JP2003511078A

JP2003511078A - 複数のエピトープと融合した組換えタンパク質の精製

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Publication number: JP2003511078A
Application number: JP2001530496A
Authority: JP
Inventors: ビル・ブリザード; ロン・ハーナン
Original assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Current assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 2000-09-20
Publication date: 2003-03-25
Anticipated expiration: 2020-09-20
Also published as: US20020045193A1; EP2075336A1; CA2386471C; JP4405125B2; ES2321058T7; WO2001027293A1; CA2386471A1; EP1220933B3; US20060088878A1; DE60041345D1; AU7704900A; EP1220933A1; US7094548B2; AU774216B2; EP2075336B1; EP1220933B1; ATE420186T1; ES2321058T3; US6379903B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的ペプチドの精製および検出感度を増大させるための縦一列に結合した複数コピーの抗原性ドメイン、開裂可能なリンキング配列、および所望によりスペーサードメインを含む新規同定ポリペプチドを提供する。さらに、組換えDNA技術により製造され、１またはそれ以上のリガンドを用いるアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製される同定ポリペプチドおよび標的ペプチドからなるハイブリッド分子を提供する。したがって、同定ポリペプチドをコードするDNAを含むDNA発現ベクター、および標的ペプチドを精製するためにそのような同定ポリペプチドを用いる方法も提供する。新規同定ポリペプチドをコードするDNAベクター、および標的ペプチドと結合する同定ポリペプチドをコードするDNA発現ベクターの構築方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、タンパク質タグ、および種々の組換えＤＮＡ技術に用いるタンパク
質精製法に関する。より詳細には、本発明は、新規同定ポリペプチド、および縦
一列に連結した複数の抗原性ドメインを含有する新規同定ポリペプチドをコード
するＤＮＡベクターを指向するものである。そのような同定ポリペプチドを用い
て標的ペプチドを精製する方法、ならびに新規同定ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡベクター、および標的ペプチドと連結した同定ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ発現ベクターの構築方法も提供する。

【０００２】（発明の背景）タンパク質様分子、例えば酵素、ホルモン、貯蔵タンパク質、結合タンパク質
、輸送タンパク質、およびシグナル変換タンパク質は、種々の組換えＤＮＡ技術
を用いて製造および精製してよい。例えば、選択したタンパク質をコードするＤ
ＮＡ断片を、リボソーム結合部位およびプロモーターの適切なＤＮＡ配列ととも
にプラスミドベクターに連結する。プラスミドを宿主原核または真核細胞中に挿
入する。形質転換宿主細胞を同定し、単離し、次いで培養してタンパク質様分子
を発現させる。ハイブリッドポリペプチドを精製するのに用いる１つの方法は、
ハイブリッドペプチドを陽イオン樹脂を用いて選択的に精製するポリアルギニン
系である。Sassenfeld, H. M.およびBrewer, S. J. BioTechnologv, 2: 76 (198
4); 米国特許4,532,207参照。SassenfeldおよびBrewerは、標的タンパク質と融
合した５個のアルギニン残基のカルボキシ末端伸張を報告した。この基本的ポリ
アルギニン伸張によりSP-Sephadex樹脂を用いてハイブリッドポリペプチドを精
製することができた。類似タンパク質の発現および精製系では、ハイブリッドポ
リペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにポリヒスチジン領域（tr
act）またはタグを用いる。融合タンパク質はNi²⁺金属アフィニティ樹脂を用い
るクロマトグラフィーにより精製される。Porath, J., Protein Expression and
Purification, 3: 7995 (1992)参照。さらに、融合タンパク質の単離を容易に
するため、一般に種々のアフィニティ精製プロトコールが用いられている。アフ
ィニティクロマトグラフィーは、リガンドと特異的かつ非共有結合的に結合する
タンパク質の能力に基づく。単独で用いることにより、連続イオン交換およびゲ
ルカラムクロマトグラフィーで可能なよりも精製度が高くなるだけでなく、活性
の有意な損失なしに非常に複雑な混合物からタンパク質を単離することができる
。典型的には、アフィニティマトリックスと高い特異性で結合することができる
リガンドを融合パートナーに選ぶ。例えば、p-アミノフェニル-β-D-チオガラク
トシジル-スクシニルジアミノヘキシル-セファロースはβ-ガラクトシダーゼと
選択的に結合し、β-gal融合タンパク質を精製することができる。Germinoら, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6848 (1983)参照。融合タンパク質のアフィニ
ティ精製が可能な他の発現系には、グルタチオン-S-トランスフェラーゼを用い
て作製される融合タンパク質が含まれ、これはグルタチオン-アガロースを用い
て選択的に回収される。Smith, D. B.およびJohnson, K. S. Gene 67: 31 (1988
)参照。IgG-セファロースを用いてブドウ球菌のプロテインAを含む融合タンパク
質をアフィニティ精製することができる。Uhlen, M.ら、Gene 23: 369 (1983)参
照。E. coliのmalE遺伝子由来のマルトース結合タンパク質ドメインを融合パー
トナーに用い、アミロース樹脂を用いて融合タンパク質をアフィニティ精製する
ことができる。

【０００３】タンパク質の検出および単離に用いる別の方法はエピトープタグを用いること
による。エピトープ標識（タグづけ）ではゲストペプチドに対する抗体を用いて
細胞レベルおよび細胞下レベルでのタンパク質の局在を試験する。Kolodziej, P
. A.およびYoung, R. A., Methods Enzvmol., 194: 508-519 (1991)参照。組換
えDNA技術を用い、エピトープをコードするヌクレオチド配列をクローン化遺伝
子のコーディング領域中に挿入し、形質転換のような方法によりハイブリッド遺
伝子を細胞内に導入する。ハイブリッド遺伝子が発現すると、ゲストペプチドと
してエピトープを含むキメラタンパク質が生じる。タンパク質表面上にエピトー
プが露出すると、エピトープ特異的抗体により認識させることができ、研究者は
免疫蛍光や他の免疫学的技術を用いて細胞内のタンパク質を観察することができ
る。さらに、そのようなエピトープタグで標識した融合タンパク質はアフィニテ
ィ精製技術を用いてタンパク質を精製するのに用いられることが多い。

【０００４】このように、エピトープタグづけは発現タンパク質の検出および精製のための
強力な手段となってきた。Kolodziej, P. A.およびYoung, R. A., Methods Enzy
mol., 194: 508-519 (1991)参照。多くのタイプのタグが用いられており、c-myc
およびFLAG(登録商標)タグが用いられる最も人気のある２つのエピトープである
。Evanら, Mol Cell Biol. 5: 3610-3616 (1985)参照。一般に、これらエピトー
プは発現タンパク質のアミノまたはカルボキシ末端と融合し、検出用抗体を該タ
ンパク質により接近しやすくし、重大な構造的または機能的不安を生じることが
少ないようである。

【０００５】アミノ末端にFLAG(登録商標)オクタペプチド： Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (配列番号1) を有する融合タンパク質は、該オクタペプチドに特異的な抗体を含む免疫アフィ
ニティ樹脂を用いてアフィニティ精製することができる。Hopp, T. P.ら、Biote
chnology, 6:1204 (1988); Prickett, K. S.,ら, BioTechniques, 7:580 (1989)
; および米国特許4,851,341参照。FLAGS(登録商標)エピトープタグは、哺乳動物
および細菌系においてタンパク質を検出および精製するのに有効に用いられてき
た。最初のFLAG(登録商標)配列は２つの抗体M1およびM2により認識され、イニシ
エーターメチオニンが結合したFLAG(登録商標)配列は第三抗体、M5により認識さ
れる。FLAG(登録商標)配列の最後の５アミノ酸はプロテアーゼエンテロキナーゼ
の認識部位であり、FLAG(登録商標)エピトープを除去することができる。FLAG(
登録商標)エピトープは、ヘテロローガスなタンパク質を検出および精製するた
めの種々の発現系、例えばE. coli (Brizzardら, BioTechniques, 16: 730-735
(1994))、 Saccharomyces cerevisiae (Leeら, Nature, 372: 739-746 (1994);
Prickettら, BioTechniques, 7: 580-589 (1989))、Drosophila (Xuら, Develop
ment, 117: 1223-1237 (1993))、Baculovirus (Dentら, Mol. Cell Biol, 15: 4
125-4135 (1995); Ritchieら, Biochem Journal, 338: 305-10 (1999))、および
哺乳動物系(Overholtら, Clin. Cancer Res., 3: 185-191 (1997); Schulteおよ
びEschら, Biochemistry, 38: 2248-2258 (1999)) で用いられてきた。しかしな
がら、多くの哺乳動物発現系ではタンパク質発現レベルが低く、確立された方法
を用いて発現した外来タンパク質を効果的に検出するのが難しいことがある。したがって、組換えタンパク質の検出と感度を増大させるエピトープタグ、お
よびそのようなエピトープタグを用いる発現系が求められている。

【０００６】発明の要約本発明は、組換えタンパク質を高収率で産生するのに使用できる方法およびビ
ークルを提供することにより１またはそれ以上の前記問題に取り組むものである
。したがって、本発明の多くの目的のうち、新規同定ポリペプチド、新規同定ポ
リペプチドと融合した標的ペプチドを含むハイブリッド分子、およびそれをコー
ドする組換えDNAベクターが注目されよう。単一リガンドまたは複数リガンド、
好ましくは抗体を用いて、抗原性があるかないかに関わらず形質転換宿主細胞に
より発現したすべてのタンパク質分子を実質的に単離および精製することができ
る標的ペプチドの精製方法も提供する。本発明のさらなる目的は、アフィニティ
クロマトグラフィー法が可能でないものを含む、組換えDNA法で生成したあらゆ
るタンパク質分子を高度に精製するのに使用できる方法を提供することである。

【０００７】したがって、簡単には、本発明は、縦一列に連結した抗原性ドメインの複数コ
ピーを含む同定ポリペプチドを指向するものである。同定ポリペプチドは、個々
の抗原性ドメイン中に位置しないかまたはそれらの間に挿入されていない、標的
ペプチドと隣接して位置する開裂可能な部位を含むリンキング配列を含んでいて
よい。各抗原性ドメインは抗原反応を誘導することができ、リガンド、好ましく
は抗体により結合し得る。さらに、各抗原性ドメインは、少なくとも２、好まし
くは３またはそれ以上の異なるアミノ酸の組み合わせからなる。

【０００８】標的ペプチドと融合した新規同定ポリペプチドを含む本発明の融合タンパク質
も提供される。同定ポリペプチドは、配列特異的タンパク質分解剤を用いること
により、標的ペプチドに隣接した特定アミノ酸残基で開裂可能であることを特徴
とするリンキング配列を含有する。そのような開裂可能な部位は、標的ペプチド
のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに隣接して位置し、好ましくは標
的ペプチドのアミノ末端の直近に位置する。理想的には、該開裂可能な部位のア
ミノ酸配列はユニークであり、タンパク質分解剤が標的ペプチドを開裂する可能
性を最小限にする。好ましい態様において、該開裂可能な部位は、エンテロキナ
ーゼ、トロンビン、またはXa因子に特異的なアミノ酸を含む。

【０００９】融合タンパク質のこの独特な構成により、標的ペプチドをアフィニティクロマ
トグラフィー技術により単離することができよう。すなわち、本発明の目的は、
標的ペプチドの精製方法を提供することである。これは同定ポリペプチドの抗原
性ドメインに特異的な固定化リガンドを有するアフィニティカラムを構築して融
合タンパク質を結合させることにより達成される。本発明では、単一抗体または
複数抗体を用いて同定ポリペプチドの複数の抗原性ドメインを含む個々の抗原性
ドメインと結合させてよいことは認識されよう。次に、結合した融合タンパク質
をカラムから遊離させ、同定ポリペプチドを適切なタンパク質分解剤で開裂させ
、次いで精製された標的ペプチドを放出させることができる。好ましい態様にお
いて、標的ペプチドを同定ポリペプチドから開裂させるのに用いるタンパク質分
解剤はエンテロキナーゼ、トロンビン、およびXa因子からなる群から選ばれる。

