JP2002530291A - インターフェロンアイソフォームおよびその産物の変換の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、タンパク質の付加アイソフォームを単離する方法およびこれらをその所望されるタンパク質に変換する方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、所望されるタンパク質から化学基を切断するために、酸性溶液または亜鉛溶液の使用を企図する。さらなる好ましい実施形態においては、本発明は、機能的な所望されるタンパク質を形成するための化学基の切断を伴う、還元型メルカプト基の酸化を企図する。本発明の別の実施形態においては、付加アイソフォームは、抗酸化剤を含む酸性溶液に曝露される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本開示を通して、種々の刊行物、特許および特許出願が参照される。これらの
刊行物、特許および特許出願の開示は、本明細書中に参考として援用される。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、タンパク質の単離および精製に関する。特に、本発明は、タンパク
質の単離、タンパク質のアイソフォームの単離および所望されるタンパク質のア
イソフォームの変換に関する。

【０００３】 （背景） 天然に存在するタンパク質は、研究および臨床的目的に広く用いられる。この
ようなタンパク質はその天然の供給源から得られ得るが、組換え技術は、天然に
は存在しない供給源からのこれらのタンパク質の産生を可能にし得る。例えば、
組換え技術（例えば、形質転換された細菌）を介して構築された微生物の発酵は
、天然の供給源を利用して可能なよりも実質的に低いコストで大量のヒトインタ
ーフェロンを産生する。このような組換えＤＮＡ技術はまた、他の重要なタンパ
ク質（例えば、インシュリンおよび組織プラスミノゲンアクチベーター）を産生
するために利用された。

【０００４】 しかし、組換え技術によって改変された細菌はまた、夾雑物および産生される
ことが企図されたタンパク質の構造的アイソフォームを産生する。これらの夾雑
物およびアイソフォームは、オリゴマーのタンパク質および還元型タンパク質ア
イソフォーム（Ｄ’Ａｎｄｒｅａらに対する米国特許第４，７６５，９０３号を
参照のこと）、細胞片およびウイルス（Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓらに対する米国特
許第４，７３２，６８３号を参照のこと）およびピルベート連結アイソフォーム
（Ｒｏｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：１９１０１（１９９２）；Ｐ
ｒｏｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１３０５０（１９９１）；Ｓｒ
ｅｖｅｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２９９８（１９７７）；およ
びＳｈａｐｉｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：３１２０（１９８０）
を参照のこと）を含む。タンパク質の精製の間に、これらの夾雑物を取り除くこ
とが所望される。

【０００５】 明らかに、これらのタンパク質アイソフォームは、この所望されるタンパク質
の純度を下げ、そしてこのアイソフォームの除去のためのプロセスが、全体の収
量を低減させる。しかし、タンパク質アイソフォームが所望されるタンパク質に
変換され得る場合、これらの除去は不必要であり、そして全体のタンパク質収量
は顕著に増加される。必要とされるのは、所望されないタンパク質アイソフォー
ムを同定しかつそれらをその所望されるタンパク質に変換する方法である。本発
明は、このような必要性に向けられる。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、付加アイソフォーム（ａｄｊｕｎｃｔ ｉｓｏｆｏｒｍ）を単離す
ることおよびそれらを所望の機能的タンパク質に変換することによって、高い収
量で高度に精製されたタンパク質を調製するための方法を提供する。１つの実施
形態において、本発明は、インターフェロンα組成物の収量を増加するための方
法を提供し、これは付加アイソフォームをインターフェロンαに変換することを
含む。本発明は特定のインターフェロンαに限定されないが、好ましい実施形態
において、インターフェロンαはインターフェロンα２ｂである。

【０００７】 別の実施形態において、本発明は、組換え的に産生された付加アイソフォーム
を、その所望されるタンパク質に変換するための方法（付加アイソフォームから
切断可能な基を化学的に除去することを含む）を提供する。

【０００８】 本発明は、除去される切断可能な基によって限定されない。１つの実施形態に
おいて、切断可能な基はピルベートを含む。

【０００９】 本発明はまた、切断可能な基を化学的に除去する方法によって限定されない。
１つの実施形態において、本発明は、付加アイソフォームを、酸性溶液に曝露す
ることを含む。付加アイソフォームがインターフェロンαのピルベート付加アイ
ソフォームである場合、酸性溶液は約ｐＨ５．５であることが好ましい。このよ
うな実施形態において、この酸性溶液が３４〜４０℃であることはさらに好まし
い。しかし、別の実施形態において、付加アイソフォームは、亜鉛溶液に曝露さ
れる。好ましい実施形態において、亜鉛溶液は、ｐＨ７．８〜ｐＨ８．６である
。さらに好ましい実施形態において、この亜鉛溶液は３０〜３８℃である。

