였다. 세포를 초음파에 의해 분쇄하고, 30분 동안 12,000 x g에서 원심분리하여 조 추출물을 얻는다. 조 추출물을 1 M HCl을 첨가하여 처리하고 pH를 3으로 조정한다. 10분 동안 12,000 x g에서 원심분리에 의해 상층액에서 에코틴을 얻었다. 재조합 에코틴을 4℃에서 20분간 인큐베이션시킨 다음, 1M 트리스 베이스를 첨가하여 pH를 7.8로 재조정하고, 100℃에서 20분간 가열한다. 각 단계에서, 12,000 x g로 10분간 원심분리시켜 불용성 물질을 제거하여 상층액을 얻고, 얻어진 상층액에 고체 암모늄 설페이트를 첨가하여 80%(w/v)로 포화시킬 때까지 10% 간격으로, 분획된 단백질을 수득하였다.

침전된 단백질을 6mM MgCl₂를 함유한 10mM Tris-HCl (pH 7.8)에 대해 투석시키고 동일한 버퍼로 평형화된 음이온 교환 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼에 결합하지 않은 단백질들을 수거하여 트립신 친화성 컬럼을 사용하여 정제하고, 이후 정제된 에코틴을 4℃에 저장하였다.

2. 젤 전기영동

항목 1에서 얻어진 에코틴에 대해 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 수행하였다. 에코틴의 정제도를 결정하기 위해, Laemmli 논문( Laemmli, U. K. (1970) Nature 227,680-685)에 기재된 바와 같이 0.1%(w/v) 소디움 도데실 설페이트(SDS)를 함유한 10-20%(w/v) 폴리아크릴아마이드 그레디언트 슬랩 젤을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동 결과는 도 2에 나타내었다. 상기 얻어진 에코틴의 정제도는 95% 이상임을 알 수 있었다.

3. 에코틴의 활성 측정

얻어진 에코틴이 프로테아제 활성을 갖는지를 알아보기 위해, 형광성 펩티드의 절단에 대해 분석한다(Woo, K. M., Chung, W. J., Ha, D. B., Goldberg, A. L., and Chung, C. H. (1989) J. Biol. Chem. 264,2088-2091). 트립신, 키모트립신 및 엘라스타아제의 기질로서 N-벤질옥시카르보닐-Ala-Arg-Arg-4-메톡시-β-나프틸아미드, N-숙시닐(Suc)-Leu-Leu-Val-Tyr-7-아미도-4-메틸 쿠마린(AMC) 및 Suc-Ala-Ala-Ala-AMC를 각각 사용한다. 적량의 에코틴을 10ng의 트립신, 2ng의 키모트립신 또는 30ng의 엘라스타아제를 100mM Tris-HCl 버퍼(pH 8)에서 혼합하여 얻어진 반응 혼합물 0.1ml를 실온에서 30분간 인큐베이션시킨 후 각 펩티드 기질(0.1mM)을 첨가한다. 트립신 및 키모트립신을 분석할 때에는 20mM CaCl₂를 함께 첨가시켰다. 인큐베이션시킨 후, 상기 반응 혼합물을 0.9ml의 0.1 x 소디움 보레이트(pH 9.1)와 혼합한 다음 보일링 워터 배쓰에서 6분간 가열하였다. 4-메톡시-p-나프틸아미드에 대해서는 310nm(여기) 및 410nm(방출)에서 형광을 측정하였고, AMC에 대해서는 380nm(여기) 및 440nm(방출)에서 측정하였다. Bradford의 논문(Bradford, M. M. (1976)Anal. Biochem. 72,248-254)에 기재되어 있는 바와 같이 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하여 단백질을 분석하거나, 소멸 계수(extinction coefficient)가 알려진 단백질에 대해서는 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 분석하였다. 그 결과 위 1에서 얻어진 에코틴은 트립신, 키모트립신 및 엘라스타아제의 활성을 모두 100% 저해하는 것을 알 수 있었다.

<실시예 2: 에코틴 친화성 컬럼의 준비>

정제된 에코틴을 환원적 아미노화(reductive amination)반응을 이용하여 시아노겐 브로마이드(CNBr)-활성화된 세파로오스(Sepharose) 4B (GE Health care)에 고정화시켜, 본 실시예에서 에코틴 친화성 컬럼을 제조하였다.

