KR20100103595A - 비-글라이코실화된 단백질의 정제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제 1 크로마토그래피 단계가 i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 또는 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되고, 제 2 크로마토그래피 단계가 i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 또는 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되고, 제 3 크로마토그래피 단계가 i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피 또는 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되고, 금속 리간드와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드의 경우 제 1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피이고, 6.0 미만의 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 제 2 크로마토그래피 단계가 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계가 아니고, 낮거나 높은 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 제 3 크로마토그래피 단계가 플로우-쓰루(flow-through) 방식으로 수행될 수 있는, 원핵 세포에서 재조합 생성되는 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

비-글라이코실화된 단백질의 정제{PURIFICATION OF NON-GLYCOSYLATED PROTEINS}
본 발명은 폴리펩타이드 정제 분야에 관한 것이다. 3가지 크로마토그래피 단계의 조합을 이용하여 비-글라이코실화된 폴리펩타이드를 정제하는 방법이 보고되어 있다.
단백질은 오늘날의 의료 포트폴리오에서 중요한 역할을 한다. 인간에 적용하기 위해, 모든 약학 물질은 명확한 기준을 충족해야 한다. 인간에 대한 생물약제(biopharmaceutical agent)의 안전성을 보장하기 위해, 심각한 유해를 야기할 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질은 특별히 제거되어야 한다. 규제 내역을 충족시키기 위해, 하나 이상의 정제 단계가 제조 공정에 이어져야 한다. 무엇보다, 순도, 처리량 및 수율이 적절한 정제 공정을 결정하는데 중요한 역할을 한다.
친티오성(thiophilic) 리간드, Cu-킬레이트 또는 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예: 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예: 양이온 교환, 음이온 교환 및 혼합-모드 이온 교환), 친티오성 흡착, 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예를 들면, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)(문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech., 75 (1998) 93-102])과 같은 상이한 방법들이 단백질 정제에 잘 확립되어 있으며 널리 사용되고 있다.
재조합 폴리펩타이드는 예를 들면 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에 의해 생성될 수 있다. 재조합 생성된 폴리펩타이드는 원핵 세포의 폴리펩타이드 내용물의 대부분을 차지하며, 종종 원핵 세포 내부에서 불용성 응집체, 즉, 소위 봉입체로서 침착된다. 재조합 폴리펩타이드의 단리를 위해서, 세포가 붕괴되어야만 하고, 세포 부스러기로부터 봉입체를 분리한 후에 봉입체 내에 함유된 재조합 폴리펩타이드가 가용화되어야만 한다. 용해를 위해 카오트로픽(chaotropic) 시약, 예를 들면 우레아 또는 구아니디늄 하이드로클로라이드를 이용한다. 다이설파이드 결합을 쪼개기 위해서, 특히 알칼리 조건하에서 환원제, 예를 들면 다이티오에리트리톨, 다이티오트레이톨 또는 β-머캅토에탄올을 첨가한다. 응집된 폴리펩타이드가 용해된 후, 생물학적 활성에 필수적인 재조합 폴리펩타이드의 구형 구조가 재확립되어야만 한다. 이 소위 재생 과정동안, 변성제의 농도는, 예를 들면 변성된 폴리펩타이드가 그의 생물학적 활성 구조로 재절첩되는 것을 허용하는 적합한 완충액에 대해 투석함으로써 서서히 감소된다. 재생 후, 재조합 폴리펩타이드가 의도된 용도에 허용가능한 순도로 정제된다. 예를 들면, 치료 단백질로서 사용하기 위해서, 90% 이상의 순도가 확립되어야만 한다. 이. 콜라이로부터 수득된 재조합 생성된 폴리펩타이드에는 일반적으로 핵산, 내독소, 생산 세포에서 나온 폴리펩타이드 및 비-재생된 재조합 폴리펩타이드가 동반된다.
다수의 상이한 크로마토그래피 방법이 이용가능하기 때문에 적합한 정제 방법을 찾기 위해서는 다수의 조합을 시험해야만 한다. 이들 조합에서 서로 다른 순서, 심지어는 다른 수의 크로마토그래피 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 비-글라이코실화된 폴리펩타이드를 정제하기 위해 적합한 순서의 크로마토그래피 단계를 결정하는 방법이 바람직하다.
제WO2007/075283호에서, 다단 시스템 및 표적 분자 정제 방법이 보고되어 있다. 흥미있는 단백질을 포함하는 화합물을 정제하는 방법이 제WO2007/016250호에 보고되어 있다. 하나 또는 몇개의 공정 단계 만을 포함하는 재조합 단백질의 정제 방법이 제WO2006/101441호에 보고되어 있다. [(Rege, K., Biotechnol. Bioeng. 93 (2006) 618-630]은 재조합 단백질 정제를 위한 높은 처리량 공정 개발을 보고하고 있다. 제KR 2002/080108호에서는, 재조합 이.콜라이에서 인간 성장 호르몬을 정제하는 방법이 보고되어 있다.
본 발명의 제 1 양태는
a) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 또는 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는 제 1 크로마토그래피 단계,
b) i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 v) 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서 선택되는 제 2 크로마토그래피 단계,
c) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 3 크로마토그래피 단계의 순서로 상기 3가지 크로마토그래피 단계를 포함하며, 여기서, 금속 리간드와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드의 경우 제 1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피이고, 등전점이 6.0 미만인 폴리펩타이드의 경우, 제 2 크로마토그래피 단계가 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계가 아니고, 낮거나 높은 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 제 3 크로마토그래피 단계가 플로우-쓰루 방식으로 수행될 수 있고, 선택적으로 제 3 크로마토그래피 단계는 폴리펩타이드의 농축을 위해 이용될 수 있으며, 단계 c) 이후에 정제된 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 수득되는, 원핵 세포에서 재조합 생산되는 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드의 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 각각의 단계에 대한 크로마토그래피 물질이 주어진 단서조항만을 고려하여 이전 단계 또는 다음 단계에서 선택되는 크로마토그래피 물질과는 독립적으로 선택될 수 있는 3개 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 비-글라이코실화된 폴리펩타이드를 본 발명에 따른 방법에 가한 후에 수득된 순도가 선택된 크로마토그래피 단계 순서와 무관하게 유사한, 비-글라이코실화된 폴리펩타이드의 정제를 위한 유연하고 교환가능한 순서의 크로마토그래피 단계들을 제공한다.
한 양태에서, 원핵 세포는 이.콜라이 세포이다. 다른 양태에서, 친화성 크로마토그래피는 금속 킬레이팅 크로마토그래피이다. 또다른 양태에서, 방법은 단계 a), 단계 b) 또는 단계 c) 중 하나 다음에, 상기 폴리펩타이드를 PEG화시키는 추가의 단계 d)를 포함한다. 한 양태에서, 상기 단계 a) 및 b)는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 또다른 추가의 양태에서, 비-글라이코실화된 이종의 폴리펩타이드는 성장 인자 작용제 또는 길항제, 또는 인터페론 또는 인터페론 변이체에서 선택된다.
본 발명의 제 2 양태는 a) 이종 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건 하에서 이종 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 세포를 배양하는 단계;
b) 배양 배지 또는 원핵 세포로부터 이종 폴리펩타이드를 회수하는 단계;
c) 이종 폴리펩타이드를 본 발명에 따른 방법으로 정제하여 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 포함하는, 원핵 세포에서 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 재조합 생산하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 3개의 크로마토그래피 단계의 2개 이상의 상이한 순서가 유사한 순도를 갖는 정제된 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 생성한다는 점을 특징으로 한다. 한 양태에서, 제 3 크로마토그래피 단계는 낮은, 즉 6.0 이하의, 또는 높은, 즉, 8.0 이상의 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 플로우-쓰루 방식으로 수행될 수 있다.
도 1은 (a) 이전과 (b) 제 1 HCIC 이후의 IGF-1 작용제의 역상 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 (a) 이전과 (b) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계 이후의 IGF-1 작용제의 역상 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 (a) 이전과 (b) 제 2 HCIC 이후의 IGF-1 작용제의 역상 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 (a) 이전과 (b) HIC 이후의 IGF-1 작용제의 역상 HPLC 크로마토그램이다.
도 5는 (a) 이전과 (b) 양이온 교환 크로마토그래피 단계 이후의 IGF-1 작용제의 역상 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 (a) 이전과 (b) 음이온 교환 크로마토그래피 단계 이후의 IGF-1 작용제의 역상 HPLC 크로마토그램이다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 그들의 용도는 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 예를 들면 [Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)]; [Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)]; [Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991), Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)]; [Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]; [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds)., John Wiley &　Sons, Inc., New York]; 또는 [Freitag, R., Chromatographical processes in the downstream processing of (recombinant) proteins, Meth. Biotechnol. 24 (2007) 421-453 (Animal cell biotechnology 2nd Edition)]를 참고할 수 있다.