【００１０】 本発明はまた、利用される酸性溶液または亜鉛溶液の型によって限定されない
。好ましい実施形態において、酸性溶液または亜鉛溶液は、抗酸化剤を含む。特
定の好ましい実施形態において、抗酸化剤はメチオニンを含む。このような実施
形態において、メチオニンの好ましい濃度は５〜４０ｍＭである。

【００１１】 （定義） 本明細書中で用いられる場合、用語「所望されるタンパク質」は、精製される
ことが企図される目的のタンパク質を意味する。もちろん、所望されるタンパク
質の同定は、精製手順の究極の目標を示す。例えば、精製手順の間、精製プロセ
スの中間の工程において、夾雑物を含むタンパク質群を得ることが、所望され得
る。中間のタンパク質群を得る際の目的にかかわらず、精製手順の究極の目標で
あるタンパク質群が、所望されるタンパク質として見なされる。

【００１２】 本明細書中に用いられる場合、用語「付加アイソフォーム」は、所望されるタ
ンパク質に類似する構造的および／または機能的な特徴を有するタンパク質アイ
ソフォームを意味し、ここで切断可能な基はこのタンパク質から除去されて、所
望されるタンパク質を産生し得る。「切断可能な基」は、所望されるタンパク質
に付加される化学的に除去され得る化学基を意味すると理解される。本明細書中
に用いられる場合、「化学的除去」または「化学的に除去された」は、化学基が
、酸性溶液、塩基性溶液、金属イオン触媒などを含むが、これらに限定されない
化学的手段によってタンパク質から分離されたことを示すと理解される。

【００１３】 本発明を実行するために必要ではないが、切断可能な基が化学的に同定され得
る場合、付加アイソフォームは、付加アイソフォームの特定の型として言及され
得る。例えば、「ピルベート付加アイソフォーム」は、ピルベートとして同定可
能な付加された切断可能な基を有する所望されるタンパク質である。

【００１４】 本明細書中に用いられる場合、用語「酸化反応」は、２つのシステインアミノ
酸のメルカプト基にジスフィルド結合を形成させることが企図される反応を意味
する。

【００１５】 本明細書中に用いられる場合、用語「インターフェロンα」は、標的細胞にウ
イルス耐性を与え、細胞増殖を阻害し、そしてＭＨＣクラスＩ抗原の発現を調節
する、誘導可能な分泌タンパク質のファミリーをいう。このファミリーは、イン
ターフェロンα２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ、Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ、Ｎ
ｕｔｌｅｙ、ＮＪ）、インターフェロンα２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｓｃｈｅｒｉｎ
ｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、インターフェロンα２ｃ（Ｂｅｒ
ｏｆｏｒ Ａｌｐｈａ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｉｎｇｅ
ｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または天然に存在するインターフェロンα（Ｉｎ
ｆｅｒｇｅｎ、Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）のコンセンサ
ス配列の決定によって定義されるようなコンセンサスのインターフェロンを含む
が、これらに限定されない。

【００１６】 （発明の詳細な説明） 本発明は、タンパク質の単離および精製に関する。１つの実施形態において、
本発明は、付加アイソフォームの同定および精製を提供する。別の実施形態にお
いて、本発明は、付加アイソフォームから所望されるタンパク質を産生するため
の方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、付加アイソフォー
ムと所望されるタンパク質との共精製によって、およびそれに引き続く付加アイ
ソフォームの所望されるタンパク質への変換によって、高度に精製された所望さ
れるタンパク質を提供する。この様式において、付加アイソフォームの量は低減
され、そして所望のタンパク質の全体的収量は増加し、および／または以前に達
成されたよりも高度に精製される。この所望されるタンパク質の収量は、付加ア
イソフォームの変換なしに得られる収量の１０倍程増加され得る。

【００１７】 本発明は、所望されるタンパク質または付加アイソフォームの供給源によって
限定されないが、１つの実施形態において、供給源は、組換え技術を介して構築
された微生物である。当業者に公知のこのような技術が、多く存在する。このよ
うな形質転換された微生物は、原核生物細胞または真核生物細胞、細菌、哺乳動
物細胞などであり得る。例えば、インターフェロンαは、細菌において、以下の
教示に従って産生され得る：Ｗｅｉｓｓｍａｎに対する米国特許第４，５３０，
９０１号または欧州特許出願公開番号ＥＰ０３２，１３４に記載される技術。

【００１８】 同様に、本発明は、付加アイソフォームを産生細胞から抽出する任意の特定の
方法に限定されない。所望されるタンパク質がインターフェロンαである場合、
例えば、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚらに対する米国特許第４，３１５，８５２号および
同第４，３６４，８６３号に記載された方法が適切である。

