ES2348104T3 - Metodo para la conversion de isoformas de interferon y productos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar el rendimiento de una composición de interferón alfa, que comprende la conversión de una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en interferón alfa, donde dicha isoforma adjunta se expone a la solución de zinc.

Description

Durante el transcurso de esta descripción, se citan varias publicaciones, patentes y solicitudes de patentes. Campo de la Invención

La presente invención concierne al aislamiento y purificación de proteínas. En particular, la presente invención concierne al aislamiento de proteínas, aislamiento de isoformas de proteínas y la conversión de isoformas a las proteínas deseadas. Antecedentes

Las proteínas que se producen de manera natural se usan ampliamente para fines de investigación y clínicos. Mientras que dichas proteínas puedan obtenerse de su fuente natural, las técnicas recombinantes pueden permitir la producción de esas proteínas a partir de fuentes no naturales. Por ejemplo, la fermentación de microorganismos construidos mediante tecnología recombinante, tal como bacterias transformadas, producen grandes cantidades de interferón humano a un coste sustancialmente menor que el que es posible utilizando fuentes naturales. Estas técnicas recombinantes de ADN también se han utilizado para producir otras proteínas importantes, tales como la insulina y el activador tisular del plasminógeno.

Las bacterias alteradas mediante técnicas recombinantes sin embargo, también producen contaminantes e isoformas estructurales de la proteína que se pretende producir. Esos contaminantes e isoformas incluyen proteínas oligoméricas e isoformas de proteínas reducidas (véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.765.903 de D’Andrea et al.), residuos celulares y virus (véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.732.663 de Georgiadis et al.) e isoformas ligadas al piruvato (véase Rose et al., J. Biol. Chem. 287: 19101 (1992); Prome et al., J. Biol. Chem. 266:13050 (1991); Stevens et al., J. Biol. Chem. 252:2998 (1977); y Shapiro et al., J. Biol.. Chem. 255:3120 (1980)). Es deseable eliminar estos contaminantes durante la purificación de la proteína.

Claramente, estas isoformas de proteínas reducen la pureza de la proteína deseada y los procesos para la eliminación de las isoformas reducen el rendimiento total. Si, sin embargo, las isoformas de proteína se pueden convertir en la proteína deseada, su eliminación es innecesaria y los rendimientos de proteína totales aumentarían significativamente. Lo que se necesita es una forma de identificar isoformas de proteína no deseadas y convertirlas en la proteína deseada. La presente invención aborda estas necesidades.

La presente invención se refiere a métodos para la preparación de proteínas altamente purificadas en rendimientos altos mediante el aislamiento de isoformas adjuntas y la conversión de las mismas en una proteína funcional deseada. En una realización, la presente invención proporciona un método para el aumento del rendimiento de una composición de interferón alfa, que comprende la conversión de una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en interferón alfa, dónde dicha isoforma adjunta se expone a una solución de zinc. Mientras que la presente invención no se limita a un interferón alfa particular, en una realización preferida el interferón alfa es interferón alfa2b.

La presente invención se refiere a métodos para la conversión de una isoforma adjunta producida de manera recombinante en la proteína deseada que comprende la eliminación química de un grupo escindible de la isoforma adjunta.

En la presente invención, el grupo de escisión comprende piruvato.

En cuanto al método de la eliminación química del grupo de escisión, en el presente documento se describe un método que comprende la exposición de la isoforma adjunta a una solución ácida. Cuando la isoforma adjunta es una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa, se prefiere que la solución ácida sea tenga aproximadamente un pH de 5,5. En este caso, se prefiere además que la solución ácida esté a 34-40ºC. En la invención, sin embargo, la isoforma adjunta se expone a una solución de zinc. En una realización preferida, la solución de zinc está de pH 7,8 a pH 8,6. En otra realización preferida, la solución de zinc está a 30-38ºC.