폴리펩타이드를 정제하는 방법은 잘 확립되어 있고 널리 이용된다. 이들은 단독으로 또는 조합되어 이용된다. 이런 방법은 예를 들면 금속 이온과 복합체를 형성한 티올 리간드(예를 들면 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질) 또는 미생물 유래된 단백질(예를 들면 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피)를 이용한 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합-모드 이온 교환 크로마토그래피), 친티오성 흡착(예를 들면 베타-머캅토에탄올 및 다른 SH 리간드를 이용한), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들면 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 이용), 크기 배제 크로마토그래피 및 준비적 전기영동 방법(예를 들면, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)(문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech., 75 (1998) 93-102])이다.
본원에서 이용되는 용어 "완충된"은 산성 또는 염기성 물질의 추가 또는 방출로 인한 pH의 변화가 완충제 물질에 의해 일정하게 되는 용액을 의미한다. 이런 효과를 생성하는 임의의 완충 물질이 이용될 수 있다. 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 완충 물질, 예를 들면 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 모폴린 또는 이의 염, 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 또는 이의 염, 히스티딘 또는 이의 염, 글리신 또는 이의 염, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 또는 이의 염이 이용된다. 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 히스티딘 또는 이의 염이 특히 바람직하다. 선택적으로 완충된 용액은 추가의 염, 예를 들면 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산 칼륨을 포함할 수 있다.
본원 내에서 사용된 "막"이라는 용어는 미세다공질 또는 거대다공질 막 모두를 의미한다. 상기 막 자체는 중합체 물질, 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리 비닐 클로라이드, 폴리아미드(나일론, 예를 들면 제타포어TM, N66 포시다인TM), 폴리에스터, 셀룰로스 아세테이트, 재생 셀룰로스, 셀룰로스 복합체, 폴리설폰, 폴리에터설폰, 폴리아릴설폰, 폴리페닐설폰, 폴리아크릴로나이트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 부직 및 제직 직물(예를 들면 타이벡®), 또는 섬유성 물질로 이루어지거나, 또는 무기 물질 예를 들면 제올라이트, SiO2, Al2O3, TiO2 또는 하이드록실아파타이트로 이루어진다.
본원에서 이용되는 용어 "크로마토그래피 물질"은 한편으로는 크로마토그래피 물질로서 추가의 개질없이 이용될 수 있는 고형 물질, 예를 들면 하이드록실아파타이트 또는 친화성 크로마토그래피 물질을 의미하고, 또한 크로마토그래피 작용기가 바람직하게는 공유 결합에 의해 부착되는 벌크 코어 물질을 포함하는 물질을 의미한다. 벌크 코어 물질은 크로마토그래피 과정, 즉, 분리되고자 하는 폴리펩타이드와 크로마토그래피 물질의 크로마토그래피 작용기 사이의 상호작용에 포함되지 않는 것으로 이해된다. 이는 단순히 크로마토그래피 작용기가 부착되고, 분리될 물질을 함유하는 용액이 크로마토그래피 작용기에 접근할 수 있도록 보장하는 3차원 골격을 제공한다. 바람직하게는 상기 벌크 코어 물질은 고형 상이다. 따라서, 바람직하게는 상기 "크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기가 바람직하게는 공유 결합에 의해 부착된 고형 상이다. 바람직하게는 상기 "크로마토그래피 작용기"는 이온화가능한 소수성 기 또는 소수성 기이거나, 또는 서로 다른 크로마토그래피 작용기가 일부 유형의 폴리펩타이드만 결합하도록 조합되어 있는 복합기이거나, 공유 결합된 하전된 기이다.
"고형 상"은 비-유체 물질을 의미하고, 중합체, 금속(상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로 제조된 입자(미세입자 및 비드 포함); 겔 물질, 예를 들면 실리카, 알루미나 및 중합체 겔; 제올라이트 및 다른 다공성 물질을 포함한다. 고형 상은 정지상 성분, 예를 들면 팩킹된 크로마토그래피 컬럼일 수 있거나, 비-정지상 성분, 예를 들면 비드 및 미세입자일 수 있다. 이런 입자는 중합체 입자, 예를 들면 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트); 금 입자, 예를 들면 금 나노입자 및 금 콜로이드; 및 세라믹 입자, 예를 들면 실리카, 유리 및 산화 금속 입자를 포함한다. 예를 들면 [Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1 (1998) 322A-327A]를 참고할 수 있다.
본원에서 서로 교환되어 이용될 수 있는 용어 "소수성 전하 유도 크로마토그래피" 또는 "HCIC"는 "소수성 전하 유도 크로마토그래피 물질"을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. "소수성 전하 유도 크로마토그래피 물질"은 한 pH 범위에서는 분리하고자하는 물질에 대한 소수성 결합을 형성하고 다른 pH 범위에서는 양전하 또는 음전하를 띠는 크로마토그래피 작용기를 포함하는 크로마토그래피 물질이고, 즉, HCIC는 크로마토그래피 작용기로서 이온화가능한 소수성 기를 이용한다. 일반적으로 폴리펩타이드는 중성 pH 조건 하에서는 소수성 전하 유도 물질에 결합하고, pH 값의 변화에 의해 전하 반발이 생성됨으로써 나중에 회수된다. 예시적인 "소수성 전하 유도 크로마토그래피 물질"은 바이오세프라(BioSepra) MEP 또는 HEA 하이퍼셀(Hypercel)(미국 팔 코포레이션(Pall Corp.))이다.
본원에서 서로 교환되어 이용될 수 있는 용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피" 또는 "HIC"는 "소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"이 이용되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. "소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"은 소수성 기, 예를 들면 부틸-, 옥틸- 또는 페닐 기가 크로마토그래피 작용기로서 결합되어 있는 크로마토그래피 물질이다. 폴리펩타이드는, 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질의 소수성 기와 상호작용할 수 있는 이들의 표면 노출된 아미노산 측쇄의 소수성에 따라 분리된다. 폴리펩타이드와 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용은 온도, 용매 및 용매의 이온 강도의 영향을 받을 수 있다. 아미노산 측쇄의 움직임이 증가하고 더 낮은 온도에서는 폴리펩타이드 내부에 파묻힌 소수성 아미노산 측쇄가 접근가능해지므로, 온도 증가는 예를 들면 폴리펩타이드와 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용을 지지한다. 또한 소수성 상호작용은 코스모트로픽 염에 의해 촉진되고 카오트로픽 염에 의해 감소된다. "소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"은 예를 들면 페닐세파로스 CL-4B, 6FF, HP, 페닐 슈퍼로스, 옥틸세파로스 CL-4B, 4 FF 및 부틸세파로스 4FF(모두 독일 소재의 아머샴 파마시아 바이오텍 유럽 게엠베하(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH)에서 이용가능하다)이고, 이들은 벌크 물질에 대한 글리시딜-에터 커플링을 통해 수득된다.
본원에서 이용되는 용어 "친화성 크로마토그래피"는 "친화성 크로마토그래피 물질"을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 친화성 크로마토그래피에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 작용기에 대한 정전기적 상호작용, 소수성 결합 및/또는 수소 결합 형성에 따른 이들의 생물학적 활성 또는 화학적 구조에 근거하여 분리된다. 특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 친화성 크로마토그래피 물질로부터 회수하기 위해서, 경쟁자 리간드가 첨가되거나, 또는 pH 값, 극성 또는 완충제의 이온 강도와 같은 크로마토그래피 조건을 변화시킨다. "친화성 크로마토그래피 물질"은 일정한 유형의 폴리펩타이드에만 결합하도록 서로 다른 단일한 크로마토그래피 작용기가 조합되는 복합 크로마토그래피 작용기를 포함하는 크로마토그래피 물질이다. 이 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기의 특이성에 따라 일부 유형의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 예시적인 "친화성 크로마토그래피 물질"은 헥사히스티딘 택을 함유하는 융합 폴리펩타이드, 또는 여러개의 표면 노출된 히스티딘, 시스테인 및/또는 트립토판 잔기를 갖는 폴라펩타이드의 결합을 위한 "금속 킬레이팅 크로마토그래피 물질", 예를 들면 Ni(II)-NTA 또는 Cu(II)-NTA 함유 물질이거나, 또는 "항체 결합 크로마토그래피 물질" 예를 들면 단백질 A, 또는 "효소 결합 크로마토그래피 물질", 예를 들면 효소 기질 유사체, 효소 공동인자 또는 효소 억제제를 크로마토그래피 작용기로서 포함하는 크로마토그래피 물질이거나, 또는 "렉틴 결합 크로마토그래피 물질", 예를 들면 폴리사카라이드, 세포 표면 수용체, 당단백질 또는 온전한 세포를 크로마토그래피 작용기로서 포함하는 크로마토그래피 물질이다.
