ES2321058T3 - Purificacion de proteinas recombinantes fusionadas con epitopos multiples. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido de identificación para ser usado en la purificación de una molécula de péptido diana, en el que el polipéptido de identificación comprende la secuencia de aminoácidos en la que: D, Y y K son sus aminoácidos representativos; X 20 es hidrógeno o un enlace; X 20 -(X 1 -Y-K-X 2 -X 3 -D-X 4 ) n-X 5 -(X 1 -Y-K-X 7 -X 8 -D-X 9 -K)-X 21 X 21 es hidrógeno o un enlace covalente que une el polipéptido de identificación a una molécula de péptido diana; cada X 1 y X 4 es de forma independiente un enlace o por lo menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; cada X 2 , X 3 , X 7 y X 8 es de forma independiente un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; X 5 es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de aminoácido; X 9 es un enlace o un residuo de aspartato; y n es por lo menos 2, y en el que el sitio escindible representado por la secuencia X 7 -X 8 -D-X 9 -K no está situado en el, o interpuesto entre múltiples copias del, dominio antigénico X 1 -Y-K-X 2 -X 3 -D.
Description
Purificación de proteínas recombinantes
fusionadas con epítopos múltiples.
La presente invención se refiere a etiquetas de
proteínas y a métodos de purificación de proteínas que usan varias
técnicas de ADN recombinante. Más particularmente, la invención
trata sobre polipéptidos de identificación novedosos y vectores de
ADN que codifican polipéptidos de identificación novedosos que
contienen múltiples dominios antigénicos unidos en tándem. Se
proporcionan también métodos para usar dichos polipéptidos de
identificación para la purificación de péptidos diana y métodos de
construcción de vectores de ADN que codifican los polipéptidos de
identificación novedosos y vectores de expresión de ADN que
codifican los polipéptidos de identificación unidos a un péptido
diana.
Las moléculas proteicas tales como enzimas,
hormonas, proteínas de almacenamiento, proteínas de unión,
proteínas transportadoras y proteínas transductoras de señales se
pueden producir y purificar usando varias técnicas de ADN
recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican una
proteína seleccionada, junto con secuencias de ADN apropiadas para
un promotor y un sitio de unión al ribosoma se ligan a un plásmido
vector. El plásmido se inserta dentro de una célula procariota o
eucariota hospedadora. Las células hospedadoras transformadas se
identifican, se aíslan y a continuación se cultivan para conseguir
la expresión de las moléculas proteicas. Uno de los métodos usados
para purificar polipéptidos híbridos es el sistema de
poli-arginina en el que un polipéptido híbrido se
purifica selectivamente sobre una resina de intercambio catiónico.
Véase Sassenfeld, H. M. y Brewer, S. J. BioTechnology, 2:76 (1984);
patente U.S. n.º 4.532.207. Sassenfeld y Brewer dieron a conocer
una extensión del carboxi terminal de cinco residuos de arginina
fusionados en una proteína diana. Esta extensión de poliarginina
básica permitió la purificación del polipéptido híbrido sobre una
resina SP-Sephadex. Un sistema análogo de expresión
y purificación de proteínas utiliza una cola o etiqueta de
polihistidina en el extremo o bien amino o bien carboxi del
polipéptido híbrido. La proteína de fusión se purifica por
cromatografía sobre una resina de afinidad metálica con Ni^{2+}.
Véase Porath, J., Protein Expression and Purification, 3:7995
(1992). Adicionalmente, actualmente se utilizan varios protocolos de
purificación por afinidad para facilitar el aislamiento de
proteínas de fusión. La cromatografía de afinidad se basa en la
capacidad de las proteínas a unirse de forma específica y no
covalente con un ligando. Usada por sí sola, puede aislar proteínas
de mezclas muy complejas con no solamente un mayor grado de
purificación que el posible mediante la cromatografía secuencial de
intercambio iónico y en columna de gel, sino también sin pérdidas
significativas de actividad. Típicamente, como socio de fusión se
selecciona un ligando capaz de unirse con una alta especificidad a
una matriz de afinidad. Por ejemplo, la
p-aminofenil-\beta-D-tiogalactosidil-succinildiaminohexil-Sefarosa
se une selectivamente a la \beta-galactosidasa
permitiendo la purificación de proteínas de fusión a
\beta-gal. Véase Germino et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:6848 (1983). Otros sistemas de expresión que
permiten la purificación por afinidad de proteínas de fusión
incluyen proteínas de fusión realizadas con
glutatión-S-transferasa, que se
recuperan selectivamente en glutatión-agarosa. Véase
Smith, D. B. y Johnson., K. S. Gene 67:31 (1988). La
IgG-Sefarosa se puede usar para purificar por
afinidad proteínas de fusión que contienen la proteína
estafilocócica A. Véase Uhlen, M. et al. Gene 23:369 (1983).
El dominio de la proteína de unión a maltosa del gen malE de E.
coli se ha usado como socio de fusión y permite la purificación
por afinidad de la proteína de fusión sobre resinas de amilasa.
Otro método usado para detectar y aislar
proteínas es mediante el uso de un epítopo etiqueta. El etiquetado
con epítopos utiliza anticuerpos contra péptidos huéspedes para
estudiar la localización de la proteína en el nivel celular y
niveles subcelulares. Véase Kolodziej, P. A. y Young, RA., Methods
Enzymol., 194:508-519 (1991). Usando la tecnología
del ADN recombinante, una secuencia de nucleótidos que codifica el
epítopo se inserta en la región codificante del gel clonado, y el
gen híbrido se introduce en una célula mediante un método tal como
transformación. Cuando se expresa el gen híbrido, el resultado es
una proteína quimérica que contiene el epítopo como péptido
huésped. Si el epítopo queda expuesto en la superficie de la
proteína, el mismo queda disponible para su reconocimiento por el
anticuerpo específico del epítopo, permitiendo que el investigador
observe la proteína dentro de la célula usando técnicas de
inmunofluorescencia u otras técnicas de inmunolocalización. Además,
las proteínas de fusión marcadas con dichos epítopos etiquetas se
usan frecuentemente para purificar proteínas utilizando técnicas de
purificación por afinidad.
De este modo, el etiquetado con epítopos se ha
convertido en una herramienta poderosa para la detección y
purificación de proteínas expresadas. Véase Kolodziej, P. A. y
Young, RA., Methods Enzymol., 194:508-519 (1991).
Se han usado muchos tipos de etiquetas, siendo c-myc
y las etiquetas FLAG® dos de los epítopos más populares usados.
Véase Evan et al., Mol Cell Biol. 5:3610-3616
(1985). En general, estos epítopos se fusionan con el extremo amino
o carboxi de la proteína expresada consiguiendo que los mismos
resulten más accesibles al anticuerpo para su detección y que haya
menos probabilidad de provocar perturbaciones estructurales o
funcionales importantes.
Forsburg, S.L., et al., Gene,
191:191-195 (1997) describen una serie de vectores
para ser usados en la levadura de fisión Schizosaccharomyces
pombe que permiten la fusión de una proteína de interés a un
epítopo HA triple o dominio GST. El epítopo HA se puede situar en el
extremo N ó el extremo C bajo tres versiones diferentes del
promotor nmt1, para permitir niveles variables de expresión
génica.
Nilsson, J., et al. Protein Expression
and Purification, 11:1-16 (1997) proporcionan una
visón general de etiquetas de afinidad usadas comúnmente que se
centran en el uso de fusiones de las etiquetas de afinidad para la
detección, purificación, e inmovilización de proteínas recombinantes
y que ofrecen algunos ejemplos recientes de aplicaciones
específicas para etiquetas de afinidad.
Las proteínas de fusión que tienen el
octapéptido FLAG®
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(ID SEC n.º: 1) en el extremo amino se pueden purificar por
afinidad sobre una resina de inmunoafinidad que contenga un
anticuerpo específico para el octapéptido. Véase Hopp, T. P., et
al. Biotechnology, 6:1204 (1988); Prickett, K. S., et
al., BioTechniques, 7:580 (1989); y la patente U.S. n.º
4.851.341. El epítopo etiqueta FLAG® se ha usado eficazmente para
detectar y purificar proteínas en sistemas de mamíferos y
bacterianos. La secuencia FLAG® original es reconocida por dos
anticuerpos, M1, M2, y una secuencia FLAG® con un iniciador
metionina fijado es reconocida por un tercer anticuerpo, M5. Los
últimos cinco aminoácidos de la secuencia FLAG® son un sitio de
reconocimiento para la proteasa enteroquinasa, permitiendo de este
modo la eliminación del epítopo FLAG®. El epítopo FLAG® se ha usado
en varios sistemas de expresión para la detección y purificación de
proteínas heterólogas, por ejemplo, en E. coli (Brizzard
et al., BioTechniques, 16:730-735 (1994)),
Saccharomyces cerevisiae (Lee et al., Nature,
372:739-746 (1994); Prickett et al.,
BioTechniques, 7:580-589 (1989)), Drosophila (Xu
et al., Development, 117:1223-1237 (1993)),
Baculovirus (Dent et al., Mol, Cell Biol,
15:4125-4135 (1995); Ritchie et al., Biochem
Journal, 338:305-10 (1999)), y sistemas mamíferos
(Overholt et al., Clin. Cancer Res.,
3:185-191 (1997); Schulte am Esch et al.,
Biochemistry, 38:2248-2258 (1999)). No obstante, en
muchos sistemas de expresión mamíferos, los niveles de expresión de
proteínas son bajos, y una detección eficaz de proteínas foráneas
expresadas usando métodos establecidos puede resultar difícil.
Por lo tanto, existe una necesidad de un epítopo
etiqueta y un sistema de expresión que utilice dichos epítopos
etiqueta los cuales permitirían el aumento de la sensibilidad y la
detección de proteínas recombinantes.
La presente invención afronta uno o más de los
problemas anteriores proporcionando métodos y vehículos que se
pueden usar para producir altos rendimientos de proteínas
recombinantes. Por consiguiente, de entre los varios objetivos de
la presente invención se pueden indicar la provisión de un
polipéptido de identificación novedoso, una molécula híbrida
compuesta por un péptido diana fusionado en el polipéptido de
identificación novedoso y vectores de ADN recombinante que
codifican los mismos. Se proporcionan también métodos para la
purificación del péptido diana en los que se puede utilizar un único
ligando o múltiples ligandos, preferentemente anticuerpos, para
aislar y purificar sustancialmente todas las moléculas proteicas
expresadas por células hospedadoras transformadas, ya sean o no
antigénicas. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar
procesos que se pueden usar para purificar altamente cualquier
molécula proteica producida por métodos de ADN recombinante,
incluyendo aquellas que no son susceptibles de experimentar
procedimientos de cromatografía de afinidad.
Por lo tanto, resumiendo, la presente invención
se refiere a un polipéptido de identificación que comprende
múltiples copias de un dominio antigénico unidas entre sí en tándem.
El polipéptido de identificación puede contener una secuencia de
unión que contenga un sitio escindible situado adyacente al péptido
diana en donde el sitio escindible no está situado en o interpuesto
entre los dominios antigénicos individuales. Cada dominio
antigénico es capaz de provocar una respuesta antigénica y se puede
unir mediante un ligando, preferentemente, un anticuerpo. Además,
cada dominio antigénico está compuesto por una combinación de por lo
menos dos, preferentemente tres o más, aminoácidos diferentes.
Se proporcionan también proteínas de fusión de
la presente invención que comprenden el polipéptido de
identificación novedoso fusionado a un péptido diana. El polipéptido
de identificación contiene una secuencia de unión que está
caracterizada por ser escindible en un residuo aminoácido específico
adyacente al péptido diana mediante el uso de un agente
proteolítico específico de la secuencia. Dicho sitio escindible está
situado adyacente o bien al extremo carboxi o bien al extremo amino
del péptido diana, preferentemente situado inmediatamente adyacente
al extremo amino del péptido diana. Idealmente, la secuencia de
aminoácidos del sitio escindible es única, minimizando de este modo
la posibilidad de que el agente proteolítico escinda el péptido
diana. En una realización preferida, el sitio escindible comprende
aminoácidos específicos para enteroquinasa, trombina o un Factor
Xa.
