PL200274B1 - Sposób zwiększania wydajności kompozycji interferonu alfa - Google Patents

Abstract

Przedstawiono sposób zwi ekszania wydajno sci kompozycji interferonu alfa obejmuj acy przekszta l- canie pirogronianowej izoformy towarzysz acej interferonu alfa w interferon alfa przez poddawanie pirogro- nianowej izoformy towarzysz acej interferonu alfa dzia laniu roztworu o pH w zakresie od 5,2 do 5,6. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy izolowania i oczyszczania białek, w szczególności zwiększania wydajności kompozycji interferonu alfa, izolowania białek, izolowania izoform białek i przekształcania izoform w żądane białka.

Tło wynalazku

Do celów badań naukowych i klinicznych szeroko stosuje się białka występujące w stanie naturalnym. Jakkolwiek takie białka można pozyskać z ich źródeł naturalnych, to techniki rekombinacji umożliwiają ich produkcję ze źródeł nienaturalnych. Przykładowo, drogą fermentacji z użyciem mikroorganizmów modyfikowanych z użyciem technologii rekombinacji, takich jak transformowane bakterie, wytwarza się ogromne ilości ludzkiego interferonu przy znacznie niższych kosztach od tych, jakie wiązałyby się z użyciem źródeł naturalnych. Techniki rekombinacji DNA stosuje się również do produkcji innych ważnych białek, takich jak insulina i aktywator tkankowego plazminogenu.

Bakterie zmienione technikami rekombinacji wytwarzają niestety również zanieczyszczenia i izoformy strukturalne tych białek, które powinny produkować. Do takich zanieczyszczeń i izoform należą białka oligomeryczne i izoformy białka zredukowanego (patrz: US-4765903 na rzecz D'Andrea i wsp.), komórkowe debris i wirusy (patrz: US-4732683 na rzecz Georgiadis i wsp.) oraz izoformy związane z pirogronianem (patrz Rose i wsp., J. Biol. Chem. 287:19101, 1992; Prome i wsp., J. Biol. Chem. 266: 13050, 1991; Stevens i wsp., J. Biol. Chem. 252: 2998, 1977) i Shapiro i wsp., J. Biol. Chem. 255: 3120, 1980). Pożądane jest usunięcie tych zanieczyszczeń podczas oczyszczania białka.

Jest oczywiste, że takie izoformy białek obniżają czystość żądanego białka a procesy stosowane do ich usuwania obniżają całkowitą wydajność. Jeśli jednak takie izoformy białka można byłoby przekształcać w białko żądane, wówczas ich usuwanie nie byłoby potrzebne i można byłoby znacznie zwiększyć całkowitą wydajność wytwarzanego białka. Potrzebny jest sposób identyfikowania niepożądanych izoform białek i przekształcania ich w białko żądane. Niniejszy wynalazek spełnia te potrzeby.

Krótki opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania wydajności kompozycji interferonu alfa obejmujący przekształcenie pirogronianowej izoformy towarzyszącej interferonu alfa w interferon alfa przez poddawanie pirogronianowej izoformy towarzyszącej interferonu alfa działaniu roztworu o pH w zakresie od 5,2 do 5,6.

Korzystnie interferonem alfa jest interferon alfa 2b.

Także korzystnie kwaśny roztwór ma temperaturę 34-40°C, a w tym przypadku korzystnie kwaśny roztwór zawiera antyutleniacz, a zwłaszcza jako antyutleniacz zawiera metioninę, korzystnie w stężeniu 5-40 mM.

Opisano sposoby wytwarzania wysoce oczyszczonych białek z dużą wydajnością przez wyizolowanie towarzyszących izoform i przekształcenie ich w żądane białka funkcyjne. Chociaż wynalazek nie ogranicza się do konkretnego interferonu alfa, takim interferonem w korzystnym rozwiązaniu jest interferon alfa 2b.

Opisano konwersji, powstającej w procesie rekombinacyjnym izoformy towarzyszącej w żądane białko. Sposoby te polegają na usunięciu z tej towarzyszącej izoformy grupy odszczepialnej na drodze chemicznej.

Zastrzegany sposób polega na poddaniu towarzyszącej izoformy działaniu roztworu kwasu. Dla pirogronianowej izoformy towarzyszącej interferonu alfa, korzystne jest, aby wartość pH kwaśnego roztworu wynosiła około 5,5. Korzystne jest również, jeśli temperatura roztworu kwasu wynosi 34-40°C. W innym rozwiązaniu natomiast, towarzyszącą izoformę poddaje się działaniu roztworu cynku. W takim korzystnym rozwiązaniu roztwór cynku ma pH 7,8 do 8,6, a także korzystnie temperatura roztworu cynku wynosi 30-38 C.

Wynalazek nie jest ograniczony pod względem użytego rodzaju kwasu. W rozwiązaniach korzystnych, roztwór kwasu zawiera antyutleniacz. W szczególnie korzystnych rozwiązaniach antyutleniacz zawiera metioninę. W takim rozwiązaniu metionina występuje w stężeniu od 5 do 40 mM.