La presente descripción tampoco está limitada mediante el tipo de solución ácida o de zinc utilizada. En realizaciones preferidas, la solución ácida (descrita en el presente documento) o la solución de zinc (usada en esta invención) comprende un antioxidante en realizaciones particularmente preferidas, el antioxidante comprende metionina. En dicha realización, la concentración preferida de metionina es 5-40 µM. Definiciones

Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína deseada” significa una proteína de interés que se pretende purificar. La identificación de la proteína deseada está, por supuesto, sujeta al objetivo final del procedimiento de purificación. Por ejemplo, durante un procedimiento de purificación puede ser deseable obtener un grupo o grupos de proteínas, incluyendo contaminantes, en una etapa intermedia del proceso de purificación. Independientemente del interés en la obtención de un grupo de proteínas intermedio, el grupo de proteínas que es el objetivo final del procedimiento de purificación se considera la proteína deseada.

Como se usa en el presente documento, la expresión “isoforma adjunta” significa una isoforma de proteína que tiene características estructurales o funcionales similares a una proteína deseada, dónde puede eliminarse un grupo de escisión de la proteína para producir la proteína deseada. Se entiende que un “grupo de escisión” significa un grupo químico unido a una proteína deseada que puede eliminarse químicamente. “Eliminación química” o “eliminado químicamente” como se usa en el presente documento se entiende que indica que un grupo químico se ha separado de una proteína mediante medios químicos, incluyendo, pero sin limarse a, solución ácida, soluciones básicas, catálisis de iones metálicos, etc.

Si el grupo de escisión se puede identificar químicamente, la isoforma adjunta se puede denominar tipo específico de isoforma adjunta. Por ejemplo, una “isoforma adjunta de piruvato” es una proteína deseada que tiene un grupo de escisión unido que se identifica como piruvato.

Como se usa en el presente documento, la expresión “reacción de oxidación” significa una reacción que pretende provocar que los grupos sulfhidrilo de dos aminoácidos de cisteína formen enlaces disulfuro.

Como se usa en el presente documento, la expresión “interferón alfa” se refiere a una familia de proteínas secretadas inducibles que confieren resistencia a virus en células diana, inhiben la proliferación celular y regulan la expresión de antígenos MHC de clase I. Esta familia incluye, pero sin limitación interferón alfa-2a (Roferon, Hoffman La-Roche, Nutley, NJ), interferón alfa 2b (Intron, Schering-Plough, Madison, NJ), interferón alfa-2c (Berofor Alpha, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) o interferón de consenso como se define por determinación de una secuencia consenso de interferones alfa que se producen de manera natural (Infergen, Amgen, Thousand Oaks, CA).

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención concierne al aislamiento y purificación de proteínas. En el presente documento se describen la identificación y purificación de isoformas adjuntas. En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para la producción de una proteína deseada a partir de isoformas adjuntas. También se describe en el presente documento una proteína deseada altamente purificada mediante la copurificación de la proteína deseada junto con isoformas adjuntas y la subsiguiente conversión de las isoformas adjuntas en la proteína deseada. De este modo, la cantidad de la isoforma adjunta está reducida y el rendimiento total de la proteína deseada está aumentado y/o la purificación es más alta que la que se podía conseguir previamente. El rendimiento de la proteína deseada se puede aumentar tanto como diez veces el rendimiento obtenido sin convertir las isoformas adjuntas.

Mientras que la presente invención no está limitada por la fuente de la proteína deseada o las isoformas adjuntas, en una realización, la fuente son los microorganismos construidos mediante técnicas recombinantes. Hay muchas de estas técnicas que conocen los expertos en la materia. Estos microorganismos transformados pueden ser células eucariotas o procariotas, bacterias, células de mamífero, etc. Por ejemplo, el interferón alfa se puede producir en bacterias siguiendo los contenidos de la Patente de Estados Unidos Nº 4.530.901 de Weissman o mediante las técnicas descritas en la Solicitud de Patente Europea de publicación número EP032.134.

De la misma manera, la presente invención no se limita a cualquier método particular de extracción de la isoforma adjunta de la célula productora. Cuando la proteína deseada es interferón alfa, por ejemplo, los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.315.852 y 4.364.863 de Leibowitz et al., están disponibles.

De la misma manera, la presente invención no está limitada por las técnicas de purificación particulares empleadas para aislar la isoforma adjunta

o la proteína deseada. Muchas técnicas de cromatografía y otras técnicas de separación las conocen aquellos expertos en la materia y se pueden aplicar en el presente documento.

