JP2011509963A - 非グリコシル化タンパク質の精製 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリペプチド精製の分野に関する。非グリコシル化ポリペプチドを三つのクロマトグラフィー工程の組合せで精製するための一般法を報告する。
タンパク質は、今日の医学ポートフォリオに重要な役割を果たす。ヒトへの応用のために、あらゆる薬物は別個の基準を満たさねばならない。ヒトに対する生物薬剤の安全性を保証するために、重度の危害を加えるであろう核酸、ウイルス、および宿主細胞タンパク質を特に除去しなければならない。規制上の規格を満たすために、一つまたは複数の精製工程が製造プロセスに続かなければならない。とりわけ、純度、処理量、および収率は、適切な精製プロセスの決定に重要な役割を果たす。
本発明の第一の局面は、原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化異種ポリペプチドの精製のための方法であり、その方法は、以下の順番で三つのクロマトグラフィー工程:
a) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii)アフィニティークロマトグラフィー、または
iv)イオン交換クロマトグラフィー
より選択される第一のクロマトグラフィー工程、
b) i)陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii)陽イオン交換クロマトグラフィー、
iii)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー、または
v)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー
より選択される第二のクロマトグラフィー工程、
c) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)陰イオン交換クロマトグラフィー、
iii)陽イオン交換クロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第三のクロマトグラフィー工程
を含み、
ここで、
− 金属リガンドと相互作用することができるポリペプチドの場合に、第一のクロマトグラフィー工程はアフィニティークロマトグラフィーであり、
− 6.0未満の等電点を有するポリペプチドの場合に、第二のクロマトグラフィー工程はヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー工程ではなく、
− 低または高等電点を有するポリペプチドについては、第三のクロマトグラフィー工程はフロースルーモードで行うことができ、
− 場合により第三のクロマトグラフィー工程は、ポリペプチドの濃縮のために使用することができ、精製された非グリコシル化異種ポリペプチドは、工程c)の後で得られる。
a)異種ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を、その異種ポリペプチドの発現に適した条件で培養すること、
b)培養液からまたは原核細胞から異種ポリペプチドを回収すること、
c)本発明の方法で異種ポリペプチドを精製し、それにより非グリコシル化異種ポリペプチドを得ること
を含む。
一般的なクロマトグラフィー法およびそれらの使用は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991), Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds)., John Wiley & Sons, Inc., New York;またはFreitag, R., Chromatographical processes in the downstream processing of (recombinant) proteins, Meth. Biotechnol. 24 (2007) 421-453 (Animal cell biotechnology 2nd Edition)を参照されたい。
a) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii)アフィニティークロマトグラフィー、または
iv)イオン交換クロマトグラフィー
より選択される第1のクロマトグラフィー工程、
b) i)陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii)陽イオン交換クロマトグラフィー、
iii)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー、または
v)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー
より選択される第2のクロマトグラフィー工程、
c) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)陰イオン交換クロマトグラフィー、
iii)陽イオン交換クロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第3のクロマトグラフィー工程
を含む、原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化異種ポリペプチドを精製するための方法を提供する。
− 金属リガンドと相互作用できるポリペプチドの場合に、第1のクロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーであり、
− 等電点が6.0未満のポリペプチドの場合に、第2のクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー工程ではなく、
− 低または高等電点を有するポリペプチドについて、第3のクロマトグラフィー工程は、フロースルーモードで行うことができ、
− 場合により、ポリペプチド溶液を濃縮するために、第3のクロマトグラフィー工程を使用することができる。
第1の例示的なポリペプチドは、例えば国際公開公報第2006/066891号に報告されたIGF−1アゴニストである。