【００１９】 同様に、本発明は、付加アイソフォームまたは所望のタンパク質を単離するた
めに使用される特定の精製技術によって限定されない。多くのクロマトグラフィ
ーおよび他の分離技術が当業者に公知であり、そして本発明は適用可能である。

【００２０】 本発明は付加アイソフォームを同定する方法によって限定されないが、付加ア
イソフォームの同定は、所望されるタンパク質および所望されるタンパク質より
大きな分子量を有する任意の夾雑物の分子量の研究によって達成され得る。１つ
のこのような方法は、Ｒｏｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９１０
１（１９９２）に記載される。所望されるタンパク質より大きな分子量を有する
夾雑物は、分解条件（例えば、強酸性または強塩基性ｐＨ）に曝露され得、そし
て分解産物について分析され得る。これらの分解産物の１つが所望されるタンパ
ク質と同一の質量および／または構造的特徴を有する場合、夾雑物は、切断可能
な基を有する付加アイソフォームとみなされ得る。

【００２１】 本発明は付加アイソフォームを所望されるタンパク質に変換するための特定の
方法によって限定されないが、１つの実施形態において、スクリーニングプロセ
スは、適切な変換条件を決定し得る。例えば、１つのプロセスは、切断可能な基
が付加アイソフォームから除去されるが機能的な所望されるタンパク質または非
不可逆的に変性した所望されるタンパク質が生じる点への反応溶液のｐＨの段階
的な調整を必要とする。

【００２２】 さらに、本発明は、切断可能な基を化学的に除去する方法によって限定されな
い。１つの実施形態において、付加アイソフォームを酸性条件（例えば、酢酸を
用いて）に曝露することによって、基は除去または切断される。代替の実施形態
において、付加アイソフォームは、亜鉛に曝露される。

【００２３】 本発明はまた、切断反応が行われる温度によって限定されない。しかし、一般
に、より高い温度は、より速く付加アイソフォームを所望されるタンパク質に変
換する。

【００２４】 切断可能な化学的な除去は、所望されるタンパク質と同一の構造的特徴を有す
るタンパク質を産生し得るが、これは、還元型メルカプト基を酸化してジスフィ
ルド結合するために時として必要である。これによって、タンパク質は、適切な
フォールディングを達成し、そして機能的なタンパク質となる。メルカプト基を
酸化する方法は、当該分野において公知であり、そして本発明は、任意の特定の
酸化の方法によって限定されない。

【００２５】 １つの実施形態において、本発明は、酸化の間のメチオニンスルホキシドの形
成を防ぐメチオニン基の保護を企図する。メチオニン基を保護する方法は、当該
分野において公知であり、そして本発明は、メチオニン基を保護するための特定
の方法によって限定されない。しかし、方法は、Ｌａｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓ
ｃｉ．８６：１２５０（１９９７）およびＴａｋｒｕｋｉに対する米国特許第５
，２７２，１３５号によって記載されるような抗酸化剤の使用を含む。

【００２６】 本発明はまた、酸化反応の実行の方法によって限定されない。例えば、１つの
実施形態において、本発明は、切断可能な基の除去、次ぐメルカプト基の酸化を
企図する。別の実施形態において、本発明は、同一の反応条件下で切断可能な基
の除去およびメルカプト基の酸化を企図する。

【００２７】 同様に、切断可能な基の化学的除去およびタンパク質の酸化が同一の反応にお
いて行われる場合、本発明は、付加アイソフォームからの切断可能な基の除去お
よび酸化の任意の特定の方法によって限定されない。しかし、１つの実施形態に
おいて、スクリーニングプロセスは、切断可能な基の化学的除去のための最良の
条件を決定するように行われる。例えば、ｐＨ条件の範囲を用いる実験が行われ
得、そして生じる適切な構造的整合性（すなわち、不可逆的に変性されない）を
有する所望されるタンパク質の量および／または切断可能な基の量を測定し得る
。（適切な構造的整合性を有する所望されるタンパク質の量）対（反応ｐＨ）の
プロットは、一般に、切断可能な基の化学的除去反応に対する理想的なｐＨを示
す曲線の最高点を有する釣鐘型の曲線を生じる。このような実施形態において、
類似のスクリーニングが、酸化反応のために行われ得る。化学的除去反応および
酸化反応の釣鐘型の曲線が交差する場合、交点は、同一反応における切断可能な
基の除去およびメルカプト基の酸化のための最良のｐＨ条件を示す。インターフ
ェロンαのピルベート付加アイソフォームの化学的除去および酸化に関して、組
合せ反応を行う最良のｐＨを示すｐＨ５付近で２つの曲線が交差する。評価され
得る他の反応条件は、塩濃度、温度などを含むが、これらに限定されない。

【００２８】 付加アイソフォームの所望されるタンパク質への変換後、さらなるクロマトグ
ラフィー工程が、夾雑物から所望されるタンパク質を精製するために必要であり
得る。