Mientras que la presente invención no está limitada mediante el método de identificación de las isoformas adjuntas, la identificación de isoformas adjuntas se puede conseguir mediante el estudio de los pesos moleculares de la proteína deseada y cualquiera de los contaminantes que tienen un peso molecular más alto que la proteína deseada. Uno de estos métodos se describe en Rose, et al, J. Biol. Chem. 267:19101 (1992). Los contaminantes que tienen un peso molecular más alto que la proteína deseada se pueden exponer a condiciones de degradación (por ejemplo, pH extremadamente ácido o extremadamente básico) y analizar respecto a los productos de degradación. Si uno de estos productos de degradación tiene la misma masa y/o características estructurales de la proteína deseada, entonces el contaminante se puede considerar una isoforma adjunta que tiene un grupo de escisión.

En relación a métodos para la conversión de isoformas adjuntas en la proteína deseada, como se describe en el presente documento, un proceso de exploración puede determinar las condiciones de conversión adecuadas. Por ejemplo, un proceso supone un ajuste gradual del pH de la solución de reacción hasta el punto en el que el grupo de escisión se elimina de la isoforma adjunta, no obstante se obtiene como resultado una proteína deseada funcional

o desnaturalizada de manera no irreversible.

En relación con el método de eliminación química de un grupo de escisión, en un caso descrito en el presente documento, el grupo se elimina o escinde mediante la exposición de la isoforma adjunta a condiciones ácidas (por ejemplo, usando ácido acético). En la invención la isoforma adjunta se expone a zinc, como se define por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención tampoco está limitada por la temperatura a la que la reacción de escisión se lleva a cabo. En general, si embargo, a más alta temperatura, más rápidamente la isoforma adjunta se convertirá en la proteína deseada.

Mientras que la eliminación química de un grupo escindible puede producir una proteína con las mismas características estructurales que la proteína deseada, a veces es necesario oxidar grupos sulfhidrilo reducidos a enlaces disulfuro. Esto permite a la proteína conseguir el plegamiento adecuado y convertirse en una proteína funcional. Los métodos de oxidación de los grupos sulfhidrilo se conocen en la técnica y la presente invención no está limitada por cualquier método particular de oxidación.

En una realización, la presente invención contempla la protección de grupos de metionina durante la oxidación para prevenir la formación de sulfóxido de metionina. Los métodos para la protección de los grupos de metionina se conocen en la técnica y la presente invención no está limitada por métodos particulares para proteger los grupos de metionina. Los métodos, sin embargo, incluyen el uso de antioxidantes como se describe por Lam, et al, J. Pharm. Sci. 86:1250 (1997) y la Patente de Estados Unidos Nº 5.272.135 de Takruri.

La presente invención tampoco está limitada por el método de implementación de una reacción de oxidación. Por ejemplo, en una realización, la presente invención contempla la eliminación de un grupo de escisión seguida de la oxidación de grupos sulfhidrilo. En otra realización, la presente invención contempla la eliminación de grupos escindibles y la oxidación de grupos sulfhidrilo en las mismas condiciones de reacción.

De la misma manera, la eliminación química del grupo de escisión y la oxidación de la proteína puede realizarse en la misma reacción. Como se describe en el presente documento, un proceso de exploración se realiza para determinar las mejores condiciones para la eliminación química del grupo de escisión. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo los experimentos que usan un intervalo de condiciones de pH y la cantidad de proteína deseada resultante que tiene una integridad estructural adecuada (es decir, desnaturalizada de manera no irreversible) y/o la cantidad de grupo de escisión se puede medir. Un diagrama de la cantidad de la proteína deseada que tiene una integridad estructural adecuada frente a la reacción de pH dará como resultado generalmente una curva en campana, representando el punto más alto de la curva el pH ideal para la eliminación química del grupo de escisión.

Se puede llevar a cabo una exploración similar para la reacción de oxidación. Si las curvas en campana de la reacción de eliminación química y la reacción de oxidación se cortan, el punto de intersección revela las mejores condiciones de pH para la eliminación del grupo de escisión y de oxidación de los grupos de sulfhidrilo en la misma reacción. Para la eliminación química y la oxidación de una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa, las dos curvas se cruzan a aproximadamente pH 5, lo que revela el mejor pH al que realizar una reacción de combinación. Otras condiciones de reacción que se pueden evaluar incluyen, pero sin limitación, concentración salina, temperatura, etc.