Definicje

Stosowany w opisie termin „żądane białko” oznacza białko będące przedmiotem zainteresowania, przeznaczone do oczyszczania. Identyfikacja żądanego białka jest oczywiście przedmiotem ostatecznego celu procesu oczyszczania. Przykładowo, podczas procedury oczyszczania może okazać się celowe uzyskanie grupy lub grup białka, w tym zanieczyszczeń, w pośrednim etapie tej procedury

PL 200 274 B1 oczyszczania. Niezależnie od zainteresowania w uzyskaniu grupy białka pośredniego, grupę białka będącą ostatecznym celem procedury oczyszczania uważa się za białko żądane.

Termin „izoforma towarzysząca” oznacza izoformę białka posiadającą cechy strukturalne i/lub funkcyjne podobne do żądanego białka, z której to izoformy można usunąć grupę odszczepialną, wytwarzając białko żądane. Termin „grupa odszczepialna” oznacza grupę chemiczną przyłączoną do żądanego białka, dającą się usunąć metodą chemiczną. Stosowane w opisie terminy „usuwanie drogą chemiczną lub „usunięty drogą chemiczną oznaczają, że grupa chemiczna daje się usunąć z białka środkami chemicznymi obejmującymi, ale nie ograniczająco, roztwór kwaśny, roztwory zasadowe, katalizę z użyciem jonów metali i podobne środki.

Jakkolwiek, nie jest to niezbędne w praktycznym wykonaniu wynalazku, jednak jeśli grupę odszczepialną można zidentyfikować pod względem chemicznym, to towarzyszącą izoformę można nazwać specyficznym typem towarzyszącej izoformy. Przykładowo, „pirogronianową izoformą towarzyszącą” jest żądane białko, posiadające przyłączoną grupę odszczepialną, identyfikowaną jako pirogronian.

Termin „reakcja utleniania” oznacza reakcję, w której grupy sulfhydrylowe w dwóch aminokwasowych resztach cysteiny tworzą wiązania dwusiarczkowe.

Stosowany w opisie termin „interferon alfa” odnosi się do rodziny indukowalnych białek sekrecyjnych, nadających odporność na wirusy na komórkach docelowych, hamujących proliferację komórek i regulujących ekspresję antygenów głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I. Rodzina ta obejmuje bez ograniczeń interferon alfa-2a (Roferon, Hoffman La-Roche, Nutley, NJ), interferon alfa 2b (Intron, Schering-Plough, Madison, NJ), interferon alfa-2c (Berofor Alpha, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Niemcy) lub interferon consensus, definiowany oznaczeniem sekwencji consensus w naturalnych interferonach alfa (Infergen, Amgen, Thousand Oaks, CA).

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dotyczy izolowania i oczyszczania białek. Jednym z rozwiązań jest identyfikacja i oczyszczanie towarzyszą cych izoform. W innym rozwią zaniu opisano metodę wytwarzania żądanego białka z towarzyszących izoform. W jeszcze innym rozwiązaniu dostarcza się wysoce oczyszczonego żądanego białka na drodze wspólnego oczyszczania tego żądanego białka, łącznie z towarzyszącymi izoformami i następnej konwersji tych towarzyszących izoform w żądane białko. W ten sposób, zmniejsza się ilość towarzyszącej izoformy i zwiększa się całkowita wydajność żądanego białka i/lub białko to ma znacznie wyższą czystość, od tej jaka była poprzednio do osiągnięcia. Wydajność żądanego białka można zwiększyć aż dziesięciokrotnie w stosunku do wydajności osiąganej bez przekształcania towarzyszących izoform.

Chociaż wynalazek nie jest ograniczony co do źródła żądanego białka bądź towarzyszących izoform, to w jednym rozwiązaniu jego źródłem są mikroorganizmy konstruowane przy użyciu technik rekombinacji. W stanie techniki znanych jest wiele takich technik. Jako transformowane mikroorganizmy można użyć komórki organizmów eukariotycznych lub prokariotycznych, bakterie, komórki ssaków i podobne. Interferon alfa może być np. wytwarzany w bakteriach, w sposób podany w opisie US-4530901 na rzecz Weissman'a, albo w sposób opisany w EP-032134.

Podobnie, wynalazek nie ogranicza się do jakiejkolwiek konkretnej metody ekstrahowania towarzyszącej izoformy z wytwarzającej ją komórki. W przypadkach, gdy żądanym białkiem jest interferon alfa, odpowiednie będą np. metody podane przez Leibowitz'a i wsp. W publikacjach US-4315852 i US-4364863.

Analogicznie, wynalazek nie jest ograniczony pod względem jakichkolwiek konkretnych technik oczyszczania użytych do izolowania towarzyszącej izoformy albo żądanego białka. Specjalistom znanych jest wiele chromatograficznych i innych technik rozdziału, które mają zastosowanie w wynalazku.