【００２９】 所望されるタンパク質が適切に精製された後、所望されるならば、これは治療
的使用に適切な形態に置かれ得る。例えば、所望されるタンパク質がインターフ
ェロンαである場合、Ｋｗａｎに対する米国特許第４，８４７，０７９号および
同第４，４９６，５３７号、ならびにＹｕｅｎらに対する米国特許第５，７６６
，５８２号に記載された処方が適切である。あるいは、他の不活性の、薬学的に
受容可能なキャリアは、固体または液体のいずれかであり得る。固形調製物は、
粉末、錠剤、分散可能な顆粒、カプセル、カシューおよび坐剤を含む。粉末およ
び錠剤は、約５〜約９５％の所望されるタンパク質を含み得る。適切な固体キャ
リアは、当該分野において公知である（例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン
酸マグネシウム、タルク、糖またはラクトース）。錠剤、粉末、カシューおよび
カプセルは、経口投与に適切な固体投薬形態として用いられ得る。

【００３０】 坐剤を調製するために、低融点ワックス（例えば、脂肪酸グリセリドの混合物
（例えば、ココアバター））がまず融解され、そして活性成分が、撹拌によって
そこに均質に拡散される。次いで、溶融した均質な混合物は、都合よいサイズの
型に流し込まれ、冷却されそして固化される。

【００３１】 液体形態調製物は、溶液、懸濁液および乳濁液を含む。例えば、非経口注射の
ための水またはプロピレングリコール水溶液または経口の溶液、懸濁液および乳
濁液のための甘味料および乳白剤（ｏｐａｃｉｆｙ）の添加。液体形態調製物は
また、鼻腔内投与のための溶液を含み得る。

【００３２】 吸入に適切なエアロゾル調製物は、溶液または粉末形態にある固形を含み得、
これらは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、不活性圧縮ガス）と組み合わ
せられ得る。

【００３３】 本発明の化合物はまた、経皮的に送達され得る。経皮的組成物は、クリーム、
ローション、エアロゾルおよび／または乳濁液の形態をとり得、そしてこの目的
のために該当分野に慣用的なように、マトリックスの経皮的パッチまたはリザー
バー型に含ませ得る。

【００３４】 調製物の単位用量における活性化合物の量は、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍ
ｇ、そして好ましくは約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇに調整され得る。代わりに
、活性化合物は、国際単位によって調製され得、好ましい投薬量は、３００万〜
５０００万国際単位である。このような実施形態において、３００万、５００万
、１８００万、２５００万および５０００万単位投薬量形態が、企図される。

【００３５】 使用直前に、経口的、局所的または非経口的投与のいずれかのための液体形態
調製物へ変換されることが企図される固形もまた含まれる。

【００３６】 以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を例示するため
に示し、そして本発明の範囲を限定するようには解釈されない。

【００３７】 （実施例１：ピルベート付加アイソフォームの変換のためのスクリーニングプ
ロセス） ピルベート付加アイソフォームは内部セル（ｃｅｌｌ）を形成し得、この内部
セルでは、タンパク質のＮ末端アミノ酸残基のα−アミノ基は、ピルベートのカ
ルボニル基と縮合されている。ピルベートがタンパク質のコンフォメーションを
干渉する場合には、このようなピルベート−タンパク質付加アイソフォームが加
水分解される（ピルベートが、タンパク質から切断される）場合にのみ、熱力学
的に有利なコンフォメーション変化を通して、タンパク質をその所望される形態
へと自由にリフォールディングし得る。所望されるタンパク質がジスルフィド結
合を有する場合、ピルベート切断から生じる還元アイソフォームは、所望される
形態へのリフォールディングの一部として、酸化されるべきである。

【００３８】 以下の手順は、ピルベート−タンパク質付加アイソフォームをその所望される
形態に変換するための最適な条件を決定する方法を例示する。先に考察したよう
に、所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有さない場合、スクリーニング
は、単に、ピルベート切断（加水分解）を最大化するように実施される必要があ
る。所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有する場合、スクリーニングは
、ピルベート切断（加水分解）だけでなくジスルフィド結合形成（酸化）をも最
大化するように実施される必要がある。

【００３９】 （１）ピルベートアッセイ） ピルベートアッセイは、ピルベート−切断動態を理解するために、加水分解の
程度をモニターすることが必要とされる。例えば、「遊離」ピルベートは、化学
修飾方法または酵素的方法により定量的にアッセイされ得る。２，４−ジニトロ
フェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）は、ピルベートを誘導体化するために使用され
得る。アッセイサンプルは、ピルベート−タンパク質付加アイソフォームを排除
するために、適切なＭＷＣＯ膜（例えば、１０Ｋ膜）を使用して、限外濾過され
るべきである。濾液を、酸性ｐＨにおいてＤＮＰＨ（これは、「遊離」ピルベー
トと反応する）と共にインキュベートする。ＤＮＰＨ誘導体化ピルベートである
、２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンは、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ８（５ｕｍ
（μｍ））カラムのようなＣ８カラムを使用して、ＲＰ−ＰＨＬＣで容易に分析
され得る。