1)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(a−i)、
2)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー(b−iii)、および
3)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(c−i)
を含む。
1)疎水性相互作用クロマトグラフィー(a−ii)、
2)陽イオン交換クロマトグラフィー(b−ii)、および
3)陰イオン交換クロマトグラフィー(c−ii)
である。
第2の例示的なポリペプチドは、例えばEP0 043 980に報告されたようなインターフェロンα−2a(IFNα−2a)である。
1)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(a−i)、
2)陰イオン交換クロマトグラフィー(b−ii)、および
3)疎水性相互作用クロマトグラフィー(c−iv)
を含む。
1)疎水性相互作用クロマトグラフィー(a−ii)、
2)陽イオン交換クロマトグラフィー(b−ii)、および
3)疎水性相互作用クロマトグラフィー(c−iv)
で、比較のために精製した。
本発明の方法は、非グリコシル化リコンビナント製造ポリペプチドに適用可能なだけでなく、さらに、PEG化非グリコシル化ポリペプチドの製造にもより適する。例示的なPEG化インターフェロンについては、例えばEP0 809 996を参照されたい。
a) 原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化異種ポリペプチドを提供すること、
b) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii)アフィニティークロマトグラフィー、または
iv)イオン交換クロマトグラフィー
より選択される第1のクロマトグラフィー工程、
c) i)陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii)陽イオン交換クロマトグラフィー、
iii)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第2のクロマトグラフィー工程、
d) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)陰イオン交換クロマトグラフィー、
iii)陽イオン交換クロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第3のクロマトグラフィー工程
を含む、原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化PEG化異種ポリペプチドを製造するための方法であるが、ここで、当該非グリコシル化異種ポリペプチドは、工程d)後にPEG化された後に得られる。
− 金属リガンドと相互作用できるポリペプチドの場合に、第1のクロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーであり、
− 6.0未満の等電点を有するポリペプチドの場合に、第2のクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー工程ではなく、
− 低または高等電点を有するポリペプチドについて、第3のクロマトグラフィー工程は、フロースルーモードで行うことができる。
1)疎水性相互作用クロマトグラフィー(b−ii)、
2)陽イオン交換クロマトグラフィー(c−ii)、および
3)陰イオン交換クロマトグラフィー(d−ii)
を含み、工程3)の後に精製非グリコシル化非PEG化IFNをPEG化する。
1)金属アフィニティークロマトグラフィー(b−iii)、
2)陽イオン交換クロマトグラフィー(c−ii)、および
3)陰イオン交換クロマトグラフィー(d−ii)
でIFNをまた精製し、工程3)の後に、精製非グリコシル化非PEG化IFNをPEG化する。
1)疎水性相互作用クロマトグラフィー(b−ii)、
2)陽イオン交換クロマトグラフィー(c−ii)、および
3)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(d−i)
と比較するために行うことができ、工程3)の後に精製非グリコシル化非PEG化IFNをPEG化する。
a)当該異種ポリペプチドの発現に適した条件で、当該異種ポリペプチドをコードしている核酸を含む原核細胞を培養すること、
b)培養液または原核細胞から当該異種ポリペプチドを回収すること、
c)以下の順番で以下の工程:
α) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii)アフィニティークロマトグラフィー、または
iv)イオン交換クロマトグラフィー
より選択される第1のクロマトグラフィー工程、
β) i)陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii)陽イオン交換クロマトグラフィー、
iii)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー、または
v)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー
より選択される第2のクロマトグラフィー工程、
γ) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)陰イオン交換クロマトグラフィー、
iii)陽イオン交換クロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第3のクロマトグラフィー工程
を含む方法で当該異種ポリペプチドを精製すること
を含むことを特徴とする、原核細胞における非グリコシル化異種ポリペプチドのリコンビナント製造のための方法である。
− 金属リガンドと相互作用できるポリペプチドの場合に、第1のクロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーであり、
− 6.0未満の等電点を有するポリペプチドの場合に、第2のクロマトグラフィー工程はヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー工程ではなく、