1. 크로마토그래피 매질(medium)의 제조

시아노겐 브로마이드(CNBr)-활성화된 세파로오스(Sepharose) 4B (GE Health care)를 칭량하여 1mM HCl 중에 현탁하고 30분 이상 방치하여 젤이 부풀어오르도록 한다. 1g의 동결 건조된 세파로오스 파우더가 약 3.5ml의 최종 매질 부피를 생성한다. 현탁 직후 지지체가 침전하면 상층액을 버리는 과정을 반복하여 부서진 지지체 조각 등을 분리하여 버리고 차가운 1mM HCl로 세척한다. 이 때 사용한 1mM HCl의 양은 젤 양의 15배를 사용한다. 지지체를 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)/0.5M NaCl의 커플링 버퍼로 세척하여, 지지체의 버퍼를 커플링 버퍼로 치환한다.

2. 에코틴의 커플링

실시예 1에서 얻어진 에코틴을 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)/0.5M NaCl의 커플링 버퍼에 용해시킨다. 커플링 버퍼는 상기 동결건조된 세파로오스 파우더 1g당 약 7ml의 양으로 사용된다. 이 때 지지체 1ml 당 약 10mg의 에코틴을 사용하였다. 이렇게 하여 제조된 에코틴 함유 커플링 용액에 상기 1에서 제조된 세파로스 현탁물을 첨가하고, 실온에서 3~4시간 동안 또는 4℃에서 밤새 교반시킨다. 에코틴이 커플링된 아가로오스에 스톱 버퍼(0.1M 에탄올아민)를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 그 후 과량의 에코틴을 배지 (젤) 부피의 5배의 커플링 버퍼로 세척하여 제거한다. 크로마토그래피 매질을 1M 에탄올아민(pH 8.0)으로 옮기고 2~4시간 동안 정치한다. 그런 다음 상기 매질을 pH를 변화시키는 8회의 사이클을 통해 세척한다. 이 때 각 세척용 버퍼는 매질 부피의 5배를 사용한다. 각 사이클은 50mM glycine, 1M NaCl(pH3.5)로 1차 세척한 후 50mM Tris-HCl(pH 8)/1M NaCl로 2차 세척하는 것으로 구성된다. 세척 후 크로마토그래피 매질을 다시 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 이 때 PBS는 매질 부피의 10배를 사용한다.

3. 항체의 정제에 일회용 컬럼(직경 0.5 mm)를 사용한다. 컬럼은 16 x 125 mm의 글라스 테스트 튜브(테스트 튜브 랙에서)에 위치한다. 충분한 부피의 탈기된 버퍼/물을 컬럼에 첨가하여 저수 부분(넓은 개구)까지 채운 다음, 컬럼 내의 모든 공기 버블이 제거되도록 한다. 겔은 실온에서 탈기된 50% 겔 슬러리 및 탈기된 버퍼 용액(또는 물)과 함께 컬럼에 팩킹된다. 충분한 부피의 탈기된 겔 슬러리를 첨가하여 목적하는 안정적인 겔 부피를 얻는다. 컬럼 내에서 30분 이상 겔을 정치시킨다. 팩킹된 컬럼은 4ㅀC에서 보관하여 사용된다.

<실시예 3: 에코틴 친화성 크로마토그래피를 이용한 트립신 태그의 정제>

사람의 양이온성 트립시노겐(Cationic trypsinogen, Prss1)을 클로닝하였다. 단백질 가수분해 활성이 결여된 돌연변이 PRSS1을 얻어 항-EGFR 항체(서열번호 2)를 가수분해하지 못하도록 와일드 타입 사람의 PRSS1 (HGNC: 9475; UniProtKB/Swiss-Prot P07477)(도 6, 서열번호 13)을 단백질 가수분해 활성 자리에서 사이트 다이렉트 돌연변이(site-directed mutagenesis) 시킨다. 특히, 사이트 다이렉트 돌연변이 키트(Stratagen, #200524-5, site-Directed Mutagenesis kit)을 사용하여 200번째 세린 아미노산의 코돈을 알라닌에 대한 코돈으로 돌연변이 시킨다. 얻어진 돌연변이 PRSS1 유전자(서열번호 2)를 pET21b(Novagen) 벡터에 클로닝한 후 YT 배지에서 자란 E. coli BL21(DE3)에서 발현시킨다. 흡광도 600에서 O.D. 0.6일 때, 1mM IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)를 넣고 37℃에서 4시간 더 배양한다. 배양하여 얻어진 세포를 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 및 0.2 M NaCl, 6M Guanidine-HCl 조성의 버퍼 하에 초음파로 분쇄한 후 원심분리기(10000g)를 이용하여 상층액을 얻는다. 상층액은 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 및 0.2 M NaCl, 0.9M Guanidine-HCl 버퍼로 투석하여 리폴딩한다. 이렇게 얻어진 샘플을 실시예 2에서 제조된 1-mL 에코틴 컬럼에 적용시킨다. 적용 후 상기와 동일한 버퍼로 세척 한 후 50 mM HCl로 용리하여 정제된 트립시노겐을 얻는다. 얻어진 트립시노겐을 실시예 1에서와 같이 전기영동한다. 그 결과는 도 3에 나타나 있다. 레인 1(맨 왼쪽)은 사이즈 마커, 레인 2(왼쪽에서 2번째)는 조 추출물(미정제 추출물), 레인 3(왼쪽에서 세번째)은 플로우 쓰루(에코틴 미결합 추출물), 레인 4(맨 오른쪽)는 정제된 트립신 돌연변이 태그(purified trypsin mutant tag only )이다.