Según este constructo particular de la proteína
de fusión, el péptido diana se puede aislar mediante técnicas de
cromatografía de afinidad. De este modo, es un objetivo de la
invención proporcionar métodos para la purificación del péptido
diana. Esto se logra construyendo una columna de afinidad con
ligandos inmovilizados específicos para los dominios antigénicos
del polipéptido de identificación uniéndose de este modo la proteína
de fusión. Se apreciará que, gracias a la presente invención, se
pueden usar un único anticuerpo o múltiples anticuerpos para unirse
a los dominios antigénicos individuales que comprenden los múltiples
dominios antigénicos del polipéptido de identificación. A
continuación, la proteína de fusión unida se puede liberar de la
columna y el polipéptido de identificación se puede escindir con un
agente proteolítico apropiado, liberando de este modo un péptido
diana purificado. En una realización preferida, el agente
proteolítico usado para escindir el péptido diana del polipéptido
de identificación se selecciona de entre el grupo consistente en
enteroquinasa, trombina y Factor Xa.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un vector de clonación recombinante que contenga ADN
que codifique el polipéptido de identificación. El vector que
codifica el polipéptido de identificación incluye también
secuencias de ADN que codifican un sitio de clonación múltiple
compuesto por sitios de enzimas de restricción múltiples que se
pueden situar entre los dominios antigénicos o en cualquiera de los
lados de los dominios antigénicos lo cual permitirá que los
expertos en la materia inserten un número cualquiera de secuencias
de ADN que codifiquen cualquier proteína deseada. Esta secuencia de
ADN se puede insertar dentro de un vector de clonación tal como un
plásmido, mediante el uso de endonucleasas y ligasas de restricción
apropiadas. El plásmido recombinante se utiliza para transformar
células hospedadoras procariotas o eucariotas compatibles para la
replicación del plásmido y la expresión de la molécula
proteica/dominio de afinidad híbrido. Idealmente, el plásmido tiene
un gen marcador fenotípico para la identificación y el aislamiento
de células hospedadoras transformadas. En una realización
preferida, secuencias de ADN que codifican un péptido señal
secretado se unirán o bien al vector de ADN o bien al plásmido
permitiendo de este modo que las células hospedadoras transformadas
sean fácilmente identificadas y separadas con respecto a células que
no experimentan transformación.
Otros objetivos y características en parte
resultarán evidentes y en parte serán señalados en lo sucesivo en
el presente documento.
La Fig. 1A es una representación de una
secuencia de ADN y proteica del sitio de clonación múltiple
3XFLAG-CMV-7 y secuencias de
FLAG.
La Fig. 1B es un mapa del plásmido del
p3XFLAG-CMV-7 que muestra el
promotor CMV, un sitio de terminación de transcripción y
poliadenilación de la hormona del crecimiento humano, el origen de
replicación del SV40, el origen de replicación Col E1, y el gen de
la \beta-lactamasa.
La Fig. 2A es un mapa del vector del
p3xFLAG-CMV-7-BAP
que muestra la inserción de la región codificante del phoA
en P3xflag-CMV-7.
La Fig. 2B es un mapa del vector de
p3XFLAG-ATS-BAP que muestra la
inserción de la región codificante del phoA en
pFLAG-ATS-BAP.
La Fig. 3 es un Western Blot de
3XFLAG-BAP (A) y
N-FLAG-BAP (B) purificados usando el
anticuerpo anti-FLAG M2. Calle(s) (1) 0,5
ng; (2) 1,0 ng; (3) 2,0 ng; (4) 5,0 ng; y (5) 10 ng. Las cantidades
mostradas son las cantidades cargadas en el gel antes de la
transferencia.
Para facilitar la comprensión de la invención, a
continuación se definen una serie de términos:
Las bases de nucleótidos se abrevian en el
presente documento de la manera siguiente: A representa adenina; C:
representa citosina; G representa guanina; T representa timina; U
representa uracilo.
Los residuos de aminoácidos se abrevian en el
presente documento según sus letras individuales: A representa
alanina; R representa arginina; N representa asparagina; D
representa ácido aspártico; C representa cisteína; Q representa
glutamina; E representa ácido glutámico; G representa glicina; H
representa histidina; I representa isoleucina; L representa
leucina; K representa lisina; M representa metionina; F representa
fenilalanina; P representa prolina; S representa serina; T
representa treonina; W representa triptófano; Y representa tirosina;
V representa valina.
La expresión "molécula de ADN recombinante"
tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula
de ADN que está compuesta por segmentos de ADN unidos entre sí por
medio de tecnología de ADN recombinante.
La expresión "vector de expresión" tal como
se usa en el presente documento hace referencia a secuencias de
ácido nucleico que contienen una secuencia de codificación deseada y
secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la
expresión de la secuencia de codificación unida operativamente en un
organismo hospedador particular. Las secuencias de ácido nucleico
necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor,
un sitio de unión al ribosoma, un codón de iniciación, un codón de
parada, opcionalmente una secuencia operadora y posiblemente otras
secuencias. Las células eucariotas utilizan promotores, una
secuencia Kozak y frecuentemente intensificadores y señales de
poliadenilación. Las células procariotas utilizan también un sitio
de unión al Ribosoma Shine-Dalgarno. La presente
invención incluye vectores o plásmidos que se pueden usar como
vehículos para transformar cualquier célula hospedadora viable con
el vector de expresión de ADN recombinante.
El término "FLAG" tal como se usa en el
presente documento es la marca comercial registrada que se refiere
al epítopo etiqueta FLAG® ampliamente usado que consiste en la
secuencia peptídica sintética de DYKDDDDK (ID SEC n.º: 1) según se
describe en las patentes U.S. n.º 4.703.004, 4.782.137, 4.851.341 y
5.011.912.
El término "hidrófilo" cuando se usa en
referencia a aminoácidos se refiere a aquellos aminoácidos que
tienen cadenas laterales polares y/o cargadas. Los aminoácidos
hidrófilos incluyen lisina, arginina, histidina, aspartato (es
decir, ácido aspártico), glutamato (es decir, ácido glutámico),
serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina.
Al término "hidrófobo" cuando se usa en
referencia a aminoácidos se refiere a aquellos aminoácidos que
tienen cadenas laterales no polares. Los aminoácidos hidrófobos
incluyen valina, leucina, isoleucina, cisteína y metionina. Tres
aminoácidos hidrófobos tienen cadenas laterales aromáticas. Por
consiguiente, el término "aromático" cuando se usa en
referencia a aminoácidos se refiere a los tres aminoácidos
hidrófobos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano.
La expresión "sitio escindible" se refiere
a una secuencia definida de aminoácidos que permite la escisión de
una proteína o péptido que contiene esta secuencia mediante un
agente proteolítico selectivo.
La expresión "proteína de fusión" tal como
se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido híbrido
que comprende dominios proteicos de por lo menos dos proteínas
diferentes. El péptido diana puede estar situado en la parte
terminal amino de la proteína de fusión o en la proteína terminal
carboxi formando de este modo una "proteína de fusión terminal
amino" o una "proteína de fusión terminal carboxi",
respectivamente.
La expresión "péptido diana" tal como se
usa en el presente documento se refiere al péptido cuya expresión
se desea dentro del polipéptido híbrido. En los polipéptidos
híbridos de la invención, el péptido diana puede comprender la
parte terminal o bien amino o bien carboxi del polipéptido
híbrido.
El término "endoproteasa" o
"endopeptidasa" tal como se usa en el presente documento se
refiere a una proteasa capaz de hidrolizar enlaces peptídicos
interiores de un polipéptido, por lugares que no sean los enlaces
terminales (es decir, los enlaces peptídicos del aminoácido
terminal).
Las expresiones "molécula de ácido nucleico
que codifica", "secuencia de ADN que codifica" y "ADN que
codifica" se refieren al orden o secuencia de
desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido
desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos
determina el orden de aminoácidos a lo largo de la cadena
polipeptídica (proteica). De este modo, la secuencia de ADN
codifica la secuencia de aminoácidos.
Para todas las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos dadas a conocer en el presente documento, se entiende
que en las secuencias se pueden sustituir nucleótidos y aminoácidos
equivalentes sin afectar a la función de las secuencias. Dichas
sustituciones quedan incluidas dentro de las habilidades de un
profesional con conocimientos habituales en la materia.
Los procedimientos dados a conocer en el
presente documento que conllevan la manipulación molecular de
ácidos nucleicos son conocidos para aquellos expertos en la materia.
Véanse en general Fredrick M. Ausubel et al. (1995),
"Short Protocols in Molecular Biology," John Wiley and Sons, y
Joseph Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning, A
Laboratory Manual," segunda ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
Según la presente invención, se proporcionan
polipéptidos de identificación con una sensibilidad aumentada para
la detección y purificación de péptidos diana que se producen usando
una tecnología de ADN recombinante. Se proporcionan además
moléculas de polipéptidos híbridos compuestas por un polipéptido de
identificación y un péptido diana que se producen mediante
tecnología de ADN recombinante y se purifican usando cromatografía
de afinidad haciendo uso de uno o más ligandos. Por consiguiente, se
proporcionan también vectores de expresión de ADN que incluyen
segmentos de ADN que codifica el polipéptido de identificación y el
péptido diana deseado.
Según la presente invención, un péptido diana
puede estar compuesto por cualquier sustancia proteica que se pueda
expresar en células hospedadoras transformadas. La antigenicidad
aumentada del polipéptido de identificación es el resultado de la
presencia de múltiples copias de un dominio antigénico en tándem. El
polipéptido de identificación contiene también una secuencia de
unión escindible que une el polipéptido de identificación al
péptido diana produciendo de este modo un polipéptido híbrido. Los
vectores de clonación de ADN se pueden replicar y el polipéptido
híbrido compuesto por el polipéptido de identificación y un péptido
diana se expresa en células procariotas o eucariotas transformadas
con el vector. Las células transformadas se aíslan y a continuación
se expanden en cultivo u otros medios conocidos en la materia.
Las moléculas de polipéptidos híbridos de la
presente invención se pueden purificar mediante cromatografía de
afinidad. La molécula de polipéptido híbrido que comprende el
polipéptido de identificación y el péptido diana se puede purificar
usando una resina de afinidad que se une a los dominios antigénicos
del polipéptido de identificación. En general, los ligandos
específicos para los dominios antigénicos del polipéptido etiqueta
de identificación se inmovilizan en una columna de perlas u otro
tipo de matriz. Un extracto de las células hospedadoras obtenido a
partir del cultivo se aplica a la columna y a continuación los
polipéptidos que se unen a la columna son eluídos. Seguidamente el
polipéptido de identificación se escinde de la molécula del péptido
diana con un agente proteolítico apropiado liberando de este modo el
péptido diana en un estado altamente purificado.
El polipéptido de identificación de la presente
invención es una secuencia de residuos de aminoácidos que flanquean
al extremo amino o carboxi de un péptido diana. En general, el
polipéptido de identificación incluye múltiples copias de un
dominio antigénico, en las que cada dominio antigénico es capaz de
unir un anticuerpo, una secuencia de unión escindible para unir los
dominios antigénicos al péptido diana, y opcionalmente uno o más
espaciadores.