【００１０】本発明のさらなる目的は、同定ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え
クローニングベクターを提供することである。同定ポリペプチドをコードするベ
クターは、当業者が所望のあらゆるタンパク質をコードするあらゆる数のＤＮＡ
配列を挿入することができるように、抗原性ドメインのいずれかの側または抗原
性ドメイン間に位置する複数の制限酵素部位からなる複数のクローニング部位を
コードするＤＮＡ配列も含む。このＤＮＡ配列は、適切な制限エンドヌクレアー
ゼおよびリガーゼを用いてクローニングベクター、例えばプラスミドに挿入する
ことができよう。組換えプラスミドを用いて、プラスミドの複製およびハイブリ
ッドアフィニティドメイン／タンパク質分子の発現に適合する原核性または真核
性宿主細胞を形質転換する。理想的には、該プラスミドは、形質転換宿主細胞を
同定および単離するための表現型マーカー遺伝子を有する。好ましい態様におい
て、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をＤＮＡベクターまたはプラ
スミドと連結することにより形質転換宿主細胞を容易に同定し、形質転換してい
ない細胞から分離することができる。他の目的および特徴は一部が明らかであり、一部を後述する。

【００１１】略号および定義本発明の理解を促すために、多くの用語を以下に定義する。ヌクレオチド塩基は本明細書では以下のように略す：Aはアデニンを表す。Cは
シトシンを表す。Gはグアニンを表す。Tはチミンを表す。Uはウラシルを表す。

【００１２】本明細書ではアミノ酸残基は一文字標記に従って略す：Aはアラニンを表す。R
はアルギニンを表す。Nはアスパラギンを表す。Dはアスパラギン酸を表す。Cは
システインを表す。Qはグルタミンを表す。Eはグルタミン酸を表す。Gはグリシ
ンを表す。Hはヒスチジンを表す。Iはイソロイシンを表す。Lはロイシンを表す
。Kはリジンを表す。Mはメチオニンを表す。Fはフェニルアラニンを表す。Pはプ
ロリンを表す。Sはセリンを表す。Tはトレオニンを表す。Wはトリプトファンを
表す。Yはチロシンを表す。Vはバリンを表す。本明細書で用いている用語「組換えＤＮＡ分子」は、組換えＤＮＡ技術により
一緒に連結されたＤＮＡ断片を含むＤＮＡ分子を表す。

【００１３】本明細書で用いている用語「発現ベクター」は、特定の宿主生物において機能
性に連結したコーディング領域の発現に必要な適切な核酸配列および所望のコー
ディング配列を含む核酸配列を表す。原核生物中で発現させるのに必要な核酸配
列は、プロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドン、所望によ
りオペレーター配列、およびおそらく他の配列を含む。真核細胞は、プロモータ
ー、Kozak配列、およびしばしばエンハンサー、およびポリアデニル化シグナル
を利用する。原核細胞はShine Dalgarnoリボソーム結合部位も利用する。本発明
は、あらゆる生存能力のある宿主細胞を組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換す
るためのビークルとして使用できるベクターまたはプラスミドを含む。

【００１４】本明細書で用いている用語「FLAG」は、米国特許4,703,004、4,782,137、4,851
,341、および5,011,912（この内容は本明細書の一部を構成する）に記載のDYKDD
DDK (配列番号1)の合成ペプチド配列からなる広く使用されるFLAG(登録商標)エ
ピトープタグを表す登録商標である。

【００１５】用語「親水性」は、アミノ酸について用いるとき、極性および／または荷電側
鎖を有するアミノ酸を表す。親水性アミノ酸には、リジン、アルギニン、ヒスチ
ジン、アスパータイト（すなわち、アスパラギン酸）、グルタメート（すなわち
、グルタミン酸）、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン
、およびグルタミンが含まれる。

【００１６】用語「疎水性」は、アミノ酸について用いるとき、非極性側鎖を有するアミノ
酸を表す。疎水性アミノ酸には、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン
、およびメチオニンが含まれる。３つの疎水性アミノ酸は芳香族側鎖を有する。
したがって、用語「芳香族（の）」は、アミノ酸について用いるとき、３つの芳
香族疎水性アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを表
す。

【００１７】用語「開裂可能な部位」は、選択的タンパク質分解剤によりこの配列を含むタ
ンパク質またはペプチドを開裂させることができる定義されたアミノ酸配列を表
す。

【００１８】本明細書で用いている用語「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異なるタ
ンパク質由来のタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを表す。標
的ペプチドは、融合タンパク質のアミノ末端部分やカルボキシ末端タンパク質に
局在し、それぞれ「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タ
ンパク質」を形成してよい。

【００１９】本明細書で用いている用語「標的ペプチド」は、ハイブリッドポリペプチド内
で発現することが望ましいペプチドを表す。本発明のハイブリッドポリペプチド
において、標的ペプチドはハイブリッドポリペプチドのアミノまたはカルボキシ
末端部分のいずれかを含んでいてよい。

【００２０】本明細書で用いている用語「エンドプロテアーゼ」または「エンドペプチダー
ゼ」は、ポリペプチドの内部ペプチド結合を末端結合（すなわち、末端アミノ酸
のペプチド結合）以外の箇所で加水分解することができるプロテアーゼを表す。

【００２１】用語「コーディング（をコードする）核酸分子」、「コーディングＤＮＡ配列
」、および「コーディングＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシ
リボヌクレオチドの順序または配列を表す。これらデオキシリボヌクレオチドの
順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。す
なわち、ＤＮＡ配列はアミノ酸をコードする。

【００２２】本明細書に記載のすべてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列について、配列の
機能に影響を及ぼすことなく配列内を同等のヌクレオチドおよびアミノ酸で置換
することができると理解される。そのような置換は当業者の能力内である。核酸の分子操作を含む本明細書に記載の方法は当業者に知られている。一般的
には、Fredrick M. Ausubelら (1995),「Short Protocols in Molecular Biolog
y」, John Wiley and Sons、およびJoseph Sambrookら (1989),「Molecular Clo
ning, A Laboratory Manual」第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press（
これらの内容は本明細書の一部を構成する）参照。

【００２３】詳細な説明本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いて製造される標的ペプチドの精製および検
出感度が増大した同定ポリペプチドを提供する。さらに、組換えＤＮＡ技術によ
り製造され、１またはそれ以上のリガンドを用いるアフィニティクロマトグラフ
ィーを用いて精製される標的ペプチドおよび同定ポリペプチドからなるハイブリ
ッドポリペプチド分子を提供する。したがって、同定ポリペプチドおよび所望の
標的ペプチドをコードするＤＮＡの断片を含むＤＮＡ発現ベクターも提供される
。

【００２４】本発明によれば、標的ペプチドは形質転換宿主細胞中で発現することができる
あらゆるタンパク質様物質を含んでよい。同定ポリペプチドの抗原性の増大は、
縦一列になった抗原性ドメインの複数コピーが存在することにより生じる。同定
ポリペプチドは、同定ポリペプチドと標的ペプチドを結合してハイブリッドポリ
ペプチドを生成する開裂可能なリンキング配列も含む。ＤＮＡクローニングベク
ターは複製されてよく、同定ポリペプチドと標的ペプチドからなるハイブリッド
ポリペプチドはは該ベクターで形質転換された原核または真核細胞中で発現する
。形質転換細胞を単離し、次いで、培養または当該分野で知られた他の手段を用
いて増殖させる（expand)。

【００２５】本発明のハイブリッドポリペプチド分子はアフィニティクロマトグラフィーで
精製してよい。同定ポリペプチドおよび標的ペプチドを含むハイブリッドポリペ
プチド分子は、同定ポリペプチドの抗原性ドメインと結合するアフィニティ樹脂
を用いて精製してよい。一般的には、同定ポリペプチドタグの抗原性ドメインに
特異的なリガンドはビーズカラムまたは他のタイプのマトリックスに固定される
。培養から得た宿主細胞の抽出物をカラムに適用し、次いで、カラムに結合する
ポリペプチドを溶出する。次に、同定ポリペプチドを適切なタンパク質分解剤で
標的ペプチド分子から開裂させ、標的ペプチドを高度に精製された状態で放出さ
せる。

【００２６】ポリペプチドの同定本発明の同定ポリペプチドは、標的ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端と
側面を接するアミノ酸残基の配列である。一般的には、同定ポリペプチドは、そ
れぞれ、抗体、抗原性ドメインと標的ペプチドを連結する開裂可能なリンキング
配列、および所望により１またはそれ以上のスペーサーを結合することができる
抗原性ドメインの複数コピーを含む。

【００２７】検出感度を増大させるには、同定ポリペプチドは抗原性ドメインの複数コピー
、すなわち、抗原性ドメインの少なくとも２コピー、好ましくは抗原性ドメイン
の少なくとも３コピー、そしていくつかの態様では抗原性ドメインの４コピーま
たはそれ以上を含むことが好ましい。例えばカラムまたは他のマトリックス上に
固定化された抗体と結合する複数抗原性ドメイン配列の能力は標的ペプチドの単
離および精製を可能にする。

【００２８】複数抗原性ドメイン配列の各抗原性ドメインは、全体で、好ましくはわずか約
２０アミノ酸残基、より好ましくはわずか１５アミノ酸残基、さらにより好まし
くは１０アミノ酸残基、さらにより好ましくはわずか約６アミノ酸残基を含む。
さらに、各抗原性ドメインは、好ましくは親水性および芳香族アミノ酸から選ば
れる、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個の異なるアミ
ノ酸残基を含む。非芳香族、疎水性アミノ酸残基を抗原性ドメインから排除する
必要はないが、抗原性ドメインを構成するアミノ酸残基の少なくとも１／２が親
水性および芳香族アミノ酸から選ばれることが一般的に好ましく、抗原性ドメイ
ンを構成するアミノ酸残基の少なくとも１／２が親水性アミノ酸であることがさ
らに好ましく、抗原性ドメインを構成するアミノ酸残基の少なくとも３／４が親
水性アミノ酸残基であることがさらに好ましい。ある好ましい態様において、抗
原性ドメインを構成するアミノ酸残基は親水性アミノ酸が１／２で、芳香族アミ
ノ酸が１／２である。別の好ましい態様において、抗原性ドメインを構成するア
ミノ酸残基は親水性アミノ酸から選ばれる。

【００２９】本発明のある好ましい態様において、各抗原性ドメインは、少なくとも１つが
芳香族アミノ酸の群から選ばれ、少なくとも１つが親水性アミノ酸の群から選ば
れ、また親水性アミノ酸残基の数が抗原性ドメインを定義するアミノ酸残基の総
数の少なくとも50%、より好ましくは少なくとも75%を構成する少なくとも３つの
異なるアミノ酸残基を含む一連の約６〜約１０アミノ酸残基により定義される。
Hopp T. P. and Woods K. R., Proc. Natl. Acad. Sci., 78: 3824-3828 (1981)
参照。所望により、この配列は１またはそれ以上の非芳香族、疎水性残基を含ん
でいてよい。

【００３０】本発明の別の態様において、各抗原性ドメインのアミノ酸は荷電または極性ア
ミノ酸残基から選んでよい。Jinらは、ヒト成長ホルモン(hGH)の機能的エピトー
プにおいてアルギニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルア
ラニン、およびイソロイシンのアミノ酸側鎖が主な役割を果たすことを示した。
Jinら, J. Mol. Biol. 116: 851-865 (1992)（この内容は本明細書の一部を構成
する）参照。さらに、Jinらは、該エピトープのモノクローナル抗体との結合が
エピトープ中の少数のアミノ酸側鎖により特徴づけられ、しばしば荷電または極
性アミノ酸側鎖であることを示した。Jinら、上記参照。したがって、アルギニ
ン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニン、およびイソ
ロイシンから選ばれるアミノ酸残基を用いる抗原性ドメインを設計し、同定ポリ
ペプチドの表面接近性を増大させてよい。Benjaminら, Annu. Rev. Immunol. 2:
101 (1984); Novotnyら, Proc. Nat. Acad. Sci., 83: 226-230 (1986); Alzai
ら, Annu. Rev. Immunol. 6: 555-580 (1988); Daviesら, Annu. Rev. Biochem.
, 59: 439473 (1990)参照。