<실시예 4: 에코틴 친화성 크로마토그래피를 이용한 항-에코틴 항체의 정제>

실시예 1에서 얻어진 에코틴 200ug를 10mM Tris-HCl (pH 7.8) 버퍼에 녹여 하얀 수컷 2개월령 뉴질랜드 토끼에 피하에 주사한 후 항-에코틴 항체를 생성한다. 항체 생성 후, 토끼의 혈장을 수득한다. 혈장 샘플을 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 및 0.2 M NaCl로 구성된 로딩 버퍼를 사용하여 Protein A sepharose CL-4B(GE Healthcare) 또는 실시예 2에서 제조된 에코틴 컬럼에 각각 적용한다. 각 컬럼은 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 및 0.5M NaCl로 구성된 버퍼로 세척한 후, 글라이신 버퍼(50 mM Glycine-HCl, pH 2.5)로 용출한다. 도 4는 단백질 A 컬럼을 이용한 항-에코틴 항체의 정제 과정 또는 에코틴 친화성 컬럼을 이용한 항-에코틴 항체의 정제 과정을 나타낸 모식도이다. 단백질 A 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제 또는 에코틴 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 항-에코틴 항체를 실시예 1에서와 같이 단백질 겔 전기영동에 의해 분석한다. 도 5는 전기 영동 결과를 나타내는 사진이다.

도 5에서 레인 1과 레인 7은 사이즈 마커이며, 레인 2에서 레인 6은 프로테인 A 컬럼의 결과이며, 레인 8에서 레인 12는 에코틴 컬럼의 결과이다. 특히, 레인 2 및 8은 조 추출물(컬럼에 적용하지 아니한 혈장), 레인 3 및 9는 미결합 단백질(Flow-through extract) (컬럼 통과 미결합 추출물), 레인 4 및 10은 0.5M NaCl이 들어 있는 버퍼의 세척으로 얻어진 추출물, 레인 5 및 11은 용리액에 DTT첨가한 용액, 레인 6 및 12는 용리액에 DTT를 첨가하지 않은 결과이다.

<실시예 5: HEK293세포 중 anti-EGFR-Trypsin(m)) 단일 항체의 발현>

본 실시예에서는, 트립신 태그로 태깅된 단일클론 EGFR 항체(anti-EGFR-Trypsin(m))를 HEK293세포 (ATCC.CRL-1573)에서 과발현시켜 특성화한다. 하기 표 3은 본 실험에 사용된 항-EGFR 항체의 CDR(Complementarity Determining Regions) 부위 아미노산 서열이다.

CDR	아미노산 서열
	헤비 체인	라이트 체인
CDR 1	DYGMS (서열번호 7)	TGTSSDVGGYNYVS (서열번호 10)
CDR 2	GINWNGGSTGYADSVKG (서열번호 8)	DVNRRPS (서열번호 11)
CDR 3	DYWGSLDY (서열번호 9)	SSYVSTNTYV (서열번호 12)

타겟 항원으로 EGFR 단백질(Sigma E3641)을 사용하여 패닝한 파지 라이브러리 디스플레이 라이브러리를 사용하여 항-EGFR 단일 항체를 얻는다. 항-EGFR 항체의 헤비 체인 및 라이트 체인의 가변부위에 대한 아미노산 서열을 준비한 다음, 변형된 pcDNA3.3 헤비 체인 벡터 상에서 헤비 체인 서열의 가변 부위를 인간 전체 IgG1 헤비 체인 항체 백본으로 치환한다. 변형된 pcDNA3.3 라이트 체인 벡터 상에서 라이트 체인 서열의 가변 부위를 인간 전체 IgG1 라이트 체인 항체 백본으로 치환한다.

또한, 항-EGFR 단일 항체의 Fc(fragment crystallizable region)는 서열번호: 5의 서열을 가진다. 서열번호 5는 헤비 체인 단독에서의 Hinge, CH2 및 CH3의 서열이다.