본원에서 이용되는 "금속 킬레이팅 크로마토그래피"는 "금속 킬레이팅 크로마토그래피 물질"을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 금속 킬레이팅 크로마토그래피는 크로마토그래피 작용기로서 벌크 물질에 결합하는 금속 이온, 예를 들면 Cu(II), Ni(II) 또는 Zn(II)과 폴리펩타이드(특히 이미다졸 함유 측쇄 및 티올기 함유 측쇄를 갖는 것들)의 표면 노출된 아미노산 측쇄의 전하 공여기 사이의 킬레이트 형성에 근거한다. 킬레이트는 측쇄가 적어도 부분적으로 양자화되지 않는 pH 값에서 형성된다. 결합된 폴리펩타이드는 pH 값의 변화에 의해, 즉 양자화에 의해 크로마토그래피 물질로부터 회수된다. 예시적인 "금속 킬레이팅 크로마토그래피 물질"은 하이트랩 킬레이팅(HiTrap Chelating) HP(아머샴 파마시아 바이오텍 유럽 게엠베하) 또는 프랙토겔(Fraktogel) EMD(미국 소재의 이엠디 케미칼 인코포레이티드(EMD Chemicals Inc))이다.
본원에서 이용되는 용어 "이온 교환 크로마토그래피"는 "이온 교환 크로마토그래피 물질"을 이용한 크로마토그래피 방법을 의미한다. 용어 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 "양이온 교환 크로마토그래피"에서 양이온이 교환되는 "양이온 교환 크로마토그래피 물질", 또는 "음이온 교환 크로마토그래피"에서 음이온이 교환되는 "음이온 교환 크로마토그래피 물질"을 포함한다. 본원에서 이용되는 용어 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기로서 공유 결합된 하전된 기를 갖는 부동의 고분자량 고형 상을 의미한다. 공유결합되지 않은 전체적으로 전하 중성인 경우, 대이온은 이와 결합되어 있다. "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 주위 용액의 유사하게 하전된 이온의 경우 그의 공유결합되지 않은 대이온과 교환할 능력을 갖고 있다. 그의 교환가능한 대이온의 전하에 따라, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 "양이온 교환 크로마토그래피 물질" 또는 "음이온 교환 크로마토그래피 물질"로서 언급된다. 또한, 하전된 기의 성질에 따라, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 예를 들면 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 경우 설폰산 기(S) 또는 카복시메틸 기(CM)을 갖는 것으로 언급된다. 하전된 기의 화학적 성질에 따라, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 공유결합되어 있는 하전된 치환기의 강도에 따라 강하거나 약한 이온 교환 크로마토그래피 물질로서 추가로 분류될 수 있다. 예를 들면 강한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 설폰산 기를 갖고, 약한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 카복실산 기를 갖는다. 예를 들면, "양이온 교환 크로마토그래피 물질"은 예를 들면, 바이오-렉스, 마크로-프레프 CM(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재의 바이오래드 래보레이토리즈(Biorad Laboratories)), 약한 양이온 교환 WCX 2(미국 캘피포니아주 프레몬트 소재의 사이퍼겐(Cyphergen) 제품), 다우엑스®(Dowex) MAC-3(미국 미들랜드주 미들랜드 소재의 다우 케미칼 캄파니에서 시판 - 액체 분리), 무스탕(Mustang) C(미국 뉴욕주 이스트 힐, 폴 코포레이션 제품), 셀룰로스 CM-23, CM-32, CM-52, 하이퍼-D 및 파티스피어(partisphere)(영국 브렌트포드 소재의 와트만 피엘씨(Watman plc)에서 시판), 앰버라이트(Amberlite)® IRC 76, IRC 747, IRC 748, GT 73(독일 스튜트가르트 소재의 토쇼 바이오사이언스 게엠베하(Tosoh Bioscience GmbH)에서 시판함), CM 1500 및 CM 3000(미국 인디아나주 데르흐트 소재의 바이오크롬 랩스(BioChrom Labs)에서 시판) 및 CM-세파로스 패스트 플로(GE 헬스케어(GE Healthcare) - 독일 프라이버그 소재의 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences Europe GmbH))와 같이 다수의 회사에서 이용가능하다.
본원에서 이용되는 용어 "하이드록실아파타이트 크로마토그래피"는 크로마토그래피 물질로서 일부 형태의 인산 칼슘을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 예시적인 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 물질은 바이오-겔(Bio-Gel) HT, 바이오-겔 HTP, 마크로-프렙 세라믹(바이오래드 래보레이토리즈에서 이용가능함), 하이드록실아파타이트 유형 I, 유형 II, HA 울트로겔(미국 시그마 알드리치 케미칼 코포레이션(Sigma Aldrich Chemical Corp.)), 하이드록실아파타이트 패스트 플로 앤드 하이 레졸루션(Hydroxylapatite Fast Flow and High Resolution)(칼바이오켐(Calbiochem)) 또는 TSK 겔 HA-1000(미국, 토쇼 하스 코포레이션(Tosoh Hass Corp.))이다.
"폴리펩타이드"는 천연적으로 생성되던 합성으로 생성되던 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드가 "펩타이드"로서 언급된다. "단백질"은 하나 이상이 100개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 분자이다. 펩타이드 및 단백질은 또한 비-아미노산 성분, 예를 들면 탄화수소 기를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 또는 단백질이 생성되는 세포에 의해 탄화수소 기 및 다른 비-아미노산 성분을 첨가할 수 있고, 이들은 세포 유형에 따라 다양할 것이다. 폴리펩타이드 및 단백질은 본원에서 아미노산 주쇄 구조의 측면에서 한정되고, 탄화수소 기와 같은 치환체는 일반적으로 특정되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 이용될 수 있는 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 일반적으로 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 분자를 의미한다. 중쇄 및 경쇄 각각은 항원과 상호작용하는 특정한 결합 영역(CDR, 상보적 결정 영역)을 함유하는 가변 영역(일반적으로 쇄의 아미노 말단 부분)을 포함한다. 또한 중쇄와 경쇄는 각각 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포, 일부 식세포 및 전통적인 보체 시스템의 제 1 성분(C1q)을 비롯한 숙주 세포 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있는 불변 영역(일반적으로, 쇄의 카복실 말단 부분)을 포함한다. 전형적으로, 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 완전한 쇄이고, 이들은 각각 본질적으로 가변 영역과 완전한 불변 영역으로 구성된다. 일반적으로 경쇄는 경쇄 가변 도메인, 경첩 영역 및 경쇄 불변 도메인을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 도메인, 경첩 영역, 및 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 선택적으로 CH4 도메인으로 구성된 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 항체는, 예를 들면, Fv, Fab 및 F(ab)2 및 단일쇄를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(예를 들면, [Huston, J.S., et al., PNAS USA 85 (1988) 5879-5883]; [Bird et al., Science, 242 (1988) 423-426]; 및 일반적으로, 문헌[Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y. (1984) 2nd edition]; 및 [Hunkapiller and Hood, Nature, 323 (1986) 15-16]). 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 하기의 여러 부류로 할당된다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들 부류중 일부는 하위부류(아이소타입), 즉, IgG의 경우 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로, 또는 IgA의 경우 IgA1 및 IgA2으로 추가로 나누어진다. 면역글로불린이 속하는 면역글로불린 부류에 따라, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 각각 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 및 μ(IgM)라 불린다.
본 발명에서 이용되는 용어 "결합 및 용출 모드" 및 이의 문법적인 등가물은 흥미있는 물질을 함유하는 용액이 정지상, 바람직하게는 고형 상과 접촉하고, 여기서, 흥미있는 물질은 정지상에 결합하는 크로마토그래피 방법의 작동 방식을 의미한다. 그 결과, 흥미있는 물질이 정지상에 보유되는 반면, 흥미있지 않은 물질이 플로우-쓰루 또는 상층액과 함께 제거된다. 이후에 흥미있는 물질은 제 2 단계에서 정지상으로부터 용출되고 이에 의해 용출 용액과 함께 정지상으로부터 회수된다. 이는 흥미있지 않은 물질의 100%가 제거되는 것을 반드시 의미하는 것은 아니지만, 흥미있지 않은 물질의 본질적으로 100%, 즉 흥미있지 않은 물질의 50% 이상이 제거되고, 바람직하게는 흥미있지 않은 물질의 75% 이상이 제거되고, 바람직하게는 흥미있지 않은 물질의 90% 이상이 제거되고, 바람직하게는 흥미있지 않은 물질의 95% 이상이 제거된다.