【００４０】 誘導体化反応は化学量論的であるので、ピルベートの定量的測定もまた可能で
ある。酵素キット（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ）もまた、ピルベ
ートを測定するために使用され得る。この方法は、サンプルの限外濾過を必要と
しない。なぜなら、その穏和な条件は、インキュベーションの間にピルベート−
タンパク質付加アイソフォームからピルベートを切断しないからである。

【００４１】 遊離ピルベートおよびタンパク質に結合したピルベートを組み合わせた量を測
定するために、すべての結合ピルベートを、誘導体化の前に切断するべきである
。ＤＮＰＨ誘導体化方法は、強酸性ｐＨおよび比較的長いインキュベーション時
間を必要とするので、ピルベートは、このインキュベーションの間に切断され得
、引き続いてＤＮＰＨで誘導体化され得る。従って、サンプル中の遊離ピルベー
トおよび結合ピルベートを組み合わせた量を測定するために、このサンプルは、
ＤＮＰＨ誘導体化方法において限外濾過されることを伴わずに使用されるべきで
ある。

【００４２】 （２）アイソフォームアッセイ） ジスルフィド結合を有するタンパク質については、少なくとも３つのアイソフ
ォームが存在し、そしてジスルフィド結合を有さないタンパク質については、２
つのアイソフォームが存在する。概して、所望されるタンパク質およびその還元
型は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより容易に分離され得る。

【００４３】 ジスルフィド結合を有するタンパク質の場合、スクリーニングは、３つのアイ
ソフォーム（付加アイソフォーム、還元タンパク質、および所望されるタンパク
質）がＲＰ−ＨＰＬＣにおいて定量的に分析され得る場合に非常に効率的である
。ピルベートアッセイについて絶対的な必要性は存在せず、そして存在するので
あれば、どの工程が律速であるかを同定することは可能である。しかし、還元型
からピルベート−タンパク質付加アイソフォームを分離することは、通常、困難
である。この場合、ピルベートアッセイは、各変換工程を最適化するために不可
欠である。

【００４４】 （３）アイソフォーム組成の測定） 所望される形態がジスルフィド結合を有さない場合、アイソフォーム組成は、
困難を伴わずに決定され得る。なぜなら、ピルベート−タンパク質付加アイソフ
ォームは、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて所望の形態から容易に分離され得るからであ
る。

【００４５】 所望される形態がジスルフィド結合を有し、そしてタンパク質付加アイソフォ
ームがその還元型から分離可能でない場合、タンパク質に結合したピルベートを
測定して、アイソフォーム組成を決定するべきである。タンパク質に結合したピ
ルベートのモル濃度の量（これは、タンパク質付加アイソフォームの量である）
は、遊離ピルベートおよび遊離ピルベートの量を減じた結合ピルベートを組み合
わせた量である。これは、ＤＮＰＨ方法において、限外濾過ありまたはなしのサ
ンプルを使用して測定され得る。次いで、還元型の量は、ＲＰ−ＨＰＬＣによっ
て測定される、タンパク質付加アイソフォームおよび還元型を組み合わせた量と
、ピルベートアッセイによって決定される、タンパク質に結合したピルベートの
量との間の差異である。次いで、アイソフォーム組成が算出され得る。

【００４６】 （４）スクリーニングの最適条件） 所望される形態がジスルフィド結合を有するか否かに関わらず、所望される形
態への付加アイソフォームの変換の比速度を最大化するために、スクリーニング
基準は同一であるべきである。

【００４７】 （４．１）所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有さない場合） この場合、ピルベートとして所望されるタンパク質形態は、ピルベート−タン
パク質付加アイソフォームから切断される。ピルベート切断は、この場合、ピル
ベートアッセイによってモニターされる必要がない。なぜなら、所望される形態
への付加アイソフォームの変換に関与する、わずか１つの工程（加水分解）のみ
存在するからである。例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣにおける付加アイソフォームの消
失および所望される形態の形成の両方をモニターすることで十分である。所望さ
れるタンパク質への付加アイソフォームの変換を最大化するためのインキュベー
ション条件を見出すことが必要とされる。

【００４８】 第１の工程は、スクリーニングで使用されるタンパク質付加アイソフォーム濃
度の作業範囲に関して、反応動態を調査することである。動態が付加アイソフォ
ーム濃度に関して一次的である場合、サンプル濃度は動態に対する影響を有さず
、そして任意の濃度が、スクリーニングまたはパラメーター評価の間に使用され
得る。さもなくば、濃度は、スクリーニングの間、一定に維持されるべきである
。