Después de la conversión de las isoformas adjuntas en la proteína deseada, pueden necesitarse etapas de cromatografía adicionales para purificar las proteínas deseadas de contaminantes.

Después de que la proteína deseada se purifique adecuadamente, se puede poner en una forma adecuada para el uso terapéutico, si se desea. La proteína deseada en esta invención es interferón alfa y por tanto, las formulaciones descritas en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.347.079 y

4.496.537 de Kwan y la Patente de Estados Unidos Nº 5.766.582 de Yuen et al. están disponibles. Como alternativa otros vehículos inertes, farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones de forma sólida incluyen polvos, comprimidos, gránulos dispersables, cápsulas, comprimidos oblongos y supositorios. Los polvos y los comprimidos pueden estar comprendidos de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 95 por ciento de proteína deseada. Los vehículos sólidos adecuados se conocen en la técnica, por ejemplo carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar o lactosa. Los comprimidos, polvos, comprimidos oblongos y cápsulas pueden usarse como formas de dosificación sólidas adecuadas para la administración oral.

Para preparar supositorios, se funde primero una cera de fusión baja, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos (por ejemplo, manteca de cacao) y el principio activo se dispersa homogéneamente en ella mediante agitación. La mezcla homogénea fundida después se vacía en moldes de tamaño conveniente, se permite que enfríe y de este modo solidificar.

Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Por ejemplo, soluciones de agua o propilenglicol agua para la inyección parenteral o adición de edulcorantes y opacificantes para soluciones orales, suspensiones y emulsiones. Las preparaciones de forma líquida pueden incluir también soluciones para la administración intranasal.

Las preparaciones de aerosol adecuadas para la inhalación pueden incluir soluciones y sólidos en forma de polvos, que pueden estar en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un gas comprimido inerte.

Los compuestos de la presente invención pueden suministrarse por vía transdérmica. Las composiciones trasndérmicas pueden tomar la forma de cremas, lociones, aerosoles y/o emulsiones y pueden incluirse en un parche transdérmico de tipo reservorio o matriz como es habitual en la técnica para este fin.

La cantidad de compuesto activo en una dosis unitaria de preparación se puede ajustar desde aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1.000 mg y preferiblemente desde aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 750 mg. Como alternativa, el compuesto activo puede prepararse mediante unidades internacionales, siendo las dosis preferidas entre 3 millones y 50 millones de unidades internacionales. En dicha realización, se contemplan 3 millones, 5 millones, 18 millones, 25 millones y 50 millones de formas de dosificación unitarias.

También se incluyen formas sólidas que se pretende que se conviertan, poco antes del uso, en preparaciones de forma líquida para administración oral, tópica o parenteral.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar determinados aspectos y realizaciones preferidas de la presente invención y no deben interpretarse como que limitan el alcance de la misma. Ejemplo 1: Proceso de Exploración para la Conversión de Isoformas Adjuntas de Piruvato

Las isoformas adjuntas de piruvato se pueden formar dentro de las células, donde el grupo alfa-amino del resto de aminoácido N-terminal de una proteína se condensa con el grupo carbonilo del piruvato. Si el piruvato interfiere con la conformación de las proteínas, entonces sólo cuando dicha isoforma adjunta de piruvato-proteína se hidroliza (se escinde el piruvato de una proteína) la proteína puede replegarse libremente en su forma deseada a través de un cambio termodinámicamente favorable de la conformación. Si una proteína deseada tiene enlace/s disulfuro, una isoforma reducida que se obtiene de la escisión del piruvato debería oxidarse como parte del replegamiento en una forma deseada.