본원에서 이용되는 용어 "플로우-쓰루 모드" 및 이의 문법적 등가물은 흥미있는 물질을 함유하는 용액이 정지 상, 바람직하게는 고형 상과 접촉하고, 여기서 흥미있는 물질이 정지 상에 결합하지 않는 작동 모드의 크로마토그래피 방법을 의미한다. 그 결과, 흥미있는 물질은 플로우-쓰루 또는 상층액에서 수득된다. 용액에 또한 존재하는 흥미있지 않은 물질은 정지 상에 결합하여 용액으로부터 제거된다. 이는 흥미있지 않은 물질의 100%가 제거되는 것을 반드시 의미하는 것은 아니지만, 흥미있지 않은 물질의 본질적으로 100%, 즉 흥미있지 않은 물질의 50% 이상이 용액으로부터 제거되고, 바람직하게는 흥미있지 않은 물질의 75% 이상이 용액으로부터 제거되고, 바람직하게는 흥미있지 않은 물질의 90% 이상이 용액으로부터 제거되고, 바람직하게는 흥미있지 않은 물질의 95% 이상이 용액으로부터 제거된다.
본원에서 서로 교환되어 이용되는 용어 "연속 용출" 및 "연속 용출 방법"은 예를 들면 용출, 즉 결합된 물질의 크로마토그래피 물질로부터의 분리를 야기하는 물질의 농도가 연속적으로 상승되거나 감소됨을 의미한다. 즉, 각각의 단계가 용출을 야기하는 물질의 농도를 2% 보다 크지 않게, 바람직하게는 1% 보다 크지 않게 변화시키는 일련의 작은 단계에 의해 농도가 변화된다. 이러한 "연속 용출"에서, 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 조건, 예를 들면 pH, 이온 강도, 염의 농도, 및/또는 유속은 선형으로 변화되거나, 기하급수적으로 변화되거나, 또는 점근적으로 변화된다. 바람직하게는, 변화는 선형이다.
본원에서 서로 교환가능하게 이용되는 용어 "단계 용출" 및 "단계 용출 방법"은 예를 들면 용출, 즉, 결합된 물질의 크로마토그래피 물질로부터의 분리를 야기하는 물질의 농도가 한번에, 즉, 한 값/수준에서 다음 값/수준으로 상승되거나 감소되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 이러한 "단계 용출"에서, 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 조건, 예를 들면 pH, 이온 강도, 염의 농도, 및/또는 유속은 제 1 값, 예를 들면 출발값에서 제 2 값, 예를 들면 최종 값으로 한번에 변화된다. 단계에서의 변화는 용출을 야기하는 물질의 농도를 5% 보다 크게, 바람직하게는 10% 보다 크게 변화시킨다. "단계 용출"은 선형 변화와는 대조적으로 증분적으로, 즉, 단계별로 변화된다. "단계 용출 방법"에서는 각각의 증가 후에 새로운 분획이 수집된다. 각각의 증가후, 용출 방법에서의 다음 단계까지 조건이 유지된다.
"단리된 폴리펩타이드"는 탄화수소, 지질 또는 자연에서 폴리펩타이드와 관련된 다른 단백질 불순물과 같은 오염 세포 성분이 본질적으로 없는 폴리펩타이드이다. 전형적으로, 단리된 폴리펩타이드의 제조는 매우 정제된 형태, 즉, 약 80% 이상 순수한, 약 90% 이상 순수한, 약 95% 이상 순수한, 95% 이상 순수한, 또는 99% 초과로 순수한 폴리펩타이드를 함유한다. 특정한 단백질 제제가 단리된 폴리펩타이드를 함유하고 있음을 보여주는 한가지 방법은 단백질 제제를 전기영동시키고 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색시킨 후 단일 밴드가 나타나는 것이다. 그러나, 용어 "단리된"은 이량체, 유도체화된 형태, 정확하게 절첩되지 않은 형태, 정확하지 않게 다이설파이드 가교된 형태 또는 스크램블된 형태와 같은 다른 물리적 형태의 동일한 폴리펩타이드의 존재를 배제하지는 않는다.
"이종 DNA" 또는 "이종 폴리펩타이드"는 주어진 세포 내에서 자연적으로는 존재하지 않는 DNA 분자 또는 폴리펩타이드 또는 DNA 분자의 모집단 또는 폴리펩타이드의 모집단을 의미한다. 특정한 세포에 대해 이종인 DNA 분자는, 세포의 DNA가 비-세포 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되는 한, 그 세포 종에서 유래한 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들면 프로모터를 포함한 세포의 DNA 분획에 기능적으로 연결된 폴리펩타이드를 인코딩하는 비-세포 DNA 절편을 함유하는 DNA분자는 이종 NDA 분자로서 간주된다. 이와는 대조적으로, 이종 DNA 분자는 외인성 프로모터와 기능적으로 연결된 내인성 구조 유전자를 포함할 수 있다. 비-세포 DNA 분자에 의해 인코딩되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 "이종" 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 원핵 세포에 의해 재조합 생산되는 비-글라이코실화된 폴리펩타이드의 정제가 수행될 수 있음이 발견되었다. 비-글라이코실화된 재조합 생성된 폴리펩타이드를 상기 폴리펩타이드가 치료적 목적으로 사용되는 것을 허용하는 순도까지 정제하는 것을 허용하는 크로마토그래피 정제 방법을 확립하기 위해서, 최대 3개의 크로마토그래피 단계라는 작은 한정된 수만이 요구되고 또한 한정된 수의 상이한 크로마토그래피 방법만을 시험하면 된다는 것이 발견되었다.
따라서, 본 발명은 제 1 양태에서,
a) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 또는 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는 제 1 크로마토그래피,
b) i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 v) 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서 선택되는 제 2 크로마토그래피,
c) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 3 크로마토그래피의 순서로 상기 3가지 크로마토그래피 단계를 포함하는, 원핵 세포에서 재조합 생산되는 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드의 정제 방법을 제공한다.
한 실시양태에서는, 본 발명에 따른 방법의 단계 c) 다음에, 정제된 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 수득된다. 등전점(Ip) 또는 표면 노출된 아미노산 잔기의 분포와 같은 이의 물리적 성질에 따른 서로 다른 폴리펩타이드의 서로 다른 특성으로 인해, 모든 크로마토그래피 방법이 모든 폴리펩타이드에 적합한 것은 아니다. 따라서, 하기의 단서조항이 본 발명에 따른 방법에 적용된다:
-금속 리간드와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드의 경우 제 1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고,
- 등전점이 6.0 미만인 폴리펩타이드의 경우, 제 2 크로마토그래피 단계는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계가 아니고,
- 제 3 크로마토그래피 단계는 낮거나 높은 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 플로우-쓰루 방식으로 수행될 수 있고,
- 선택적으로 제 3 크로마토그래피 단계는 폴리펩타이드의 농축을 위해 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 하기에서 예시될 것이다. 이들 실시예는 본 발명에 따른 방법을 예시하기 위해서 제시될 뿐 첨부된 특허청구범위에 제시된 본 발명의 범위를 한정하고자 하지 않는다.
IGF -1 작용제
제 1의 예시적인 폴리펩타이드는 제WO 2006/066891호에 보고된 바와 같은 IGF-1이다.
IGF-1 작용제의 정제를 위해서 본 발명에 따른 방법에 따른 3개의 크로마토그래피 단계의 순서가 수행되었다. 순서는 1) 소수성 전하 유도 크로마토그래피(a-i), 2) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피(b-iii) 및 3) 소수성 전하 유도 크로마토그래피(c-i)의 크로마토그래피 단계를 포함한다.
이 순서는 폴리펩타이드가 헥사히스티딘 택 및 6.0 초과의 등전점을 가지므로, 본 발명에 따른 방법에 대한 단서조항을 만족한다.
출발 물질은 50%의 IGF-1 작용제 순도를 가졌다. 상기 개론된 바와 같은 크로마토그래피 단계를 이용하여 본 발명에 따른 정제 방법을 수행한 후, (HPLC에 의해 측정시) 97% 초과의 순도가 수득되었다. 3개의 크로마토그래피 단계 모두가 결합 및 용출 모드로 수행되었다.
본 발명에 따른 방법의 다재다능성을 보여주기 위해, IGF-1 작용제를 또한 1) 소수성 상호작용 크로마토그래피(a-ii), 2) 양이온 교환 크로마토그래피(b-ii) 및 3) 음이온 교환 크로마토그래피(c-ii)인 본 발명에 따른 방법에 따른 다른 순서의 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제하였다.
상기 논의된 크로마토그래피 단계를 이용하여 본 발명에 따른 정제 방법을 수행한 후, (HPLC에 의해 측정하였을 때) 97% 이상의 순도가 수득되었다. 제 1 및 제 2 크로마토그래피 단계는 결합 및 용출 모드로 수행되었고, 제 3 크로마토그래피 단계는 플로우-쓰루 모드로 수행되었다.