【００４９】 加水分解工程に影響する多くのパラメーターが存在し得る。主要なものは、ｐ
Ｈ、温度、金属イオン（例えば、亜鉛、第二鉄、第一鉄、Ｃｕ、Ｍｇなど）、伝
導率、緩衝液、光、および攪拌である。所望される形態への付加アイソフォーム
の変換に対するインキュベーションパラメーターの効果を測定することによって
、各パラメーターは最適化され得る。例えば、ピルベート−タンパク質付加アイ
ソフォームを含む数アリコートのサンプルを、それらの個々に最良と推測される
値で他のすべてのパラメーターを用いて、十分な範囲の異なるｐＨにおいて、イ
ンキュベートする。各アリコートにおける変換反応を、特定のインキュベーショ
ン期間（例えば、一晩）の後に測定する。最高の変換が得られるｐＨを、最適ｐ
Ｈとして決定する。このような実験を繰り返して、それらの個々に最良と推測さ
れる値の代わりに使用される最適化されたパラメーターの最適値を用いて、他の
パラメーターを最適化する。これは、典型的な最適化技術である。

【００５０】 インキュベーションのｐＨは、加水分解速度に影響する。一般的に、ｐＨが低
いほど、より多く加水分解を引き起こす。より高い温度はまた、加水分解を増加
させる。しかし、強酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２）での加水分解は、付加アイソフ
ォームまたは所望されるタンパク質の不可逆的沈降が存在する場合、またはタン
パク質が不可逆的に変性される場合には、作用しないかもしれない。いくつかの
金属カチオンの存在は、加水分解を触媒し得る。金属カチオンがピルベート切断
を触媒するとしても、このような触媒は、非常に金属カチオン濃度依存性であり
得る。従って、金属カチオンをスクリーニングする場合には、非常に広範な金属
カチオン濃度を使用すべきである。

【００５１】 パラメーター間の相互作用もまた存在し得る。例えば、いくつかの金属イオン
が存在するか否かに依存して、このようなカチオンが変換に対する影響を有する
場合には、異なる最適ｐＨが存在することが可能であり得る。ピルベート付加ア
イソフォームの場合、Ｚｎカチオンの存在は、ピルベート切断について異なる最
適ｐＨを生じる（ｐＨ７．８〜８．６）。従って、それを真に最適化するために
は、最適化される新たなパラメーターだけでなく、他の重要なパラメーターをも
同時に変動させることが必要である。

【００５２】 （４．２）所望されるタンパク質がジスルフィド結合を有する場合） ２工程の変換プロセスにおいて、還元型が、加水分解を通して付加アイソフォ
ームから切断され、そしてこれは引き続いて、酸化を通して所望される形態へと
変換される。

【００５３】 理想的には、タンパク質付加アイソフォームおよび還元型が単離され、そして
ジスルフィド結合なしのタンパク質の場合に関して上記された手順が、各工程を
最適化するために、付加アイソフォームおよび還元型の各々に対して適用される
。主要な差異は、上記に列挙されたパラメーターに加えて、酸素転移およびいく
つかの酸化剤様の酸化型グルタチオン（ＧＳ−ＳＧ）が酸化工程のために最適化
され得ることである。ＧＳ−ＳＧが還元型のみを酸化する場合、これは、酸化ま
たはジスルフィド結合形成工程を非常に増強する。しかし、ＧＳ−ＳＧがまた、
付加アイソフォームを酸化し、そして酸化された付加アイソフォームが容易に加
水分解しない場合には、低い収量または変換となる可能性が高い。

【００５４】 各最適条件から、所望される形態への付加アイソフォームの変換に最適な条件
が推定され得る。それらが合理的に近接している場合、中間の条件が、最適条件
として設定される。理論的には、サンプル中の還元型に対するピルベート−タン
パク質付加アイソフォームの最初の割合に依存する異なる最適条件が存在し得る
。例えば、最適条件は、還元型が絶対多数である場合よりも、付加アイソフォー
ムが絶対多数である場合に異なる。従って、加水分解および酸化についての個々
の最適条件から最適条件を推定する場合には、サンプル組成を考慮するべきであ
ることを認識するべきである。

【００５５】 最後に、変換の最適条件は実験的に確認される。もしあるならば律速工程を同
定するために、変換の最適条件を微調整することが、しばしば有用である。イン
キュベーション時間に伴う還元型の安定な蓄積は、酸化工程が律速であることを
示す。蓄積が生じる場合、酸化に対してより有利な条件（例えば、より多い酸素
、より高いｐＨ、およびより高い温度）が、所望される形態の形成を最適化する
ために適用されるべきである。所望される形態の顕著な形成速度を通して常に還
元型タンパク質のレベルが低い場合には、切断工程が律速である。これが生じる
場合、それらが所望される形態の形成の最大化へと導く切断工程を改善し得るよ
うに、インキュベーション条件を変化し得る。