El siguiente procedimiento ilustra cómo determinar las condiciones óptimas para convertir la isoforma adjunta de piruvato-proteína en su forma deseada. Como se analiza previamente, sí una proteína deseada no tiene enlace/s disulfuro, la exploración necesita realizarse simplemente para maximizar la escisión del piruvato (hidrólisis). Sí una proteína deseada tiene un/os enlace/s disulfuro, necesita realizarse la exploración para maximizar no sólo la escisión de piruvato (hidrólisis) si no también la formación de enlaces disulfuro (oxidación). 1) Ensayo de Piruvato:

Se necesita un ensayo de piruvato para controlar el grado de hidrólisis para entender la cinética de la escisión de piruvato. Por ejemplo, el piruvato “libre” puede ensayarse cuantitativamente mediante un método de modificación química o un método enzimático. La 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) se puede usar para obtener derivados del piruvato. Una muestra de ensayo debería ultrafiltrarse para eliminar una isoforma adjunta de piruvato-proteína usando una membrana MWCO adecuada, por ejemplo, una membrana de 10 K. Se incuba un filtrado a pH ácido con DNPH que reacciona con piruvato “libre”. El piruvato modificado por DNPH, 2,4-dinitrofenilhidrazona, puede analizarse fácilmente en RP-HPLC usando una columna C8 tal como una columna Nucleosil C8 (5 µm).

Puesto que la reacción para la obtención de derivados es estequiométrica, también es posible una medida cuantitativa de piruvato. Un kit enzimático (por ejemplo, lactato deshidrogenasa/NADH) se puede usar también para medir el piruvato. Este método no requiere ultrafiltración de muestras puesto que sus condiciones moderadas no escinden el piruvato de una isoforma adjunta de piruvato-proteína durante la incubación.

Para medir la cantidad combinada de piruvato libre y piruvato unido a una proteína, todo el piruvato unido debe escindirse antes de la modificación. Puesto que el método de modificación de DMPH requiere un pH muy ácido y un tiempo de incubación relativamente largo, el piruvato puede escindirse y posteriormente modificarse con DMPH durante la incubación. Por lo tanto, debería usarse una muestra sin ultrafiltrarse en el método de modificación de DMPH para medir una cantidad combinada de piruvato libre y unido en la muestra. 2) Ensayo de Isoforma:

Al menos existen tres isoformas para proteínas con enlaces disulfuro y existen dos isoformas para proteínas sin enlaces disulfuro. En términos generales, una proteína deseada y su forma reducida pueden resolverse fácilmente mediante RP-HPLC.

En caso de una proteína que tiene enlace/s disulfuro, la exploración será muy eficaz en tres isoformas (isoforma adjunta, proteína reducida y deseada) puede analizarse cuantitativamente en RP-HPLC. No habrá necesidad absoluta para el ensayo de piruvato y es posible identificar qué etapa es limitante de la velocidad, si existe alguna. Sin embargo, normalmente es difícil resolver una isoforma adjunta de piruvato-proteína a partir de una forma reducida. En este

caso, es indispensable un ensayo de piruvato para optimizar cada etapa de conversión. 3) Medida de la composición de la isoforma:

Cuando una forma deseada no tiene un/os enlace/s disulfuro, la composición de isoformas se puede determinar sin dificultades puesto que una isoforma adjunta de piruvato-proteína puede resolverse fácilmente a partir de una forma deseada en RP-HPLC.

Cuando la forma deseada tiene enlace/s disulfuro y una isoforma adjunta de proteína no se puede separar de su forma reducida, el piruvato unido a una proteína debería medirse para determinar la composición de la isoforma. La cantidad molar de piruvato unido a una proteína, que es la cantidad de una isoforma adjunta de proteína, es la cantidad combinada de piruvato libre y unido menos la cantidad de piruvato libre. Esto puede medirse usando una muestra con o sin ultrafiltración en el método de DMPH. Después, la cantidad de una forma reducida es la diferencia entre la cantidad combinada de una isoforma adjunta de proteína y una forma reducida medida por RP-HPLC y la cantidad de piruvato unido a una proteína determinado mediante un ensayo de piruvato. Después, se puede calcular la composición de isoforma. 4) Condiciones óptimas de exploración:

Si una forma deseada tiene un/unos enlace/s disulfuro o no, los criterios de exploración deberían ser los mismos, para maximizar la velocidad específica de conversión de la isoforma adjunta en una forma deseada. 4.1) Cuándo una proteína deseada no tiene enlace disulfuro:

En este caso, se forma una proteína deseada a medida que el piruvato se escinde de una isoforma adjunta de piruvato-proteína. La escisión del piruvato no tiene que controlarse mediante ensayo de piruvato en este caso, puesto que sólo hay una etapa, la hidrólisis, implicada en la conversión de la isoforma adjunta en una forma deseada. Por ejemplo, tanto el control de la desaparición de la isoforma adjunta como la formación de la forma deseada en RP-HPLC es suficiente. Necesitan encontrarse las condiciones de incubación para maximizar la conversión de una isoforma adjunta en una proteína deseada.