− 第3のクロマトグラフィー工程は、低または高等電点を有するポリペプチドを用いたフロースルーモードで行うことができる。
a)当該異種ポリペプチドの発現および当該異種ポリペプチドを含有する封入体の形成に適した条件で、当該異種ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を培養すること、
b)原核細胞から当該封入体を回収すること、
c)当該封入体から当該異種ポリペプチドを溶解および再生すること、
d)本発明の第1の局面の方法で当該異種ポリペプチドを精製すること
を含む方法である。
[式中、Rおよびmは上記と同義である]である。一態様では、PEG種は、メトキシポリ(エチレングリコール)−酪酸のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。「アルコキシ」という用語は、「アルキル」という用語が最大4個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する場合のアルキルエーテル基、例えばメトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、好ましくはメトキシを表す。
a) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii)アフィニティークロマトグラフィー、または
iv)イオン交換クロマトグラフィー
より選択される第1のクロマトグラフィー工程、
b) i)陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii)陽イオン交換クロマトグラフィー、
iii)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー、または
v)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー
より選択される第2のクロマトグラフィー工程、
c) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)陰イオン交換クロマトグラフィー、
iii)陽イオン交換クロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第3のクロマトグラフィー工程
を含むことを特徴とする、原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化異種ポリペプチドの精製のための方法であり、
ここで、
− 金属リガンドと相互作用できるポリペプチドの場合に、当該第1のクロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーであり、
− 6.0未満の等電点を有するポリペプチドの場合に、当該第2のクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー工程ではなく、
− 低または高等電点を有するポリペプチドについて、当該第3のクロマトグラフィー工程はフロースルーモードで行うことができ、
但し、三つのクロマトグラフィー工程の組合せが、
− アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、
− 疎水性相互作用クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー、
− 陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、
− 陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー、
− 陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー
ではないことを条件とする。
材料および方法:
特に示さない限り、異なるクロマトグラフィー法は、クロマトグラフィー材料の製造業者のマニュアルに準じて行った。
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されたような標準法をDNAの操作に使用した。分子生物試薬は、製造業者の説明書に準じて使用した。
アミノ酸配列に基づき計算したモル吸光係数を使用して、参照波長320nmで280nmの光学的密度(OD)を測定することにより、タンパク質濃度を決定した。
クロマトグラフィーは、Tosoh Haas TSK 3000 SWXLカラムを用いてASI-100 HPLCシステム(Dionex, Idstein, Germany)で実施した。UVダイオードアレイ検出器(Dionex)により溶離ピークを280nmでモニターした。濃縮試料を1mg/mlに溶解させた後に、安定したベースラインが達成されるまで、200mMリン酸二水素カリウムおよび250mM塩化カリウムから成る緩衝液(pH7.0)でカラムを洗浄した。流速0.5ml/minを使用した均一濃度条件で分析運転を室温で30分間行った。Chromeleon(Dionex, Idstein, Germany)でクロマトグラムをマニュアル積分した。
純度をRP−HPLCにより分析する。アッセイは、アセトニトリル/水性TFA勾配をかけてPoroshellカラムで行う。溶離プロファイルは、215nmのUV吸光としてモニターする。溶離した物質の率は、溶離したタンパク質の総ピーク面積に基づき計算する。
例えばMerrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照されたい。
マイクロタイタープレートのウェルの壁を血清アルブミンおよびストレプトアビジンの混合物でコーティングする。HCPに対するヤギ由来ポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄工程の後に、マイクロタイタープレートの異なるウェルを、異なる濃度のHCP較正シーケンスおよび試料溶液と共にインキュベーションする。インキュベーション後に、緩衝溶液で洗浄することにより、結合していない試料物質を除去する。検出のためにウェルを抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートし、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定されたペルオキシダーゼ活性は、ABTSと一緒のインキュベーションおよび405nmでの検出により検出される。