따라서, 놀랍게도 서로 다른 순서의 3개의 크로마토그래피 단계를 수행함으로써, 동일한 분자가 유사한 순도로 정제될 수 있다는 것이 발견되었다. 또한, 최종 크로마토그래피 단계를 서로 다른 용출 모드, 즉, 결합 및 용출 모드 또는 플로우-쓰루 모드로 수행할 수 있는 것으로 발견되었다. 단계 용출 또는 연속 용출중 하나로서 다른 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있는 것으로 발견되었다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는, 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고, 제 2 크로마토그래피 단계가 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는, 3개의 순차적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하는, 폴리펩타이드, 특히 제WO 2006/066891호에 보고된 바와 같은 IGF-1 또는 IGF-1 변이체를 정제하는 방법에 관한 것이다.
인터페론
제 2의 예시적인 폴리펩타이드는 예를 들면 제EP　0　043　980호에 보고되는 바와 같은 인터페론 알파-2a(IFNα-2a)이다.
IFNα-2a의 정제를 위해서, 본 발명의 방법에 따른 3개의 크로마토그래피 단계의 순서를 수행하였다. 순서는 1) 소수성 전하 유도 크로마토그래피(a-i), 2) 음이온 교환 크로마토그래피(b-ii) 및 3) 소수성 상호작용 크로마토그래피(c-iv)의 크로마토그래피 단계를 포함한다.
재조합 생성된 IFNα-2a가 금속 킬레이팅 크로마토그래피 물질과의 상호작용을 위한 택을 갖고 있지 않고 6.0보다 높은 등전점을 갖고 있으므로, 이 순서는 본 발명에 따른 방법에 대한 단서조항을 만족한다.
출발 물질은 (HPLC에 의해 측정시) 49%의 순도를 가졌다. 상기 개론된 바와 같은 크로마토그래피 단계를 갖는 본 발명에 따른 정제 방법을 수행한 후, (HPLC에 의해 측정시) 99% 이상의 순도가 수득되었다. 크로마토그래피 단계는 결합 및 용출 모드로 수행되었다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피 단계이고, 제 2 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 단계이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피 단계인 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하는 IFNα-2a의 정제 방법에 관한 것이다.
IFNα-2a는 또한 비교를 위해 1) 소수성 상호작용 크로마토그래피(a-ii), 2) 양이온 교환 크로마토그래피(b-ii) 및 3) 소수성 상호작용 크로마토그래피(c-iv)의 다른 순서의 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제되었다.
상기 논의된 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제 방법을 수행한 후, (HPLC 에 의해 측정하였을 때) 97% 이상의 순도가 수득되었다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피이고, 제 2 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피 단계이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피인 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하는 IFNα-2a의 정제 방법에 관한 것이다.
PEG화된 인터페론
본 발명에 따른 방법은 비-글라이코실화된 재조합 생성된 폴리펩타이드에만 적용되는 것이 아니라, 또한 PEG화된, 비-글라이코실화된 폴리펩타이드의 생성에 적합하다. 예시적인 PEG화된 인터페론은 예를 들면 제EP　0　809　996호를 참조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 a) 원핵 세포에서 재조합 생성된 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 제공하는 단계; b) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 또는 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는 제 1 크로마토그래피 단계; c) i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 또는 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 2 크로마토그래피 단계; d) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 3 크로마토그래피 단계의 순서로 상기 단계를 포함하며, 여기서, 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 단계 d) 후의 PEG화 후에 수득되는, 원핵 세포에서 재조합 생성된 비-글라이코실화된 PEG화된 이종 폴리펩타이드를 생성하는 방법에 관한 것이다.
등전점(Ip) 또는 표면 노출된 아미노산 잔기의 분포와 같은 이의 물리적 성질에 따른 서로 다른 폴리펩타이드의 서로 다른 특성으로 인해, 모든 크로마토그래피 방법이 모든 폴리펩타이드에 적합한 것은 아니다. 따라서, 하기의 단서조항이 본 발명에 따른 방법에 적용된다:
-금속 리간드와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드의 경우 제 1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고,
- 등전점이 6.0 미만인 폴리펩타이드의 경우, 제 2 크로마토그래피 단계는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계가 아니고,
- 낮거나 높은 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 제 3 크로마토그래피 단계가 플로우-쓰루 방식으로 수행될 수 있다.
예시적인 PEG화된 IFN은 제EP　0　809　996호에 보고되어 있다.
PGE화된 IFN를 생성하기 위해, 본 발명에 따른 방법에 따른 3개의 크로마토그래피 단계의 순서를 수행하였다. 순서는 1) 소수성 상호작용 크로마토그래피(b-ii), 2) 양이온 교환 크로마토그래피(c-ii) 및 3) 음이온 교환 크로마토그래피(d-ii)의 크로마토그래피 단계를 포함하고, 단계 3) 이후에 정제된 비-글라이코실화된 IFN 및 비-PEG화된 IFN이 PEG화된다.
출발 물질은 (HPLC에 의해 측정시) 58%의 순도를 가졌다. 상기 논의된 바와 같은 크로마토그래피 단계를 이용하여 본 발명에 따른 정제 방법을 수행한 후, (HPLC에 의해 측정시) 90% 이상의 순도가 수득되었다. 모든 크로마토그래피 단계는 결합 및 용출 모드로 수행되었다.
또한 PEG화된 폴리펩타이드를 이용한 본 발명에 따른 생산 방법의 다재다능성을 나타내기 위해, IFN을 또한 PEG화시키기 전에 1) 금속 친화성 크로마토그래피(b-iii), 2) 양이온 교환 크로마토그래피(c-ii) 및 3) 음이온 교환 크로마토그래피(d-ii)의 본 발명의 방법에 따른 크로마토그래피 단계를 이용하고, 단계 3) 이후에 정제된 비-글라이코실화된 IFN 및 비-PEG화된 IFN을 PEG화시켰다.
상기 논의된 크로마토그래피 단계를 갖는 본 발명에 따른 정제 방법을 수행한 후, (HPLC에 의해 측정시) 90% 이상의 순도가 수득되었다. 모든 크로마토그래피 단계는 결합 및 용출 모드로 수행되었다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 금속 친화성 크로마토그래피에서 선택되고, 제 2 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피이고, 제 3 크로마토그래피 단계 후에 정제된 비-글라이코실화된 IFN 및 비-PEG화된 IFN이 PEG화 되는, 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하는 PEG화된 IFNα-2a의 제조 방법에 관한 것이다.
비교하기 위해서 또한 1) 소수성 상호작용 크로마토그래피(b-ii), 2) 양이온 교환 크로마토그래피(c-ii) 및 3) 소수성 하전 유도 크로마토그래피(d-i)의 다른 순서의 3개의 크로마토그래피 단계를 이용하고, 단계 3) 이후에 정제된 비-글라이코실화된 IFN 및 비-PEG화된 IFN을 PEG화시켜 PEG화된 IFN의 생산을 수행하였다.
상기 개론된 바와 같은 크로마토그래피 단계를 이용한 정제 방법을 수행한 후, (HPLC에 의해 측정시) 89%의 순도가 수득되었다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피이고, 제 2 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 소수성 하전 유도 크로마토그래피이고, 제 3 크로마토그래피 단계 후에 정제된 비-글라이코실화된 IFN 및 비-PEG화된 IFN이 PEG화 되는, 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하는 PEG화된 인터페론, 특히 IFNα-2a의 제조 방법에 관한 것이다.
에스케리치아, 살모넬라, 스트렙토마이세스 또는 바실러스가 예를 들면 원핵 세포 숙주 미생물로서 적합하다. 한 양태에서, 원핵 세포는 이.콜라이 세포이다. 바람직하게는 이.콜라이 세포는 이.콜라이 XL1-블루 세포 또는 이.콜라이 BL21(DE3) 세포 또는 이.콜라이 K-12세포이다. 다른 양태에서는, 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 성장 인자 작용제 또는 길항제, 인터페론 또는 인터페론 변이체에서 선택된다.