La primera etapa es investigar la cinética de la reacción respecto a un intervalo de trabajo de la concentración de isoforma adjunta de proteína a emplear en la exploración. Si la cinética es de primer orden respecto a la concentración de isoforma adjunta, la concentración de muestra no tiene impacto en la cinética y cualquier concentración puede emplearse durante la exploración o evaluación de parámetros. Por el contrario, la concentración debe mantenerse constante durante la exploración.

Puede haber muchos parámetros que afecten a la etapa de hidrólisis. Los principales podrían ser pH, temperatura, iones metálicos (tales como zinc, férrico, ferroso, Cu, Mg, etc.), conductividad, tampones, luz y agitación. Midiendo el efecto de un parámetro de incubación en la conversión de una isoforma adjunta en una forma deseada se puede optimizar cada parámetro. Por ejemplo, varias alícuotas de una muestra que contiene la isoforma adjunta de piruvato-proteína se incuban a un intervalo suficiente de diferentes pH con todos los otros parámetros a sus valores mejor estimados. La reacción de conversión en cada alícuota se mide después de un determinado periodo de incubación, (por ejemplo, durante una noche). El pH al que la conversión más alta se obtiene se determina como un pH óptimo. Dicho experimento se repite para optimizar otros parámetros con valores óptimos de los parámetros optimizados utilizados en lugar de sus valores mejor estimados previamente. Esta es una técnica de optimización típica.

El pH de incubación afecta a la velocidad de hidrólisis. Generalmente, el pH bajo conduce a más hidrólisis. La temperatura más alta también aumenta la hidrólisis. Sin embargo, la hidrólisis a un pH muy ácido, tal como pH 2, puede que no funcione cuando hay precipitación irreversible de una isoforma adjunta

o una proteína deseada o si la proteína se desnaturaliza irreversiblemente. La presencia de algunos cationes metálicos puede catalizar la hidrólisis. Aunque un catión metálico cataliza la escisión de piruvato, dicha catálisis puede ser muy dependiente de la concentración de catión metálico. Por lo tanto, debería emplearse un intervalo muy amplio de concentración de cationes metálicos cuando los cationes metálicos se exploran.

Podría haber también interacciones entre parámetros. Por ejemplo, podría ser posible que haya diferente pH óptimo dependiendo de si algunos iones metálicos están presentes o no cuando dicho catión tiene un impacto en la conversión. En el caso de una isoforma adjunta de piruvato la presencia del catión Zn da como resultado un pH óptimo diferente para la escisión de piruvato (pH 7,8-8,6). Por lo tanto, es necesario variar al mismo tiempo no sólo un nuevo parámetro a optimizar sino también otros parámetros importantes

para realmente optimizarlos. 4.2) Cuando una proteína tiene enlace/s disulfuro:

En un proceso de conversión de dos etapas, una forma reducida se escinde de la isoforma adjunta mediante hidrólisis y se convierte posteriormente en una forma deseada mediante oxidación.

Idealmente hablando, una isoforma adjunta de proteína y una forma reducida se aíslan y el procedimiento, que se describe anteriormente para el caso de una proteína sin un/unos enlace/s disulfuro, se aplica a cada una de las isoformas adjuntas y las formas reducidas para optimizar cada etapa. Una diferencia principal es que la transferencia de oxígeno y algunos oxidantes como el glutation oxidado (GS-SG) además de los parámetros enumerados anteriormente se pueden optimizar para la etapa de oxidación. Sí GS-SG oxida sólo una forma reducida, potenciará mucho la etapa de oxidación o formación de enlaces disulfuro. Sin embargo, probablemente habrá un rendimiento o conversión menores si GS-SG también oxida la isoforma adjunta y la isoforma adjunta oxidada no se hidroliza fácilmente.