【００３１】同定ポリペプチドは抗原性ドメインの配列を標的ペプチドと連結する開裂可能
なリンキング配列を含む。一般的には、リンキング配列を含むアミノ酸残基は、
抗原性ドメイン配列を標的ペプチドと結合するのを助けるあらゆるアミノ酸配列
を含む。さらに、該リンキング配列は、配列特異的タンパク質分解剤を用いて開
裂することができるユニークなアミノ酸配列を含む開裂部位を含む。同定ポリペ
プチドおよび標的ペプチドからなるハイブリッドポリペプチドを培養抽出物から
精製したら、開裂部位のアミノ酸に特異的なタンパク質分解剤で消化して同定ポ
リペプチドを標的ペプチドから開裂させることが好ましい。あるいはまた、当該
分野で知られた方法を用いる化学的開裂により標的ペプチドから同定ポリペプチ
ドを除去してよい。

【００３２】一般的に、開裂可能な部位は標的ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に位
置してよい。好ましくは、開裂可能な部位は標的ペプチドを同定ポリペプチドか
ら分離することができるように標的ペプチドの直近にある。この開裂可能な部位
は、抗原性ドメインまたは存在する場合は同定ポリペプチドのスペーサードメイ
ンに存在しないか、それらの間に挿入されないことが好ましい。好ましい態様に
おいて、開裂可能な部位は標的ペプチドのアミノ末端に位置する。開裂可能な部
位が標的ペプチドのアミノ末端に位置し、タンパク質分解剤で開裂した後に標的
ペプチド上に異質のアミノ酸が残っている場合は、エンドペプチダーゼ、例えば
トリプシン、クロストロパイン、またはフリンを用いてこれらの残留アミノ酸を
除去し、高度に精製された標的ペプチドを得てよい。

【００３３】ハイブリッドポリペプチドがアフィニティ樹脂と結合したままでタンパク質分
解剤を用いる消化が生じるか、またはアフィニティ樹脂からハイブリッドペプチ
ドを溶出し、次いでタンパク質分解剤で消化してさらに標的ペプチドを精製して
よい。組換え標的ペプチドのタンパク質分解剤によるかもしくは化学的開裂の効
率は抗原性ドメインと標的ペプチドの配列間に挿入されたリンキング配列のアミ
ノ酸配列によって決定される。理想的には、開裂部位のアミノ酸配列はユニークであり、タンパク質分解剤が
標的ペプチドを開裂する可能性を最小限にする。好ましい態様において、開裂可
能な部位はエンテロキナーゼ、トロンビン、またはXa因子開裂部位のためのアミ
ノ酸を含む。

【００３４】エンテロキナーゼはいくつかの配列を認識する： Asp-Lys; Asp-Asp-Lys; Asp
-Asp-Asp Lys (配列番号2);およびAsp-Asp-Asp-Asp-Lys (配列番号3)。Matsushi
maら, J. Biochem 125: 947-51 (1999)参照。ウシエンテロキナーゼおよびある
酵母タンパク質の天然の基質であるタンパク質トリプシノーゲンを用いてAsp-As
p-Asp-Asp-Lys (配列番号3)が天然に生じることが知られているのみである。し
たがって、標的ペプチドのアミノ末端と抗原性ドメイン配列の間に開裂可能な部
位としてアミノ酸配列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (配列番号3)を含むリンキング配列
を挿入することにより、標的ペプチド自身のいかなる部分も開裂する可能性が非
常に低いウシエンテロキナーゼを用いて同定ポリペプチドから標的ペプチドを遊
離させることができる。

【００３５】トロンビンはアルギニンのカルボキシ末端部位で以下の配列を開裂する：Leu-
Val-Pro-Arg-Gly-X (配列番号4)（ここで、Xは非酸性アミノ酸である）。Chang,
Eur. J. Biochem., 151: 217 (1985)参照。Xa因子プロテアーゼ(すなわち、X因
子の活性化型）は、下記配列のArgの後を開裂する: Ile-Glu-Gly-Arg-X (配列番
号5)、Ile-Asp-Gly-Arg-X (配列番号6)、およびAla-Glu-Gly-Arg-X (配列番号7)
（ここで、Xはプロリンまたはアルギニンを除くあらゆるアミノ酸である）。cII
タンパク質の31アミノ末端残基、Xa因子開裂部位、およびヒトβ-グロビンを含
む融合タンパク質はXa因子により開裂し、真正なβ-グロビンを生じることが示
された。Nagai, K.およびThogersen, H. C., Nature, 308: 810-812 (1984)参照
。Xa因子ベースの融合系の限界は、Xa因子がXa因子認識配列中に存在しないアル
ギニン残基を開裂すると報告されている事実があることである。Nagaiら, Prot.
Expr. and Purif., 2: 372 (1991)参照。

【００３６】あまり好ましくはないが、他の開裂可能な部位のための他のユニークなアミノ
酸配列を本発明の精神や範囲から離れることなくリンキング配列に用いるてもよ
い。例えば、リンキング配列は一部塩基性アミノ酸（すなわち、Lys、Arg、また
はHis）対を含むことができる。この配列は腺酵素のカリクレインにより開裂さ
れる。また、酵素トロンビンはArgのあとにGlyが続くときにArgの後を開裂する
ことが知られているので、リンキング部分は一部Arg-Glyからなることができる
。さらに、抗原性ドメインと開裂可能な部位は互いに排他的である必要はない。
エンテロキナーゼの開裂可能な部位Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (配列番号3)の部分を
認識するFLAG(登録商標)モノクローナル抗体M2を用いる場合のように、抗体は開
裂可能な部位にみられるアミノ酸と結合することができる。

【００３７】一般的に、各抗原性ドメインが別の抗原性ドメインの直近にあることが好まし
いが（すなわち、介在配列なし）、抗原性ドメインはスペーサードメインにより
互いに分離されてよい。スペーサードメインがリンキング配列と抗原性ドメイン
の複数コピーの間に挿入されてもよい。スペーサードメインの挿入は、同定ポリ
ペプチドの抗原性ドメイン間に開裂可能な部位の第二コピーの挿入をもたらさな
いことが好ましい。好ましくは、各スペーサードメイン中のアミノ酸残基の数が
最小、好ましくは長さがわずか１０アミノ酸、より好ましくはわずか約６アミノ
酸残基、さらにより好ましくは２またはちょうど１アミノ酸残基からなることが
好ましい。

【００３８】スペーサードメインを用いる場合は、同定ポリペプチドに１またはそれ以上の
所望の特性を与えるよう設計してよい。ある態様において、スペーサードメイン
のアミノ酸は同定ポリペプチドの親水性を増大するように親水性アミノ酸から選
ばれる。あるいはまた、スペーサードメインのアミノ酸は、同定ポリペプチドに
所望のホールディングをもたらして抗体に対する接近性を増加させるように選ん
でよく、例えば、スペーサードメインは、抗体に対する接近性を改善するタンパ
ク質のホールディング構造を生じるグリシン残基を含んでいてよい。Danら, J.
Bio. Chem. 271: 30717-30724 (1996); Borjigin, J.およびNathans, J., J. Bi
ol. Chem. 269: 14715-147622 (1994)参照。ある種のアミノ酸残基、例えばヒスチジンが固定化金属イオンを結合またはキ
レートする親和性を有することが当該分野でよく知られている。したがって、ス
ペーサードメイン中に複数または交互ヒスチジン残基を含む金属キレーティング
配列を有する同定ポリペプチドを設計するかまたは抗原性ドメインの配列のいず
れかの側面に位置することにより、ハイブリッドポリペプチドは樹脂または他の
マトリックス上に固定した金属イオンと結合することができる。好ましい態様に
おいて、抗原性ドメインの複数コピーと側面を接するか、またはスペーサードメ
イン中の金属キレーティング配列は、少なくとも１個のヒスチジン残基、少なく
とも１個のグリシン残基、または式：-(His-X) m-（ここで、mは1〜6であり、X
は、Gly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Phe、Met、Ala、Glu、Ile、Thr
、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群から選ばれる。）で示される
交互または複数ヒスチジン残基の組み合わせを含んでいてよく、これをNi²⁺結合
金属樹脂を用いるアフィニティ精製技術に用いることができる。例えば、米国特
許4,569,794、5,310,663、5,284,933、および5,594,115参照（この内容は本明細
書の一部を構成する）。好ましくは、スペーサードメインのアミノ酸は本明細書
に記載の開裂可能な部位の第２コピーを含まない。ハイブリッドポリペプチドが
金属樹脂と結合したら、その付随金属イオン結合リガンドのプロトン化によりハ
イブリッドポリペプチドを放出させることができる。解離は、結合タンパク質を
溶出するための当該分野で知られた一般的方法である、周囲緩衝媒質のpHを下げ
ることにより達成される。

【００３９】本発明のある態様において、同定ポリペプチドは、単一エンテロキナーゼ開裂
部位を含むリンキング配列と結合するFLAT(登録商標)ペプチド配列と一般的に対
応する抗原性ドメインの複数コピーを含む。そのような同定ポリペプチドは一般
的には下記配列に対応する。 X²⁰-(X¹-Y-K-X²-X³-D-X⁴)_n-X⁵-(X¹-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K)-X²¹ ［ここで、D、Y、およびKはその代表的アミノ酸である。 X²⁰およびX²¹は独立して水素または結合である。 X¹およびX⁴は独立して結合であるか、または結合でない場合は少なくとも１個
のアミノ酸残基、好ましくは芳香族アミノ酸残基および親水性アミノ酸残基から
なる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも
１個の親水性アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１個のアスパラギ
ン酸残基である。 X²、X³、X⁷、およびX⁸は、それぞれ独立してアミノ酸残基、好ましくは芳香族
アミノ酸残基および親水性アミノ酸残基からなる群から選ばれるアミノ酸残基、
より好ましくは親水性アミノ酸残基、さらにより好ましくはアスパラギン酸残基
である。 X⁵は結合、または結合でない場合は好ましくはヒスチジン残基、グリシン残基
、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（ここで、ｍは１〜６であり、ＸはGly、
His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Phe、Ala、Glu、Ile、Thr、Asp、Asn、Gl
n、Arg、Cys、およびProからなる群から選ばれる）を含む複数もしくは交互ヒス
チジン残基の組み合わせを含むスペーサードメインである。 X⁹は結合またはDである。ｎは少なくとも２である。］

【００４０】この態様において、アミノ酸配列、X²⁰-(X¹-Y-K-X²-X³-D-X⁴)_nは、リンキング
配列（X¹-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K）と連結する縦一列に連結した抗原性ドメイン-X¹-Y
-K-X²-X³-D-の複数コピーを表す。X⁴が結合であり、所望によりX⁴は抗原性ドメ
インの複数コピー間に挿入されたスペーサー基であってよいときは、抗原性ドメ
インは互いに直近にあってよい。リンキング配列は、配列：-X⁷-X⁸-D-X⁹-K（こ
こでX⁷およびX⁸はアミノ酸残基または結合であり、X⁹は結合またはアスパラギン
酸残基である）で示される単一エンテロキナーゼ開裂部位を含む。好ましい態様
において、X⁷、X⁸およびX⁹はそれぞれ独立してエンテロキナーゼで開裂可能な部
位DDDDK (配列番号3)を生じるアスパラギン酸残基であり、これは標的ペプチド
のアミノ末端の直近に位置することが好ましい。X⁵が結合であり、所望によりX⁵ がリンキング配列と抗原性ドメインの間に挿入されたスペーサードメインであっ
てよい場合は、抗原性ドメインの複数コピーはリンキング配列の直近にあってよ
い。X⁴およびX⁵がそれぞれ独立してスペーサードメインである場合は、各X⁴およ
びX⁵のアミノ酸残基は、同定ポリペプチドに１またはそれ以上の所望の特性をも
たらすことが好ましく、例えば、スペーサードメインのアミノ酸は同定ポリペプ
チドに所望のホールディングをもたらすことにより抗体に対する接近性を増大さ
せるように選ぶことができる。別の好ましい態様において、スペーサードメイン
X⁴およびX⁵のアミノ酸は、樹脂または他のマトリックス上の固定化金属イオンと
キレーティングすることができる複数または交互ヒスチジン残基の組み合わせの
ような所望の親和性特性をもたらすように選択してよい。さらに、これら所望の
特性を同定ポリペプチドの他の領域内に設計してよく、例えばX²およびX³で示さ
れるアミノ酸は、アフィニティ精製に用いるための所望のペプチドホールディン
グまたは所望のアフィニティ特性をもたらすように選んでよい。