Chociaż wynalazek nie jest ograniczony pod względem sposobu identyfikowania towarzyszących izoform, identyfikację takich towarzyszących izoform można przeprowadzić przez badanie mas cząsteczkowych żądanego białka i zanieczyszczeń o masie cząsteczkowej większej od masy żądanego białka. Jedna z takich metod jest opisana przez Rose i wsp. w J. Biol. Chem. 267:19101(1992). Zanieczyszczenia posiadające masę cząsteczkową większą od masy cząsteczkowej żądanego białka można wystawić na warunki, w których zachodzi degradacja (np. środowisko o pH wybitnie kwaśnym lub wybitnie zasadowym) i analizować na obecność produktów degradacji. Jeśli jeden z tych produktów degradacji ma taką samą masę i/lub cechy strukturalne żądanego białka, to wówczas można uznać, że zanieczyszczenie jest towarzyszącą izoformą posiadającą grupę odszczepialną.

PL 200 274 B1

Jakkolwiek wynalazek nie jest ograniczony co do konkretnego sposobu przekształcania towarzyszących izoform w żądane białko, to jednak w jednym rozwiązaniu, metodą skriningu można oznaczyć właściwe warunki konwersji. Przykładowo, w jednym procesie etapowo doprowadza się wartość pH roztworu reakcyjnego do punktu, w którym następuje usunięcie grupy odszczepialnej z towarzyszącej izoformy i powstaje funkcyjne albo nie-nieodwracalnie zdenaturowane żądane białko.

W jednym z rozwiązań, grupę tę usuwa się bądź odszczepia przez poddanie tej towarzyszącej izoformy działaniu warunków kwasowych (np. z użyciem kwasu octowego). W rozwiązaniu alternatywnym tę towarzyszącą izoformę poddaje się działaniu cynku.

Wynalazek nie jest ponadto ograniczony pod względem temperatury, w której przebiega reakcja odszczepiania. W zasadzie jednak, im wyższa temperatura tym szybciej będzie przebiegać konwersja izoformy towarzyszącej do żądanego białka.

Chociaż usunięcie grupy odszczepialnej na drodze chemicznej może dawać białko o tych samych cechach strukturalnych co białko żądane, to niekiedy zachodzi potrzeba utlenienia powstałych przez redukcję grup sulfhydrylowych do wiązań dwusiarczkowych. Umożliwia to uzyskanie właściwego sfałdowania białka i przejścia w białko funkcyjne. Sposoby utleniania grup sulfhydrylowych są znane i niniejszy wynalazek nie jest ograniczony ż adnym konkretnym sposobem utleniania.

W jednym rozwią zaniu zakł ada się zabezpieczenie grup metioniny podczas utleniania w celu zapobieżenia powstawaniu sulfotlenku metioniny. Sposoby zabezpieczania grup metioninowych są znane i wynalazek nie jest ograniczony szczególnymi sposobami ochrony grup metioninowych. Jednak zaznacza się, że do tych sposobów należy użycie antyutleniaczy, co zostało opisane przez Lam'a i wsp. w J. Pharm. Sci. 86:1250(1997) i przez Takruri w US-5272135.

Wynalazek nie jest poza tym ograniczony pod względem metody użycia reakcji utleniania. Przykładowo, w jednym rozwiązaniu według wynalazku zakłada się usunięcie grupy odszczepialnej i następnie przeprowadzenie utlenienia grup sulfhydrylowych. W innym rozwiązaniu zakłada się usunięcie grup odszczepialnych i utlenienie grup sulfhydrylowych w tych samych warunkach reakcji.

Podobnie, jeśli chemiczne usunięcie grupy odszczepialnej i utlenianie białka prowadzi się w tej samej reakcji, to wynalazek nie ogranicza się do jakiejkolwiek konkretnej metody usuwania grup odszczepialnych z towarzyszącej izoformy i utleniania. Jednakże w jednym rozwiązaniu prowadzi się proces skriningu w celu określenia najlepszych warunków usuwania grupy odszczepialnej na drodze chemicznej. Dla przykładu, można przeprowadzić doświadczenia stosując pewien zakres warunków pH i oznaczać ilość powstałego żądanego białka o odpowiedniej integralności struktury (to znaczy, zdenaturowanego nie-nieodwracalnie) i/lub ilość grupy odszczepialnej. Wykres zależności ilości żądanego białka posiadającego odpowiednią integralność struktury od wartości pH reakcji na ogół będzie dawał krzywą w kształcie dzwonu a najwyższy punkt tej krzywej będzie oznaczał idealne pH dla chemicznego usunięcia grupy odszczepialnej. W tym rozwiązaniu można przeprowadzić podobny skrining dla reakcji utleniania. Jeśli krzywe dzwonowe dla reakcji chemicznego usunięcia grupy odszczepialnej i dla reakcji utleniania przecinają się, to punkt przecięcia wyznacza najlepsze warunki pH dla usuwania grupy odszczepialnej i utleniania grup sulfhydrylowych w tej samej reakcji. Dla chemicznego usunięcia i utleniania towarzyszącej izoformy pirogronianowej interferonu alfa te dwie krzywe przecinają się przy pH około 5, co oznacza najlepszą wartość pH, przy której należy prowadzić tę kombinowaną reakcję. Do innych warunków reakcji, które można oceniać, należą bez ograniczeń stężenie soli, temperatura i podobne.