트립신 태그는 사람의 돌연변이 PRSS1 (HGNC:9475)(서열번호 2)로부터 얻는다. 단백질 가수분해 활성이 결여되어 항-EGFR 항체를 가수분해 하지 못하도록 하게 위해, 와일드 타입 인간 PRSS1(HGNC:9475; UniProtKB/Swiss-Prot P07477)(도 6, 서열번호 13)에 대한 유전자 중 가수분해 활성 자리에서 사이트-다이렉티드 돌연변이 시킨다. 특히, 사이트-다이렉티드 돌연변이 키트를 사용하여 200번째 세린(serine) 아미노산의 코돈을 알라닌(alanine)에 대한 코돈으로 돌연변이 시킨다.

다음의 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 돌연변이된 PRSS1 유전자를 증폭한다: XhoI-TEV-Forward(서열번호 3, 5'-GAG-CTCGAG-GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGA TCC- ATCGTTGGGGGCTACAACTGTGAGGAG) 및 XhoI-TAA-R(서열번호 4: 5'-GAG-CTCGAG-TTA GCT GTT GGC AGC TAT GGT GTT CTT A). 이러한 프라이머를 사용하여, 시그날펩타이드(1-15aa)와 프로펩타이드 (16-23aa)를 제거한 트립신 도메인(24-244aa, 서열번호 2)을 코딩하는 핵산을 돌연변이 PRSS1 유전자로부터 증폭하여, 항-EGFR 항체의 헤비 체인을 코딩하는 핵산에 연결하기 위한 트립신 태그 코딩 핵산으로 사용된다.

위에서 얻어진 트립신 태그 핵산을 XhoI 제한 효소로 절단하고, 항-EGFR 항체의 헤비 체인을 코딩하는 핵산의 C-말단 XhoI-사이트 내(Fc 부분의 서열 참조, 서열번호 5)로, T4-DNA 라이게이즈 (NEB, M0202L)를 이용하여 연결한다. 항-EGFR 항체의 헤비 체인 중 Fc를 코딩하는 cDNA(서열번호: 5)의 697~699 위치에서 헤비체인의 중지코돈 (TGA)을 사이트-디렉티드 돌연변이 키트 (Stratagen, #200524-5)를 이용하여 제거한다. 중지코돈이 제거된 항체 cDNA와 제조된 트립신 태그 핵산 사이에 TEV 프로테아제 절단부위(염기서열: 5'-GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGA TCC-3', 서열번호: 6)를 삽입한다.

pcDNA™3.3-TOPO^® TA Cloning^® Kit(Invitrogen)을 사용하여 앞서 언급한 태깅된 항-EGFR 항체의 헤비 체인 구성을 벡터에 삽입한다. 또한, 항-EGFR 항체의 라이트 체인을 코딩하는 유전자 역시 pcDNA™3.3-TOPO^® TA Cloning^®Kit(Invitrogen)을 사용하여 백터에 삽입한다. 이와 같이 얻어진 헤비 체인 벡터와 라이트 체인 벡터를 각각 12μg씩 준비한다. 전체 24 ug의 플라스미드를 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 이용하여 HEK293세포로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션된 HEK293 세포의 배양액으로서 항생제(페니실린(최종 농도가 100U/ml) 및 스트렙토마이신(최종 농도가 100U/ml)) 및 10% FBS를 포함하는 DMEM(Gibco cat no 11995)를 사용하여, 37℃, 5% CO₂에서 3일간 배양한다. 발현된 항체의 헤비 체인 및 라이트 체인은 배지로 각각 분비되어, 헤비 체인과 라이트 체인 각각이 결합하여 항체 복합체를 형성한다. 그 후 세포 배양액의 상층액을 수득하여, 실시예 2에서 제조된 에코틴 컬럼에 각각 적용한다. 정제 과정은 다음과 같다:

위에서 제조된 에코틴 친화성 컬럼을 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 세팅한다. 세포 배양물 상층액에 1/10 부피의 1.0M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가하여 세포 배양물 상층액의 pH를 조정한다. 그런 다음, 세포 배양물 상층액을 에코틴 친화성 컬럼에 통과시킨다. 컬럼 부피의 10배에 해당하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)/0.5M NaCl로 상기 컬럼을 세척한다. 그런 다음 컬럼 부피의 10배에 해당하는 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.6)/0.5M NaCl로 컬럼을 다시 세척한다. 그 다음, 글라이신 버퍼(50 mM Glycine-HCl, pH 2.5)을 처리하여 트립신이 태깅된 단일클론 항체를 용출시킨다. 그 후 1M Tris-HCl (pH 9.0)을 첨가하여 샘플의 최종 pH를 중성으로 중화시킨다.