【００４１】より好ましい態様において、同定ポリペプチドは抗原性ドメインの複数コピー
、単一エンテロキナーゼ開裂部位を含むリンキング配列を含み、一般的には下記
配列に対応する。 X²⁰-(D-Y-K-X²-X³-D)_n-X⁵-（D-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K)-X²¹ ［ここで、D、Y、およびKはその代表的アミノ酸である。 X²⁰およびX²¹は独立して水素または結合である。 X²、X³、X⁷、およびX⁸は、それぞれ独立してアミノ酸残基、好ましくは芳香族
アミノ酸残基および親水性アミノ酸残基からなる群から選ばれるアミノ酸残基、
より好ましくは親水性アミノ酸残基、さらにより好ましくはアスパラギン酸残基
である。 X⁵は結合、または結合でない場合は少なくとも１個のアミノ酸、好ましくはヒ
スチジン残基、グリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（ここで、
ｍは１〜６であり、ＸはGly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Phe、Met、
Ala、Glu、Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群から選ば
れる）を含む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含むスペーサード
メインである。 X⁹は結合またはアスパラギン酸残基である。ｎは少なくとも２である。］

【００４２】この態様において、アミノ酸配列X²⁰-(D-Y-K-X²-X³-D)_nは、リンキング配列（
D-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K)と連結する縦一列に並んだ抗原性ドメインD-Y-K-X²-X³-Dの
複数コピーを表す。この態様において、ある抗原性ドメインは別の抗原性ドメイ
ンの直近にあり（すなわち、介在スペーサードメインがない）、X⁵が結合である
ときは、抗原性ドメインの複数コピーはリンキング配列の直近にある。リンキン
グ配列は、配列-X⁷-X⁸-D-X⁹-K（ここで、X⁷およびX⁸は結合またはアミノ酸残基
、好ましくはアスパラギン酸残基であり、X⁹は結合またはアスパラギン酸残基で
ある）で示される単一のエンテロキナーゼで開裂可能な部位を含む。好ましい態
様において、X⁷、X⁸、およびX⁹はそれぞれ独立してアスパラギン酸残基であり、
好ましくは標的ペプチドのアミノ末端の近傍にあるエンテロキナーゼで開裂可能
な部位DDDDK (配列番号3)を生じる。所望により、X⁵が少なくとも１個のアミノ
酸残基であるときは、抗原性ドメインの複数コピーはスペーサーX⁵によりリンキ
ング配列と連結する。X⁵がスペーサードメインであるときは、X⁵のアミノ酸残基
が同定ポリペプチドに１またはそれ以上の所望の特性をもたらすことが好ましく
、例えば、スペーサードメインのアミノ酸は、同定ポリペプチドに所望のホール
ディングをもたらすことにより抗体に対する接近性が増大するように選んでよい
。別の好ましい態様において、スペーサードメインのアミノ酸は、樹脂または他
のマトリックス上の固定化金属イオンとキレーティングすることができる複数ま
たは交互ヒスチジン残基の組み合わせにような望ましいアフィニティ特性をもた
らすように選んでよい。さらに、これら所望の特性は同定ポリペプチドの他の領
域中に設計してよく、X²およびX³で示されるアミノ酸は、アフィニティ精製に用
いるための望ましいペプチドホールディングまたは所望のアフィニティ特性をも
たらすように選んでよい。

【００４３】同定ポリペプチドが標的ペプチドのアミノ末端に位置するときは、イニシエー
ターのメチオニンが存在するように同定ポリペプチドのアミノ酸配列を設計する
ことが望ましい。したがって、本発明の好ましい態様において、同定ポリペプチ
ドは抗原性ドメインの複数コピー、単一エンテロキナーゼ開裂部位を含むリンキ
ング配列を含み、一般に以下の配列に対応する。 X²⁰-X¹⁰-(D-Y-K-X²-X³-D)_n-X⁵-(D-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K)-X²¹ ［ここで、D、Y、およびKはその代表的アミノ酸である。 X²⁰およびX²¹は独立して水素または結合である。 X¹⁰は結合またはアミノ酸であり、結合でないときはメチオニン残基であるこ
とが好ましい。 X²、X³、X⁷、およびX⁸は、それぞれ独立してアミノ酸残基、好ましくは芳香族
アミノ酸残基および親水性アミノ酸残基からなる群から選ばれるアミノ酸残基、
より好ましくは親水性アミノ酸残基、さらにより好ましくはアスパラギン酸残基
である。 X⁵は結合、または結合でない場合は少なくとも１個のアミノ酸、好ましくはヒ
スチジン残基、グリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（ここで、
ｍは１〜６であり、ＸはGly、His、Tyr、Trp、Val、-Leu、-Ser、-Lys、-Phe、-
Met、Ala、Glu、Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群か
ら選ばれる）を含む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含むスペー
サードメインである。 X⁹は結合またはアスパラギン酸残基である。ｎは少なくとも２である。］

【００４４】この態様において、アミノ酸配列、X²⁰-(D-Y-K-X²-X³-D)_nは、リンキング配列
(D-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K)およびイニシエーターアミノ酸X¹⁰、好ましくはメチオニ
ンと側面を接する縦に一列に並んだ抗原性ドメインD-Y-K-X²-X³-Dの複数コピー
を表す。イニシエーターのメチオニンを有する抗原性ドメインD-Y-K-X²-X³-DはM
5抗体により認識される。この態様において、ある抗原性ドメインは別の抗原性
ドメインの直近にあり（すなわち、介在スペーサードメインなし）、X5が結合で
あるとき、抗原性ドメインの複数コピーはリンキング配列の直近にある。リンキ
ング配列は、アミノ酸配列-X⁷-X⁸-D-X⁹-K（ここで、X⁷およびX⁸は結合またはア
ミノ酸残基、好ましくはアスパラギン酸残基であり、X⁹は結合またはアスパラギ
ン酸残基である）で示されるエンテロキナーゼで開裂可能な部位を含む。好まし
い態様において、X⁷、X⁸、およびX⁹はそれぞれ独立してアスパラギン酸残基であ
り、好ましくは標的ペプチドのアミノ末端近傍にあるエンテロキナーゼで開裂可
能な部位 DDDDK (配列番号3)を生じる。所望により、X⁵が少なくとも１個のアミ
ノ酸残基であるとき、抗原性ドメインの複数コピーはスペーサードメインX⁵によ
りリンキング配列と連結する。X⁵がスペーサードメインであるときは、X⁵のアミ
ノ酸残基は同定ポリペプチドに１またはそれ以上の所望の特性をもたらすことが
好ましく、例えばスペーサードメインのアミノ酸は同定ポリペプチドに所望のホ
ールディングをもたらすことにより抗体に対する接近性を増大させるように選ん
でよい。別の好ましい態様において、スペーサードメインのアミノ酸は樹脂また
は他のマトリックス上の固定化金属イオンとキレーティングすることができる複
数または交互ヒスチジン残基の組み合わせのような所望のアフィニティ特性をも
たらすように選んでよい。さらに、これら所望の特性は同定ポリペプチドの他の
領域中に設計してよく、X²およびX³で示されるアミノ酸はアフィニティ精製に用
いるための望ましいペプチドホールディングまたは所望のアフィニティ特性をも
たらすように選んでよい。

【００４５】本発明の別の態様において、同定ポリペプチドは抗原配列の複数コピー、単一
エンテロキナーゼ開裂可能部位を含むリンキング配列を含み、一般的に配列に対
応する： X²⁰-(D-X¹¹-Y-X¹²-X¹³)_n-X¹⁴-(D-X¹¹-Y-X¹²-X¹³-D-X¹⁵-K)-X²¹ ［ここで、D、Y、およびKはその代表的アミノ酸である。 X²⁰およびX²¹は独立して水素または結合である。各X¹¹は結合、またはアミノ酸残基、好ましくはＬである。各X¹²は、好ましくは芳香族アミノ酸残基および親水性アミノ酸残基からなる
群から選ばれるアミノ酸、より好ましくは親水性アミノ酸残基、さらにより好ま
しくはアスパラギン酸残基である。各X¹³は結合、または結合以外であるときは好ましくは芳香族アミノ酸残基お
よび親水性アミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸、よ
り好ましくは親水性アミノ酸残基、さらにより好ましくはアスパラギン酸残基で
ある。 X¹⁴は結合、または結合以外であるときは好ましくはヒスチジン残基、グリシ
ン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（ここで、ｍは１〜６であり、Ｘ
はGly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Phe、Met、Ala、Glu、Ile、Thr、
Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群から選ばれる）を含む複数もし
くは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含むスペーサードメインである。 X¹⁵は結合またはアスパラギン酸残基である。ｎは少なくとも２である。］

【００４６】この態様において、アミノ酸配列X²⁰-(D-X¹¹-Y-X¹²-X¹³)_nはリンキング配列(D
-X¹¹-Y-X¹²-X¹³-D-X¹⁵-K)と連結した縦一列に並ぶ抗原性ドメインD-X¹¹-Y-X¹²-X ¹³ の複数コピーを表す。さらに、１つの抗原性ドメインは別の抗原性ドメインの
直近にあり（すなわち、介在スペーサードメインなし）、そしてX¹⁴が結合であ
るときは、抗原性ドメインの複数コピーはリンキング配列の直近にある。該リン
キング配列は、配列：-X¹²-X¹³-D-X¹⁵-K（ここで、X¹²およびX¹³は結合またはア
ミノ酸残基、好ましくはアスパラギン酸残基であり、X¹⁵は結合またはアスパラ
ギン酸残基である）で示される単一エンテロキナーゼ開裂可能な部位を含む。好
ましい態様において、X¹²、X¹³、およびX¹⁵はそれぞれ独立してアスパラギン酸
残基であり、好ましくは標的ペプチドのアミノ末端の近傍にあるエンテロキナー
ゼで開裂可能な部位 DDDDK (配列番号3)を生じる。所望により、抗原性ドメイン
の複数コピーは、X¹⁴が少なくとも１個のアミノ酸残基であるときはスペーサーX ¹⁴ によりリンキング配列と連結する。X¹⁴がスペーサードメインであるときは、X ¹⁴ のアミノ酸残基は同定ポリペプチドに１またはそれ以上の所望の特性をもたら
し、例えば、スペーサードメインのアミノ酸は同定ポリペプチドに所望のホール
ディングをもたらし、抗体に対する接近性を増大させるように選んでよい。別の
好ましい態様において、スペーサードメインX¹⁴のアミノ酸は所望のアフィニテ
ィ特性、例えば樹脂または他のマトリックス上で固定化金属イオンとキレーティ
ングすることができる複数または交互ヒスチジン残基の組み合わせをもたらすよ
うに選んでよい。

【００４７】標的ペプチド本発明によれば、標的ペプチドは形質転換宿主細胞中に発現することができる
あらゆるタンパク質様物質を含んでいてよい。したがって、本発明は、形質転換
宿主細胞中でベクターにより発現させることができるあらゆる原核性もしくは真
核性の単純もしくはコンジュゲートタンパク質を実質的に生成するのに好都合に
用いてよい。そのようなタンパク質には酵素、酸化還元酵素、トランスフェラー
ゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼが含まれる。