Po przeprowadzeniu konwersji towarzyszących izoform do żądanego białka może okazać się potrzebne dalsze zastosowanie etapów chromatografii w celu oczyszczenia żądanego białka z zanieczyszczeń.

Po odpowiednim oczyszczeniu żądanego białka, o ile to wskazane, można je przygotować w postaci odpowiedniej do stosowania leczniczego. Dla przykładu, jeśli tym żądanym białkiem jest interferon alfa, można go przygotować w postaci preparatów opisanych przez Kwan'a w US-4847079 i US-4496537, oraz przez Yuen'a i wsp. w US-5766582. Inne obojętne nośniki dopuszczalne farmaceutycznie mogą być alternatywnie albo stałe albo ciekłe. Do stałych postaci preparatów należą proszki, tabletki, granulaty dyspergowalne, kapsułki, saszetki i czopki. Proszki i tabletki mogą zawierać od około 5 do około 95% żądanego białka. Odpowiednie stałe nośniki są znane. Należą do nich przykładowo węglan magnezu, stearynian magnezu, talk, cukier lub laktoza. Tabletki, proszki, saszetki i kapsułki mogą być używane jako stałe formy dawkowania, odpowiednie do stosowania doustnego.

W celu wytworzenia czopków, na początku stapia się wosk o niskiej temperaturze topnienia, taki jak mieszanina glicerydów kwasów tłuszczowych (np. masło kakaowe) i następnie przez mieszanie

PL 200 274 B1 dysperguje się w nim na jednorodną masę składnik aktywny. Tę stopioną homogenną mieszaninę wylewa się do form o odpowiedniej wielkości i schładza do zestalenia.

Do ciekłych postaci preparatów należą roztwory, zawiesiny i emulsje. Przykładami takich postaci są roztwory wodne i roztwory oparte na wodnych roztworach glikolu propylenowego do iniekcji pozajelitowych, albo preparaty z dodatkiem środków słodzących i zmętniających do doustnych roztworów, zawiesin i emulsji. Do ciekłych postaci preparatów należą również roztwory do stosowania donosowego.

Preparaty aerozolowe odpowiednie do inhalacji mogą obejmować roztwory i ciała stałe w postaci proszku. Mogą one występować w połączeniu z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie, takim jakim jest obojętny, sprężony gaz.

Związki według wynalazku mogą być również dostarczane przezskórnie. Kompozycje przezskórne mogą mieć postać kremów, płynów, aerozoli i/lub emulsji i mogą być zawarte w plastrze transdermalnym typu matrycowego albo typu zbiornikowego, co jest dobrze znane w stanie techniki dla preparatów przeznaczonych do tego celu.

Ilość związku aktywnego w jednostce dawkowania preparatu można dobrać w zakresie od około 0,01 mg do około 1000 mg, a korzystnie od około 0,01 mg do około 750 mg. Alternatywnie, można sporządzić preparaty, w których ilość związku aktywnego jest wyrażana w jednostkach międzynarodowych. Korzystne dawki będą się zawierać w zakresie od 3 milionów do 50 milionów jednostek międzynarodowych. W takim rozwiązaniu przyjmuje się jednostkowe formy dawkowania zawierające 3 miliony, 5 milionów, 18 milionów, 25 milionów i 50 milionów jednostek.

Wynalazkiem objęte są również postacie stałe przeznaczone do przekształcenia, na krótko przed użyciem, w postacie ciekłe przeznaczone do stosowania doustnego, miejscowego albo pozajelitowego.

Następujące przykłady służą do zilustrowania niektórych korzystnych rozwiązań i aspektów niniejszego wynalazku i nie mają na celu ograniczania jego zakresu.

P r z y k ł a d 1. Sposób skriningu konwersji pirogronianowych izoform towarzyszących.

Pirogronianowe izoformy towarzyszące mogą tworzyć wewnętrzne pierścienie, w których grupa alfa-aminokwasowa N-terminalnej reszty aminokwasowej białka jest skondensowana z grupą karbonylową pirogronianu. Jeśli pirogronian zaburza naturalną konformację białka, wówczas tylko zhydrolizowanie takiej towarzyszącej izoformy: pirogronian-białko (pirogronian ulega odszczepieniu z białka) umożliwia swobodne powtórne sfałdowanie do żądanej formy w wyniku uprzywilejowanej termodynamicznie zmiany konformacji. Jeśli żądane białko zawiera wiązanie (wiązania) dwusiarczkowe, to powstałą po odszczepieniu pirogronianu izoformę zredukowaną należy utlenić, w ramach procesu refałdowania do formy żądanej.