【００５６】 切断可能な基の化学的除去およびタンパク質の酸化についての最適条件が、非
常に遠く離れている場合、それらは段階的に適用され得る。例えば、加水分解工
程に最適な条件が最初に適用され、そして酸化工程に最適な条件は、この加水分
解がほぼ完了する時点で適用される。

【００５７】 各アイソフォームを単離することが可能でない場合、特に、２つのアイソフォ
ームがＲＰ−ＨＰＬＣにおいて分離され得ない場合、ピルベートアッセイは不可
欠となる。ピルベート放出をモニターすることにより、加水分解工程は、まず最
適化され得る。第２の工程は、この第１の工程がほぼ終了であるかまたは非常に
緩慢である場合に、最適化される。これらの最適条件から、全体的な変換の最適
条件が推定され、そして実験的に確認される。代替のアプローチは、加水分解工
程を最適化した後に、全体的な変換を最適化することである。このアプローチは
、特に、顕著でかつ持続した付加アイソフォームの加水分解によって引き起こさ
れる干渉に起因して、第２の工程を最適化することが困難である場合に、より実
用的であり得る。先に述べたように、ｐＨ、温度、酸素転移、金属カチオンおよ
び酸化剤は、最適化されるべき重要なパラメーターである。

【００５８】 パラメーター間の相互作用は、一工程変換プロセスについてのパラメーター間
の相互作用よりも、二工程変換プロセスについてより重要となる。

【００５９】 所望される形態に対してこのような最適条件パラメーターの影響が存在しない
ことを確証するために、所望される形態を精製するべきであり、そしてその特性
（生物学的な比活性および純度を含む）を、完全にチェックするべきである。

【００６０】 （実施例２：インターフェロンα２ｂへのピルベート付加アイソフォームの変
換） ピルベートの切断およびジスルフィド結合の形成を、上昇した温度（３０〜３
７℃）および反応ｐＨ（５．２〜５．６）で実施する。これらの反応条件は、両
方の反応が同じ反応条件下で連続的に生じるという点、および生物活性タンパク
質が回収されるという点で独特である。

【００６１】 タンパク質単離クロマトグラフィーから溶出するタンパク質ＵＶ吸収度のピー
クを含む画分を共にプールし、そして０．４５μＭ（μｍ）で濾過滅菌する。

【００６２】 １リットルのタンパク質プールあたり３グラムのメチオニンを、このタンパク
質プールに添加し、そして溶解するまで攪拌する。このプールのｐＨを、希水酸
化ナトリウムを用いて５．２〜５．６に調整する。塩化ナトリウム濃度は調整し
ない：これは、１５０〜２００ｍＭ ＮａＣｌの間である。

【００６３】 １０ｍＭアセテート（ｐＨ５．５）、２００ｍＭメチオニン、および２００ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含有するストック溶液を、最終濃度２０ｍＭメチオニンまで、こ
のタンパク質プールに添加する。

【００６４】 タンパク質プールを反応容器に移し、そして一定に攪拌しつつ温度を３７℃に
上昇させる。タンパク質プールを、３６〜３８℃にて２４〜３０時間インキュベ
ートする。

【００６５】 ２４〜３０時間の時点で、反応混合物をデプスフィルターを通して濾過し、次
いで０．４５ｕＭフィルターを通して濾過して、沈殿物を取り出す。次いで、こ
のプールを濃縮し、そして２〜１０℃で１０ｍＭアセテート（ｐＨ５．５）に対
してダイアフィルトレーションする。

【００６６】 （実施例３：亜鉛を使用した、インターフェロンα２ｂへのピルベート付加ア
イソフォームの変換） ピルベート付加アイソフォームを、亜鉛（１Ｍ）を用いて、３４Ｃ（℃）およ
びｐＨ８．２にてインターフェロンα２ｂに変換する。反応の間、反応溶液を攪
拌する。変換が約８０％になる時点で、反応溶液温度を４Ｃに低下させて反応を
停止し得る。

【００６７】 溶液調製：１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液：４Ｃで維持、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基＋ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、１ｍＭ Ｚｎ溶液：４Ｃで維持、１ｍＭ ＺｎＳＯ₄Ｈ₂Ｏ＋１
０ｍＭ 酢酸ナトリウム＋１７５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）。