【００４８】本発明は、貯蔵タンパク質、例えばフェリチンもしくは卵白アルブミン、また
は輸送タンパク質、例えばヘモグロビン、血清アルブミンもしくはセルロプラス
ミンの生成も予期させる。収縮および運動系に作用するタイプのタンパク質、例
えばアクチンおよびミオシンも含まれる。

【００４９】本発明は、防御または防衛機能に役立つタンパク質、例えば血液タンパク質フ
ィブリノーゲンの生成も予期する。他の防御タンパク質には、結合タンパク質、
例えば抗原と結合して中和する抗体または免疫グロブリンが含まれる。

【００５０】本発明により産生されるタンパク質には、種々のホルモン、例えばヒト成長ホ
ルモン、ソマトスタチン、プロラクチン、エストロン、プロゲステロン、メラノ
サイト、サイロトロピン、カルシトニン、ゴナドトロピン、およびインスリンも
含まれてよい。他のそのようなホルモンには、免疫系に関与する同定されたもの
、例えばインターロイキン１、インターロイキン２、コロニー刺激因子、マクロ
ファージ活性化因子、およびインターフェロンが含まれる。

【００５１】本発明は毒性タンパク質、例えばトウゴマ由来のリシン、または綿亜麻仁由来
のゴシピンの生成にも応用できる。

【００５２】構造的要素として役立つタンパク質を本発明により生成してよく、そのような
タンパク質には繊維性タンパク質コラーゲン、エラスチン、およびα−ケラチン
が含まれる。他の構造タンパク質には糖タンパク質、ウイルスタンパク質、およ
びムコタンパク質が含まれる。

【００５３】上記天然タンパク質に加えて、本発明は、あらゆる非天然のアミノ酸配列とし
て一般的に定義される合成タンパク質を生成するのに用いてよい。

【００５４】先に同定された種々のタイプのタンパク質をコードする遺伝子は、種々の原核
性または真核性供給源、例えば植物もしくは動物細胞または細菌細胞から得てよ
い。該遺伝子は標準的なよく知られた技術を用いてこれら細胞の染色体物質また
は原核細胞のプラスミドから単離することができる。多くの種々のタンパク質分
子をコードする遺伝子を有する種々の天然および合成のペプチドについては種々
の供給源からの市販品を利用できない。所望のDNAは、酵素逆転写酵素を用いて
ｍRNAから生成することもできる。この酵素はRNAの鋳型からDNAの合成を可能に
する。

【００５５】 DNA発現ベクターの製造本発明によれば、標的ペプチドをコードする遺伝子が単離もしくは合成される
か、または他の方法で得られたら、同定ポリペプチドをコードする合成DNA断片
と連結する。同定ポリペプチド遺伝子はよく知られた技術により合成してよい。同定ポリペ
プチドの選択した組成物について、同定ポリペプチドの所望のアミノ酸をコード
するDNAオリゴマーは、当該分野でよく知られた方法で、市販の自動DNA合成装置
を用いて合成してよい。DNAを合成するための技術および装置は当該分野で一般
的で知られており、これを実施するための説明および詳細は本明細書に完全には
記載しない。実質的に、本方法は、合成オリゴヌクレオチド対を得、それを適切
な制限エンドヌクレアーゼで消化することを含む。これにより同定ポリペプチド
タグをコードする正しいヌクレオチド配列が生成される。消化後、コーヘシブな
(cohesive)、すなわち「突出末端」を有する種々のDNA断片が形成される。その
ような構築を行うには多くの方法があるが、好ましい態様には縦一列に並ぶ複数
FLAG(登録商標)エピトープ配列またはその変形物が含まれる。

【００５６】同定ポリペプチドの構築に用いるオリゴヌクレオチド対は天然であるかまたは
合成的に生じるものであってよい。特異的なオリゴヌクレオチド対は、所望の同
定ポリペプチドタグのアミノ酸配列を生成するように合成的に生成されたものが
一般的に好ましい。各オリゴヌクレオチドの鎖を一緒にアニールし、適切な制限
エンドヌクレアーゼ、例えばEcoRIおよびHind IIIで消化する。ヌクレオチドカ
セットを消化および作製後、DNAシーケンシングにより配列を確認する。

【００５７】後述するように、同定ポリペプチドをコードする合成DNAオリゴマーを所望の
タンパク質をコードするDNA配列と結合させ、次いで結合DNA断片を適切な発現ベ
クターと結合させて適切な宿主細胞に形質転換するためのクローニングビークル
を形成させてよい。

【００５８】標的ペプチド遺伝子および同定ポリペプチド遺伝子に加えて、必要であればハ
イブリッドDNA断片は宿主細胞中で高レベルにタンパク質を翻訳するためのリボ
ソーム結合部位、翻訳開始コドン（ATG）、およびプロモーターを含んでいてよ
い。

【００５９】一般的に、標的ペプチドおよび同定ポリペプチドをコードする遺伝子は、理想
的には適切な制限酵素で処理されるか、または他の方法で、互いのそしてプラス
ミドもしくは他のタイプのクローニングベクターとのライゲーションを促がすた
めに突出末端を有するように操作される。クローニングベクターは、好ましくは
外来遺伝子と結合する前に外来遺伝子に相補的な突出（cohesive）末端（すなわ
ち、「突出（sticky）末端」を形成させるのに用いるのと同じ制限エンドヌクレ
アーゼで消化される。あるいはまた、ある種の制限酵素（例えばPvu II、Bal I
）を用いることにより、一般的には「スクウェア（square）」または「平滑末端
」と呼ばれる相補的な突出配列を持たない末端を形成してよい。プラスミドのス
クウェア末端を適切なリガーゼを用いて外来遺伝子と連結することができる。さ
らに、種々の技術を用いて平滑末端の核酸を操作して突出末端を形成するか、例
えばリンカー分子を用いてヌクレオチド塩基を加えるか、または適切な酵素を用
いてフラッシュ末端からヌクレオチド塩基を除去してよい。これを達成するため
の方法と物質（材料）は当該分野でよく知られている。

【００６０】 PCRは既知遺伝子（平滑または突出部位内の）をクローニングするのに有効な
道具でもある。プライマーは25〜40塩基の既知配列をコードすることができ、得
られたPCR生成物を、T4 DNAポリメラーゼを用いてあらゆる考えられる3'側のオ
ーバハングを除去することにより平滑末端を有する消化ベクターにクローンする
ことができる。PCR反応を用いて配列を連結する別の方法は、増幅DNAの末端に制
限部位を生成することである。この制限部位は増幅に用いるプライマーの5'末端
に容易に付加される。精製PCR生成物の消化により適合性末端を有する他のDNAと
結合するための末端が生じる。

【００６１】制限エンドヌクレアーゼで選択されたプラスミドを消化することにより２また
はそれ以上のDNA断片が形成されることは予期されよう。クローニングベクター
を形成するのに用いる断片、すなわち表現型的に同一な遺伝子、レプリコンおよ
び他の所望の成分を有する断片を、ゲル電気泳動のようなよく知られた技術によ
り同定することができよう。

【００６２】得られるクローニングベクターを用いて宿主微生物を形質転換する。形質転換
体を単離し、外来遺伝子の存在と、該遺伝子がベクター内で適切な方向にあるか
について分析する。次に、形質転換体を培養中で増殖させ、ベクターを複製させ
て求めるハイブリッドポリペプチドを高レベルの発現を得る。さらに、クローニ
ングベクターを用いてヘテロローガスなハイブリッドポリペプチドを大規模に産
生するために選択した他の宿主系または他のタイプの宿主を形質転換してよい。
組換えベクターを作製し、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、該ベクターを複
製し、ポリペプチドおよびタンパク質を発現させる種々の手順および方法はOld
およびPrimrose, Principles of Gene Manipulation, (第２版、1981)に記載さ
れている。

【００６３】本発明を実施するには種々のクローニングベクターを利用してよい。プラスミ
ドを用いるのが好ましいが、ベクターはバクテリオファージやコスミッドであっ
てよい。哺乳動物または宿主細胞中でクローニングを行う場合はウイルスをベク
ターに用いてよい。プラスミドを用いる場合は天然の供給源から得るか、または
人工的に合成してよい。選択した特定のプラスミドは、宿主として用いる特定の
細胞、Escherichia coli (E. coli)のような細菌、酵母、または他の単細胞微生
物と適合性でなければならない。プラスミドは選択した特定の宿主細胞のための
適切な複製起点（レプリコン）を持たなければならない。

【００６４】さらに、プラスミドのサイズは標的ペプチドと同定ポリペプチドの両方をコー
ドするハイブリッド遺伝子を保持するのに十分で、可能な限り低分子でなければ
ならない。低分子はせん断による損傷に対してより抵抗性であり、宿主細胞から
より容易に単離される。天然の供給源から得る場合は、通常複数コピーとして存
在するので、単離が容易になる。低分子量プラスミドは制限エンドヌクレアーゼ
に対する複数の基質部位を持つ可能性も低い。

【００６５】プラスミドクローニングベクターに対する別の必要条件は、レプリコンの不活
化を生じることなく続いて外来遺伝と結合させるために適切な制限酵素でプラス
ミドを開裂することができるような制限部位が存在することである。このために
はプラスミドが多数の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の基質部位を有する
ことが有用であろう。

【００６６】上記のごとく、同定ポリペプチドの複数抗原性ドメイン間にはアミノ酸スペー
サードメインが介在していてよい。これらスペーサードメインの設計において特
定のアミノ酸を示すトリプレットDNA配列（すなわちコドン）を変化させること
により、コードされる同定ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなくそ
の設計された配列を認識し、開裂させる酵素に対する複数の制限酵素部位を作製
することが可能である。複数の制限部位がDNAベクターと標的ペプチドをコード
するDNA配列の両方に存在する可能性を減らすために、認識部位中に最小６塩基
を有する制限酵素に対する認識部位をコードする配列を用いることが好ましい。

【００６７】同様に、リンキング配列を用いて、標的ペプチドをコードするDNA配列を同定
ポリペプチドの複数の抗原性ドメインをコードするDNA配列と結合する。リンキ
ング配列の設計において特定のアミノ酸を示すトリプレットDNA配列を変化させ
ることにより、コードされた同定ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させること
なく設計したそれらの配列を認識し、開裂させる酵素に対する制限部位を作製す
ることができる。制限部位に最小６塩基を有する制限酵素の認識部位をコードす
る配列を使用するのが好ましく、これにより複数の制限酵素開裂可能部位がベク
ターと標的ペプチドをコードする配列の両方に存在する可能性が減少する。さら
に、プラスミドは、形質転換宿主細胞が形質転換されていない細胞から簡単に同
定および分離できるように表現型的特性を持つ必要がある。そのような表現型的
選択遺伝子には、成長阻害物質、例えば抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子
を含めることができる。種々の抗生物質、例えばテトラサイクリン、ストレプト
マイシン、サルファ剤、ペニシリン、およびアンピシリンに耐性な遺伝子を含む
プラスミドは広範には利用可能ではない。宿主細胞がこれら抗生物質の１つを含
む培地中で増殖すると、適切な抗生物質耐性遺伝子を有する形質転換体のみが生
存するであろう。

【００６８】形質転換宿主細胞を同定するのに成長阻害化合物に対する耐性遺伝子を利用す
る以外に、表現型選択遺伝子は、宿主細胞に必要な成長因子を欠く培地中で形質
転換細胞が増殖できるように成長因子をもたらす遺伝子を含むこともできる。例
えば、酵母栄養要求体のためのそのような成長因子にはトリプトファンやロイシ
ンが含まれる。