Opisany poniżej proces obrazuje, jak ustalać optymalne warunki konwersji towarzyszącej izoformy: pirogronian-białko do formy żądanej. Jak podano powyżej, jeśli żądane białko nie posiada wiązania dwusiarczkowego (wiązań dwusiarczkowych), skrining jest potrzebny tylko w celu maksymalizacji procesu odszczepienia (hydrolizy) pirogronianu. Jeśli w żądanym białku występują wiązania dwusiarczkowe, wówczas należy przeprowadzić skrining nie tylko w celu maksymalizacji reakcji odszczepienia (hydrolizy) pirogronianu lecz również dla reakcji tworzenia wiązań dwusiarczkowych (utleniania).

1) Próba pirogronianowa

Próba pirogronianowa jest potrzebna do monitorowania przebiegu hydrolizy, w celu zrozumienia kinetyki reakcji odszczepienia pirogronianu. Dla przykładu, „wolny” pirogronian można oznaczyć ilościowo metodą modyfikacji chemicznej albo metodą enzymatyczną. Do derywatyzacji pirogronianu można użyć 2,4-dinitrofenylohydrazynę (DNPH). Badaną próbkę należy poddać ultrafiltracji w celu usunięcia towarzyszącej izoformy: pirogronian-białko, stosując odpowiednią membranę MWCO, np. membranę 10K. Filtrat inkubuje się w środowisku o pH kwaśnym razem z DNPH, która reaguje z „wolnym” pirogronianem. Pirogroniań zderywatyzowany DNPH, 2,4-dinitrofenylohydrazon, moż na łatwo analizować metodą HPLC z odwróconymi fazami (RP-HPLC), na kolumnie C8, takiej jak Nucleosil C8 (5 μm).

Reakcja derywatyzacji jest reakcją stechiometryczną, a więc, możliwe jest oznaczenie ilościowe pirogronianu. Do oznaczenia pirogronianu można również użyć zestawu enzymatycznego (np. dehydrogenaza mleczanowa/NADH). Ta metoda nie wymaga ultrafiltracji próbki, gdyż prowadzi się ją w warunkach na tyle łagodnych, że podczas inkubacji nie zachodzi odszczepienie pirogronianu z towarzyszącej izoformy: pirogronian-białko.

PL 200 274 B1

Dla oznaczenia całkowitej ilości wolnego pirogronianu i pirogronianu związanego z białkiem, należy przed derywatyzacją odszczepić cały związany pirogronian. Ponieważ metoda derywatyzacji za pomocą DNPH wymaga bardzo kwaśnego pH i stosunkowo długiego czasu inkubacji, pirogronian można odszczepić i następnie zderywatyzować podczas inkubacji. W metodzie derywatyzacji z użyciem DNPH można zatem stosować próbkę nie poddaną ultrafiltracji w celu oznaczenia całkowitej ilości wolnego i związanego pirogronianu w tej próbce.

2) Próba na izoformy

Istnieją co najmniej trzy izoformy dla białek z wiązaniami dwusiarczkowymi i dwie izoformy dla białek nie zawierających wiązań dwusiarczkowych. W zasadzie, żądane białko i jego formę zredukowaną można łatwo rozdzielić metodą RP-HPLC.

W przypadku białka posiadającego wiązanie (wiązania) dwusiarczkowe, skrining będzie bardzo wydajny jeśli trzy izoformy (izoforma towarzysząca, białko zredukowane i białko żądane) będzie można ilościowo analizować metodą RP-HPLC. Wówczas nie będzie absolutnej potrzeby wykonania próby na pirogronian i możliwe jest ustalenie, czy istnieje etap limitujący szybkość i który etap jest etapem limitującym. Jednakże na ogół, trudno jest oddzielić towarzyszącą izoformę: pirogronian-białko od formy zredukowanej. W tym przypadku próba na pirogronian jest niezbędna dla optymalizacji każdego etapu konwersji.

3) Oznaczenie składu izoform

Jeśli żądana forma nie zawiera wiązania dwusiarczkowego (wiązań dwusiarczkowych) to skład kompozycji izoform można określić bez trudności, gdyż towarzyszącą izoformę: pirogronian-białko można łatwo oddzielić od formy żądanej metodą RP-HPLC.

Jeśli żądana forma posiada wiązanie (wiązania) dwusiarczkowe i białkowa izoforma towarzysząca nie daje się oddzielić od jej formy zredukowanej, wówczas dla określenia składu izoform należy wykonać oznaczanie pirogronianu związanego z białkiem. Zawartość molowa pirogronianu związanego z białkiem, będąca zawartością towarzyszącej izoformy białka, jest to całkowita zawartość wolnego i związanego pirogronianu minus zawartość wolnego pirogronianu. Można ją oznaczyć stosują c próbkę po ultrafiltracji i bez ultrafiltracji w metodzie z użyciem DNPH. Tak więc, zawartość formy zredukowanej stanowi różnicę pomiędzy całkowitą zawartością towarzyszącej izoformy białka i formy zredukowanej, oznaczonych metodą RP-HPLC i zawartością pirogronianu związanego z białkiem oznaczoną w próbie pirogronianowej. Na tej podstawie można wyliczyć skład izoform.