A partir de cada condición óptima, las condiciones óptimas para la conversión de la isoforma adjunta en una forma deseada se pueden estimar. Si están razonablemente cercanas, las condiciones intermedias se fijan como condiciones óptimas. Teóricamente hablando, puede haber condiciones óptimas diferentes dependiendo del porcentaje inicial de isoforma adjunta de piruvato-proteína frente a una forma reducida en una muestra. Por ejemplo, las condiciones óptimas deberían ser diferentes cuando la isoforma adjunta es la mayoría absoluta que cuando una forma reducida es la mayoría absoluta. Por lo tanto, debe reconocerse que la composición de muestra debe tenerse en cuenta cuando las condiciones óptimas se estiman a partir de las condiciones óptimas individuales para la hidrólisis y la oxidación.

Finalmente, las condiciones óptimas de conversión se confirman experimentalmente. A menudo es útil en el ajuste fino de las condiciones óptimas de conversión para identificar, una etapa limitante de la velocidad, si existe. La acumulación constante de la forma reducida con tiempo de incubación indica que la etapa de oxidación es limitante de la velocidad. Cuando se produce la acumulación, deben aplicarse las condiciones más favorables para la oxidación tales como más oxigeno, pH más alto y temperatura más alta para maximizar la formación de la forma deseada. Si siempre hay un nivel bajo de proteína reducida aunque una velocidad significativa de formación de una forma deseada, la etapa de escisión es limitante de la velocidad. Cuando esto sucede, las condiciones de incubación se pueden cambiar de modo que pueden mejorar la etapa de escisión que conducirá a la maximización de la formación de la forma deseada.

Si las condiciones óptimas para la eliminación química de un grupo escindible y oxidación de la proteína son muy diferentes, se pueden aplicar gradualmente. Por ejemplo, las condiciones óptimas para la etapa de hidrólisis se aplican primero y las condiciones óptimas para la etapa de oxidación se aplican cuando la hidrólisis está casi completa.

Cuando no es factible aislar cada isoforma, el ensayo de piruvato se convierte en indispensable, especialmente, cuando las dos isoformas no puedan resolverse en RP-HPLC. Mediante el control de la liberación de piruvato, la etapa de hidrólisis se puede optimizar primero. La segunda etapa se optimiza cuando la primera etapa casi ha terminado o es muy lenta. A partir de estas condiciones óptimas, las condiciones óptimas de conversión total se estiman y se confirman experimentalmente. Un planteamiento alternativo es que la conversión total se optimiza después de que la etapa de hidrólisis se optimice. Este planteamiento podría ser más práctico especialmente cuando es difícil optimizar la segunda etapa debido a la interferencia provocada mediante hidrólisis de isoforma adjunta continua y significativa. Como se menciona anteriormente, el pH, la temperatura, la transferencia de oxígeno, los cationes metálicos y oxidantes son importantes parámetros a optimizar.

Las interacciones entre parámetros se vuelven más importantes para el proceso de conversión de dos etapas de lo que lo son para el proceso de conversión de una etapa.

Para confirmar que no existe impacto de dichos parámetros de condiciones óptimas en una forma deseada, debería purificarse una forma deseada y sus propiedades, que inducen pureza y acción biológica específica, deberían comprobarse totalmente. Ejemplo 2: Conversión de la Isoforma Adjunta de Piruvato a Interferon alfa2b

Este ejemplo está fuera del alcance de las reivindicaciones anexas.

La escisión del piruvato y la formación de los enlaces disulfuro se realizan a una temperatura elevada (30-37ºC) y a un pH de reacción de 5,2-5,6. Estas condiciones de reacción son únicas ya que en ambas reacciones se producen secuencialmente en las mismas condiciones de reacción y la proteína bioactiva se recupera.

Las fracciones que contienen el máximo de absorbancia UV de proteína que eluyen de la cromatografía de aislamiento de proteínas se agrupan juntas y se filtran 0,45 µM para la esterilidad.

Se añaden 3 gramos de metionina por litro de combinación de proteínas a la combinación de proteínas y se agitan hasta que se disuelvan. El pH de la combinación se ajusta a 5,2-5,6 con hidróxido sódico diluido. La concentración de cloruro sódico no se ajusta: está entre NaCl 150-200 mM.