정제 과정으로부터 다양한 샘플을 도 1에서 설명한 바와 같이 단백질 겔 전기영동으로 분석한다. 결과는 도 7에 나타나 있으며, 전기영동 겔의 사진이다. 도 7에서 재조합 항체의 HEK293에서의 발현을 확인한다.

도 7에서 레인 1은 사이즈 마커이다. 레인 2에서 레인 10은 돌연변이 트립신으로 태깅된 헤비 체인을 가지는 항-EGFR 항체의 에코틴 친화성 정제로부터 얻은 용액의 전기영동 결과이며, 레인 11과 레인 12는 트립신 태그없는 항-EGFR 항체를 포함하며, DTT 존재 또는 부재하에서 각각 전기영동한 것이다. 레인 2는 대조군(Control) 레인으로 컬럼 적용 전 세포배양액이다. 레인 3은 F: 미결합 단백질(Flow-through) 컬럼통과 후 용액 즉, 컬럼에 적용 후 에코틴에 결합되지 않은 단백질이다. 레인 4는 E (+): 컬럼에서 용출된 용액(Elution)으로 전기영동시에 DTT 첨가함. 레인 5는 E(-): 컬럼에서 용출된 용액 (Elution)에 전기영동시 DTT 첨가하지 않음. 레인 6은 TEV 단독, TEV 프로테아제 밴드는 겔 사진 내에서 C로 라벨링 된다. 레인 7에서 레인 10은 37℃에서 인큐베이션한 경우로서, DTT의 존재(+) 또는 부재(-) 및 TEV 프로테아제의 존재 또는 부재하에서 용출된 용액(E)에 대한 결과를 나타내는 것이다. 레인 7은 E(+):레인 4와 동일, 레인 8은 E(-):레인 5와 동일, 레인 9는 E+T, 레인 10은 E+T(-).

도 7의 겔 사진 내의 약칭과 관련하여, A는 항-EGFR 헤비 체인-트립신 융합 단백질이고, B는 TEV 프로테아제 처리후 트립신이 절단된 항-EGFR 헤비 체인이고, C는 TEV 프로테아제를, D는 잘려진 트립신 (5개 S-S결합을 지닌 단일체) 태그을, G는 항-EGFR 라이트체인을 가리킨다.

<실시예 6: 에코틴 친화성 크로마토그래피를 이용한 단일클론 항체의 정제>

본 실시예에서는, 실시예 5에 설명된 항-EGFR 단일클론 항체가 CHO-DG44 (DHFR-) 세포(Invitrogen. Cat.no. 12613-014)에서 과발현시킨다.

도 5에 기재된 바와 같이, 돌연변이 트립신으로 태깅된 항-EGFR 헤비 체인 유전자는 pcDNA™3.3-TOPO^® TA Cloning^® Kit(Invitrogen)을 사용하여 벡터로 삽입한다. 또한, 항-EGFR 라이트 체인을 코딩하는 유전자는 pcDNA™3.3-TOPO^® TA Cloning^®Kit (Invitrogen)을 사용하여 벡터로 삽입한다. 본 실험에서, 위에서 얻어진 헤비 체인 벡터와 라이트 체인 벡터 각각을 18.75μg씩 준비한다.

이들 벡터를 트랜스펙션하기 전에, 37℃, 8% CO₂에서 130rpm조건으로 48시간 전에, 24시간 전에 각각 한번씩 두차례에 걸쳐 CHO-DG44 세포를 6 x 10⁵ cells/ml 로 8mM L-glutamine와 0.18% PLURONIC F-68를 첨가한 CD DG44 배지 (Gibco. Cat no.12610)에서 계대하여 준다. 생존률이 95% 이상 되는 세포들을 3 x 10⁷cells로 맞춰 125ml 플라스크에 넣고, 최종 30ml이 되도록 CD DG44 배지를 넣어준다. 헤비 체인 벡터와 라이트 체인 벡터 각각 18.75 μg과 FreeStyle MAX reagent (Invitrogen, 16447100) 37.5μl를 OptiPro SFM (Invitrogen의 무혈청 배지)을 이용하여 전체 부피 1.2ml이 되도록 넣으면서 천천히 섞어준다. 이후 상온에서 10분간 반응킨다. 플라스미드-지질 복합체를 CHO-DG44(DHFR-) 세포가 들어있는 플라스크에 천천히 넣어주고, 제네티신(Geneticin) 500 μg/ml를 첨가한 CD DG44 배지에서 5일 동안 배양한다. 이후 배양 배지를 수득하여 정제하였고, 이 때 정제는 실시예 2에서 제조된 에코틴 친화성 크로마토그래피 매질에 적용하였으며, 구체적인 정제 과정은 다음과 같다.