4) Skrining na warunki optymalne

W celu maksymalizacji specyficznej szybkości konwersji izoformy towarzyszącej w formę żądaną, kryteria skriningu powinny być takie same, niezależnie od tego, czy żądana forma zawiera wiązanie (wiązania) dwusiarczkowe czy ich nie zawiera.

4.1) Jeśli żądane białko nie zawiera wiązania dwusiarczkowego:

W tym przypadku prowadzi się odszczepienie żądanych form biał ka jako pirogronianu z towarzyszącej izoformy: pirogronian-białko. W tym przypadku nie ma potrzeby monitorowania odszczepienia pirogronianu w próbie pirogronianowej gdyż w tym przypadku w procesie konwersji izoformy towarzyszącej w formę żądaną występuje tylko jeden etap, hydroliza. Wystarczające jest np. monitorowanie jednoczesnego zanikania izoformy towarzyszącej i powstawania żądanej formy metodą RP-HPLC. Należy jednak określić warunki inkubacji w celu maksymalizacji konwersji izoformy towarzyszącej w żądane biał ko.

Pierwszym etapem jest poznanie kinetyki reakcji w odniesieniu do roboczego zakresu stężenia towarzyszącej izoformy białka, jakie ma być stosowane podczas skriningu. Jeśli jest to kinetyka pierwszego rzędu w odniesieniu do stężenia towarzyszącej izoformy to stężenie próbki nie ma wpływu na kinetykę i podczas skriningu lub oceny parametrów reakcji można stosować dowolne stężenie. W przeciwnym razie podczas skriningu należy utrzymywać stałe stężenie.

Może być wiele parametrów, które wpływają na etap hydrolizy. Głównymi z nich mogą być: pH, temperatura, jony metali (takich jak cynku, żelaza trójwartościowego i dwuwartościowego, Cu, Mg i podobnych), przewodnictwo, bufory, światło i mieszanie. Przez oznaczenie wpływu parametru inkubacji na konwersję izoformy towarzyszącej w formę żądaną można optymalizować każdy parametr. Przykładowo, kilka odważek próbki zawierającej towarzyszącą izoformę: pirogronian-białko inkubuje się w wystarczającym zakresie różnych pH z jednoczesnym utrzymaniem wszystkich innych parametrów w ich wartościach najlepiej założonych. Po pewnym czasie inkubacji (np. przez dobę) wykonuje się oznaczenie konwersji w każdej odważce próbki. Wartość pH, przy której uzyskano najwyższą konwersję przyjmuje się jako pH optymalne. To doświadczenie powtarza się dla optymalizacji innych

PL 200 274 B1 parametrów, stosując zoptymalizowane wartości zbadanych parametrów zamiast wcześniejszych wartości założonych jako najlepsze. Jest to typowa technika optymalizacji.

Wartość pH inkubacji wpływa na szybkość hydrolizy. Na ogół, niższe pH zwiększa wydajność hydrolizy. Wyższa temperatura również zwiększa hydrolizę. Jednakże, hydroliza przy bardzo kwaśnym pH, takim jak pH 2, może nie zachodzić jeśli następuje nieodwracalna precypitacja towarzyszącej izoformy albo żądanego białka albo, jeśli białko ulega nieodwracalnej denaturacji. Obecność kationów niektórych metali może katalizować hydrolizę. Chociaż kation metalu katalizuje odszczepienie pirogronianu, kataliza ta może być w znacznym stopniu zależna od stężenia kationu metalu. Podczas skriningu na wpływ kationu metalu należy zatem stosować bardzo szeroki zakres stężenia tego kationu.

Mogą również występować interakcje pomiędzy parametrami. Dla przykładu, jest możliwe, że istnieją różne optymalne wartości pH, zależnie od tego, czy jest obecny jon danego metalu czy jon ten nie występuje jeśli taki kation ma wpływ na konwersję. W przypadku pirogronianowej izoformy towarzyszącej, obecność kationu cynku zmienia optymalne pH dla odszczepienia pirogronianu (pH 7,8-8,6). Istnieje zatem potrzeba jednoczesnej zmiany nie tylko nowego parametru, który jest optymalizowany ale również innych ważnych parametrów, tak, aby optymalizacja była prawdziwa.

4.2) Jeśli żądane białko zawiera wiązanie (wiązania) dwu-siarczkowe:

W dwuetapowym procesie konwersji odszczepia się formę zredukowaną z izoformy towarzyszącej na drodze hydrolizy i następnie przekształca się tę formę w formę żądaną drogą utleniania.