【００６９】あるいはまた、シグナルペプチドをコードするDNA配列が同定ポリペプチドお
よび標的ペプチドをコードする配列と連結することが好ましい。分泌シグナル配
列を用いることにより、形質転換宿主細胞を容易に同定し、形質転換されていな
い細胞から分離することもできよう。分泌シグナルはほとんどの種で比較的短く
、一般に16〜40アミノ酸を含む。さらに、細菌または真核性遺伝子由来のシグナ
ル配列は機能が高度に保存されている。これらシグナルペプチドをコードするDN
A配列は高度に保存されているが、これらシグナル配列の多くは互換性であるこ
とが示された。Grey, G. L.ら, Gene 39: 247 (1985)参照。

【００７０】組換えプラスミドの形質転換所望のハイブリッドポリペプチドをコードする適切なDNAベクターが構築され
たら、ベクターを所望の宿主細胞内に導入する。宿主細胞はあらゆる適切な原核
細胞または真核細胞であってよいが、よく定義された細菌、例えばE. coliや酵
母株が好ましい。そのような両宿主は容易に形質転換され、発酵培養中で急速に
増殖することができる。E. coliの代わりに、他の単細胞微生物、例えば真菌お
よび藻類を用いることができる。さらに、E. coliを、サルモネラや肺炎球菌の
ような他の形の細菌に置き換えてもよい。どんな宿主を選ぶにせよ、組換えプラ
スミドを開裂する制限酵素を含まず、表現型を発現するのに必要な生化学的経路
、およびハイブリッドポリペプチドを適切に発現させるための他の機能を有する
制限酵素を含まない宿主であるべきである。

【００７１】 DNA分子を当該分野で知られた標準的プロトコールを用いて原核性および真核
性宿主にトランスフェクトする。簡単には、原核性宿主細胞を塩化カルシウム溶
液で処理してコンピテントにする（コンピテント細菌細胞は市販のものを利用で
き、実験室でも容易に作製される）。この処理は細菌細胞によるDNAの取込みを
可能にする。細菌細胞にDNAを導入する別の手段は、電気パルスを用いて細菌細
胞によるDNAの取込みを可能にするエレクトロポーレーションである。同様に、
酵母および高等真核生物を含む真核性宿主にDNA分子を導入するには、通常、標
準的プロトコール、例えばリン酸カルシウム-DNA共沈殿、DEAE-デキストラン介
在トランスフェクション、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクショ
ン、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、粒子衝撃（
例えばバイオリスティクス（biolistics)）を用いる。

【００７２】形質転換プロトコールでは細胞によるプラスミドの取込みが限られるため宿主
細胞の小部分のみが実際に形質転換される。すなわち、形質転換体を単離する前
に、典型的には形質転換プロトコールに用いる宿主細胞を適切な培地中で増殖さ
せる。実際に形質転換された細胞は、抗生物質のような表現型同定物質を含む適
切な成長培地を含む寒天平板上に元培養を接種することにより同定することがで
きる。適切な耐性遺伝子を有する該細胞のみが生存するであろう。生存するコロ
ニーの細胞を溶解し、次いで溶解物からプラスミドを単離することができる。こ
のようにして単離したプラスミドは、同時に統合された遺伝子が正しい方向に結
合しているかを決定するために、制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いでゲル
電気泳動するか、または両方の他の標準的方法により特徴付けることができる。
形質転換細胞が同定されたら、確立された技術、例えば発酵により増殖させるこ
とができる。さらに、回収したクローン化組換えプラスミドを用いて、他の細菌
株や他の種類の宿主細胞を形質転換し、ハイブリッドポリペプチドを大規模に複
製および発現させることができる。

【００７３】ハイブリッドポリペプチドの精製形質転換宿主細胞により発現したハイブリッドポリペプチド分子は、好ましく
はアフィニティクロマトグラフィー法により培養液、他の細胞物質などから単離
される。このためには、カラムマトリックスに用いるための、ハイブリッドポリ
ペプチドの同定ポリペプチドの抗原性ドメインに対する抗体を作製する必要があ
る。そのような抗体を作製するには、最初に同定ポリペプチドを合成し、次いで
これを用いて適切な動物を免疫して同定ポリペプチドに対する抗体を産生する。
そのような抗体産生方法は米国特許4,851,341に開示されている（この内容は本
明細書の一部を構成する）。抗体は酵素免疫測定法(ELISA)または他の適切なア
ッセイにより同定することができる。次に、ハイブリドーマ技術によりモノクロ
ーナルを作製することができる。好ましい抗体はFLAG(登録商標)モノクローナル
抗体M1、M2、およびM5である。精製後、抗体をカラムマトリックスに結合させ、
次いで形質転換宿主細胞由来抽出物をカラムにかけてハイブリッドポリペプチド
を単離する。例えば、遊離同定ポリペプチドからの競合によりハイブリッドポリ
ペプチドをカラムから溶出する。

【００７４】さらに、同定ポリペプチドがヒスチジン、グリシン、または複数もしくは交互
ヒスチジン残基の組み合わせを含む場合は、Immobilized Metal Ion Affinity C
hromatography（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー、IMAC）を
別の標的ペプチドの単離および精製法として用いる。標的ペプチドおよび同定ポ
リペプチドを含むハイブリッドポリペプチドを生成し、固定化金属イオンを含む
カラムを通すと、ハイブリッドポリペプチドは固定化金属イオンとキレートする
であろう。該ハイブリッドポリペプチドが他の物質から単離されるように十分な
時間、該ハイブリッドポリペプチドを固定化金属イオンとキレートさせるべきで
ある。ハイブリッドポリペプチドが金属イオン樹脂と結合したら、ハイブリッド
ポリペプチドを、それが結合した金属イオン結合リガンドのプロトン化により放
出させてよい。結合タンパク質を溶出するための当該分野で知られた一般的方法
である周囲緩衝媒質のpHを低下させることにより解離を達成する。次に、標的ペ
プチドをさらに本明細書に記載のごとく同定ポリペプチドから開裂させてよい。

【００７５】他の方法を用いて標的ペプチドを検出、モニター、または単離してよい。その
ような方法には、「Principles and Practice of Immunoassay」、PriceおよびN
ewman編, Stochton Press, 1991に記載の免疫沈降法やウエスタンブロッティン
グが含まれる。タンパク質混合物中の標的抗原を検出および定量するための鋭敏
で特異的な技術として免疫沈降法を用いることは当業者に知られている。Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual, 第２版, Maniatis, T.ら編 (1989) Cold S
pring Harbor Press参照。簡単には、同定ポリペプチドの抗原性ドメインと結合
することができる抗体、好ましくはFLAG(登録商標)モノクローナル抗体、M1、M2
、またはM5を用いる免疫沈降試験を用いて該タンパク質を検出してよい。既述し
たように、細胞を同定ポリペプチドで形質転換し、培養液中で増殖させ、次いで
溶解させて細胞が産生した標識タンパク質様物質溶液を得る。この溶液をモノク
ローナル抗体溶液とインキュベーションし、細胞中に形成された同定ポリペプチ
ド標識タンパク質と抗体とのあらゆる複合体を沈降により検討する。次に、タン
パク質／抗体複合体を沈降物から単離することができる。次いで、標識タンパク
質の存在を通常の分析法、例えばタンパク質／抗体複合体の解離条件下でSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動および蛍光間接撮影法を用いて確認する。

【００７６】さらに、ウエスタンブロッティングは標的ペプチドを検出するのに用いる別の
イムノアッセイ技術である。一般的に、少量の標的ペプチドをポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動し、次いでポリマーシートまたは膜に移す（ブロッティング
による）。次に、膜を、同定ポリペプチドの抗原性ドメインと結合する抗体、好
ましくはFLAG（登録商標）モノクローナル抗体とインキュベーションする。次に
、抗体-抗原を含む膜を第一抗体と特異的な第二標識抗体とインキュベーション
する。同定ポリペプチドで標識したタンパク質をオートラジオグラフィのような
知られた方法により検出および可視化してよい。

【００７７】精製ハイブリッド同定ポリペプチド／タンパク質分子からの成熟タンパク質の分
離アフィニティカラムまたはマトリックスと結合したまま除去しないかぎり、同
定ポリペプチドをタンパク質分子から開裂させ、該タンパク質分子を同定ポリペ
プチドから分離し、次いで精製タンパク質を得てよい。これは、最初にハイブリ
ッド同定ポリペプチド／タンパク質分子を緩衝液に懸濁することにより達成され
る。次いで、同定ポリペプチドのリンキング部分を含むアミノ酸残基に特異的な
タンパク質分解酵素または他の化学的タンパク質分解剤を懸濁液に加える。精製
物溶液に酵素が混入するのを防ぐために酵素をゲルマトリックスとカップリング
させてよい。既述のごとく、タンパク質分解酵素や化学的タンパク質分解剤は、
同定ポリペプチドとタンパク質分子のリンキング部分の近傍アミノ酸残基間のハ
イブリッドポリペプチドを開裂させる。さらに既述のごとく、非限定的例として
、該リンキングアミノ酸は配列：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (配列番号3)を含んでい
てよい。この特定のアミノ酸配列は、ウシ粘膜エンテロキナーゼの基質であるタ
ンパク質トリプシノーゲン中に天然に生じることが知られているだけである。す
なわち、この特定アミノ酸配列を用いるハイブリッド同定ポリペプチドタンパク
質分子の酵素開裂がタンパク質分子自身の開裂も生じるとは非常に考えにくい。

【００７８】インキュベーション後、所望のタンパク質を以下のごとく精製する。タンパク
質分解剤がゲルマトリックスに結合した酵素であれば、懸濁液を遠心し、ペレッ
ト（酵素-ゲルコンジュゲートを含む）を捨てる。上清は、緩衝剤の塩と、タン
パク質生成物、開裂同定ポリペプチド、およびおそらく少量の非開裂ペプチド／
タンパク質分子のみを含む。化学的開裂剤の場合は、ゲル遠心工程がなく、該溶
液は、タンパク質生成物、同定ポリペプチド、および少量の非開裂ペプチド／タ
ンパク質分子に加えて、残留化学物質および該化学物質の副産物を含むであろう
。

【００７９】上記混入物質のほとんどはタンパク質生成物よりはるかに小さく、単純な方法
、例えばゲルろ過や透析により効率的に除去することができる。そのような工程
後には非開裂同定ポリペプチド／タンパク質分子のみがタンパク質生成物に混入
したままであろう。タンパク質生成物からポリペプチド／タンパク質分子を除去
するには、最初の生成培地からペプチド／タンパク質分子を除去するのに用いた
のと同じ同定ポリペプチドに特異的な抗体が結合した第二アフィニティカラムに
混合物を通す。抗体は不必要なポリペプチド／タンパク質分子を結合し、カラム
からの溶出液はすべての夾雑（混入）物を含まず所望の生成タンパク質のみを含
む。

【００８０】タンパク質分解による開裂に可溶性酵素を用いる場合は、タンパク質生成物は
少量の酵素を含むことがあり、これは、溶液を酵素の固定化基質を含むアフィニ
ティカラムを通すことにより除去することができる。それによって酵素はカラム
に結合し、所望のタンパク質分子は通過する。

【００８１】既述のごとく、いくらかのタンパク質生成物は、まだ同定ポリペプチドが結合
しており、所望の酵素活性を有するであろう。結果として、同定ポリペプチドは
タンパク質分子から開裂する必要はなく、上記の開裂とそれに続く精製工程を行
う必要がない。さらに、同定ポリペプチドがタンパク質分子と結合したままの状況では同定ポ
リペプチドのリンキング部分は必要ない。その代わり、同定ポリペプチドは抗原
性ドメインのみを含むことができる。この状況下では上記DNA発現ベクターの構
築および製造方法を適切に修飾することができる。以下の実施例は例示のためであって本発明を何ら限定するものではない。