본 발명의 다른 양태는
a) 이종 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건 하에서 이종 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 세포를 배양하는 단계;
b) 배양배지 또는 원핵 세포로부터 이종 폴리펩타이드를 회수하는 단계;
c) α) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 또는 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는 제 1 크로마토그래피 단계; β) i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 v) 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서 선택되는 제 2 크로마토그래피 단계; γ) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 3 크로마토그래피 단계의 순서로 크로마토그래피 단계들을 포함하는 방법을 이용하여 이종 폴리펩타이드를 정제하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 원핵 세포에서 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 재조합 생성하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서는, 단계 c) 이후에 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 수득된다. 등전점(Ip) 또는 표면 노출된 아미노산 잔기의 분포와 같은 이의 물리적 성질에 따른 서로 다른 폴리펩타이드의 서로 다른 특성으로 인해, 모든 크로마토그래피 방법이 모든 폴리펩타이드에 적합한 것은 아니다. 따라서, 하기의 단서조항이 본 발명에 따른 방법에 적용된다:
-금속 리간드와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드의 경우 제 1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고,
- 등전점이 6.0 미만인 폴리펩타이드의 경우, 제 2 크로마토그래피 단계는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계가 아니고,
- 낮거나 높은 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 제 3 크로마토그래피 단계는 플로우-쓰루 방식으로 수행될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "적합한 조건 하에서"는 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 배양하는데 이용되며, 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있거나, 이들이 쉽게 결정할 수 있는 조건을 의미한다. 당 분야의 숙련자들에게 이들 조건은 배양되는 세포의 유형 및 발현되는 폴리펩타이드의 유형에 따라 변화될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 일반적으로 세포는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 효과적인 생산을 허용하기에 충분한 기간, 예를 들면 4 내지 28일동안 배양된다.
한 양태에서, 상기 크로마토그래피 단계는 결합 및 용출 모드로 수행된다. 본원에서 이용되는 용어 "결합 및 용출 모드"는 정제되고자 하는 흥미있는 물질을 함유하는 용액을 정지상, 바람직하게는 고형 상과 접촉시키고, 여기서, 흥미있는 물질이 정지 상에 결합되는 정제 방법의 조작 모드를 의미한다. 결과적으로 흥미있는 물질이 정지 상에 보유되는 반면, 흥미있지 않은 물질은 플로우-쓰루 또는 상층액과 함께 제거된다. 흥미있는 물질은 선택적으로 세척 단계 후에 제 2 단계에서 정지상으로부터 용출되고, 이에 의해 용출 용액을 이용하여 정지상으로부터 회수된다.
용어 "PEG화"는 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 내부 라이신 잔기에서 (폴리에틸렌) 글리콜 잔기의 공유 결합 형성을 의미한다. 단백질의 PEG화는 당 분야에 매우 널리 공지되어 있고, 예를 들면 [Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417]에 개론되어 있다. PEG은 서로 다른 작용기, 및 서로 다른 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, 선형 및 분지된 PEG, 및 또한 서로 다른 연결기를 이용하여 연결될 수 있다(또한 [Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18]; [Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304] 참고). 활성화된 PEG 유도체는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 PEG-비닐설폰의 경우 [Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368]에 개시되어 있다. 선형 및 분지쇄 PEG 종은 PEG화된 절편의 제조에 적합하다. 반응성 PEG 시약의 예는 요도-아세틸-메톡시-PEG 또는 메톡시-PEG-비닐설폰이다.
본 발명에 따른 방법의 한 양태에서는, 제 1 크로마토그래피 단계 전의 함량에 비해 제 3 크로마토그래피 단계 후에 수득된 폴리펩타이드 용액에서 내독소, 및/또는 이.콜라이 DNA 및/또는 이.콜라이 세포 단백질의 함량이 감소된다.
다른 양태에서는, 본 발명에 따른 방법은
a) 이종 폴리펩타이드의 발현 및 이종 폴리펩타이드를 함유하는 봉입체의 형성에 적합한 조건 하에서 이종 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 세포를 배양하는 단계;
b) 원핵 세포로부터 봉입체를 회수하는 단계;
c) 봉입체로부터 이종 폴리펩타이드를 용해 및 재생시키는 단계;
d) 본 발명의 제 1 양태에 따른 방법을 이용하여 이종 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하는, 봉입체를 통해 원핵 세포에서 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 재조합 생성하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 단계 d) 이후에 수득되었다. 봉입체는 세포질에서 발견되었고, 물에서 불용성인 응집된 형태로 발현된 폴리펩타이드를 함유한다. 일반적으로, 봉입체의 이런 단백질은 변성된 형태(즉, 무작위 연결된 다이설파이드 가교)이다. 이들 봉입체는 예를 들면 세포 용균 후의 원심분리에 의해 다른 세포 성분과 분리된다. 본 발명에 따르면, 봉입체는 변성 조건 하에서 세척된다. 이런 변성제는 당 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면 매우 농축된 구아니디늄 하이드로클로라이드(예를 들면 약 6mol/l) 또는 우레아(예를 들면 약 8 mol/l)이다. 변성제는 바람직하게는 완충된 용액으로 이용된다. 세척 후, 봉입체는 용해된다.
용어 "PEG화"는 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 내부 라이신 잔기에서 (폴리에틸렌) 글리콜 잔기의 공유 결합 형성을 의미한다. 단백질의 PEG화는 당 분야에 매우 널리 공지되어 있고, 예를 들면 [Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417]에 개론되어 있다. PEG은 서로 다른 작용기, 및 서로 다른 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, 선형 및 분지된 PEG, 및 또한 서로 다른 연결기를 이용하여 연결될 수 있다(또한 [Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18]; [Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304] 참고). PEG화는 예를 들면 제WO00/44785호에 개시된 바와 같은 PEG화 시약을 이용하여 수용액에서 수행될 수 있고, 한 양태에서는 5kDa 내지 40kDa 분자량의 NHS-활성화된 선형 또는 분지형 PEG 분자를 이용하여 수행될 수 있다. PEG화는 또한 [Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229]에 따라 고형 상에서 수행될 수 있다. 무작위가 아닌, N-말단 PEG화된 폴리펩타이드가 또한 제WO　94/01451호에 따라 생성될 수 있다.
활성화된 PEG 유도체는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 PEG-비닐설폰의 경우 [Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368]에 개시되어 있다. 선형 및 분지쇄 PEG 종은 PEG화된 절편의 제조에 적합하다. 반응성 PEG 시약의 예는 요도-아세틸-메톡시-PEG 또는 메톡시-PEG-비닐설폰(m은 바람직하게는 약 450 내지 약 900의 정수이고, R은 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지쇄 C1 내지 C6-알킬이고, 예를 들면 메틸, 에틸, 아이소프로필 등이며, 한 양태에서는 R이 메틸이다)이다:
Figure pct00001
이들 요도-활성화된 물질의 이용은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 [Hermanson, G. T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148]에 개시되어 있다.
한 양태에서, PEG 종은 활성화된 PEG 에스터, 예를 들면 N-하이드록시석신이미딜 프로피오네이트 또는 N-하이드록시석신이미딜 부타노에이드, 또는 N-하이드록시석신이미드, 예를 들면 PEG-NHS([Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69])이다. 한 양태에서, 활성화된 N-하이드록시석신이미드 에스터는 알콕시-PEG-N-하이드록시석신이미드, 예를 들면 메톡시-PEG-N-하이드록시석신이미드(분자량: 30000; 쉐어워터 폴리머스 인코포레이티드(Shearwater Polymers))를 이용한
Figure pct00002
Figure pct00003
(여기서, R 및 m은 상기 정의된 바와 같다)이다. 한 양태에서, PEG 종은 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)-부티르산의 N-하이드록시석신이미딜 에스터이다. 용어 "알콕시"는 용어 "알킬"이 최대 4개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기인 알킬 에터 기를 의미하고, 예를 들면 메톡시, 에톡시, n-프로폭시 등이고, 바람직하게는 메톡시이다.
본 발명의 한 양태는
a) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 또는 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는 제 1 크로마토그래피 단계,
b) i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 v) 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서 선택되는 제 2 크로마토그래피 단계,
c) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 3 크로마토그래피의 순서로 상기 단계를 포함하며, 여기서,
- 금속 리간드와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드의 경우 제 1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고,
- 등전점이 6.0 미만인 폴리펩타이드의 경우, 제 2 크로마토그래피 단계는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계가 아니고,
- 낮거나 높은 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 제 3 크로마토그래피 단계는 플로우-쓰루 방식으로 수행될 수 있고,
단, 3개의 크로마토그래피 단계의 조합이
- 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피,
- 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피,
- 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피,
- 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 아님을 특징으로 하는,
원핵 세포에서 재조합 생산되는 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드의 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법의 한 양태에서, 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 제 3 크로마토그래피 단계 후에 수득된다.
본원에서 이용되는 용어 "유사한"은 2개의 결과가 서로의 10% 이내임을 의미한다. 예를 들면, 90%의 순도 및 95%의 순도는, 95%가 90%의 순도의 10% 이내이들므로(90%의 90% + 10%는 90% + 9%로서 99%이다), 95%와 유사하다.
하기 실시예, 인용참증 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 개시되어 있다. 본 발명의 진의를 벗어나지 않고, 개질될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
실험 부분
재료 및 방법
달리 개시되어 있지 않은 한, 크로마토그래피 물질 제조자의 매뉴얼에 따라 서로 다른 크로마토그래피 방법을 수행하였다.