【００６８】 タンパク質精製クロマトグラフィーから溶出するＵＶ吸収度のピークを含む画
分を共にプールし、そして０．２ｕＭで濾過滅菌する。約０．０８３（Ｖ／Ｖ）
の１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液を、攪拌されているタンパク質プール（代表的なタンパ
ク質プールのｐＨは、５．２〜５．５の範囲にある）に、約８．２のｐＨまで緩
徐に添加する。

【００６９】 １ｍＭのＺｎ溶液を、総ピルベート付加アイソフォームに対するＺｎカチオン
の０．６〜１．０モル比を達成するために、攪拌中の塩基性タンパク質プールに
緩徐に添加する（例えば、ピルベート付加アイソフォームの濃度が１．０ｍｇ／
ｍＬである場合、３０ｕＭ（μＭ）のＺｎまたは０．０３（Ｖ／Ｖ）の１ｍＭの
Ｚｎ溶液が必要とされる）。新鮮なＺｎカチオン溶液を使用する。

【００７０】 反応溶液を、攪拌しながら、リアクター内で３４Ｃに加熱する。反応温度を、
反応全体を通して３４Ｃに制御する。持続した攪拌もまた、反応溶液中の混合が
、気泡を生じるに十分に乱暴ではないが十分である程度に必要とされる。リアク
ターにおける幾分かの通気は、反応溶液内への酸素転移を可能にするべきである
。他方で、リアクターが反応溶液でほぼ半分を満たす（ｈａｌｆ−ｆｉｌｌ）場
合、このような通気は必要とされない。反応の間、反応サンプルは、ＲＰ−ＨＰ
ＬＣを使用して変換を追跡するために採取され得る。反応が終了する時点で、次
のクロマトグラフィー工程のために、温度は４Ｃに下げられ得る。

【００７１】 上記から、本発明が、所望されないタンパク質アイソフォームを同定する方法
、および所望のタンパク質にそれらを変換させる方法（これは、所望のタンパク
質の全体的収量および純度を増加させる）を提供することが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ (71)出願人 2000 Ｇａｌｌｏｐｉｎｇ Ｈｉｌｌ Ｒ ｏａｄ， Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ， Ｎｅ ｗ Ｊｅｒｓｅｙ 07033−0530， Ｕ． Ｓ．Ａ (72)発明者 フレイ， アンドレス アメリカ合衆国 ニュージャージー 07728， フリーホールド， ファイブ ポインツ ロード 75 (72)発明者 リー， セオジュ アメリカ合衆国 ニュージャージー 08817， エディソン， ハナ ロード 3506 (72)発明者 メンジセン， ローランド アメリカ合衆国 ニュージャージー 07728， フリーホールド， ランドルフ ロード 40 (72)発明者 ボロッチ， マルシオ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10024， ニュー ヨーク， コロンブス アベニ ュー 600， アパートメント ７アール (72)発明者 ウィリー， ディビット シー． アメリカ合衆国 ニュージャージー 07016， クランフォード， ヘザーミー ド プレイス ９ Ｆターム(参考） 4H045 AA20 BA50 CA40 DA16 EA29 FA65 GA23 GA40

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターフェロンα組成物の収量を増加するための方法であ
   って、付加アイソフォームをインターフェロンαに変換する工程を含む、方法。
2. 【請求項２】 前記付加アイソフォームが、ピルベート付加アイソフォーム
   である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記インターフェロンαがインターフェロンα２ｂである、
   請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記付加アイソフォームが酸性溶液に曝露される、請求項３
   に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記酸性溶液が約ｐＨ５．５である、請求項４に記載の方法
   。
6. 【請求項６】 前記酸性溶液が３４〜４０℃である、請求項５に記載の方法
   。
7. 【請求項７】 前記酸性溶液が抗酸化剤を含む、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記抗酸化剤がメチオニンを含む、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記メチオニンが５〜４０ｍＭの濃度である、請求項８に記
   載の方法。
10. 【請求項１０】 前記付加アイソフォームが亜鉛溶液に曝露される、請求項
    ３に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記亜鉛溶液がｐＨ７．８〜ｐＨ８．６である、請求項１
    ０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記亜鉛溶液が３０〜３８℃である、請求項１１に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 前記亜鉛溶液が抗酸化剤を含む、請求項１２に記載の方法
    。
14. 【請求項１４】 前記抗酸化剤がメチオニンを含む、請求項１３に記載の方
    法。
15. 【請求項１５】 前記メチオニンが５〜４０ｍＭの濃度である、請求項１４
    に記載の方法。
16. 【請求項１６】 クロマトグラフィーを用いる前記インターフェロンα２ｂ
    の精製をさらに含む、請求項９に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記クロマトグラフィーがアガロースに基づく色素親和性
    クロマトグラフィー、次いでアガロースに基づくアニオン交換クロマトグラフィ
    ー、次いで結晶化工程を含む、請求項１６に記載の方法。