【００８２】（実施例）実施例1 : p3XFLAG-CMV-7の構築材料と方法 P3XFLAG-CMV-7の構築 P3XFLAG-CMV-7を哺乳動物発現ベクターpCMV-5から構築した。トリプレットFLA
G配列を２対の相補的オリゴヌクレオチドから構築した。最初のオリゴヌクレオ
チド対を以下のごとく合成した: 5'GAAGAATTCACCATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGAT3' (配列番号8)、
および 5'ATCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGAATTCTTC3' (配列番号9)。
第二対は以下の配列を用いて合成した： 5'GAAGATATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGCTTGGG3'(配列番号10)、および 5'CCCAAGCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGATATCTTC3' (配列番号11)。第一オリゴヌクレオチド対を一緒にアニールし、EcoR Iで消化した。第二オリ
ゴヌクレオチド対を一緒にアニールし、EcoR VおよびHind IIIで消化した。２対
の消化ヌクレオチドカセットをCMV-5中に連結し、これをEcoR IおよびHind III
で二重に消化した。配列をDNAシーケンシングにより確認した。

【００８３】 pFLAG-CMV7-BAPの構築成熟酵素のリーダー配列とN末端の４アミノ酸が欠失してるF. coli pho A遺伝
子の修飾バージョンをベクターp3XFLAG-CMV-7中にサブクローンした。修飾配列
をHind IIIおよびBgl IIによる二重消化によりpFLAG-ATS-BAPから切り出した。
次に、断片をHind IIIおよびBam HIで二重消化したp3XFLAG CMV-7中にクローン
し、p3XFLAG CMV-7-BAPを得た。phoAコーディング領域のN末端のヌクレオチド配
列を確認した。

【００８４】トリプレットFLAG-ATS-BAPの構築トリプレットFLAG配列のセンスおよびアンチセンス鎖をコードするオリゴヌク
レオチドを合成し、T4ポリヌクレオチドキナーゼで5'リン酸化し、一緒にアニー
ルした。pFLAG-ATS-BAPをNde IおよびHind IIIで消化し、ベクターをゲル電気泳
動で精製した。アニールしたカセットを、T4 DNAリガーゼで二重消化したpFLAG-
ATS-BAPベクターと結合させ、反応を一夜、16℃で16時間行った。Nru I消化によ
り結合を強化し、次いで E. coli DH5α中に形質転換した。クローンを単離し、
シーケンシングにより確認した。

【００８５】結果出願人は、縦一列に並んだ3XFLAG配列を含むFLAG発現系の修飾バージョンを用
いて哺乳動物宿主細胞中でタンパク質を発現させるためのベクターを構築した（
図１）。この構築物は哺乳動物宿主細胞中で発現したタンパク質の検出限界を改
善するために設計した。最初の２flagペプチドは修飾FLAG配列である。最初のFL
AG（登録商標）エピトープはAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (配列番号1)で
あり、最初の２flag認識配列は２配列間にGlyまたはIleスペーサー配列を有する
Asp-Tyr-Lys Asp-His-Asp (配列番号12)である。これら交互配列は、種々の結
合モチーフを決定するファージ表現試験から生じる。Miceliら, J. Immunologic
al Methods 167: 279-287 (1994)参照。これにより、余分なエンテロキナーゼ認
識／開裂可能部位を付加することなくさらなるFLAG抗体結合部位を導入すること
ができる。

【００８６】 p3XFLAG-CMV-7発現ベクターは、多くの哺乳動物細胞系中でクローン化遺伝子
を構成性に発現させるのに必要なヒトサイトメガロウイルスプロモーター領域を
含む。Kozakコンセンサス配列は、種々のクローニング戦略を可能にする複数ク
ローニング部位と共に該ベクター中に提供される。複数クローニング部位は他に
存在するCMV哺乳動物発現ベクターと適合性である。さらに、発現ベクターは、
効率的な高レベルの一時的発現のためのSV40の複製起点と転写終止配列とポリア
デニル化シグナルを含むヒト成長ホルモン由来のDNA断片を含む。p3XFLAG CMV-7
は、E. coli中のプラスミドを選択するためのβ-ラクタマーゼ遺伝子を含む。

【００８７】実施例2: p3XFLAG-ATS-BAPの細菌における発現とタンパク質の精製材料と方法 E. coli BL21 (DE3)を、実施例１の方法に従って作製したトリプレットFLAG B
AP構築物を含む発現プラスミドで形質転換した。細胞を37℃で攪拌しながら100
μg/mlアンピシリン含有のテリフィックブロス中で増殖させた。培養をOD₆₀₀= 4
.0まで増殖させ、次いで最終濃度1mMのIPTGで誘導した。細胞培養をさらに37℃
で3時間増殖させ、次いで遠心して回収した。細胞ペレットを50mM Tris-HCl（pH
8.0）に再懸濁し、細胞を超音波処理して破壊し、次いで遠心して細胞屑を除去
した。上清を、50mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl (TBS)で平衡化したM2アフィ
ニティゲルに適用した。樹脂を20ベッド容量のTBSで洗浄し、次いでトリプレッ
トFLAG BAPを５カラム容量の0.1 Mグリシン pH 3.5で溶出した。溶出タンパク質
をプールし、1.0 M Tris-HCI pH 8.0でｐH7.5に調整した。タンパク質含量をBra
dfordおよびε280=0. 7ml/mgを用いる吸光度の両方により決定した。

【００８８】ウエスタンブロット精製3XFLAG-BAPおよびN-BAPを2X Laemlli緩衝液を用いて分離させ、５分間沸
騰させ、次いで氷上に置いた。試料をLaemlli (Laemli, V., Nature, 227: 680-
685 (1970))の方法を用い15% SDS-PAGEで分析し、次いでニトロセルロース膜に
移した。膜を3%無脂肪乾燥ミルクを含むリン酸緩衝生理食塩水で１時間ブロック
し、次いでTBS, 0.05% Tween 20 (TBS-T)で３回リンスした。膜をTBS-T中の最終
濃度10μg/mlのM2抗体とインキュベーションし、次いでTBS-Tで3回リンスした。
次に、膜をTBS-Tで1:10,000に希釈したヤギ抗ウサギIgG（全分子）ホースラディ
ッシュパーオキシダーゼ（HRP)と30分間インキュベーションし、次いでTBS-Tで
３回洗浄した。FLAG標識タンパク質をHRPコンジュゲートで検出し、露出時間１
〜30分間で製造業者の指示書に従ってECL (Amersham)およびKodak X-Omat MRフ
ィルムを用いる化学ルミネッセンス検出法により可視化した。

【００８９】結果トリプレットFLAG融合タンパク質が伝統的FLAT（登録商標）エピトープより鋭
敏な反応を誘導するかどうかを検討するため、細菌性アルカリホスファターゼの
トリプレットFLAGバージョンをE. coli中で発現させるために構築した。材料と
方法に記載のごとく、ベクターp3XFLAG-ATS-BAPをE. coli中に形質転換し、次い
で3XFLAG-BAPを発現させ、精製した。さらに伝統的FLAGS（登録商標）エピトー
プ：DYKDDDDK (配列番号1)を含むN-FLAG-BAPも発現させ、精製した。単一対トリ
プレットFLAG-BAP の感度の比較は、上記ウエスタンブロット分析により示した
。図４は、M2抗FLAG抗体でプローブし、化学ルミネセンスで検出した精製1本鎖
およびトリプレットflagのウエスタンブロットを示す。結果は、単一FLAG-BAP融
合タンパク質と比べてトリプレットFLAG-BAPの検出限界が10倍増加することを明
確に示している。出願人は、わずか１分間の暴露により精製3X Flag細菌アルカ
リホスファターゼの500 pgを検出できた。暴露時間が増すと、100pgの低さの検
出が達成されたが、バックグラウンドが増加した。出願人は、ドットブロットお
よびELISAアッセイにおいて少なくとも10倍検出が増大することも示した。

【００９０】実施例3: COS-7細胞中の3X細菌性アルカリホスファターゼの発現材料と方法 COS-7細胞のp3XFLAG-CMV-7-BAPによるトランスフェクション COS-7細胞を、10%ウシ胎児血清、4mM L-グルタミン、5μg/mlゲンタマイシン
を含むDulbeccoの改良Eagles培地(DME)を用い35mm²プレート上で培養した。細胞
を、5%CO₂の加湿CO₂インキュベーター中で37℃で増殖させた。p3XFLAG-CMV7-BAP
プラスミドのトランスフェクションを、製造業者の指示書に従ってLipofectamin
e (Life Technologies Inc., Gaithersburg MD.)を用いて達成した。ベクターDN
A 2μgをトランスフェクションに用いた。免疫染色をトランスフェクションの72
時間後に行った。

【００９１】免疫染色誘導の72時間後、細胞を50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl (TBS)で洗浄した
。細胞を1:1 (v/v)メタノール-アセトン混合物で１分間固定した。固定した細胞
をTBSで４回洗浄し、次いでTBS中の10μg/ml M2抗体-HRPコンジュゲートで１時
間インキュベーションした。細胞をTBSで５回洗浄し、M2抗体-HRPコンジュゲー
トを新たに調製したTBS中の0.01 mg/ml o-ジアニシジン、0.015%過酸化水素で可
視化した。細胞を約15分間染色した。

【００９２】結果 p3XFLAG-CMV-7-BAP (図2)を、材料と方法に記載のごとくCOS-7細胞にトランス
フェクションした。トランスフェクションして72時間後に、細胞を、抗FLAG M2
HRPコンジュゲートを用いる免疫染色により分析した。細胞の光学顕微鏡検査でM
2抗体を検出し、図３に示すようにo-ジアニシジンで可視化した。

【００９３】考察出願人は、検出感度が増大し、細胞内で発現するように設計された、縦一列に
並ぶ複数FLAG（登録商標）エピトープを含む哺乳動物発現プラスミドp3XFLAG CM
V-7を作製した。このベクターはCOS-7細胞中で効率的に発現するためのサイトメ
ガロウイルス(CMV)プロモーターおよびSV40複製起点を含む。さらに、E. coliか
ら発現し、精製したトリプレットFLAG標識BAPの検出を単一FLAG標識BAPと比較し
た。

【００９４】哺乳動物および細菌系でタンパク質を検出および精製するためにFLAG（登録商
標）エピトープタグを有効に用いた。出願人は、３つのFLAGエピトープの存在が
精製細菌性アルカリホスファターゼの検出限界を有意に増大させることを示した
。さらに、3X FLAG-BAPは、最初のFLAG（登録商標）ペプチドとの競合により抗F
LAG M2アフィニティゲルで溶出することができない。しかしながら、3XFLAG BAP
および1XFLAG-BAPは、3X FLAGペプチドを用いて抗FLAG M2アフィニティゲルから
競合的に溶出することができる。p3XFLAG-CMV-7ベクターは哺乳動物細胞中でヘ
テロローガスなタンパク質を発現させ、検出するために設計され、存在するpFLA
G-CMVベクターと適合性であり、単一FLAGおよびトリプレットFLAGを含むベクタ
ー間で容易にサブクローンすることができる。免疫染色の結果は、COS-7細胞中
のpho A遺伝子の発現は3X FLAG配列を加えても有意には混乱しないことを示す。

【００９５】 M2抗体は3X FLAG配列中の交互FLAGと反応する。反対に、M5抗体はM2抗体が示
す感度の増大を示さなかった。ファージ表現を用いる最近の結果は、M2結合およ
びM5結合のための重要な残基がわずかに異なることを示した。M2抗体は配列： A
sp-Tyr-Lys-XXX-XXX-Asp-XXX-XXX (配列番号13)を好むが、M5は、Asp-Tyr-XXX-X
XX-Asp-Asp-XXX-XXX (配列番号14)を好む。トリプレットFLAG配列：Asp-Tyr-Lys
-Asp-His-Asp (配列番号12)はM2抗体の結合においてM5抗体またはM1抗体の結合
より明らかに好ましい。

【００９６】実施例4: 複数FLAGエピトープに対するFLAG M2抗体の結合分析材料と方法 FLAGエピトープと結合するM2抗体の熱力学的分析を、OMEGA熱量計(Microcal)
を用いる等温滴定測定法により測定した。すべての試料を0.05%アジ化ナトリウ
ムを含むPBSに対して透析し、測定前に脱気した。すべての測定は25℃で行った
。M2抗体の濃度は用いる試料に応じて15〜50μMであった。滴定剤の濃度は、1X
BAPについては605μM、1X FLAGペプチドについては1110μM、3X BAPについては4
00μM、および3X FLAGペプチドについては580μMであった。4〜11μLの範囲の注
入容量でベースラインが達成されるのに十分なように2.5〜3.0分毎に注入を行っ
た。注入は、400rpmで攪拌しながら４〜10秒かけて行った。