재조합 DNA 기법:
[Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 개시된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 제조자의 지시에 따라 분자생물학적 시약을 이용하였다.
단백질 측정:
아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 소멸 계수를 320nm를 기준 파장으로 하여 280nm(OD)에서 광학 밀도를 측정함으로써 결정하였다.
크기-배타- HPLC :
ASI-100 HPLC 시스템(독일 이드스타인 소재의 디오넥스(Dionex))에서 토쇼 하스(Tosoh Haas) TSK 3000 SWXL 컬럼을 이용하여 크로마토그래피를 수행하였다. UV 다이오드 어레이 검출기(디오넥스)에 의해 용출 피크를 280nm에서 모니터링하였다. 농축된 시료를 1mg/ml로 용해시킨 후, 안정한 기준선이 수득될 때까지 컬럼을 200mM의 이수소화인산칼륨 및 250mM의 염화칼륨 pH 7.0으로 구성된 완충액으로 세척하였다. 30분동안 실온에서 0.5ml/분의 유속을 이용하여 아이소크래틱(isocratic) 조건 하에서 분석적 실시를 수행하였다. 크로멜레온(Chromeleon)(독일 이드스타인 소재의 디오넥스)을 이용하여 크로마토그램을 수동으로 통합하였다.
역상 HPLC ( RP - HPLC ):
RP-HPLC를 이용하여 순도를 분석한다. 아세토니트릴/수성 TFA 농도구배를 이용하여 포로쉘 컬럼 상에서 분석을 수행한다. 215nm에서의 UV 흡광으로서 용출 프로파일을 모니터링한다. 용출된 물질의 %를 용출된 단백질의 총 피크 면적에 근거하여 계산한다.
DNA -역치-시스템:
예를 들면 [Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403]를 참조할 수 있다.
숙주 세포 단백질 측정:
마이크로타이터 플레이트의 웰의 벽을 혈청 알부민 및 스트렙타비딘으로 코팅시킨다. HCP에 대한 염소 유래된 폴리클론 항체를 마이크로타이터 플레이트의 웰의 벽에 결합시킨다. 세척 단계 후에, 마이크로타이터 플레이트의 서로 다른 웰을 서로 다른 농도 및 시료 용액의 HCP 보정 순서를 이용하여 항온처리하였다. 항온처리 후에, 완충 용액으로 세척함으로써 결합되지 않은 시료 물질을 제거한다. 검출을 위해서, 웰을 항체 퍼옥시다제 컨쥬게이트와 함께 항온처리한다. ABTS와 함께 항온처리하고 405nm에서 검출함으로써 고정된 퍼옥시다제 활성을 검출한다.
봉입체를 단리, 용해 및 재생하는 일반적인 방법:
인용 문헌에서 수행되는 방법에 추가하여 예를 들면 [Rudolph et al., Folding Proteins, In: T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996)]의 방법에 따라 봉입체를 제조할 수 있다. 봉입체는 -70℃에서 저장되었다. 봉입체의 용해는 유사하게 [Rudolph et al., Folding Proteins, In: T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996)]의 방법에 따라 수행될 수 있다.
실시예 1
IGF-1 작용제의 정제
폴리펩타이드를 이.콜라이에서 발현시켰다. 폴리펩타이드를 먼저 HCIC 컬럼에 가한 후, 하이드록실아파타이트 컬럼에 가하고, 최종적으로 제 2 HCIC 컬럼에 가하였다.
크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
제 1 컬럼:
수지: 단일 단계 용출로서 MEP-하이퍼셀(MEP-Hypercel)(미국 폴 코포레이션(Pall Corporation))을 이용한 HCIC
로딩: 컬럼 체적 1ml당 10mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 9.0으로 조절된 25mM 트리스(하이드록시메틸)아미노 메탄 완충액
완충액 B: pH 5.0으로 조절된 10mM 아세트산 나트륨 완충액,
IGF-1 작용제를 함유한 용액을 제 1 단계에서 소수성 전하 유도 크로마토그래피 물질(폴 코포레이션의 MEP-하이퍼셀)을 함유하는 컬럼에 가하였다.
도 1에서는, HCIC 이전과 이후의 IGF-1 작용제의 역상 크로마토그램이 제시되어 있다.
제 2 컬럼:
수지: 하이드록실아파타이트 크로마토그래피(미국 바이오래드 래보레이토리스)
로딩: 컬럼 체적 1ml당 6.5mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 6.5로 조절된 5mM 인산칼륨 완충액
완충액 B: pH 6.5로 조절된 1M 염화 나트륨이 보충된 10mM MES 완충액,
도 2는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계 이전과 이후의 역상 크로마토그램을 나타낸다.
제 3 컬럼:
수지: HEA-하이퍼셀을 이용한 HCIC(미국 폴 코포레이션)
로딩: 컬럼 체적 1ml당 20mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 4.0으로 조절된 20mM 아세트산 나트륨 용액
도 3은 제 2 HCIC 단계 이전과 이후의 역상 크로마토그램을 나타낸다.
Figure pct00004

실시예 2
IGF-1 작용제의 정제- 실시예 1에 대한 비교예
폴리펩타이드를 먼저 HIC 컬럼에 가한 후, 양이온 교환 크로마토그래피에 가하고, 최종적으로 플로우-쓰루 모드로 작동되는 음이온 교환 크로마토그래피에 가하였다.
제 1 컬럼:
수지: 슈퍼 부틸 토요펄(미국 소재의 토쇼 하스 코포레이션)을 이용한 HIC
로딩: 컬럼 체적 1ml당 5mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 8.0으로 조절된 1M 염화칼륨으로 보충된 50mM 인산칼륨 완충액
완충액 B: pH 4.0으로 조절된 2-프로판올 5 내지 10%(w/v)
0%(v/v) 내지 100%(v/v)의 완충액 B로 컬럼의 30배 체적으로 선형 농도구배하여 용출시켰다.
도 4에서는, HIC 단계 이전과 이후의 역상 크로마토그램이 제시되어 있다.
제 2 컬럼:
수지: CM-세파로즈 FF를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피(미국 GE 헬쓰케어)
로딩: 컬럼 체적 1ml당 4.1mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 5.8로 조절된 50mM 아세트산
완충액 B: pH 9.5로 조절된 1M 염화 나트륨이 보충된 100mM 트리스(하이드록시메틸) 아미노 메탄 완충액,
하기와 같이 용출을 수행하였다: 15%(v/v) 완충액 B로 시작하여 컬럼 체적의 5배 동안 15%(v/v)로 유지시키고, 컬럼 체적의 20배동안 55%(v/v) 완충액 B까지 선형 구배시키고, 최종적으로 컬럼 체적의 10배 동안 55%(v/v)로 유지시켰다.
도 5는 양이온 교환 크로마토그래피 단계 이전과 이후의 역상 크로마토그램을 나타낸다.
제 3 컬럼:
수지: 플로우-쓰루 모드의 Q-세파로스를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피(GE-헬쓰케어, 미국)
로딩: 컬럼 체적 1ml당 20mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 9.5로 조절된 25mM 트리스(하이드록시메틸) 아미노 메탄 완충액
완충액 B: 10mM 아세트산(pH 3.6)
도 6은 음이온 교환 크로마토그래피 이전과 이후의 역상 크로마토그램을 나타낸다.
Figure pct00005

실시예 3
인터페론의 정제
폴리펩타이드를 먼저 HIC 컬럼에 가한 후, 음이온 교환 컬럼에 가하고, 최종적으로 양이온 교환 크로마토그래피에 가하였다.
크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
제 1 컬럼:
수지: 단일 단계 용출로서 부틸 세파로즈(GE-헬쓰케어, 미국)를 이용한 HIC
로딩: 컬럼 체적 1ml당 8mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 8.0으로 조절된 20mM 인산칼륨 완충액
제 2 컬럼:
수지: Q-세파로즈 FF를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피(미국 GE 헬쓰케어)
로딩: 컬럼 체적 1ml당 1.5mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 5.9로 조절된 30mM 암모늄 아세테이트
완충액 B: pH 3.5로 조절된 1.8mM 암모늄 아세테이트
하기와 같이 용출을 수행하였다: 15%(v/v) 완충액 B으로 시작하여 컬럼 체적의 3배 동안 15%(v/v)로 유지시키고, 최종적으로 컬럼 체적의 37.5배 동안 90%(v/v)로 선형 구배시켰다.