引用された刊行物で行われた方法に加えて、封入体の調製は、例えばRudolphら(Rudolph et al., Folding Proteins, T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996))による方法に準じて行うことができる。封入体は−70℃で保存した。封入体の溶解は、同様に、Rudolphら(Rudolph et al., Folding Proteins, T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996))による方法に準じて行うことができる。
IGF−1アゴニストの精製
ポリペプチドをE. coliで発現させた。ポリペプチドを最初にHCICカラムに、次にヒドロキシルアパタイトカラムに、最終的に第2のHCICカラムに適用する。
第1のカラム:
樹脂:一段階溶離としてMEP-Hypercel(Pall Corporation, USA)を用いたHCIC
ロード:カラム容積1mlあたり10mgのポリペプチド
緩衝液A:pH9.0に調整した25mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液
緩衝液B:pH5.0に調整した10mM酢酸ナトリウム緩衝液
樹脂:ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー(Biorad Laboratories, USA)
ロード:カラム容積1mlあたり6.5mgのポリペプチド
緩衝液A:pH6.5に調整された5mMリン酸カリウム緩衝液
緩衝液B:pH6.5に調整された1M塩化ナトリウムを補充した10mM MES緩衝液
樹脂:HEA-Hypercel(Pall Corporation, USA)を用いたHCIC
ロード:カラム容積1mlあたり20mgのポリペプチド
緩衝液A:pH4.0に調整された20mM酢酸ナトリウム緩衝液
IGF−1アゴニストの精製 − 実施例1の比較実施例
ポリペプチドを、最初にHICカラムに、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーに、最後にフロースルーモードで運転された陰イオン交換クロマトグラフィーに適用する。
樹脂:Super Butyl Toyopearl(Tosoh Haas Corp., USA)を用いたHIC
ロード:カラム容積1mlあたり5mgのポリペプチド
緩衝液A:pH8.0に調整された、1M塩化カリウムを補充された50mMリン酸カリウム緩衝液
緩衝液B:pH4.0に調整された、5〜10%(w/v)の2−プロパノール
樹脂:CM-Sepharose FF(GE-Healthcare., USA)を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー
ロード:カラム容積1mlあたり4.1mgのポリペプチド
緩衝液A:pH5.8に調整された50mM酢酸
緩衝液B:pH9.5に調整された、1M塩化ナトリウムを補充された100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液
開始時に15%(v/v)緩衝液Bに取り換え、15%(v/v)の緩衝液Bを5カラム容の間維持し、その後55%(v/v)緩衝液Bまで20カラム容にわたり直線勾配をかけ、最終的に55%(v/v)緩衝液Bを10カラム容の間維持する。
樹脂:Q-Sepharose(GE-Healthcare., USA)をフロースルーモードで用いた陰イオン交換クロマトグラフィー
ロード:カラム容積1mlあたり20mgのポリペプチド
緩衝液A:pH9.5に調整された25mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液
緩衝液B:10mM酢酸(pH3.6)
インターフェロンの精製
ポリペプチドを最初にHICカラムに、次に陰イオン交換カラムに、最終的に陽イオン交換カラムに適用する。
第1のカラム:
樹脂:一段階溶離としてブチルセファロース(GE-Healthcare, USA)を有するHIC
ロード:カラム容積1mlあたり8mgのポリペプチド
緩衝液A:pH8.0に調整された20mMリン酸カリウム緩衝液
樹脂:Q-Sepharose FF(GE-Healthcare, USA)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー
ロード:カラム容積1mlあたり1.5mgのポリペプチド
緩衝液A:pH5.9に調整された30mM酢酸アンモニウム
緩衝液B:pH3.5に調整された1.8mM酢酸アンモニウム
開始時に15%(v/v)緩衝液Bに取り換え、15%(v/v)緩衝液Bを3カラム容の間維持し、その後90%(v/v)緩衝液Bまで37.5カラム容にわたり直線勾配をかける。
樹脂:一段階溶離としてSP-Sepharoseを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー
ロード:カラム容積1mlあたり2.84mgのポリペプチド
緩衝液A:pH9.0に調整された、250mM塩化ナトリウムを補充された50mMホウ酸緩衝液
インターフェロンの精製 − 実施例3の比較実施例
ポリペプチドを最初にHICカラムに、次に陽イオン交換カラムに、最終的に陰イオン交換カラムに最初に適用する。
第1のカラム:
樹脂:ブチルセファロース(GE-Healthcare, USA)を用いたHIC
ロード:カラム容積1mlあたり8mgのポリペプチド
緩衝液A:pH8.0に調整された、2mM塩化カリウムを補充された20mMリン酸カリウム緩衝液
緩衝液B:pH8.0に調整された20mMリン酸カリウム緩衝液
樹脂:CM Toyopearl(Tosoh Hass Corp., USA)を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー
ロード:カラム容積1mlあたり5mgのポリペプチド
緩衝液A:平衡化:pH4.0に調整された75mM酢酸ナトリウム
洗浄:pH5.5に調整された15mM酢酸ナトリウム