Una solución madre que consistía de acetato 10 mM pH 5,5, metionina 200 mM y NaCl 200 mM se añade a la combinación de proteínas a una concentración final de metionina 20 mM.

La combinación de proteínas se transfiere a un recipiente de reacción y la temperatura se aumenta hasta 37ºC con agitación continua. La combinación de proteínas se incuba a 36-38ºC durante 24-30 h.

En el momento de 24-30 h, la mezcla de reacción se filtra a través de un filtro de profundidad, seguido de un filtro de 0,45 µM para eliminar precipitados. La combinación se concentra después y se diafiltra frente a acetato 10 mM pH 5,5 a 2-10ºC. Ejemplo 3: Conversión de Isoforma Adjunta de Piruvato a Interferon alfa2b Usando Zinc

La isoforma adjunta de piruvato se convierte en interferón alfa2b a 34ºC y pH 8,2 con zinc (1 M). La solución de reacción se agita durante la reacción. Cuando la conversión es aproximadamente el 80%, la temperatura de solución de reacción se puede disminuir a 4ºC para parar la reacción.

Preparación de Solución: Tampón Tris 1 M: conservado a 4ºC, Tris Base 1 M + HCl a pH 8,3, solución de Zn 1 mM: conservada a 4ºC, ZnSO4H2O 1 M + NaAcetato 10 mM + NaCl 175 mM a pH 5,5.

Las fracciones que contienen el máximo de absorbancia UV que eluye de la cromatografía de purificación de proteína se agrupan juntas y se filtran 0,2 µM para la esterilidad. Aproximadamente 0,083 (V/V) del Tampón Tris 1 M se añade lentamente en una combinación de proteínas (el pH de una combinación de proteínas típica está en el intervalo de 5,2 a 5,5) que se agita a un pH de aproximadamente 8,2.

La solución de Zn 1 M se añade lentamente en la combinación de proteínas básica mientras que está agitándose para conseguir una relación molar de 0,6 a 1,0 de catión de Zn frente a la isoforma adjunta piruvato total, por ejemplo, si una concentración de isoforma adjunta de piruvato es 1,0 mg/ml, 30 µM de Zn o 0,003 (V/V) de la solución de Zn 1 mM se necesita. Usar

5 solución de catión Zn fresca.

La solución de reacción se calienta a 34ºC en un reactor mientras que se agita. La temperatura de reacción se controla a 34ºC a lo largo de la reacción. La agitación continua también se requiere a un grado que la mezcla en la solución de reacción sea suficiente pero no lo suficientemente violenta como

10 para generar burbujas. Debe permitirse cierta ventilación en el reactor para la transferencia de oxigeno en la solución de reacción. Por otro lado, si el reactor está aproximadamente lleno por la mitad de la solución de reacción, esta ventilación no se necesita. Durante la reacción, se puede tomar una muestra de reacción para seguir la conversión usando RP-HPLC. Cuando la reacción

15 termina, la temperatura puede bajarse a 4ºC para la siguiente etapa de cromatografía. A partir de lo anterior, está claro que la presente invención proporciona métodos para identificar isoformas de proteínas no deseables y convertirlas en la proteína deseada, que aumenta la pureza y el rendimiento total de la

20 proteína deseada.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para aumentar el rendimiento de una composición de interferón alfa, que comprende la conversión de una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en interferón alfa, donde dicha isoforma adjunta se expone a la solución de zinc.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el que dicho interferón alfa es el interferón alfa2b.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1 en el que dicha solución de zinc de pH 7,8 a pH 8,6.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, en el que dicha solución de zinc está a 30-38ºC.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, en el que dicha solución de zinc comprende un antioxidante.

6. 6.

   El método de la reivindicación 5, en el que dicho antioxidante comprende metionina.

7. 7.

   El método de la reivindicación 6, en el que dicha metionina está a una concentración de 5-40 mM.

8. 8.

   El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente la purificación de dicho interferón alfa2b usando cromatografía.

9. 9.

   El método de la reivindicación 8, en el que dicha cromatografía comprende cromatografía de afinidad de los colorantes basada en agarosa seguida de cromatografía de intercambio aniónico basada en agarosa, que se sigue de una etapa de cristalización.