Para aumentar la sensibilidad de detección, el
polipéptido de identificación contiene preferentemente múltiples
copias de un dominio antigénico, es decir, por lo menos dos copias
de un dominio antigénico, preferentemente por lo menos tres copias
de un dominio antigénico y, en algunas realizaciones, cuatro o más
copias de un dominio antigénico. La capacidad de la secuencia de
múltiples dominios antigénicos de unirse a un anticuerpo
inmovilizado, por ejemplo, en una columna u otra matriz, posibilita
el aislamiento y la purificación de péptidos diana.
El polipéptido de identificación incluye una
secuencia de unión escindible para unir la secuencia de dominios
antigénicos al péptido diana. En general, los residuos de
aminoácidos que comprenden la secuencia de unión pueden comprender
cualquier secuencia de aminoácidos que serviría para conectar la
secuencia de dominios antigénicos al péptido diana. Además, la
secuencia de unión contiene un sitio de escisión que comprende una
secuencia única de aminoácidos escindible mediante el uso de un
agente proteolítico específico de la secuencia. Una vez que el
polipéptido híbrido compuesto por el polipéptido de identificación y
el péptido diana se ha purificado a partir del extracto del
cultivo, el polipéptido de identificación preferentemente se escinde
del péptido diana mediante digestión con un agente proteolítico
específico para los aminoácidos del sitio de escisión.
Alternativamente, el polipéptido de identificación se puede extraer
del péptido diana mediante escisión química usando métodos
conocidos en la materia.
En general, el sitio escindible puede estar
situado en el extremo amino o carboxi del péptido diana.
Preferentemente, el sitio escindible es inmediatamente adyacente al
péptido diana para permitir la separación del péptido diana con
respecto al polipéptido de identificación. Preferentemente, este
sitio escindible no aparece en o interpuesto entre los dominios
antigénicos o, en el caso de que estén presentes, los dominios
espaciadores del polipéptido de identificación. En una realización
preferida, el sitio escindible está situado en el extremo amino del
péptido diana. Si el sitio escindible está situado en el extremo
amino del péptido diana y si existen aminoácidos extraños restantes
en el péptido diana después de la escisión con el agente
proteolítico, se puede utilizar una endopeptidasa tal como tripsina,
clostropaína o furina para eliminar estos aminoácidos restantes,
dando como resultado de este modo un péptido diana altamente
purificado.
La digestión con un agente proteolítico se puede
producir mientras el polipéptido híbrido está todavía unido a la
resina de afinidad o alternativamente, el polipéptido híbrido se
puede eluir de la resina de afinidad y a continuación digerir con
el agente proteolítico para purificar adicionalmente el péptido
diana. La eficacia del agente proteolítico o la escisión química
del péptido diana recombinante se determina por medio de la
secuencia de aminoácidos de la secuencia de unión interpuesta entre
la secuencia de dominios antigénicos y el péptido diana.
Idealmente, la secuencia de aminoácidos del
sitio de escisión es única, minimizando de este modo la posibilidad
de que el agente proteolítico escinda al péptido diana. En una
realización preferida, el sitio escindible comprende aminoácidos
para un sitio de escisión de enteroquinasa, trombina o Factor
Xa.
La enteroquinasa reconoce varias secuencias:
Asp-Lys;
Asp-Asp-Lys;
Asp-Asp-Asp-Lys (ID
SEC n.º : 2); y
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(ID SEC n.º: 3). Véase Matsushima et al., J. Biochem
125:947-51 (1999). La única aparición natural
conocida de
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(ID SEC n.º: 3) es en la proteína tripsinógeno que es un sustrato
natural para la enteroquinasa bovina y algunas proteínas de
levadura. Como tal, interponiendo una secuencia de unión que
contenga la secuencia de aminoácidos
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(ID SEC n.º: 3) como sitio escindible entre la secuencia de
dominios antigénicos y el extremo amino del péptido diana, el
péptido diana se puede liberar del polipéptido de identificación
mediante el uso de enteroquinasa bovina con una probabilidad muy
pequeña de que esta enzima escinda cualquier parte del propio
péptido diana.
La trombina se escinde en el lado del terminal
carboxi de arginina en la siguiente secuencia:
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-X
(ID SEC n.º: 4), en la que X es un aminoácido no ácido. Véase Chang
Eur. J. Biochem., 151:217 (1985). La proteasa Factor Xa (es decir,
la forma activada del Factor X) se escinde después de la Arg en las
siguientes secuencias:
Ile-Glu-Gly-Arg-X
(ID SEC n.º: 5),
Ile-Asp-Gly-Arg-X
(ID SEC n.º: 6), y
Ala-Glu-Gly-Arg-X
(ID SEC n.º: 7), en las que X es cualquier aminoácido excepto
prolina o arginina. Se demostró que una proteína de fusión que
comprendía los 31 residuos de terminales amino de la proteína cII,
un sitio de escisión de Factor Xa y \beta-globina
humana era escindida por el Factor Xa y generaba
\beta-globina auténtica. Véase Nagai, K. y
Thogersen, H. C., Nature, 308: 810-812 (1984). Una
de las limitaciones de los sistemas de fusión basados en el Factor
Xa es el hecho de que se ha informado de que el Factor Xa se
escinde en residuos de arginina que no están presentes dentro de la
secuencia de reconocimiento del Factor Xa. Véase Nagai et
al., Prot, Expr. and Purif., 2:372 (1991).
En la secuencia de unión también se pueden
utilizar otras secuencias de aminoácidos únicas, menos preferidas,
para otros sitios escindibles. Por ejemplo, la secuencia de unión
puede estar compuesta en parte por un par de aminoácidos básicos,
es decir, Lys, Arg o His. Esta secuencia es escindida por
calicreínas, una enzima glandular. Además, la parte de unión puede
estar compuesta parcialmente por Arg-Gly, ya que se
sabe que la enzima trombina se escindirá después de la Arg si a
este residuo le sigue Gly. Además, no se requiere que los dominios
antigénicos y el sitio escindible sean exclusivos entre sí. Los
anticuerpos se pueden unir a aminoácidos que se encuentren en el
sitio escindible tal como es el caso correspondiente al anticuerpo
monoclonal FLAG® M2 que reconoce parte del sitio escindible
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(ID SEC n.º: 3) para la enteroquinasa.
Aunque en general se prefiere que cada dominio
antigénico sea inmediatamente adyacente a otro dominio antigénico
(es decir, sin secuencias interpuestas), los dominios antigénicos se
pueden separar entre sí por medio de un dominio espaciador. También
se puede insertar un dominio espaciador entre las múltiples copias
del dominio antigénico y la secuencia de unión. La inserción de un
dominio espaciador preferentemente no da como resultado la
inserción de una segunda copia del sitio escindible entre los
dominios antigénicos del polipéptido de identificación. Se prefiere
que el número de residuos de aminoácidos en cada dominio espaciador
sea mínimo, preferentemente que consista en no más de diez residuos
de aminoácidos, más preferentemente, no más que aproximadamente
seis residuos de aminoácidos, y todavía más preferentemente dos o
incluso un residuo(s) de aminoácidos en cuanto a
longitud.
Si se utiliza un dominio espaciador, el mismo
puede estar diseñado para comunicar una o más propiedades deseadas
al polipéptido de identificación. En una de las realizaciones,
el(los) aminoácido(s) del dominio espaciador se
seleccionan de entre aminoácidos hidrófilos para aumentar el
carácter hidrófilo del polipéptido de identificación.
Alternativamente, el(los) aminoácido(s) del dominio
espaciador se puede(n) seleccionar para comunicar un
plegamiento deseado al polipéptido de identificación, aumentando de
este modo la accesibilidad al anticuerpo; por ejemplo, el dominio
espaciador puede comprender residuos de glicina lo cual da como
resultado una conformación de plegamiento proteico que permite una
accesibilidad mejorada al anticuerpo. Véase Dan et al., J.
Bio. Chem. 271:30717-30724 (1996); Borjigin, J. y
Nathans, J., J. Biol. Chem. 269:14715-147622
(1994).
Es bien sabido en la técnica que ciertos
residuos de aminoácidos tales como histidina presentan una afinidad
para unir o quelar iones metálicos inmovilizados. Por consiguiente,
el diseño de un polipéptido de identificación con una secuencia
quelante de metal compuesta por residuos de histidina múltiples o
alternados en el dominio espaciador o que flanqueen cada lado de la
secuencia de dominios antigénicos permitiría que el polipéptido
híbrido se uniese a un ión metálico inmovilizado en una resina u
otra matriz. En una realización preferida, una secuencia quelante
de metal que flanquee a las múltiples copias del dominio antigénico
o en un dominio espaciador puede comprender por lo menos un residuo
de histidina, por lo menos un residuo de glicina o una combinación
de residuos de histidina alternados o múltiples de la fórmula:
-(His-X)_{m}-, en la que m es de 1 a 6 y X
se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val, Leu,
Ser, Lys, Phe, Met, Ala, Glu, Ile, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, y
Pro, la cual se puede usar en técnicas de purificación por afinidad
usando una resina metal de unión a Ni^{2+}. Véanse, por ejemplo,
las patentes U. S. n.º 4.569.794, 5.310.663, 5.284.933 y 5.594.115.
Preferentemente, los aminoácidos del dominio espaciador no incluyen
una segunda copia del sitio escindible según se describe en el
presente documento. Una vez que el polipéptido híbrido se ha unido
a la resina metal, el polipéptido híbrido se puede liberar por
protonación de su ligando de unión a iones metálicos, asociado. La
disociación se logra reduciendo el pH del medio tampón circundante,
un método común conocido en la técnica para eluir proteínas
unidas.
En una realización de la presente invención, el
polipéptido de identificación comprende múltiples copias de un
dominio antigénico en correspondencia en general con la secuencia
peptídica FLAG® unida a una secuencia de unión que contiene un
único sitio de escisión de enteroquinasa. Dicho polipéptido de
identificación en general se corresponde con la secuencia:
X^{20}-(X^{1}-Y-K-X^{2}-X^{3}-D-X^{4})_{n}-X^{5}(X^{1}-Y-K-X^{7}-X^{8}-D-X^{9}-K)-X^{21}
en la
que:
- \quad
- D, Y y K son sus aminoácidos representativos;
- \quad
- X^{20} y X^{21} son de forma independiente un hidrógeno o un enlace;
- \quad
- cada X^{1} y X^{4} es de forma independiente un enlace o por lo menos un residuo de aminoácido, preferentemente, si no es un enlace, por lo menos un residuo de aminoácido seleccionado de grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y residuos de aminoácidos hidrófilos, más preferentemente por lo menos un residuo de aminoácido hidrófilo, y todavía más preferentemente por lo menos un residuo de aspartato;
- \quad
- cada X^{2}, X^{3}, X^{7} y X^{8} es de forma independiente un residuo de aminoácido, preferentemente un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y residuos de aminoácidos hidrófilos, más preferentemente un residuo de aminoácido hidrófilo, y todavía más preferentemente un residuo de aspartato;
- \quad
- X^{5} es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un aminoácido, preferentemente, si no es un enlace, un residuo de histidina, un residuo de glicina o una combinación de residuos de histidina múltiples o alternados, comprendiendo dicha combinación His-Gly-His, ó -(His-X)_{m}-, en la que m es de 1 a 6 y X se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val, Leu, Ser, Lys, Phe, Ala, Glu, IIe, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, y Pro;
- \quad
- X^{9} es un enlace ó D; y
- \quad
- n es por lo menos 2.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta realización, la secuencia de aminoácidos
X^{20}-(X^{1}-Y-K-X^{2}-X^{3}-D-X^{4})_{n}
representa las múltiples copias del dominio antigénico
-X^{1}-Y-K-X^{2}-X^{3}-D-
unidas en tándem que se unen a una secuencia de unión
(X^{1}-Y-K-X^{7}-X^{8}-D-X^{9}-K).