위에서 제조된 에코틴 친화성 컬럼을 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 세팅한다. 위에서 얻은 세포 배양물 상층액에는 약 4ug/ml의 항체가 존재한다. 상기 세포 배양물 상층액에 1/10 부피의 1.0M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가하여 세포 배양물 상층액의 pH를 조정한다. 그런 다음, 세포 배양물 상층액을 에코틴 친화성 컬럼에 통과시킨다. 그 후 컬럼 부피의 10배에 해당하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)/0.5M NaCl로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 컬럼 부피의 10배에 해당하는 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.6)/0.5M NaCl로 컬럼을 다시 세척한다. 그 후, 글라이신 버퍼(50 mM Glycine-HCl, pH 2.5)를 처리하여 트립신이 태깅된 단일클론 항체를 에코틴 친화성 크로마토그래피 매질로부터 용출시키며, 1M Tris-HCl (pH 9.0)을 첨가하여 샘플의 최종 pH를 중성으로 중화시킨다.

정제 과정으로부터 다양한 샘플을 단백질 겔 전기영동으로 분석하였다. 결과는 도 8에 나타나 있다. 도 8에서 레인 5는 사이즈 마커이다. 레인 1는 세포배양액 대조군 (Control)으로 컬럼적용 전 세포배양액이다. 레인 2는 에코틴에 결합되지 않은 단백질(Flow-through)로 컬럼 통과 후 용액이다. 레인 3은 protein A 친화성 컬럼으로 정제된 트립신 태깅이 없는 대조군 항-EGFR(anti-EGFR) 항체로, 라이트 체인 밴드(C) 및 헤비 체인 밴드(B)의 위치를 보여준다. 레인 4와 6는 각각 에코틴 친화성 크로마토그래피 매질 컬럼으로부터 정제된 트립신 태깅된 항-EGFR 항체(anti-EGFR-trypsin(m))를 나타낸다. 레인 4에서, 트립신 태깅된 헤비 체인 밴드는 A로 라벨링되고, C는 라이트 체인이다. 레인 6에서, DTT 부재시에 체인은 연결되어 단일 밴드로 러닝(run)되며(A/C로 라벨링), 더 큰 분자량으로 러닝된다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Method for purifying antibodies and affinity column for purifying antibodies <130> 10P002/SSE <150> KR 10-2008-0045801 <151> 2008-05-16 <150> KR 10-2009-0036008 <151> 2009-04-24 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 162 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Lys Thr Ile Leu Pro Ala Val Leu Phe Ala Ala Phe Ala Thr Thr 1 5 10 15 Ser Ala Trp Ala Ala Glu Ser Val Gln Pro Leu Glu Lys Ile Ala Pro 20 25 30 Tyr Pro Gln Ala Glu Lys Gly Met Lys Arg Gln Val Ile Gln Leu Thr 35 40 45 Pro Gln Glu Asp Glu Ser Thr Leu Lys Val Glu Leu Leu Ile Gly Gln 50 55 60 Thr Leu Glu Val Asp Cys Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Lys Leu Glu 65 70 75 80 Asn Lys Thr Leu Glu Gly Trp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Val Phe Asp Lys 85 90 95 Val Ser Ser Pro Val Ser Thr Met Met Ala Cys Pro Asp Gly Lys Lys 100 105 110 Glu Lys Lys Phe Val Thr Ala Tyr Leu Gly Asp Ala Gly Met Leu Arg 115 120 125 Tyr Asn Ser Lys Leu Pro Ile Val Val Tyr Thr Pro Asp Asn Val Asp 130 135 140 Val Lys Tyr Arg Val Trp Lys Ala Glu Glu Lys Ile Asp Asn Ala Val 145 150 155 160 Val Arg <210> 2 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Pro Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Asn Cys Glu Glu 20 25 30 Asn Ser Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys 35 40 45 Gly Gly Ser Leu Ile Asn Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Gly His Cys 50 55 60 Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Glu Val 65 70 75 80 Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His 85 90 95 Pro Gln Tyr Asp Arg Lys Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys 100 105 110 Leu Ser Ser Arg Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu 115 120 125 Pro Thr Ala Pro Pro Ala Thr Gly Thr Lys Cys Leu Ile Ser Gly Trp 130 135 140 Gly Asn Thr Ala Ser Ser Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Gln Cys 145 150 155 160 Leu Asp Ala Pro Val Leu Ser Gln Ala Lys Cys Glu Ala Ser Tyr Pro 165 170 175 Gly Lys Ile Thr Ser Asn Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly 180 185 190 Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 195 200 205 Gln Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Lys Asn 210 215 220 Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Lys Trp Ile Lys 225 230 235 240 Asn Thr Ile Ala Ala Asn Ser 245 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 3 gagctcgagg aaaacctgta ttttcaggga tccatcgttg ggggctacaa ctgtgaggag 60 60 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 4 gagctcgagt tagctgttgg cagctatggt gttctta 37 <210> 5 <211> 717 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgag tgcgacggcc gctcgag 717 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tev cleavage site <400> 6 gaaaacctgt attttcaggg atcc 24 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Tyr Trp Gly Ser Leu Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Val Asn Arg Arg Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Ser Tyr Val Ser Thr Asn Thr Tyr Val 1 5 10 <210> 13 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Asn Pro Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Asn Cys Glu Glu 20 25 30 Asn Ser Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys 35 40 45 Gly Gly Ser Leu Ile Asn Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Gly His Cys 50 55 60 Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Glu Val 65 70 75 80 Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His 85 90 95 Pro Gln Tyr Asp Arg Lys Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys 100 105 110 Leu Ser Ser Arg Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu 115 120 125 Pro Thr Ala Pro Pro Ala Thr Gly Thr Lys Cys Leu Ile Ser Gly Trp 130 135 140 Gly Asn Thr Ala Ser Ser Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Gln Cys 145 150 155 160 Leu Asp Ala Pro Val Leu Ser Gln Ala Lys Cys Glu Ala Ser Tyr Pro 165 170 175 Gly Lys Ile Thr Ser Asn Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly 180 185 190 Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 195 200 205 Gln Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Lys Asn 210 215 220 Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Lys Trp Ile Lys 225 230 235 240 Asn Thr Ile Ala Ala Asn Ser 245