【００９７】データ分析および適合はMicroCal供給のOriginソフトウエアを用いて行った。
データの数値積分および希釈回数（ヒート）を引くことによりエンタルピーを得
た。適合過程中エンタルピーのみを一定に保った理論曲線にデータを適合させて
結合部位数、Ka値を求めた。

【００９８】結果および考察 1X FLAG系の場合、Kaは、値ｒが＜1000（ここでr = KaMt(0)であり、Mt(0)は
細胞中のM2抗体の初期濃度である）となるように十分小さかった。3X FLAG系に
ついては、Kaはタイトな結合系を示すr>1000となるよう十分大きく、Kaに関する
正確な測定値は求めることができなかった。出願人は、３つのエピトープを縦一列に並べることにより、表１に示すように
１つのエピトープより等級のオーダーが十分大きな結合定数の増大をもたらすこ
とを示した。

【００９９】表１

【０１００】単一エピトープペプチドおよび単一エピトープBAPのKa値は同様であり、結合
メカニズムが同等であることを示唆した。３エピトープ系については、ペプチド
エピトープとBAP上のエピトープ両方のKa値も同等のメカニズムであることを示
唆した。トリプルFLAG系で観察された検出レベルの増加は主として結合定数の増
加による。

【０１０１】本発明の他の特徴、目的および利点は当業者に明らかであろう。本明細書に記
載の説明および例示は、当業者に本発明、その原理、およびその実用的応用を知
らせるためのものである。当業者は、本発明を特定使用の必要性に最も適するよ
うに多くの形に適合させ、応用することができよう。したがって、本明細書に記
載した本発明の特定の態様は本発明を網羅もしくは限定するものではない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 3XFLAG-CMV-7複数クローニング部位およびFLAG配列のＤＮＡお
よびタンパク質配列を示す。

【図１Ｂ】 CMVプロモーター、ヒト成長ホルモン転写終止およびポリアデ
ニル化部位、SV40複製起点、Col E1複製起点、およびβ-ラクタマーゼ遺伝子を
示すp3XFLAG-CMV-7のプラスミドマップである。

【図２Ａ】 p3xflag-CMV-7内へのphoAコーディング領域の挿入を示すp3xFL
AG-CMV-7-BAPのベクターマップである。

【図２Ｂ】 pFLAG-ATS-BAP内へのphoAコーディング領域の挿入を示すp3XFL
AG-ATS-BAPのベクターマップである。

【図３】抗FLAG M2抗体を用いる精製3XFLAG-BAP (A)およびN-FLAG-BAP (B
)のウエスタンブロットである。レーン(1) 0.5ng; (2) 1.0ng; (3) 2.0ng; (4)
5.0ng; および(5) 10ng。示した量はトランスファー前にゲルにロードした量で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ロン・ハーナンアメリカ合衆国63021ミズーリ州ボールウィン、ブリトニー・サークル・コート1106 番Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA05 CA07 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC24 CE12 DA13 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA11 EA50 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的ペプチド分子を精製するのに用いる同定ポリペプチドで
あって、ａ．少なくとも２つの異なるアミノ酸残基を含むわずか２０アミノ酸残基を含
む抗原性ドメインがそれぞれ縦一列に連結している抗原性ドメインの複数コピー
と、ｂ．標的ペプチド分子と抗原性ドメインの複数コピーの間に開裂可能な部位を含
むリンキング配列（ここで、開裂可能な部位の第二コピーは、抗原性ドメインの
複数コピー中にないかまたはその間に挿入されていない）を含む該同定ポリペプ
チド。
【請求項２】そのような各抗原性ドメインのアミノ酸配列がさらにわずか
１０アミノ酸残基を含む請求項１記載の同定ポリペプチド。
【請求項３】そのような各抗原性ドメインのアミノ酸配列が少なくとも半
分の親水性アミノ酸残基を含む請求項１または２記載の同定ポリペプチド。
【請求項４】そのような各抗原性ドメインのアミノ酸配列が親水性アミノ
酸残基の群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸と芳香族アミノ酸残基の群か
ら選ばれる少なくとも１個のアミノ酸を含む請求項１または２記載の同定ポリペ
プチド。
【請求項５】そのような各抗原性ドメインのアミノ酸配列がアルギニン、
プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニン、およびイソロイ
シンからなる群の複数のアミノ酸を含む請求項１または２記載の同定ポリペプチ
ド。
【請求項６】該開裂可能な部位が、標的ペプチド分子に隣接した特定のア
ミノ酸残基で配列特異的タンパク質分解剤により開裂可能であるアミノ酸配列を
含み、該配列特異的タンパク質分解剤がエンテロキナーゼ、Ｘａ因子、およびト
ロンビンからなる群から選ばれる請求項１〜５のいずれかに記載の同定ポリペプ
チド。
【請求項７】該開裂可能な部位がエンテロキナーゼ認識部位である請求項
６記載の同定ポリペプチド。
【請求項８】さらに、リンキング配列と抗原性ドメインの複数コピーの間
、または該抗原性ドメインの複数コピーのあらゆる２またはそれ以上の抗原性ド
メインの間に挿入された少なくとも１個のアミノ酸残基を含むスペーサードメイ
ンを含む請求項１〜６のいずれかに記載の同定ポリペプチド。
【請求項９】該スペーサーのアミノ酸配列が親水性アミノ酸残基からなる
群から選ばれる請求項８記載の同定ポリペプチド。
【請求項１０】該スペーサードメインがさらに少なくとも１個のヒスチジ
ン残基、少なくとも１個のグリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-
（ここで、ｍは１〜６であり、ＸはGly、His、Tyr、Lys、Phe、Met、Ala、Glu、
Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群から選ばれる）を含
む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含む請求項９記載の同定ポリ
ペプチド。
【請求項１１】該スペーサードメインのアミノ酸配列がイソロイシンを含
む請求項１０記載の同定ポリペプチド。
【請求項１２】さらに、少なくとも１個のヒスチジン残基、少なくとも１
個のグリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（ここで、ｍは１〜６
であり、ＸはGly、His、Tyr、Trp、Met、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびPro
からなる群から選ばれる）を含む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせ
を含む、抗原性ドメインの該複数コピーと結合した金属キレーティング配列を含
む請求項１〜６のいずれかに記載の同定ポリペプチド。
【請求項１３】さらに、複数制限酵素認識部位からなる複数クローニング
部位を含む請求項１〜６のいずれかに記載の同定ポリペプチド。
【請求項１４】さらに配列： X²⁰-(X¹-Y-K-X²-X³-D-X⁴)_n-X⁵-(X¹-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K)-X²¹ ［ここで、D、Y、およびKはその代表的アミノ酸である。 X²⁰およびX²¹は独立して水素または結合である。 X¹およびX⁴はそれぞれ独立して結合であるか、または芳香族アミノ酸残基およ
び親水性アミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基で
ある。 X²、X³、X⁷、およびX⁸は、それぞれ独立して芳香族アミノ酸残基および親水性
アミノ酸残基からなる群から選ばれるアミノ酸残基である。 X⁵は結合、または少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも１個のヒスチジン残
基、少なくとも１個のグリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（こ
こで、ｍは１〜６であり、ＸはGly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Phe
、Met、Ala、Glu、Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群
から選ばれる）を含む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含むスペ
ーサードメインである。 X⁹は結合またはアスパラギン酸残基である。ｎは少なくとも２である。］を含む請求項１記載の同定ポリペプチド。
【請求項１５】さらにアミノ酸配列： X²⁰-(D-Y-K-X²-X³-D)_n-X⁵-(D-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K)-X²¹ ［ここで、D、Y、およびKはその代表的アミノ酸である。 X²⁰およびX²¹は独立して水素または結合である。 X²、X³、X⁷、およびX⁸は、それぞれ独立して芳香族アミノ酸残基および親水性
アミノ酸残基からなる群から選ばれるアミノ酸残基である。 X⁵は結合、または少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも１個のヒスチジン残
基、少なくとも１個のグリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（こ
こで、ｍは１〜６であり、ＸはGly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Glu
、Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群から選ばれる）を
含む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含むスペーサードメインで
ある。 X⁹は結合またはアスパラギン酸残基である。ｎは少なくとも２である。］を含む請求項１記載の同定ポリペプチド。
【請求項１６】さらにアミノ酸配列： X²⁰-X¹⁰-(D-Y-K-X²-X³-D)_n-X⁵-(D-Y-K-X⁷-X⁸-D-X⁹-K)-X²¹ ［ここで、D、Y、およびKはその代表的アミノ酸である。 X²⁰およびX²¹は独立して水素または結合である。 X¹⁰は結合、あらゆるアミノ酸残基、またはメチオニン残基である。 X²、X³、X⁷、およびX⁸は、それぞれ独立して芳香族アミノ酸残基および親水性
アミノ酸残基からなる群から選ばれるアミノ酸残基である。 X⁵は結合、または少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも１個のヒスチジン残
基、少なくとも１個のグリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（こ
こで、ｍは１〜６であり、ＸはGly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Phe
、Met、Ala、Glu、Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群
から選ばれる）を含む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含むスペ
ーサードメインである。 X⁹は結合またはアスパラギン酸残基である。ｎは少なくとも２である。］を含む請求項１記載の同定ポリペプチド。
【請求項１７】 X²およびX³が、それぞれ独立して少なくとも１個のヒスチ
ジン残基、少なくとも１個のグリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m -（ここで、ｍは１〜６であり、ＸはGly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys
、Phe、Met、Ala、Glu、Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからな
る群から選ばれる）を含む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含む
金属キレーティング配列である請求項１４〜１６のいずれかに記載の同定ポリペ
プチド。
【請求項１８】さらにアミノ酸配列： X²⁰-(D-X¹¹-Y-X¹²-X¹³)_n-X¹⁴-(D-X¹¹-Y-X¹²-X¹³-D-X¹⁵-K)-X²¹ ［ここで、D、Y、およびKはその代表的アミノ酸である。 X²⁰およびX²¹は独立して水素または結合である。各X¹¹は結合、あらゆるアミノ酸残基、またはリジン残基である。各X¹²は、芳香族アミノ酸残基および親水性アミノ酸残基からなる群から選ば
れるアミノ酸である。各X¹³は結合、または芳香族アミノ酸残基および親水性アミノ酸残基からなる
群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸である。 X¹⁴は結合、または少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも１個のヒスチジン
残基、少なくとも１個のグリシン残基、またはHis-Gly-Hisまたは-(His-X)_m-（
ここで、ｍは１〜６であり、ＸはGly、His、Tyr、Trp、Val、Leu、Ser、Lys、Ph
e、Met、Ala、Glu、Ile、Thr、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、およびProからなる群
から選ばれる）を含む複数もしくは交互ヒスチジン残基の組み合わせを含むスペ
ーサードメインである。 X¹⁵は結合またはアスパラギン酸残基である。ｎは少なくとも２である。］を含む請求項１記載の同定ポリペプチド。
【請求項１９】請求項１〜１８のいずれかに記載の同定ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ断片。
【請求項２０】請求項１〜１８のいずれかに記載の同定ポリペプチドおよ
び標的ポリペプチドを含むハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡを含む
ＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２１】ａ．請求項２０記載のＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞を形
質転換し、ｂ．該形質転換宿主細胞から該標的ペプチドを取り出すことにより該標的ペプチ
ドを単離および同定し、ｃ．該同定ポリペプチドのリガンドアフィニティ特性を用いることにより標的ペ
プチドを精製することを含む標的ペプチドの製造方法。
【請求項２２】標的ペプチドが免疫沈降法およびウエスタンブロッティン
グにより単離および同定される請求項２１記載の方法。