Los dominios antigénicos pueden ser inmediatamente adyacentes entre
sí cuando X^{4} es un enlace, opcionalmente, X^{4} puede ser un
dominio espaciador interpuesto entre las múltiples copias de
dominios antigénicos. La secuencia de unión contiene un único sitio
escindible de enteroquinasa que se representa mediante la secuencia
-X^{7}-X^{8}-D-X^{9}-K,
en la X^{7} y X^{8} pueden ser un residuo de aminoácido o un
enlace y X^{9} es un enlace o un residuo de aspartato. En una
realización preferida, cada X^{7}, X^{8} y X^{9} es de forma
independiente un residuo de aspartato, dando como resultado de este
modo el sitio escindible de enteroquinasa DDDDK (ID SEC n.º: 3) que
está situado preferentemente inmediatamente adyacente al extremo
amino del péptido diana. Las múltiples copias de dominios
antigénicos pueden ser inmediatamente adyacentes a la secuencia de
unión cuando X^{5} es un enlace, opcionalmente, X^{5} puede ser
un dominio espaciador interpuesto entre la secuencia de unión y los
dominios antigénicos. Cuando cada X^{4} y X^{5} es de forma
independiente un dominio espaciador, se prefiere que el(los)
residuo(s) de aminoácidos de cada X^{4} y X^{5}
comuniquen una o más propiedades deseadas al polipéptido de
identificación; por ejemplo, los aminoácidos del dominio espaciador
se pueden seleccionar para comunicar un plegamiento deseado al
polipéptido de identificación, incrementando de este modo la
accesibilidad al anticuerpo. En otra realización preferida, los
aminoácidos del dominio espaciador X^{4} y X^{5} se pueden
seleccionar para comunicar una característica de afinidad deseada
tal como una combinación de residuos de histidina múltiples o
alternados capaces de quelarse a un ión metálico inmovilizado en una
resina u otra matriz. Además, estas propiedades deseadas pueden
estar diseñadas en otras áreas del polipéptido de identificación;
por ejemplo, los aminoácidos representados por X^{2} y X^{3} se
pueden seleccionar para comunicar un plegamiento peptídico deseado
o una característica de afinidad deseada para su uso en la
purificación por afinidad.
Cuando el polipéptido de identificación está
situado en el extremo amino del péptido diana, es deseable diseñar
la secuencia de aminoácidos del polipéptido de identificación de tal
manera que esté presente un iniciador metionina. Por consiguiente,
en una realización preferida de la presente invención, el
polipéptido de identificación comprende múltiples copias de un
dominio antigénico, una secuencia de unión que contiene un único
sitio de escisión de enteroquinasa y en general se corresponde con
la secuencia:
X^{20}-X^{10}-(D-Y-K-X^{2}-X^{3}-D)_{n}-X^{5}-(D-Y-K-X^{7}-X^{8}-D-X^{9}-K)-X^{21}
en la
que:
- \quad
- D, Y, y K son sus aminoácidos representativos;
- \quad
- X^{20} y X^{21} son de forma independiente un hidrógeno o un enlace;
- \quad
- X^{10} es un enlace o un aminoácido, preferentemente, si no es un enlace, un residuo de metionina;
- \quad
- cada X^{2}, X^{3}, X^{7} y X^{8} es de forma independiente un residuo de aminoácido, preferentemente un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y residuos de aminoácidos hidrófilos, más preferentemente un residuo de aminoácido hidrófilo, y todavía más preferentemente un residuo de aspartato;
- \quad
- X^{5} es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un aminoácido, preferentemente, si no es un enlace, un residuo de histidina, un residuo de glicina o una combinación de residuos de histidina múltiples o alternados, comprendiendo dicha combinación His-Gly-His, ó -(His-X)_{m}-, en la que m es de 1 a 6 y X se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val, -Leu, -Ser, -Lys, -Phe, -Met, Ala, Glu, IIe, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, y Pro;
- \quad
- X^{9} es un enlace ó un residuo de aspartato; y
- \quad
- n es por lo menos 2.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta realización, la secuencia de aminoácidos
X^{20}-(D-Y-K-X^{2}-X^{3}-D)_{n}-
representa las múltiples copias del dominio antigénico
D-Y-K-X^{2}-X^{3}-D
en tándem que está flanqueado por una secuencia de unión
(D-Y-K-X^{7}-X^{8}-D-X^{9}-K)
y un iniciador aminoácido X^{10}, preferentemente metionina. El
dominio antigénico
D-Y-K-X^{2}-X^{3}-D
con un iniciador metionina es reconocido por el anticuerpo M5. En
esta realización, un dominio antigénico es inmediatamente adyacente
a otro dominio antigénico, es decir, no hay dominios espaciadores
interpuestos, y las múltiples copias del dominio antigénico son
inmediatamente adyacentes a la secuencia de unión cuando X^{5} es
un enlace. La secuencia de unión contiene un sitio escindible de
enteroquinasa que está representado por la secuencia de aminoácidos
X^{7}-X^{8}-D-X^{8}-K,
en la que X^{7} y X^{8} pueden ser un enlace o un residuo de
aminoácido, preferentemente un residuo de aspartato, y X^{9} es
un enlace o un residuo de aspartato. En una realización preferida,
cada X^{7}, X^{8} y X^{9} es de forma independiente un
residuo de aspartato, dando como resultado de este modo el sitio
escindible de enteroquinasa DDDDK (ID SEC n.º: 3) que es
preferentemente adyacente al extremo amino del péptido diana.
Opcionalmente, las múltiples copias del dominio antigénico están
unidas a la secuencia de unión por un dominio espaciador X^{5}
cuando X^{5} es por lo menos un residuo de aminoácido. Cuando
X^{5} es un dominio espaciador, se prefiere que el(los)
residuo(s) de aminoácidos de X^{5} comuniquen una o más
propiedades deseadas al polipéptido de identificación; por ejemplo,
los aminoácidos del dominio espaciador se pueden seleccionar para
comunicar un plegamiento deseado al polipéptido de identificación,
incrementando de este modo la accesibilidad al anticuerpo. En otra
realización preferida, los aminoácidos del dominio espaciador se
pueden seleccionar para comunicar una característica de afinidad
deseada tal como una combinación de residuos de histidina múltiples
o alternados capaces de quelarse a un ión metálico inmovilizado en
una resina u otra matriz. Además, estas propiedades deseadas pueden
estar diseñadas en otras áreas del polipéptido de identificación;
por ejemplo, los aminoácidos representados por X^{2} y X^{3} se
pueden seleccionar para comunicar un plegamiento peptídico deseado
o una característica de afinidad deseada para su uso en la
purificación por afinidad.
En otra realización de la presente invención, el
polipéptido de identificación comprende múltiples copias de una
secuencia antigénica, una secuencia de unión que contiene un único
sitio escindible de enteroquinasa y en general se corresponde con
la secuencia:
X^{20}-(D-X^{11}-Y-X^{12}-X^{13})_{n}-X^{14}-(D-X^{11}-Y-X^{12}-X^{13}-D-X^{15}-K)-X^{21}
en la
que:
- \quad
- D, Y, y K son sus aminoácidos representativos;
- \quad
- X^{20} y X^{21} son de forma independiente un hidrógeno o un enlace;
- \quad
- cada X^{11} es un enlace o un aminoácido, preferentemente L;
- \quad
- cada X^{12} es un aminoácido, preferentemente seleccionado de grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y residuos de aminoácidos hidrófilos, más preferentemente un residuo de aminoácido hidrófilo, y todavía más preferentemente un residuo de aspartato;
- \quad
- cada X^{13} es un enlace o por lo menos un aminoácido, preferentemente, si no es un enlace, seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y residuos de aminoácidos hidrófilos, más preferentemente un residuo de aminoácido hidrófilo, y todavía más preferentemente un residuo de aspartato;
- \quad
- X^{14} es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un aminoácido, preferentemente, si no es un enlace, un residuo de histidina, un residuo de glicina o una combinación de residuos de histidina múltiples o alternados, comprendiendo dicha combinación His-Gly-His, ó -(His-X)_{m}-, en la que m es de 1 a 6 y X se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val, Leu, Ser, Lys, Phe, Ala, Glu, IIe, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, y Pro;
- \quad
- X^{15} es un enlace ó un residuo de aspartato; y
- \quad
- n es por lo menos 2.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta realización, la secuencia de aminoácidos
X^{20}-(D-X^{11}-Y-X^{12}-X^{13})_{n}
representa las múltiples copias del dominio antigénico
D-X^{11}-Y-X^{12}-X^{13}
en tándem que están unidas a una secuencia de unión
(D-X^{11}-Y-X^{12}-X^{13}-D-X^{15}-K).
Adicionalmente, un dominio antigénico es inmediatamente adyacente a
otro dominio antigénico, es decir, no hay dominios espaciadores
interpuestos, y las múltiples copias del dominio antigénico son
inmediatamente adyacentes a la secuencia de unión cuando X^{14}
es un enlace. La secuencia de unión contiene un único sitio
escindible de enteroquinasa que está representado por la secuencia
-X^{12}-X^{13}-D-X^{15}-K
en la que X^{12} y X^{13} pueden ser un enlace o un residuo de
aminoácido, preferentemente un residuo de aspartato, y X^{15} es
un enlace o un residuo de aspartato. En una realización preferida,
cada X^{12}, X^{13} y X^{15} es de forma independiente un
residuo de aspartato, dando como resultado de este modo el sitio
escindible de enteroquinasa DDDDK (ID SEC n.º: 3) que es
preferentemente adyacente al extremo amino del péptido diana.
Opcionalmente, las múltiples copias del dominio antigénico están
unidas a la secuencia de unión por un espaciador X^{14} cuando
X^{14} es por lo menos un residuo de aminoácido. Cuando X^{14}
es un dominio espaciador, se prefiere que el(los)
residuo(s) de aminoácidos de X^{14} comuniquen una o más
propiedades deseadas al polipéptido de identificación; por ejemplo,
los aminoácidos del dominio espaciador se pueden seleccionar para
comunicar un plegamiento deseado al polipéptido de identificación,
incrementando de este modo la accesibilidad al anticuerpo. En otra
realización preferida, los aminoácidos del dominio espaciador
X^{14} se pueden seleccionar para comunicar una característica de
afinidad deseada tal como una combinación de residuos de histidina
múltiples o alternados capaces de quelarse a un ión metálico
inmovilizado en una resina u otra matriz.
Según la presente invención, el péptido diana
puede estar compuesto por cualquier sustancia proteica que se pueda
expresar en células hospedadoras transformadas. Por consiguiente, la
presente invención se puede utilizar ventajosamente para producir
sustancialmente cualquier proteína procariota o eucariota, simple o
conjugada, que se pueda expresar mediante un vector en una célula
hospedadora transformada. Dichas proteínas incluyen enzimas, ya
sean oxidorreductasas, transferasa, hidrolasas, liasas, isomerasas o
ligasas.
La presente invención contempla también la
producción de proteínas de almacenamiento, tales como ferritina u
ovoalbúmina o proteínas transportadoras como hemoglobina, albúmina
sérica o ceruloplasmina. Se incluyen también los tipos de proteínas
que funcionan en sistemas contráctiles y móviles, por ejemplo,
actina y miosina.
\newpage
La presente invención contempla también la
producción de proteínas que prestan servicio a una función
protectora o de defensa, tales como la proteína sanguínea
fibrinógeno. Otras proteínas protectoras incluyen las proteínas de
unión, tales como anticuerpos o inmunoglobulinas que se unen a
antígenos, y por lo tanto los neutralizan.
La proteína producida por la presente invención
también puede abarcar varias hormonas tales como la Hormona del
Crecimiento Humano, la somatostatina, la prolactina, la estrona, la
progesterona, el melanocito, la tirotropina, la calcitonina, la
gonadotropina y la insulina. Otras hormonas de este tipo incluyen
aquellas que se hayan identificado como involucradas en el sistema
inmune, tales como interleuquina 1, interleuquina 2, factor
estimulante de colonias, factor activador de macrófagos e
interferón.