제 3 컬럼:
수지: 단일 단계 용출로서 SP-세파로즈를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피
로딩: 컬럼 체적 1ml당 2.84mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 9.0으로 조절된 250mM 염화나트륨으로 보충된 50mM 보레이트 완충액
Figure pct00006

실시예 4
인터페론의 정제 - 실시예 3에 대한 비교용
폴리펩타이드를 먼저 HIC 컬럼에 가한 후, 양이온 교환 크로마토그래피에 가하고, 최종적으로 음이온 교환 크로마토그래피에 가하였다.
크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
제 1 컬럼:
수지: 부틸 세파로즈(GE-헬쓰케어, 미국)를 이용한 HIC
로딩: 컬럼 체적 1ml당 8mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 8.0으로 조절된 2mM 염화칼륨이 보충된 20mM 인산칼륨 완충액
완충액 B: pH 8.0으로 조절된 20mM 인산 칼륨 완충액
제 2 컬럼:
수지: CM 토요펄(토쇼 하스 코포레이션, 미국)을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피
로딩: 컬럼 체적 1ml당 5mg의 폴리펩타이드
완충액 A: 평형: pH 4.0으로 조절된 75mM 나트륨 아세테이트; 세척: pH 5.5로 조절된 15mM 나트륨 아세테이트
완충액 B: pH 7.0으로 조절된 30mM 나트륨 아세테이트
제 3 컬럼:
수지: Q-세파로즈를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피
로딩: 컬럼 체적 1ml당 3mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 6.8로 조절된 30mM 암모늄 아세테이트
완충액 B: 1) pH 6.5로 조절된 25mM 암모늄 아세테이트
2) pH 4.5로 조절된 3mM 아세트산이 보충된 1.8mM 암모늄 아세테이트
Figure pct00007

실시예 5
인터페론의 정제 - 실시예 3 및 4에 대한 비교용
폴리펩타이드를 먼저 금속 킬레이팅 컬럼에 가한 후, 양이온 교환 컬럼에 가하고, 최종적으로 음이온 교환 크로마토그래피에 가하였다.
크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
제 1 컬럼:
수지: 단일 단계 용출로서 구리 킬레이팅 세파로즈(GE-헬쓰케어, 미국)
로딩: 컬럼 체적 1ml당 51mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 6.45로 조절된 150mM 염화나트륨 및 20mM 인산나트륨 완충액으로 보충된 300mM 구아니디늄 하이드로클로라이드
세척: pH 4.95로 조절된 100mM 염화 나트륨으로 보충된 50mM 아세트산
완충액 B: pH 3.9로 조절된 100mM 염화나트륨으로 보충된 50mM 아세트산
제 2 컬럼:
수지: 단일 단계 용출로서 CM 토요펄(토쇼 하스 코포레이션, 미국)을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피
로딩: 컬럼 체적 1ml당 5mg의 폴리펩타이드
완충액 A: 평형: pH 4.0으로 조절된 75mM 나트륨 아세테이트;
세척: pH 5.5로 조절된 15mM 나트륨 아세테이트
완충액 B: pH 7.0으로 조절된 30mM 나트륨 아세테이트
제 3 컬럼:
수지: Q-세파로즈를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피
로딩: 컬럼 체적 1ml당 3mg의 폴리펩타이드
완충액 A: pH 6.8로 조절된 30mM 암모늄 아세테이트
완충액 B: 1) pH 6.5로 조절된 25mM 암모늄 아세테이트
2) pH 4.5로 조절된 3mM 아세트산이 보충된 1.8mM 암모늄 아세테이트
Figure pct00008

Claims (16)

  1. a) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 및 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는 제 1 크로마토그래피 단계,
    b) i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 v) 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서 선택되는 제 2 크로마토그래피 단계,
    c) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피, 및 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 3 크로마토그래피 단계의 순서로 상기 3가지 크로마토그래피 단계를 포함하며, 여기서,
    - 금속 리간드와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드의 경우 제 1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고,
    - 등전점이 6.0 미만인 폴리펩타이드의 경우, 제 2 크로마토그래피 단계는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계가 아니고,
    - 낮거나 높은 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 제 3 크로마토그래피 단계가 플로우-쓰루 방식으로 수행될 수 있음을 특징으로 하는
    원핵 세포에서 재조합 생산된 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 정제하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    원핵 세포가 이.콜라이 세포인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    친화성 크로마토그래피가 금속 킬레이팅 크로마토그래피인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
    비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 성장 인자 작용제 또는 길항제, 인터페론 또는 인터페론 변이체에서 선택되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    단계 c) 이후에 폴리펩타이드를 PEG화시키는 추가의 단계 d)를 포함하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a) 및 b)가 양이온 교환 크로마토그래피 단계인 방법.
  7. a) 이종 폴리펩타이드를 발현시키기에 적합한 조건 하에서 이종 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 세포를 배양하는 단계;
    b) 배양 배지 또는 원핵 세포로부터 이종 폴리펩타이드를 회수하는 단계;
    c) 제 1 항에 따른 방법을 이용하여 이종 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 원핵 세포에서 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 재조합 생산하는 방법.
  8. a) 이종 폴리펩타이드의 발현 및 상기 이종 폴리펩타이드를 함유하는 봉입체의 형성에 적합한 조건 하에서 이종 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 세포를 배양하는 단계;
    b) 원핵 세포로부터 봉입체를 회수하는 단계;
    c) 봉입체로부터 이종 폴리펩타이드를 용해시키고 재생시키는 단계;
    d) 제 1 항에 따른 방법을 이용하여 이종 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 봉입체를 통해 원핵 세포에서 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 재조합 생산하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 크로마토그래피 단계 이전의 함량에 비해서 제 3 크로마토그래피 단계 이후에 수득된 폴리펩타이드 용액에서 내독소 및/또는 이.콜라이 DNA 및/또는 이.콜라이 세포 단백질의 함량이 감소된 방법.
  10. 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고, 제 2 크로마토그래피 단계가 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피에서 선택되고, 제 3 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는, 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하는, 인슐린형 성장 인자-1(IGF-1) 또는 IGF-1 변이체를 정제하는 방법.
  11. 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고, 제 2 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 단계이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피인, 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하는, 인터페론 알파-2a(IFNα-2a)를 정제하는 방법.
  12. 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피이고, 제 2 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피 단계이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피인 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하는, IFNα-2a를 생산하는 방법.
  13. a) 원핵 세포에서 재조합 생성된 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 제공하는 단계,
    b) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 및 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는 제 1 크로마토그래피 단계,
    c) i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 및 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 2 크로마토그래피 단계,
    d) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피, 및 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 3 크로마토그래피 단계를 이와 같은 순서로 포함하며, 여기서, 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드가 단계 d) 이후에 PEG화되는, 원핵 세포에서 재조합 생산된 비-글라이코실화된 PEG화된 이종 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  14. 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 금속 친화성 크로마토그래피에서 선택되고, 제 2 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피인 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하고, 여기서 제 3 크로마토그래피 단계 이후에 정제된 비-글라이코실화된 IFNα-2a 및 비-PEG화된 IFNα-2a가 PEG화되는, PEG화된 IFNα-2a를 생산하는 방법.
  15. 제 1 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피이고, 제 2 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피이고, 제 3 크로마토그래피 단계가 소수성 전하 유도 크로마토그래피인 3개의 연속적인 크로마토그래피 단계의 순서를 포함하고, 여기서 제 3 크로마토그래피 단계 이후에 정제된 비-글라이코실화된 IFN 및 비-PEG화된 IFN이 PEG화되는, PEG화된 인터페론을 생산하는 방법.
  16. a) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, iii) 친화성 크로마토그래피, 및 iv) 이온 교환 크로마토그래피에서 선택되는 제 1 크로마토그래피 단계,
    b) i) 음이온 교환 크로마토그래피, ii) 양이온 교환 크로마토그래피, iii) 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 v) 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서 선택되는 제 2 크로마토그래피 단계,
    c) i) 소수성 전하 유도 크로마토그래피, ii) 음이온 교환 크로마토그래피, iii) 양이온 교환 크로마토그래피, 및 iv) 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 제 3 크로마토그래피 단계의 순서로 상기 3가지 크로마토그래피 단계를 포함하며, 여기서,
    - 금속 리간드와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드의 경우 제 1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피이고,
    - 등전점이 6.0 미만인 폴리펩타이드의 경우, 제 2 크로마토그래피 단계는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 단계가 아니고,
    - 낮거나 높은 등전점을 갖는 폴리펩타이드의 경우 제 3 크로마토그래피 단계가 플로우-쓰루 방식으로 수행될 수 있고,
    3개의 크로마토그래피 단계의 적어도 2개 이상의 상이한 순서가 유사한 순도를 갖는 정제된 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 생성하는,
    원핵 세포에서 재조합 생산된 비-글라이코실화된 이종 폴리펩타이드를 정제하는 방법.

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