W idealnym rozwią zaniu, izoluje się towarzysząc ą izoformę biał ka i formę zredukowaną i osobno dla towarzyszą cej izoformy i dla formy zredukowanej stosuje się procedurę opisaną powyż ej dla przypadku białka bez wiązania dwusiarczkowego (wiązań dwusiarczkowych) w celu optymalizacji każdego etapu. Główną różnicę stanowi fakt, że dla etapu utleniania, poza parametrami wymienionymi powyżej, można optymalizować przeniesienie tlenu i czynniki utleniające, takie jak utleniony glutation (GS-SG). O ile GS-SG będzie utleniał tylko formę zredukowaną, będzie on znacząco wzmagał etap utleniania lub tworzenia wiązań dwusiarczkowych. Jeśli jednak GS-SG będzie również utleniał izoformę towarzyszącą, wówczas wydajność będzie prawdopodobnie niska a utleniona izoforma towarzysząca nie będzie łatwo ulegać hydrolizie.

Na podstawie każdego optymalnego parametru można oszacować optymalne warunki konwersji towarzyszącej izoformy w formę żądaną. Jeśli są one w miarę rozsądku bliskie, jako warunki optymalne uznaje się warunki pośrednie. Z teoretycznego punktu widzenia, mogą istnieć różne warunki optymalne, zależnie od początkowej proporcji towarzyszącej izoformy: pirogronian-białko do formy zredukowanej w próbce. Dla przykładu, optymalne warunki powinny się różnić dla przypadku, gdy w absolutnej większoś ci wystę puje izoforma towarzysz ą ca i dla przypadku, gdy w absolutnej większości występuje forma zredukowana. Tak więc, należy wiedzieć, że skład próbki powinien być brany pod uwagę przy ocenie optymalnych warunków na podstawie indywidualnych warunków optymalnych dla hydrolizy i dla utleniania.

Ostatecznie potwierdza się optymalne warunki konwersji. Często, przy wyznaczaniu precyzyjne dostrojonych optymalnych warunków konwersji, o ile takie istnieją, użyteczne jest oznaczenie etapu limitującego szybkość. Stałe nagromadzanie się formy zredukowanej wraz z czasem inkubacji świadczy o tym, że etapem limitującym szybkość jest utlenianie. Jeśli pojawia się nagromadzanie, to dla zmaksymalizowania powstawania formy żądanej powinno się stworzyć warunki bardziej korzystne dla utleniania, takie jak więcej tlenu, wyższe pH i wyższa temperatura. Jeśli poziom zredukowanego białka jest zawsze niski pomimo znaczącej szybkości tworzenia się formy żądanej to etap odszczepiania jest etapem limitującym szybkość. Jeśli to występuje, wówczas można zmienić warunki inkubacji, gdyż może to usprawnić etap odszczepienia, co doprowadzi do maksymalizacji tworzenia się formy żądanej.

Jeśli optymalne warunki dla usuwania grupy odszczepialnej drogą chemiczną i dla utleniania białka są od siebie bardzo odległe, wtedy konwersję należy prowadzić etapami. Dla przykładu, na początku ustawia się optymalne warunki dla etapu hydrolizy a optymalne warunki dla etapu utleniania stosuje się wtedy, gdy hydroliza jest prawie zakończona.

Jeśli wyizolowanie każdej izoformy jest niewykonalne, wówczas próba pirogronianowa staje się niezbędna, zwłaszcza jeśli tych dwu izoform nie daje się rozdzielić metodą RP-HPLC. Na początku można optymalizować etap hydrolizy przez monitorowanie uwalniania pirogronianu. Drugi etap optymalizuje się wtedy, gdy pierwszy etap jest prawie zakończony albo przebiega bardzo wolno. Na podstawie tych optymalnych warunków ocenia się i potwierdza doświadczalnie optymalne warunki konwersji całkowitej. W podejściu alternatywnym optymalizuje się całkowitą konwersję po optymalizacji etapu hydrolizy. To podejście powinno być bardziej praktyczne, zwłaszcza wtedy, gdy trudno jest zopty8

PL 200 274 B1 malizować drugi etap z powodu zakłócenia spowodowanego znaczącą i ciągłą hydrolizą izoformy towarzyszącej. Jak wspomniano powyżej, ważnymi parametrami, które należy optymalizować są: pH, temperatura, przeniesienie tlenu, kationy metali i utleniacze.

Interakcje pomiędzy parametrami stają się poważniejsze dla dwuetapowego procesu konwersji niż dla procesu jednoetapowego.

W celu przekonania się o braku wpływu takich optymalnych parametrów na żądaną formę, ta żądana forma powinna być oczyszczona i powinny być w pełni oznaczone jej właściwości, łącznie ze swoistą aktywnością biologiczną i czystością.

P r z y k ł a d 2: Konwersja towarzyszącej izoformy pirogronianowej w interferon alfa 2b (według wynalazku).

Odszczepienie pirogronianu i tworzenie wiązań dwusiarczkowych prowadzi się w temperaturze podwyższonej (30-37°C), w środowisku reakcji o pH 5,2-5,6. Te warunki reakcji są unikalne pod tym względem, że obydwie reakcje przebiegają kolejno w tych samych warunkach i że odzyskuje się białko aktywne biologicznie.