La presente invención es también aplicable a la
producción de proteínas tóxicas, tales como ricina de la semilla de
ricino o gosipina de linaza de algodón.
Las proteínas que actúan como elementos
estructurales pueden ser producidas por la presente invención;
dichas proteínas incluyen las proteínas fibrosas colágeno, elastina
y \alpha-queratina. Otras proteínas estructurales
incluyen glico-proteínas, proteínas víricas y
muco-proteínas.
Además de las proteínas de origen natural antes
indicadas, la presente invención se puede utilizar para producir
proteínas sintéticas definidas en general como cualquier secuencia
de aminoácidos que no se produzca en la naturaleza.
A partir de una variedad de fuentes procariotas
o eucariotas, tales como células vegetales o animales o células
bacterianas, se pueden obtener genes que codifican los diversos
tipos de moléculas de proteínas antes identificadas. Los genes se
pueden aislar a partir del material cromosómico de estas células o a
partir de plásmidos de células procariotas utilizando técnicas
normalizadas, bien conocidas, una variedad de plásmidos de origen
natural y sintetizados que tienen genes que codifican muchas
moléculas de proteínas diferentes no están disponibles
comercialmente a partir de una variedad de fuentes. El ADN deseado
también se puede producir a partir de ARNm usando la enzima
transcriptasa inversa. Esta enzima permite la síntesis de ADN a
partir de un molde de ARN.
Según la presente invención, una vez que se ha
aislado, sintetizado u obtenido de otra manera un gen que codifica
un péptido diana, el mismo se une a un fragmento de ADN sintético
que codifica el polipéptido de identificación.
El gen de polipéptido de identificación se puede
sintetizar mediante técnicas bien conocidas. Para una composición
seleccionada del polipéptido de identificación, se pueden sintetizar
oligómeros de ADN que codifican los aminoácidos deseados del
polipéptido de identificación usando un sintetizador de ADN
automatizado, disponible comercialmente, según una manera bien
conocida en la técnica. Las técnicas y aparatos para sintetizar ADN
son comunes y conocidos en la materia; de este modo, la descripción
y los detalles para realizar esto no se expondrán de forma completa
en el presente documento. Esencialmente, este proceso implica la
obtención de pares de oligonucleótidos sintéticos y su digestión
con las endonucleasas de restricción apropiadas. Esto producirá la
secuencia de nucléotidos correcta que codifica el polipéptido
etiqueta de identificación. Después de la digestión, se forman
varios fragmentos de ADN con extremos cohesivos o "pegajosos".
Aunque puede haber muchas maneras según las cuales realizar dicha
construcción, la realización preferida implica la generación de una
secuencia de múltiples epítopos FLAG® o variaciones de la misma en
tándem.
El par de oligonucleótidos usado en la
construcción del polipéptido de identificación puede ser de origen
natural o generado sintéticamente. En general se prefiere que los
pares específicos de oligonucleótidos se hayan generado
sintéticamente para producir la secuencia de aminoácidos del
polipéptido etiqueta de identificación deseado. Las cadenas de cada
oligonucleótido se aparean entre sí y se digieren con una
endonucleasa de restricción apropiada tal como EcoR I y
Hind III. Después de la digestión y de la creación de las
casetes de nucleótidos, las secuencias se pueden verificar a través
de secuenciación de ADN.
Tal como se describe posteriormente, los
oligómeros de ADN sintéticos que codifican el polipéptido de
identificación se pueden ligar a una secuencia de ADN que codifique
la proteína deseada, y a continuación los fragmentos de ADN
combinados se ligan a un vector de expresión apropiado para formar
un vehículo de clonación para la transformación a una célula
hospedadora apropiada.
Además del gen del péptido diana y el gen del
polipéptido de identificación, si fuera necesario, el fragmento de
ADN híbrido puede incluir un sitio de unión al ribosoma para obtener
una traducción de proteínas de alto nivel en una célula
hospedadora, un codón de iniciación de la traducción (ATG), y un
promotor.
En general, los genes que codifican el péptido
diana y el polipéptido de identificación se tratan idealmente con
una enzima de restricción apropiada o, alternativamente, se
manipulan para tener extremos cohesivos que faciliten la ligación
mutua y con un plásmido u otro tipo de vector de clonación. El
vector de clonación se digiere preferentemente con la misma
endonucleasa de restricción usada para acondicionar los genes
foráneos con el fin de formar extremos cohesivos complementarios,
(es decir, "extremos pegajosos") antes de la ligación con los
genes foráneos. Alternativamente, el uso de ciertas enzimas de
restricción (por ejemplo, Pvu II, Bal I) puede dar como
resultado la formación de extremos sin secuencias sobresalientes
complementarias, a los que se hace referencia comúnmente como
"extremos cuadrados" o "romos". Los extremos cuadrados del
plásmido se pueden unir a los genes foráneos con una ligasa
apropiada. Adicionalmente, se pueden usar varias técnicas para
manipular los ácidos nucleicos de los extremos romos con el fin de
formar extremos cohesivos, por ejemplo, se pueden usar moléculas
ligadoras para adicionar bases de nucleótidos o se pueden usar
enzimas apropiadas para eliminar bases de nucleótidos de los
extremos nivelados. Los métodos y materiales para lograr esto son
bien conocidos en la materia.
La PCR es también una herramienta efectiva para
clonar genes conocidos (en sitios romos o pegajosos). Los cebadores
pueden codificar entre 25 y 40 bases de secuencia conocida y el
producto de la PCR resultante se puede clonar en un vector digerido
que tenga extremos romos eliminando cualquier posible 3' que
sobresalga con ADN polimerasa T4. Otro método de unir secuencias
con el uso de la reacción PCR es crear sitios de restricción en
el(los) extremo(s) del ADN amplificado. Estos sitios
de restricción se adicionan fácilmente a los extremos 5' de los
cebadores usados para la amplificación. La digestión de los
productos PCR purificados producirá extremos para la ligación a
otro ADN que tenga extremos compatibles.
Debe apreciarse que la digestión del plásmido
seleccionado con una(s) endonucleasa(s) de restricción
puede dar como resultado la formación de dos o más segmentos de ADN
lineales. El segmento a usar para formar el vector de clonación, es
decir, el segmento que tiene el gen de identidad fenotípico, el
replicón y los otros componentes deseados, se puede identificar
mediante técnicas bien conocidas, tales como mediante electrofóresis
en gel.
El vector de clonación resultante se usa para
transformar un microorganismo hospedador. Los transformados se
aíslan y se analizan en relación con la presencia de los genes
foráneos y en relación con la orientación correcta de los genes
dentro del vector. A continuación, los transformados se multiplican
en cultivo para conseguir la replicación del vector y la expresión
de alto nivel del polipéptido híbrido que se está buscando.
Adicionalmente, los vectores de clonación se pueden usar para
transformar otras cepas el hospedador seleccionado u otros tipos de
hospedadores para una producción a gran escala del polipéptido
heterólogo híbrido. Old y Primrose, Principles of Gene
Manipulation, (2ª Ed. 1981) describen varios procedimientos y
materiales para preparar vectores recombinantes, transformar
células hospedadoras con los vectores, replicar el vector y expresar
el polipéptido y proteínas.
Para llevar a cabo la presente invención, se
pueden utilizar varios vectores de clonación. Aunque se prefiere el
uso de un plásmido, el vector puede ser un bacteriófago o cósmido.
Si la clonación tiene lugar en células de mamíferos o vegetales,
como vectores se pueden usar virus. Si se utiliza un plásmido, el
mismo se puede obtener a partir de una fuente natural o se puede
sintetizar artificialmente. El plásmido particular seleccionado
debería ser compatible con las células particulares que actúan como
hospedador, ya sean una bacteria tal como Escherichia coli
(E. coli), levadura, u otro microorganismo unicelular. El
plásmido debería tener el origen de replicación (replicón) correcto
para la célula hospedadora particular seleccionada.
Adicionalmente, el tamaño del plásmido debe ser
suficiente para alojar los genes híbridos que codifican tanto el
péptido diana como el polipéptido de identificación, aunque también
con un peso molecular lo más bajo posible. Los plásmidos de bajo
peso molecular son más resistentes a daños por cizalladura y se
aíslan más fácilmente con respecto a células hospedadoras. Si se
obtienen a partir de fuentes naturales, los mismos habitualmente
están presentes en forma de múltiples copias, facilitando de este
modo su aislamiento. Además, existe menos probabilidad de que un
plásmido de bajo peso molecular tenga sitios de sustratos múltiples
para endonucleasas de restricción.
Otro requisito para un plásmido vector de
clonación es la presencia de sitios de restricción de manera que el
adecuado de entre los enzimas de restricción pueda escindir el
plásmido para su ligación subsiguiente con los genes foráneos sin
provocar inactivación del replicón. Con este fin, resultaría útil
que el plásmido tuviera sitios de sustrato único para un gran
número de endonucleasas de restricción.
Tal como se ha indicado anteriormente, puede
haber dominios espaciadores de aminoácidos interpuestos entre los
dominios antigénicos múltiples del polipéptido de identificación.
Variando la secuencia de ADN triplete que representa aminoácidos
específicos (es decir, codones) en el diseño de estos dominios
espaciadores, es posible crear múltiples sitios enzimáticos de
restricción para enzimas que reconocen y escinden dichas secuencias
diseñadas sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido de
identificación codificado. Se prefiere el uso de secuencias que
codifican sitios de reconocimiento para enzimas de restricción que
tienen un mínimo de 6 bases en el sitio de reconocimiento,
reduciendo de este modo la opción de que haya presentes múltiples
sitios de restricción tanto en el vector de ADN como en las
secuencias de ADN que codifican el péptido diana.
De forma similar, se usa una secuencia de unión
para unir las secuencias de ADN que codifican el péptido diana a
las secuencias de ADN que codifican los múltiples dominios
antigénicos del polipéptido de identificación. Variando la
secuencia de ADN triplete que representa aminoácidos específicos en
el diseño de la secuencia de unión, es posible crear sitios de
restricción para enzimas que reconocen y escinden dichas secuencias
diseñadas sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido
de identificación codificado. Se prefiere el uso de secuencias que
codifican sitios de reconocimiento para enzimas de restricción que
tienen un mínimo de seis bases en el sitio de reconocimiento; esto
reduce la opción de que haya presentes múltiples sitios escindibles
de enzimas de restricción tanto en el vector como en las secuencias
que codifican el péptido diana. Por otra parte, el plásmido debería
tener una propiedad fenotípica que permita que las células
hospedadoras transformadas se identifiquen y separen fácilmente de
células que no experimentan transformación. Dichos genes de
selección fenotípica pueden incluir genes que proporcionan
resistencia a una sustancia inhibidora del crecimiento, tal como un
antibiótico. Los plásmidos que incluyen genes resistentes a varios
antibióticos, tales como tetraciclina, estreptomicina, sulfamidas,
penicilina y ampicilina, no están disponibles de forma generalizada.
Cuando se cultivan células hospedadoras en un medio que contiene
uno de estos antibióticos, sobrevivirán solamente los transformados
que presenten el gen apropiado de resistencia a antibióticos.
En lugar de utilizar una resistencia génica a un
compuesto de inhibición del crecimiento para identificar células
hospedadoras transformadas, los genes de selección fenotípica
también pueden incluir aquellos que proporcionan un factor de
crecimiento para permitir que las células transformadas se propaguen
en un medio que carezca del factor de crecimiento necesario para
las células hospedadoras. Por ejemplo, para auxótrofos de levadura,
dichos factores de crecimiento incluyen triptófano o leucina.