緩衝液B:pH7.0に調整された30mM酢酸ナトリウム
樹脂:Q-Sepharoseを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー
ロード:カラム容積1mlあたり3mgのポリペプチド
緩衝液A:pH6.8に調整された30mM酢酸アンモニウム緩衝液
緩衝液B:1)pH6.5に調整された25mM酢酸アンモニウム、
2)pH4.5に調整された、3mM酢酸を補充された1.8mM酢酸アンモニウム
インターフェロンの精製 − 実施例3および4の比較実施例
最初に金属キレートカラムに、次に陽イオン交換カラムに、最終的に陰イオン交換カラムにポリペプチドを適用する。
第1のカラム:
樹脂:一段階溶離としての銅キレートセファロース(GE-Healthcare, USA)
ロード:カラム容積1mlあたり51mgのポリペプチド
緩衝液A:平衡化:pH6.45に調整された、150mM塩化ナトリウムおよび20mMリン酸ナトリウム緩衝液を補充された300mM塩酸グアニジウム
洗浄:pH4.95に調整された、100mM塩化ナトリウムを補充された50mM酢酸
緩衝液B:pH3.9に調整された、100mM塩化ナトリウムを補充された50mM酢酸
樹脂:一段階溶離としてCM Toyopearl(Tosoh Hass Corp., USA)を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー
ロード:カラム容積1mlあたり5mgのポリペプチド
緩衝液A:平衡化:pH4.0に調整された75mM酢酸ナトリウム
洗浄:pH5.5に調整された15mM酢酸ナトリウム
緩衝液B:pH7.0に調整された30mM酢酸ナトリウム
樹脂:Q-Sepharoseを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー
ロード:カラム容積1mlあたり3mgのポリペプチド
緩衝液A:pH6.8に調整した30mM酢酸アンモニウム緩衝液
緩衝液B:1)pH6.5に調整した25mM酢酸アンモニウム
2)pH4.5に調整された、3mM酢酸を補充された1.8mM酢酸アンモニウム
Claims (16)
- 以下の順番で以下の工程:
a) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii)アフィニティークロマトグラフィー、または
iv)イオン交換クロマトグラフィー
より選択される第1のクロマトグラフィー工程、
b) i)陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii)陽イオン交換クロマトグラフィー、
iii)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー、または
v)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー
より選択される第2のクロマトグラフィー工程、
c) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)陰イオン交換クロマトグラフィー、
iii)陽イオン交換クロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第3のクロマトグラフィー工程
を含むことを特徴とする、原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化異種ポリペプチドの精製のための方法であって、
ここで、
− 金属リガンドと相互作用できるポリペプチドの場合に、前記第1のクロマトグラフィー工程はアフィニティークロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーであり、
− 6.0未満の等電点を有するポリペプチドの場合に、前記第2のクロマトグラフィー工程はヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー工程ではなく、
− 低または高等電点を有するポリペプチドについて、前記第3のクロマトグラフィー工程はフロースルーモードで行うことができる方法。 - 前記原核細胞がE. coli細胞であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記アフィニティークロマトグラフィーが金属キレートクロマトグラフィーであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記非グリコシル化異種ポリペプチドが、成長因子のアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはインターフェロンもしくはインターフェロン変異体より選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 工程c)の後に、
d)前記ポリペプチドをPEG化すること
である追加の工程を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 前記工程a)およびb)が陽イオン交換クロマトグラフィー工程であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 以下の工程:
a)前記異種ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を前記異種ポリペプチドの発現に適した条件で培養すること、
b)培養液または原核細胞から前記異種ポリペプチドを回収すること、
c)請求項1記載の方法で前記異種ポリペプチドを精製すること
を含むことを特徴とする、原核細胞における非グリコシル化異種ポリペプチドのリコンビナント製造のための方法。 - 以下の工程:
a)前記異種ポリペプチドの発現および前記異種ポリペプチドを含有する封入体の形成に適した条件で、前記異種ポリペプチドをコードする核酸を含む前記原核細胞を培養すること、
b)原核細胞から前記封入体を回収すること、
c)前記封入体から前記異種ポリペプチドを溶解および再生すること、
d)請求項1記載の方法で前記異種ポリペプチドを精製すること