Claims

단백질을 포함하는 샘플로부터 단백질을 정제하는 방법으로서,
프로테아제 저해제와 상기 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 활성을 보유한 펩티드 태그를 결합시키는 것을 포함하는 단백질 정제 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 프로테아제 저해제는 지지체에 고정되어 있고,
상기 펩티드 태그는 정제될 단백질과 연결되어 있는 단백질 정제 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 단백질 정제 방법은 태깅된 단백질을 포함하는 샘플을 프로테아제 저해제가 고정된 지지체에 접촉시키는 것을 포함하고,
상기 태깅된 단백질은 펩티드 태그에 공유결합으로 연결된 단백질이고, 펩티드 태그는 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 친화성을 가지며,
상기 접촉은 프로테아제 저해제가 펩티드 태그에 결합하는 조건하에서 이루어지고,
결합되지 않은 성분들은 제거하는 것; 및
지지체로부터 단백질을 제거하는 것을 포함하는 단백질 정제 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 지지체로부터 단백질을 제거하는 것은 태깅된 단백질을 지지체로부터 용출시킨 다음, 태깅된 단백질로부터 펩티드 태그를 분리하여 단백질을 얻는 것을 포함하는 단백질 정제 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 태깅된 단백질을 지지체로부터 용출시키는 것은 펩티드 태그와 프로테아제 저해제 사이에 결합 친화성을 저하시키는 pH에서 용출을 수행하여 태깅된 단백질이 지지체로부터 제거되는 단백질 정제 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 태깅된 단백질로부터 펩티드 태그를 분리하는 것은 용출된 태그 단백질을 프로테아제로 처리하는 것을 포함하는 단백질 정제 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 프로테아제는 TEV 프로테아제, 파파인 또는 펩신인 단백질 정제 방법.
제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 하나에 있어서,
상기 지지체로부터 단백질을 제거하는 것은 결합된 펩티드 태그를 태깅된 단백질로부터 분리하여 단백질을 얻는 단백질 정제 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 결합된 펩티드 태그를 태깅된 단백질로부터 분리하는 것은 펩티드 태그가 결합된 단백질을 프로테아제로 처리하여 수행되는 단백질 정제 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드 태그는 프로테아제 유래인 단백질 정제 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 펩티드 태그는 단백질 가수분해 활성이 결여된 프로테아제의 단편, 정상 프로테아제에서 단백질 가수분해 활성이 결여된 돌연변이 프로테아제 또는 돌연변이의 단편인 단백질 정제 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 프로테아제는 파파인, 트립신, 펩신, 키모트립신, 레닌, 카텝신 D, 써몰리신, 엘라스타아제, 플라스민, 트롬빈, 유로키나아제 또는 콜라게나아제프로테아제이고,
상기 프로테아제 저해제는 에코틴, 파파야 쿠니쯔 트립신 저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는 디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸)-Ala-Ala 아미드인 단백질 정제 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 프로테아제 저해제는 에코틴, 파파야 쿠니쯔 트립신 저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는 디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸)-Ala-Ala 아미드인 단백질 정제 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질은 항체인 단백질 정제 방법.
제 3 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 태깅된 단백질은 융합 단백질인 단백질 정제 방법.
제 15 항에 있어서,
상기 융합 단백질은 펩티드 태그를 코딩하는 핵산을 단백질을 코딩하는 핵산에 연결시켜 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 얻고, 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 벡터에 삽입하고, 숙주세포에서 융합 단백질을 발현시켜 얻는 단백질 정제 방법.