Alternativamente, se prefiere que una secuencia
de ADN que codifica un péptido señal se una a las secuencias que
codifican el polipéptido de identificación y el péptido diana. El
uso de una secuencia señal secretada permitirá también que las
células hospedadoras transformadas sean identificadas y separadas
fácilmente con respecto a células que no experimentan
transformación. Las señales de secreción son relativamente cortas en
la mayoría de especies, compuestas generalmente por entre 16 y 40
aminoácidos. Adicionalmente, las secuencias señales de genes
bacterianos o eucariotas se conservan altamente en términos de
función. Aunque las secuencias de ADN que codifican estos péptidos
señal no se conservan altamente, se ha demostrado que muchas de
estas secuencias señal son intercambiables. Véase Grey, G. L. et
al., Gene 39:247 (1985).
Una vez que se ha construido un vector de ADN
adecuado que codifica el polipéptido híbrido deseado, el vector se
introduce en la célula hospedadora deseada. Aunque la célula
hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota
adecuada, preferentemente es una bacteria bien definida, tal como
E. coli o una cepa de levadura. Ambos hospedadores
mencionados se transforman fácilmente y tienen capacidad de
crecimiento rápido en cultivos de fermentación. En lugar de E.
coli, se pueden utilizar otros microorganismos unicelulares,
por ejemplo, hongos y algas. Adicionalmente, el E. coli se
puede sustituir por otras formas de bacterias tales como salmonela
o neumococo. Sea cual sea el hospedador seleccionado, debería ser
uno que no contenga ningún enzima de restricción que escinda al
plásmido recombinante y que disponga de las vías bioquímicas
necesarias para la expresión fenotípica y otras funciones para una
expresión correcta del polipéptido híbrido.
Las moléculas de ADN se transfectan en
hospedadores procariotas y eucariotas usando protocolos normalizados
conocidos en la técnica. De forma breve, se hace que las células
hospedadoras procariotas sean competentes mediante tratamiento con
soluciones de cloruro de calcio (las células bacterianas competentes
están disponibles comercialmente y se elaboran fácilmente en el
laboratorio). Este tratamiento permite la captación de ADN por la
célula bacteriana. Otros medios de introducción del ADN en células
bacterianas es la electroporación en la que se usa un impulso
eléctrico para permitir la captación de ADN por células bacterianas.
De forma similar, protocolos normalizados tales como
coprecipitación de ADN con fosfato cálcico, transfección mediada con
DEAE-dextrano, electroporación, microinyección,
lipofección, fusión de protoplastos, infección retroviral, bombardeo
de partículas (por ejemplo, biolística) se usan comúnmente para la
introducción de moléculas de ADN en hospedadores eucariotas,
incluyendo levadura y eucariotas superiores.
En los protocolos de transformación, únicamente
se transforma realmente una pequeña parte de las células
hospedadoras, debido a la captación limitada del plásmido por las
células. De este modo, antes de aislar los transformados, las
células hospedadoras usadas en el protocolo de transformación
típicamente se multiplican en un medio apropiado. Las células que
realmente sean transformados se pueden identificar colocando el
cultivo original en placas de agar que contengan un medio de
crecimiento adecuado que contenga el identificador fenotípico, tal
como un antibiótico. Únicamente sobrevivirán aquellas células que
tengan el gen resistente adecuado. Las células de las colonias que
sobrevivan se puede lisar y a continuación el plásmido se puede
aislar del lisado. El plásmido así aislado se puede caracterizar
para determinar si los genes cointegrados están ligados en la
orientación correcta, mediante digestión con endonucleasas de
restricción y una electrofóresis en gel subsiguiente o también con
otros métodos normalizados.
Una vez que se han identificado las células
transformadas, las mismas se pueden multiplicar mediante técnicas
establecidas, tales como por fermentación. Adicionalmente, los
plásmidos recombinantes clonados recuperados se pueden usar para
transformar otras cepas de bacterias u otros tipos de células
hospedadoras para una replicación y expresión a gran escala del
polipéptido híbrido.
Las moléculas del polipéptido híbrido expresadas
por las células hospedadoras transformadas se separan del medio de
cultivo, otro material celular, etcétera, preferentemente mediante
un proceso de cromatografía de afinidad. Con este fin, se deben
generar anticuerpos contra los dominios antigénicos del polipéptido
de identificación del polipéptido híbrido para su uso en una matriz
de columna. Para producir dichos anticuerpos, en primer lugar el
polipéptido de identificación se sintetiza y a continuación se usa
para inmunizar un animal adecuado para la producción de un
anticuerpo contra el polipéptido de identificación. Dichos métodos
para la producción de anticuerpos se dan a conocer en la patente U.
S. n.º 4.851.341. El anticuerpo se puede identificar mediante un
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (Elisa) u otro ensayo
apropiado. A continuación, se puede producir un monoclonal mediante
técnicas de hibridoma. Los anticuerpos preferidos son los
anticuerpos monoclonales FLAG® M1, M2 y M5. Después de la
purificación, el anticuerpo o anticuerpos se unen a la matriz de
columna y a continuación un extracto de las células hospedadoras
transformadas se aplica a la columna para aislar el polipéptido
híbrido. El polipéptido híbrido se eluye de la columna, por ejemplo,
por competición con respecto al polipéptido de identificación
libre.
Adicionalmente, si el polipéptido de
identificación contiene histidina, glicina o combinaciones de
residuos de histidina múltiple o alternada, se puede usar la
Cromatografía de Afinidad con Iones Metálicos Inmovilizados (IMAC)
como método alternativo para aislar y purificar péptidos diana.
Cuando se produce un polipéptido híbrido que contiene el péptido
diana y el polipéptido de identificación, y el mismo se hace pasar
a través de una columna que contiene iones metálicos inmovilizados,
el polipéptido híbrido se quelará los iones metálicos
inmovilizados. El polipéptido híbrido debería quelarse a los iones
metálicos inmovilizados durante una cantidad de tiempo suficiente
como para permitir su separación de otros materiales. Una vez que
el polipéptido híbrido está unido a la resina con iones metálicos,
el polipéptido híbrido se puede liberar mediante protonación de su
ligando asociado de unión a iones metálicos. La disociación se logra
reduciendo el pH del medio tampón circundante, un método común
conocido en la técnica para eluir proteínas unidas. A continuación,
el péptido diana se puede escindir del polipéptido de identificación
tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
Se pueden usar otros métodos para detectar,
monitorizar o aislar péptidos diana. Dichos métodos incluyen la
inmunoprecipitación y el Western blotting tal como se describe en
"Principles and Practice of Immunoassay", Price and Newman,
eds:, Stochton Press, 1991. El uso de la inmunoprecipitación como
técnica sensible y específica para detectar y cuantificar antígeno
diana en mezclas de proteínas es conocido para los expertos en la
materia. Véase Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición,
Maniatis, T. et al. eds. (1989) Cold Spring Harbor Press.
Resumiendo, se pueden usar anticuerpos, preferentemente anticuerpos
monoclonales FLAG®, M1, M2 ó M5 capaces de unirse a los dominios
antigénicos del polipéptido de identificación para detectar las
proteínas usando ensayos de inmunoprecipitación. Tal como se ha
descrito anteriormente, las células se transforman con el
polipéptido de identificación, cultivadas en medios de cultivo, y
lisadas para obtener una solución de material proteico etiquetado
producido por las células. Esta solución se incuba con una solución
de anticuerpos monoclonales, y cualquier complejo entre la proteína
marcada con el polipéptido de identificación formada en la célula y
los anticuerpo se determina por precipitación. El complejo
proteína/anticuerpo a continuación se puede aislar del precipitado.
Seguidamente, la presencia de la proteína marcada se confirma
mediante métodos analíticos habituales, por ejemplo, electrofóresis
en gel de poliacrilamida con SDS con fluorografía, en condiciones
que disocien el complejo proteína/anticuerpo.
Adicionalmente, el Western blotting es otra
técnica de inmunoensayo usada para detectar el péptido diana. En
general, pequeñas cantidades de un péptido diana se someten a
electrofóresis sobre un gel de poliacrilamida y se transfieren (por
blotting) a una lámina o membrana polimérica. A continuación, la
membrana se incuba con un primer anticuerpo, preferentemente un
anticuerpo monoclonal FLAG® que se puede unir a los dominios
antigénicos del polipéptido de identificación. A continuación, la
membrana que contiene el anticuerpo-antígeno se
incuba con un segundo anticuerpo marcado específico para el primer
anticuerpo. La proteína etiquetada con el polipéptido de
identificación se puede detectar y visualizar mediante métodos
conocidos tales como autorradiografía.
A no ser que se retire mientras está todavía
unido a la columna o matriz de afinidad, el polipéptido de
identificación se puede escindir de la molécula de proteína y la
molécula de proteína se puede separar del polipéptido de
identificación, dando como resultado de este modo una proteína
purificada. Esto se logra suspendiendo en primer lugar las
moléculas de proteína/polipéptido de identificación híbrido en
tampón. Después de esto, a la suspensión se le adiciona la enzima
proteolítica u otro agente proteolítico químico que sea específico
para los residuos de aminoácidos que componen la parte de unión del
polipéptido de identificación. La enzima se puede acoplar a una
matriz de gel para evitar la contaminación de la solución del
producto con la enzima. Tal como se ha descrito anteriormente, la
enzima proteolítica o agente proteolítico químico escinde al
polipéptido híbrido entre los residuos de aminoácidos adyacentes de
la parte de unión del polipéptido de identificación y la molécula
de proteína. También tal como se ha indicado anteriormente, como
ejemplo no limitativo, los aminoácidos de unión pueden estar
compuestos por la secuencia:
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(ID SEC n.º: 3). Se sabe que esta secuencia particular de
aminoácidos se produce solamente de forma natural en la proteína
tripsinógeno, el sustrato para la enteroquinasa de mucosa bovina.
De este modo, mediante el uso de esta secuencia de aminoácidos
particular, es altamente improbable que la escisión por enzimas de
las moléculas de proteína polipéptido de identificación híbrido
provoque también la escisión de la propia molécula de proteína.
Después de la incubación, la proteína deseada se
purifica de la manera siguiente. Si el agente proteolítico es una
enzima fijada a una matriz de gel, la suspensión se centrifuga y el
pellet (que contiene el conjugado enzima-gel) se
descarta. El sobrenadante contiene solamente el producto proteico,
el polipéptido de identificación escindido y posiblemente pequeñas
cantidades de molécula péptido/proteína sin escindir, además de
sales tampón. En el caso de agentes de escisión química, no habría
etapa de centrifugación del gel, y la solución contendría un agente
químico residual y subproductos de agente químico además del
producto proteico, el polipéptido de identificación y pequeñas
cantidades de molécula péptido/proteína sin escindir.
La mayoría de las sustancias contaminante antes
mencionadas son mucho menores que el producto proteico y se pueden
eliminar eficazmente por medios sencillos, tales como filtración en
gel o diálisis. Después de dichas etapas, únicamente quedaría la
molécula de proteína/polipéptido de identificación sin escindir para
contaminar el producto proteico. Para eliminar la molécula
polipéptido/proteína del producto proteico, la mezcla se hace pasar
sobre una segunda columna de afinidad, teniendo fijada a ella dicha
columna el mismo anticuerpo específico para el polipéptido de
identificación que el que se usó para la eliminación de la molécula
péptido/proteína del medio de producción original. El anticuerpo une
la molécula polipéptido/proteína no deseada, y el eluato de la
columna contiene solamente la proteína de producto deseado, en este
momento libre de todos los contaminantes.
Si se usa una enzima soluble para la escisión
proteolítica, entonces el producto proteico puede contener pequeñas
cantidades de la enzima, que se pueden eliminar haciendo pasar la
solución sobre una columna de afinidad que contenga un sustrato
inmovilizado para la enzima. De este modo, la enzima se une a la
columna y las moléculas proteicas deseadas se permiten pasar a
través de esta última.