を含むことを特徴とする、封入体による原核細胞における非グリコシル化異種ポリペプチドのリコンビナント製造のための方法。 - 第3のクロマトグラフィー工程の後に得られたポリペプチド溶液におけるエンドトキシン、および/またはE. coli DNA、および/またはE. coli細胞タンパク質の含量が、第1のクロマトグラフィー工程前の含量と比べて減少していることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第1のクロマトグラフィー工程が疎水性電荷誘導クロマトグラフィーであり、第2のクロマトグラフィー工程がヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーより選択され、第3のクロマトグラフィー工程が疎水性電荷誘導クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーより選択される、三つの逐次クロマトグラフィー工程の順序を含む、IGF−1またはIGF−1変異体の精製のための方法。
- 第1のクロマトグラフィー工程が疎水性電荷誘導クロマトグラフィーであり、第2のクロマトグラフィー工程が陰イオン交換クロマトグラフィー工程であり、第3のクロマトグラフィー工程が疎水性電荷誘導クロマトグラフィーである、三つの逐次クロマトグラフィー工程の順序を含む、IFNα−2aの精製のための方法。
- 第1のクロマトグラフィー工程が疎水性相互作用クロマトグラフィーであり、第2のクロマトグラフィー工程が陽イオン交換クロマトグラフィー工程であり、第3のクロマトグラフィー工程が疎水性相互作用クロマトグラフィーである、三つの逐次クロマトグラフィー工程の順序を含む、IFNα−2aの精製のための方法。
- 以下の順番で以下の工程:
a) 原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化異種ポリペプチドを提供すること、
b) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii)アフィニティークロマトグラフィー、または
iv)イオン交換クロマトグラフィー
より選択される第1のクロマトグラフィー工程、
c) i)陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii)陽イオン交換クロマトグラフィー、
iii)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第2のクロマトグラフィー工程、
d) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)陰イオン交換クロマトグラフィー、
iii)陽イオン交換クロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第3のクロマトグラフィー工程
を含む、原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化PEG化異種ポリペプチドを製造する方法であって、前記非グリコシル化異種ポリペプチドを工程d)の後でPEG化する方法。 - 第1のクロマトグラフィー工程が疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは金属アフィニティークロマトグラフィーより選択され、第2のクロマトグラフィー工程が陽イオン交換クロマトグラフィーであり、第3のクロマトグラフィー工程が陰イオン交換クロマトグラフィーである、三つの逐次クロマトグラフィー工程の順序を含む、PEG化IFNα−2aの製造のための方法であって、前記第3のクロマトグラフィー工程の後で、精製非グリコシル化非PEG化IFNα−2aをPEG化する方法。
- 第1のクロマトグラフィー工程が疎水性相互作用クロマトグラフィーであり、第2のクロマトグラフィー工程が陽イオン交換クロマトグラフィーであり、第3のクロマトグラフィー工程が疎水性電荷誘導クロマトグラフィーである、三つの逐次クロマトグラフィー工程の順序を含む、PEG化インターフェロンの製造のための方法であって、前記第3のクロマトグラフィー工程の後に、精製非グリコシル化非PEG化IFNをPEG化する方法。
- 以下の順序で以下の工程:
a) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii)アフィニティークロマトグラフィー、または
iv)イオン交換クロマトグラフィー
より選択される第1のクロマトグラフィー工程、
b) i)陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii)陽イオン交換クロマトグラフィー、
iii)ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー、または
v)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー
より選択される第2のクロマトグラフィー工程、
c) i)疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、
ii)陰イオン交換クロマトグラフィー、
iii)陽イオン交換クロマトグラフィー、または
iv)疎水性相互作用クロマトグラフィー
より選択される第3のクロマトグラフィー工程
を含むことを特徴とする、原核細胞においてリコンビナント製造された非グリコシル化異種ポリペプチドの精製のための方法であって、
ここで、
− 金属リガンドと相互作用できるポリペプチドの場合に、前記第1のクロマトグラフィー工程はアフィニティークロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーであり、
− 6.0未満の等電点を有するポリペプチドの場合に、前記第2のクロマトグラフィー工程はヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー工程ではなく、
− 低または高等電点を有するポリペプチドについて、前記第3のクロマトグラフィー工程はフロースルーモードで行うことができ、
ここで、三つのクロマトグラフィー工程の少なくとも二つの異なる順序が、同等の純度で精製非グリコシル化異種ポリペプチドをもたらす方法。
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