지지체 상에 프로테아제 저해제를 고정시키는 것을 포함하는 친화성 크로마토그래피를 제조하는 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 프로테아제 저해제는 에코틴, 파파야 쿠니쯔 트립신 저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는 디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸)-Ala-Ala 아미드인 방법.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
상기 지지체는 아가로스, 셀룰로오스 또는 아크릴아미드인 방법.
지지체 및 프로테아제 저해제를 포함하는 친화성 크로마토그래피 매질.
제 20 항에 있어서,
상기 지지체는 아가로스, 셀룰로오스 또는 아크릴아미드인 친화성 크로마토그래피 매질.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
상기 프로테아제 저해제는 에코틴, 파파야 쿠니쯔 트립신 저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는 디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸)-Ala-Ala 아미드인 친화성 크로마토그래피 매질.
제 22 항에 있어서,
상기 프로테아제 저해제는 에코틴인 친화성 크로마토그래피 매질.
제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 하나에 따른 친화성 크로마토그래피 매질로 팩킹(pack)된 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼.
제 24 항에 있어서,
상기 프로테아제 저해제는 에코틴, 파파야 쿠니쯔 트립신 저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는 디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸)-Ala-Ala 아미드인 친화성 크로마토그래피 컬럼.
태깅된 단백질의 발현을 위한 재조합 세포를 제조하는 방법으로서,
펩티드 태그를 코딩하는 핵산을 단백질을 코딩하는 핵산에 연결하여 태깅된 단백질을 코딩하는 핵산을 얻는 것;
태깅된 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 벡터에 연결하여 재조합 백터를 얻는 것; 및
숙주세포를 재조합 벡터로 형질전환 시키는 것을 포함하는 방법.
제 26 항에 있어서,
상기 펩티드 태그는 단백질 가수분해 활성이 결여된 돌연변이 트립신인 방법.
제 27 항에 있어서,
상기 돌연변이 트립신 서열은 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 친화성을 보유한 서열번호 2의 단편을 포함하는 방법.
제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
상기 돌연변이 트립신 서열은 서열번호 2의 24 내지 244번째 아미노산을 포함하는 방법.
제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
상기 돌연변이 트립신 서열은 서열번호 2의 16 내지 244번째 아미노산으로 구성된 방법.
제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질은 이뮤노글로불린 헤비 체인인 방법.
제 31 항에 있어서,
상기 이뮤노글로불린은 항-EGFR 항체인 방법.
프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 친화성을 지닌 펩티드 태그; 및
단백질을 포함하는 융합 단백질.
제 33 항에 있어서,
상기 펩티드 태그는 파파인, 트립신, 펩신, 키모트립신, 레닌, 카텝신 D, 써몰리신, 엘라스타아제, 플라스민, 트롬빈, 유로키나아제 및 콜라게나아제프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 프로테아제로부터 유래된 융합 단백질.
제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,
상기 펩티드 태그는 단백질 가수분해 활성이 결여된 프로테아제의 단편, 정상 프로테아제에서 단백질 가수분해 활성이 결여된 돌연변이 프로테아제 또는 돌연변이의 단편인 융합 단백질.
제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드 태그는 돌연변이 트립신인 융합 단백질.
제 36 항에 있어서,
상기 돌연변이 트립신의 서열은 프로테아제 저해제에 대한 특이적 결합 친화성을 보유하는 서열번호 2의 단편을 포함하는 융합 단백질.
제 36 항 또는 제 37 항에 있어서,
상기 돌연변이 트립신의 서열은 서열번호 2의 24 내지 244번째 아미노산을 포함하는 융합 단백질.
제 36 항 또는 제 37 항에 있어서,
상기 돌연변이 트립신의 서열은 서열번호 2의 16 내지 244번째 아미노산을 포함하는 융합 단백질.
제 33 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질은 이뮤노글로불린 헤비 체인인 융합 단백질.
제 33 항 내지 제 40 항 중 어느 하나에 따른 융합 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포.