Tal como se ha indicado anteriormente, algunos
productos proteicos poseerán la actividad enzimática deseada con el
polipéptido de identificación todavía fijado a ellos. Como
consecuencia, no es necesario escindir el polipéptido de
identificación de la molécula proteica, y por lo tanto no es
necesario realizar las etapas antes descritas de escisión y de
purificación subsiguiente.
Por otra parte, en situaciones en las que el
polipéptido de identificación permanece fijado a la molécula
proteica, la parte de unión del polipéptido de identificación no es
necesaria. En su lugar, el polipéptido de identificación puede
estar compuesto meramente por los dominios antigénicos. En esta
situación, la construcción y el método de preparación de los
vectores de expresión de ADN, antes detallados, se pueden modificar
apropiadamente.
Los siguientes ejemplos están destinados a
ilustrar, aunque no limitar, la presente invención.
El P3XFLAG-CMV-7 se
construyó a partir del vector de expresión de mamíferos,
pCMV-5. La secuencia FLAG triple se construyó a
partir de dos pares de oligonucleótidos complementarios.
El primer par de oligonucleótidos se sintetizó
de la manera siguiente:
5'GAAGAATTCACCATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGAT3' | (ID SEC n.º: 8) |
y | |
5'ATCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGAATTCTTC3' | (ID SEC n.º: 9). |
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo par se sintetizó con la siguiente
secuencia:
5'GAAGATATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGCTTGGG3' | (ID SEC n.º: 10) |
y | |
5'CCCAAGCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGATATCTTC3' | (ID SEC n.º: 11). |
El primer par de oligonucleótidos se apareó
conjuntamente y se digirió con EcoR I. El segundo par de
oligonucleótidos se apareó conjuntamente y se digirió con
EcoRV y HindIII. Los dos pares de casetes de
nucleótidos digeridos se ligaron en CMV-5, el cual
se ha digerido doblemente con EcoRI y HindIII. La
secuencia se verificó mediante secuenciación de ADN.
Una versión modificada del gen F. coli
pho A para el que se suprimieron la secuencia líder y los
cuatro aminoácidos N-terminales de la enzima madura
se subclonó en el vector
p3XFLAG-CMV-7. La secuencia
modificada se cortó del
pFLAG-ATS-BAP mediante doble
digestión con HindIII y BglII. A continuación, el
fragmento se clonó en p3XFLAG CMV-7 que se había
digerido doblemente con HindIII y BamHI para generar
p3XFLAG-CMV-7-BAP.
La secuencia de nucleótidos en el extremo N de la región codificante
phoA se verificó.
Se sintetizaron dos oligonucleótidos que
codificaban la cadena sentido y antisentido para la secuencia FLAG
triple, los mismos se fosforilaron en 5' con polinucleótido quinasa
del T4, y se aparearon entre sí. El
pFLAG-ATS-BAP se digirió con
NdeI y HindIII y el vector se purificó por
electrofóresis en gel. El casete apareado se ligó al vector
pFLAG-ATS-BAP doblemente digerido
con ADN ligasa del T4 y la reacción se llevó a cabo durante la
noche a 16ºC durante 16 horas. La ligación se enriqueció mediante
digestión con Nru I y a continuación se transformó en E.
coli DH5\alpha. Se aislaron clones y los mismos se verificaron
mediante secuenciación.
Los solicitantes han construido un vector para
la expresión de proteínas en células hospedadoras de mamíferos
usando una versión modificada del sistema de expresión FLAG, que
contiene secuencias 3XFLAG en tándem (Figura 1). Este constructo se
diseñó para mejorar el límite de detección de proteínas expresadas
en células hospedadoras de mamíferos. Los primeros dos péptidos
flag son secuencias FLAG modificadas. El epítopo FLAG® original es
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(ID SEC n.º: 1) mientras que las dos primeras secuencias de
reconocimiento flag son es
Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp
(ID SEC n.º: 12) con el dominio espaciador o bien Gly ó IIe entre
las dos secuencias. Estas secuencias alternativas surgen de los
estudios de presentación en fagos (phage display) en los que
se determinó un motivo de unión diferente. Véase Miceli et
al., J. Immunological Methods 167:279-287
(1994). Esto permite la introducción de sitios de unión a
anticuerpos FLAG adicionales sin la adición de sitios de
reconocimiento/escindibles de enteroquinasa extras.
El vector de expresión
p3XFLAG-CMV-7 contiene la región
promotora del citomegalovirus humano necesaria para la expresión
constitutiva de genes clonados en muchas líneas celulares de
mamíferos. En el vector se proporciona la secuencia de consenso
Kozak junto con un sitio de clonación múltiple, lo cual permite una
variedad de estrategias de clonación. El sitio de clonación
múltiple es compatible con los otros vectores de expresión de
mamíferos CMV existentes. Adicionalmente, el vector de expresión
contiene el origen de replicación del SV40 para una expresión
transitoria eficaz de alto nivel y un segmento de ADN de la hormona
del crecimiento humano que contiene una secuencia de terminación de
transcripción y señales de poliadenilación. El
p3XFLAG-CMV-7 contiene el gen de la
\beta-lactamasa para la selección del plásmido en
E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
E. coli BL21 (DE3) se transformaron con
el plásmido de expresión que contenía el constructo BAP FLAG triple
realizado según los métodos del Ejemplo 1. Se cultivaron células en
terrific broth que contenía 100 \mug/ml de ampicilina a
37ºC con agitación. El cultivo se desarrolló a un OD_{600}=4,0 y a
continuación se indujo con IPTG a una concentración final de 1 mM.
El cultivo celular se desarrolló durante 3 horas adicionales a 37ºC
y a continuación se recolectó mediante centrifugación. El pellet
celular se resuspendió en Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y
las células se disgregaron mediante sonicación y los residuos
celulares se eliminaron por centrifugación. El sobrenadante se
aplicó a gel de afinidad a M2 y se equilibró con
Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl (TBS) 150 mM. La resina
se lavó con 20 volúmenes de lecho de TBS y a continuación el BAP
FLAG triple se eluyó con cinco volúmenes de columna de Glicina 0,1
M pH 3,5. La proteína eluída se agrupó y se ajustó a un pH 7,5 con
Tris-HCl 1,0 M pH 8,0. El contenido de proteínas se
determinó mediante técnicas tanto Bradford como por absorbancia
usando \varepsilon_{280}=0,7 ml/mg.
3XFLAG-BAP y
N-BAP purificados se diluyeron con tampón Laemlli
2X, se hirvieron durante cinco minutos y a continuación se
colocaron en hielo. Las muestras se resolvieron en un
SDS-PAGE al 15% usando el método de Laemlli
(Laemlli, V., Nature, 227:680-685 (1970)) y a
continuación se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. La
membrana se bloqueó con solución salina tamponada con fosfato que
contenía un 3% de leche en polvo desnatada durante 1 hora y a
continuación se enjuagó tres veces en TBS, 0,05% Tween 20
(TBS-T). La membrana se incubó con anticuerpo M2 a
una concentración final de 10 \mug/ml durante 30 minutos en
TBS-T y a continuación se enjuagó tres veces en
TBS-T. A continuación, la membrana se incubó durante
30 minutos con un conjugado de IgG de cabra anticonejo (molécula
completa) y peroxidasa de Rábano (HRP) diluído 1:10.000 en
TBS-T, a continuación se enjuagó tres veces en
TBS-T. La proteína etiquetada con FLAG se detectó
con los conjugados de HRP y se visualizó mediante detección
quimioluminiscente usando ECL (Amersham) y película
X-Omat MR Kodak según las directrices del
fabricante con exposiciones de entre 1 y 30 minutos.
Para afrontar la cuestión de si una proteína de
fusión FLAG triple produce una respuesta más sensible que el
epítopo FLAG® tradicional, se construyó una versión FLAG triple de
fosfatasa alcalina bacteriana para su expresión en E. coli.
El vector p3xFLAG-ATS-BAP se
transformó en E. coli y el 3XFLAG-BAP se
expresó y purificó tal como se describe en la sección de material y
métodos. Adicionalmente, también se expresó y purificó un
N-FLAG-BAP que contenía el epítopo
FLAG® tradicional DYKDDDDK (ID SEC n.º: 1). La comparación de la
sensibilidad del FLAG-BAP sencillo con respecto al
triple se obtuvo mediante análisis de western blot tal como se ha
descrito anteriormente. La Figura 4 muestra el western blot de un
flag sencillo y triple purificado, sondeado con anticuerpo antiFLAG
M2 y detectado por quimioluminiscencia. Los resultados indican
claramente que se produce un aumento de 10 veces en el límite de
detección del FLAG-BAP triple en comparación con la
proteína de fusión FLAG-BAP sencilla. Los
solicitantes pudieron detectar 500 picogramos de fosfatasa alcalina
bacteriana con Flag 3X purificada con exposiciones de un valor tan
breve como 1 minuto. Con un aumento del tiempo de exposición, se ha
logrado una detección de un valor tan bajo como 100 picogramos pero
con el nivel de fondo aumentado. Los solicitantes han demostrado
también por lo
menos una detección incrementada en 10 veces tanto en el ensayo de transferencia puntual (dot blot) como de ELISA.
menos una detección incrementada en 10 veces tanto en el ensayo de transferencia puntual (dot blot) como de ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células COS-7
sobre placas de 35 mm^{2} en Medio de Eagle Modificado (DME) de
Dulbecco, que contenía un 10% de suero bovino fetal,
L-glutamina 4 mM, 5 \mug/ml de gentamicina. Las
células se desarrollaron a 37ºC en un incubador de CO_{2}
humidificado con 5% CO_{2}. La transfección del plásmido
p3XFLAG-CMV7-BAP se logró usando
Lipofectamina (Life Technologies Inc., Gaithersburg MD.) según las
directrices del fabricante. Se usaron dos microgramos de ADN vector
para la transfección. A las 72 horas
post-transfección se realizó una inmunotinción.
A las 72 horas post-inducción,
las células se lavaron con Tris-HCl 50 mM pH 7,4,
NaCl 150 mM (TBS). Las células se fijaron con una mezcla de
metanol-acetona 1:1 (v/v) durante 1 minuto. Las
células fijadas se lavaron cuatro veces con TBS y a continuación se
incubaron con 10 \mug/ml de conjugado de anticuerpo
M2-HRP en TBS durante 1 hora. Las células se
lavaron con TBS cinco veces y el conjugado de anticuerpo
M2-HRP se visualizó con 0,01 mg/ml de
o-dianisidina, 0,015% peróxido de hidrógeno recién
preparados, en TBS. Las células se tiñeron durante aproximadamente
durante aproximadamente 15 minutos.
El
p3XFLAG-CMV-7-BAP
(Figura 2) se transfectó en células COS-7 tal como
se describe en la sección de materiales y métodos. A las 72 horas
post-transfección, las células se analizaron por
inmunotinción usando un conjugado de anti-FLAG M2
HRP. En la Figura 3 se muestra una microscopia óptica de las células
detectadas con anticuerpo M2, y visualizadas con
o-dianisidina.
Los solicitantes han creado un plásmido de
expresión de mamíferos que contiene múltiples epítopos FLAG® en
tándem, p3X FLAG CMV-7, diseñados para expresión
intracelular con un aumento de la sensibilidad de detección. Este
vector contiene el promotor del citomegavirus (CMV) y el origen de
replicación del SV40 para obtener una expresión eficaz en células
COS-7. Por otra parte, se comparó la detección de
BAP etiquetada con FLAG triple, expresada y purificada a partir de
E. coli, con BAP etiquetada con FLAG sencillo.
El epítopo etiqueta FLAG® se ha usado
eficazmente para detectar y purificar proteínas en sistemas
mamíferos y bacterianos. Los solicitantes han demostrado que la
presencia de tres epítopos FLAG hace que aumente significativamente
el límite de detección de fosfatasa alcalina bacteriana purificada.