Frakcje wykazujące pik białka według pomiarów absorbancji w UV w eluacie z chromatograficznego izolowania białka zbiera się razem (puluje) i filtruje przez filtr 0,45 μm w celu sterylizacji.

Ilość 3g metioniny na litr połączonych frakcji białka dodaje się do połączonych frakcji białka i miesza do rozpuszczenia. Wartość pH połączonych frakcji ustawia się na 5,2-5,6 rozcieńczonym roztworem wodorotlenku sodu. Nie ustawia się stężenia chlorku sodu. Wynosi ono od 150 do 200 mM NaCl.

Do puli białka dodaje się roztwór podstawowy o składzie:

mM octanu (pH 5,5), 200 mM metioniny i 200 mM NaCl, w ilości potrzebnej do uzyskania końcowego stężenia metioniny 20 mM.

Połączone frakcje (pulę) białka przenosi się do naczynia reakcyjnego i podwyższa się temperaturę do 37°C przy stałym mieszaniu. Następnie, tę pulę białka inkubuje się w temperaturze 36-38°C w czasie 24-30 godzin.

Po 24-30 godzinach mieszaninę reakcyjną filtruje się przez głęboki filtr i następnie przez filtr 0,45 μm w celu usunięcia substancji wytrąconych. Tę pulę zatęża się i poddaje diafiltracji wobec 10 mM octanu, przy pH 5,5, w temperaturze 2-10°C.

P r z y k ł a d 3: Konwersja towarzyszącej izoformy pirogronianowej do interferonu alfa 2b z użyciem cynku.

Pirogronianową izoformę towarzyszącą przekształca się w interferon alfa 2b w temperaturze 34°C, przy pH 8,2, wobec cynku (1M). Podczas reakcji roztwór reakcyjny miesza się. Po osiągnięciu 80% konwersji obniża się temperaturę roztworu reakcyjnego do 4°C dla zatrzymania reakcji.

Przygotowanie roztworu: bufor 1M Tris: utrzymuje się w temperaturze 4°C 1M zasadę Tris + HCl przy pH 8,3; 1 mM roztwór cynku: utrzymuje się w temperaturze 4°C 1 mM ZnSO₄ · H₂O + 10 mM octan sodu + 175 mM NaCl przy pH 5,5.

Frakcje wykazujące pik absorbancji w UV, eluujące w procesie chromatograficznego oczyszczania białka, zbiera się razem i filtruje przez filtr 0,2 μm w celu sterylizacji. Do puli białka (wartość pH typowej puli białka zawiera się w zakresie od 5,2 do 5,5) dodaje się powoli, podczas mieszania, około 0,083 części objętościowych (0,083 V/V) 1M buforu Tris do pH około 8,2.

Do zasadowej puli białka dodaje się powoli, podczas mieszania 1 mM roztwór Zn do osiągnięcia stosunku molowego kationu cynku do całkowitej ilości pirogronianowej izoformy towarzyszącej równego 0,6 do 1,0, to znaczy, jeśli stężenie pirogronianowej izoformy towarzyszącej wynosi 1,0 mg/ml to trzeba dodać 30 μM Zn albo 0,03 (V/V) 1 mM roztworu Zn. Stosuje się świeżo sporządzony roztwór kationu cynkowego.

Roztwór reakcyjny ogrzewa się w reaktorze do temperatury 34°C, stosując mieszanie. Podczas reakcji utrzymuje się kontrolowaną temperaturę 34°C. Wymaga się również ciągłego mieszania o takim nasileniu, aby mieszanie roztworu reakcyjnego było wystarczające ale nie na tyle gwałtowne, aby wydzielały się pęcherzyki. Powinna być zapewniona pewna wentylacja reaktora w celu wprowadzenia tlenu do roztworu reakcyjnego. Z drugiej strony, jeśli reaktor jest wypełniony roztworem reakcyjnym do połowy, taka wentylacja nie jest potrzebna. Podczas reakcji można pobierać próbki reakcyjne w celu śledzenia konwersji metodą RP-HPLC. Po zakończeniu reakcji obniża się temperaturę do 4°C do następnego etapu chromatografii.

Na podstawie powyższego opisu jest jasne, że wynalazek dostarcza metod identyfikacji niepożądanych izoform białka i przekształcania ich w białko żądane, co przyczynia się do zwiększenia całkowitej wydajności i czystości żądanego białka.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób zwiększania wydajności kompozycji interferonu alfa, znamienny tym, że obejmuje przekształcanie pirogronianowej izoformy towarzyszącej interferonu alfa w interferon alfa przez poddawanie pirogronianowej izoformy towarzyszącej interferonu alfa działaniu roztworu o pH w zakresie od 5,2 do 5,6.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że interferonem alfa jest interferon alfa 2b.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kwaśny roztwór ma temperaturę 34-40°C.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że kwaśny roztwór zawiera antyutleniacz.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że antyutleniacz zawiera metioninę.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że metionina jest w stężeniu 5-40 mM.