Por otra parte, el 3X FLAG-BAP no se puede eluir de
un gel de afinidad a M2 anti-FLAG por competición
con el péptido FLAG® original. No obstante, el
3XFLAG-BAP y el 1XFLAG-BAP se pueden
eluir competitivamente del gel de afinidad al M2
anti-FLAG usando un péptido 3X FLAG. El vector
p3XFLAG-CMV-7 se diseño para la
expresión y detección de proteínas heterólogas en células de
mamíferos y es compatible con vectores pFLAG-CMV
existentes, permitiendo de este modo una subclonación sencilla
entre vectores que contienen el FLAG sencillo y el FLAG triple. Los
resultados de la inmunotinción muestran que la expresión del gen
pho A en células COS-7 no se ve perturbada
significativamente por la adición de la secuencia 3X FLAG.
El anticuerpo M2 reacciona con el FLAG alterno
en la secuencia 3X FLAG. Por contraposición, el anticuerpo M5 no
consigue mostrar el aumento de sensibilidad que muestra claramente
el anticuerpo M2. Resultados recientes que hacen uso de la
presentación en fagos (phage display) han demostrado que los
residuos críticos para la unión M2 y la unión M5 son ligeramente
diferentes. El anticuerpo M2 prefiere la secuencia
Asp-Tyr-Lys-XXX-XXX-Asp-XXX-XXX
(ID SEC n.º: 13) mientras que el M5 prefiere
Asp-Tyr-XXX-XXX-Asp-Asp-
XXX-XXX (ID SEC n.º: 14). La secuencia FLAG triple
Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp
(ID SEC n.º: 12) favorece claramente la unión del M2 con respecto a
la del M5 ó incluso el anticuerpo M1.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis termodinámico de la unión del
anticuerpo M2 a los epítopos FLAG se midió por calorimetría de
titulación isotérmica usando un calorímetro OMEGA (Microcal). Todas
las muestras se dializaron frente a PBS que contenía 0,05% azida
sódica y se desgasificaron antes de las mediciones. Todas las
mediciones se realizaron a 25ºC. La concentración del anticuerpo M2
estaba entre 15 y 50 uM dependiendo de qué muestras se usaban. La
concentración de los titulantes fue 605 uM para el 1X BAP, 1.110 uM
para el péptido 1X FLAG, 400 uM para el BAP 3X, y 580 uM para el
péptido 3X FLAG. Se efectuaron inyecciones entre cada 2,5 y 3,0
minutos lo cual resultó suficiente para lograr una referencia con
volúmenes de inyección comprendidos entre 4 y 11 uL. Las
inyecciones se llevaron a cabo durante un periodo de entre 4 y 10
segundos mientras se agitaba a 400 rpm.
Se realizaron un análisis y ajuste de datos
usando el software Origin suministrado por MicroCal. Las entalpías
se obtuvieron por integración numérica de los datos y sustracción de
los calores de dilución. Se determinaron valores de Ka, siendo n el
número de sitios de unión, ajustando los datos a una curva teórica
y manteniendo constante solamente la entalpía durante el proceso de
ajuste.
En el caso del sistema 1X FLAG, Ka resultó lo
suficientemente pequeña de modo que el valor r<1.000 en el que r
= KaMt(0), con Mt(0), es la concentración inicial del
anticuerpo M2 en la célula. Para el sistema 3X FLAG, la Ka fue
suficientemente grande de tal manera que no se puede determinar una
r>1.000 que indica un sistema de unión ajustado y por lo tanto
mediciones precisas sobre la Ka.
Los solicitantes han demostrado que la
colocación de tres epítopos en tándem produce un aumento en la
constante de asociación que es claramente más de un orden de
magnitud mayor que el correspondiente un epítopo, tal como se
muestra en la Tabla 1.
Los valores Ka para el péptido de un solo
epítopo y el BAP de un solo epítopo son similares lo cual hace
alusión a mecanismos de unión comparables. Para los sistemas de tres
epítopos, los valores de Ka tanto del epítopo péptido como de los
epítopos en BAP sugieren también mecanismos comparables. El aumento
de nivel de detección observado en el sistema del FLAG triple es
debido principalmente a un aumento en la constante de
asociación.
<110> BRIZZARD, BILLY L.
\hskip1cmHERNAN, RON
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES FUSIONADAS CON MÚLTIPLES EPÍTOPOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SGM6933
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/415,000
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-10-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintetizada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es un aminoácido no ácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es un aminoácido excepto Prolina o
Arginina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es un aminoácido excepto Prolina o
Arginina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es un aminoácido excepto Prolina o
Arginina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagaattca ccatggacta caaagaccat gacggtgatt ataaagatca tgat
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcatgatct ttataatcac cgtcatggtc tttgtagtcc atggtgaatt cttc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatatcg attacaagga tgacgatgac aagcttggg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttg tcatcgtcat ccttgtaatc gatatcttc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNA_BIND
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNA_BIND
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNA_BIND
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNA BIND
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (17)
1. Polipéptido de identificación para ser usado
en la purificación de una molécula de péptido diana, en el que el
polipéptido de identificación comprende la secuencia de
aminoácidos
X^{20}-(X^{1}-Y-K-X^{2}-X^{3}-D-X^{4})_{n}-X^{5}-(X^{1}-Y-K-X^{7}-X^{8}-D-X^{9}-K)-X^{21}
en la
que:
- \quad
- D, Y y K son sus aminoácidos representativos;
- \quad
- X^{20} es hidrógeno o un enlace;
- \quad
- X^{21} es hidrógeno o un enlace covalente que une el polipéptido de identificación a una molécula de péptido diana;
- \quad
- cada X^{1} y X^{4} es de forma independiente un enlace o por lo menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina;
- \quad
- cada X^{2}, X^{3}, X^{7} y X^{8} es de forma independiente un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina;
- \quad
- X^{5} es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de aminoácido;
- \quad
- X^{9} es un enlace o un residuo de aspartato; y
- \quad
- n es por lo menos 2, y
en el que el sitio escindible
representado por la secuencia
X^{7}-X^{8}-D-X^{9}-K
no está situado en el, o interpuesto entre múltiples copias del,
dominio antigénico
X^{1}-Y-K-X^{2}-X^{3}-D.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polipéptido de identificación según la
reivindicación 1, en el que:
- \quad
- X^{5} es un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de histidina, por lo menos un residuo de glicina o una combinación de residuos de histidina alternados o múltiples, comprendiendo dicha combinación His-Gly-His, o -(His-X)_{m}-, en la que m es de 1 a 6 y X se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val, Leu, Ser, Lys, Phe, Met, Ala, Glu, IIe, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, y Pro.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Polipéptido de identificación de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que X^{1} es Asp
y X^{4} es un enlace.
4. Polipéptido de identificación de la
reivindicación 3 en el que el polipéptido de identificación
comprende además X^{10} de tal manera que el polipéptido de
identificación comprende la secuencia de aminoácidos
X^{20}-X^{10}-(D-Y-K-X^{2}-X^{3}-D)_{n}-X^{5}-(D-Y-K-X^{7}-X^{8}-D-X^{9}-K)-X^{21}
en la que X^{10} es un enlace,
cualquier residuo de aminoácido, o un residuo de
metionina.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Polipéptido de identificación de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cada X^{2} y
X^{3} es de forma independiente una secuencia quelante de metal
que comprende por lo menos un residuo de histidina, por lo menos un
residuo de glicina o una combinación de residuos de histidina
múltiples o alternados, comprendiendo dicha combinación
His-Gly-His, o
-(His-X)_{m}-, en la que m es de 1 a 6 y X
se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val,
Leu, Ser, Lys, Phe, Met, Ala, Glu, IIe, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg,
Cys, y Pro.
6. Polipéptido de identificación de la
reivindicación 5, en el que el polipéptido de identificación
comprende la secuencia:
M-D-Y-K-D-H-D-G-D-Y-K-D-H-D-I-D-Y-K-D-D-D-D-K-X^{21}
en la que X^{21} es hidrógeno o
un enlace covalente que une el polipéptido de identificación a una
molécula de péptido
diana.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Polipéptido de identificación para ser usado
en la purificación de una molécula de péptido diana, en el que el
polipéptido de identificación comprende la secuencia de
aminoácidos
X^{20}-(D-X^{11}-Y-X^{12}-X^{13})_{n}-X^{14}-(D-X^{11}-Y-X^{12}-X^{13}-D-X^{15}-K)-X^{21}
en la
que:
- \quad
- D, Y y K son sus aminoácidos representativos;
- \quad
- X^{20} es hidrógeno o un enlace;
- \quad
- X^{21} es hidrógeno o un enlace covalente que une el polipéptido de identificación a una molécula de péptido diana;
- \quad
- cada X^{11} es un enlace, cualquier residuo de aminoácido, o un residuo de lisina;
- \quad
- cada X^{12} es un aminoácido seleccionado de grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina;
- \quad
- cada X^{13} es un enlace o por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo consistente en residuos de aminoácidos aromáticos y lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina;
- \quad
- X^{14} es un enlace o un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de aminoácido;
- \quad
- X^{15} es un enlace o un residuo de aspartato; y
- \quad
- n es por lo menos 2,
en el que el sitio escindible
representado por la secuencia
X^{12}-X^{13}-D-X^{15}-K
no está situado en el, o interpuesto entre múltiples copias del,
dominio antigénico
D-X^{11}-Y-X^{12}-X^{13}.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Polipéptido de identificación según la
reivindicación 7, en el que:
- \quad
- X^{14} es un dominio espaciador que comprende por lo menos un residuo de histidina, por lo menos un residuo de glicina o una combinación de residuos de histidina múltiples o alternados, comprendiendo dicha combinación His-Gly-His, o -(His-X)_{m}-, en la que m es de 1 a 6 y X se selecciona del grupo consistente en Gly, His, Tyr, Trp, Val, Leu, Ser, Lys, Phe, Met, Ala, Glu, IIe, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, y Pro.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Polipéptido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que X^{21} es hidrógeno.
10. Polipéptido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el polipéptido comprende además
un péptido diana unido a la secuencia de unión de tal manera que la
secuencia de unión está entre las múltiples copias del dominio
antigénico y la molécula del péptido diana.
11. Polipéptido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que X^{21} es un enlace covalente
que une el polipéptido de identificación a una molécula de péptido
diana y el polipéptido comprende además un péptido diana unido a la
secuencia de unión de tal manera que la secuencia de unión está
entre las múltiples copias del dominio antigénico y la molécula del
péptido diana.
12. Segmento de ADN que codifica un polipéptido
de identificación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.
13. Vector de expresión de ADN que comprende ADN
que codifica un polipéptido híbrido que comprende un polipéptido
diana y un polipéptido de identificación según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
14. Vector de expresión de ADN de la
reivindicación 13 en el que el ADN que codifica un polipéptido
híbrido comprende además un sitio de clonación múltiple que
comprende sitios de reconocimiento de enzimas de restricción
múltiples.
15. Método para producir un péptido diana, que
comprende:
- a.
- se transforman células hospedadoras con el vector de expresión de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14;
- b.
- se aísla e identifica dicho péptido diana extrayendo dicho péptido diana de dichas células hospedadoras transformadas; y
- c.
- se purifica el péptido diana mediante el uso de las propiedades de afinidad para ligandos del polipéptido de identificación.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Método de la reivindicación 15, en el que el
péptido diana se aísla e identifica por inmunoprecipitación y
Western blotting.
17. Método para purificar un polipéptido híbrido
que comprende un polipéptido de identificación de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5 y un péptido diana, en el que se usa una
columna que comprende una matriz y un anticuerpo creado contra el
dominio antigénico de uno cualquiera de los polipéptidos de
identificación de las reivindicaciones 1 a 5.
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